ES2211219T3

ES2211219T3 - Productos que comprenden trihidroxiestilbenos y sus derivados, y procedimiento para su fabricacion y utilizacion.

Info

Publication number: ES2211219T3
Application number: ES99967471T
Authority: ES
Inventors: Kan He; Qun Yi Zheng; Bo Lin Zheng; Calvin Hyungchan Kim
Original assignee: Pure World Botanicals Inc
Current assignee: Naturex Inc
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: EP1140097A2; CA2394949A1; ATE253917T1; WO2000037021A3; WO2000037021A2; US6361815B1; DE69912839D1; EP1140097B1; AU2374100A; EP1140097A4; DE69912839T2

Abstract

Procedimiento para el aislamiento de un producto purificado que comprende por lo menos un 85% en peso del 3, 4'', 5-trihidroxi-trans-estilbeno a partir de un material vegetal que contiene trihidroxiestilbenos y sus derivados glicosilados, comprendiendo dicho procedimiento: (a) poner en contacto trozos del material vegetal con un disolvente acuoso para formar una lechada; (b) separar de la lechada el disolvente acuoso contactado para aislar un primer producto que incluye por lo menos el 10% en peso de una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-a-D-glicosilados; (c) disponer un concentrado de carga del primer producto en una columna MD-1 con una fase estacionaria que comprende un copolímero de un compuesto aromático vinílico entrecruzado con un compuesto aromático polivinílico; (d) eluir una columna MD-1 con un volumen de elución que comprende un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 70 y el 80% para aislar un tercer producto que incluye por lo menos el 20% en peso de una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-a-D-glicosilados; (e) disponer un concentrado de carga del tercer producto en una columna MD-2 con una fase estacionaria que comprende una resina de poliamida; (f) eluir la columna MD-2 con un primer volumen de gradiente MD-2 que comprende una mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 20 y el 40% (g) eluir la columna MD-2 con un segundo volumen de gradiente MD-2 que incluye una mezcla alcohol-agua que comprende por lo menos un porcentaje alcohólico de un 70% para aislar un cuarto producto que incluye por lo menos el 30% en peso de una fracción de estilbeno, en la que ésta comprende alrededor del 80% en peso de trihidroxiestilbenos; (h) disponer un concentrado de carga del cuarto producto en una columna MD-3 con una fase estacionaria seleccionada del grupo formado por C-8 a C-18 y gel de sílice unido a ciano; (i) eluir la columna MD-3 con un primer volumen de gradiente que comprendeuna mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 35 y el 45%; (j) eluir la columna MD-3 con un segundo volumen de gradiente que incluye una mezcla alcohol-agua que comprende un porcentaje alcohólico de entre 50 y 60% para aislar un sexto producto que incluye por lo menos el 70% en peso de una fracción de estilbeno, en la que ésta comprende por lo menos el 70% en peso de 3, 4'', 5-trihidroxi-trans-estilbeno; y (k) cristalizar el producto purificado a partir del sexto producto.

Description

Productos que comprenden trihidroxiestilbenos y sus derivados, y procedimientos para su fabricación y utilización.

La presente invención se refiere a los trihidroxiestilbenos y a sus derivados glicosilados. En particular, la presente invención se refiere a los procedimientos para el aislamiento y purificación de estos productos, utilizando la cromatografía líquida de fase inversa, así como a un procedimiento para la conversión del producto glicosilado en el producto aglicónico.

Resveratrol, el 3,4',5-trihidroxiestilbeno, se aisló al principio a partir de las hojas de la vid (Inghim, T.L.,
Phytochem., 15 (1979) (1976)). Inghim caracterizó la estructura del resveratrol utilizando procedimientos químicos. El resveratrol posee la siguiente estructura química, en la que tanto R_{1} como R_{2} son hidrógeno.

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Se ha informado de que los trihidroxiestilbenos y sus derivados poseen propiedades medicinales que incluyen actividades anti-leucémicas y anti-tumorales. Por ejemplo, el material vegetal que contiene resveratrol se ha utilizado como medicación jerbaria para el tratamiento de la hiperlipemia y de las enfermedades hepáticas en China y Japón durante muchos siglos (Kimura, K.M. et al., Shoygakugaku Zasshi, 83, 35-58 (1981)). Experimentos posteriores con trans-resveratrol purificado demuestran que muchas funciones biológicamente útiles, que incluyen la modulación de la síntesis hepática del colesterol, la inhibición de la actividad lipooxigenasa (Kimura, Y. et al., Biochem. Biophys. Acta., 834, 275 (1985)), la inhibición de la pseudoanafilaxis (Ragazy, E. et al., Pharmacol. Ref. Commun., 79, 20 (1988)), y la protección de las lipoproteínas contra el daño oxidativo y de los radicales libres (Frankel, E.N., et al, Lancet, 1, 1017 (1979)).

Recientes informes de la literatura indican que el extracto derivado de la Cassia quinquangulata Rich (neguminasae) recolectado en Perú es un potente inhibidor de la ciclooxigenasa (COX) (Kudo, T. et al., Gann. 71, 260 (1980), Pollard, M. et al., Cancer Lett., 21, (1983), Waddell, W.R. et al., Am. J. Surg., 157, 175 (1989), Thun, M.J. et al., N. Engl. J. Med., 325, 1593 (1991)).

En las siguientes consideraciones, ED_{50} representa la dosis efectiva para una inhibición del 50%.

En un reciente artículo, Meishiang Jang informó de que el resveratrol inhibe la actividad hidroperoxidásica de COX-1, ED_{50}=3,7 \muM, y también la actividad hidroperoxidásica de COX-2, ED_{50}=85 \muM (Jang, M et al., Science, 275, 218 (1997). La actividad inhibitoria es pertinente para la terapia del cáncer y la prevención, porque COX cataliza la conversión del ácido araquidónico a las sustancias pro-inflamatorias tal como las prostaglandinas, que pueden estimular el crecimiento de las células tumorales y suprimir las respuestas inmunitarias (Plescia, O.J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, (1975)).

También se ha encontrado que el 3,4'5-trihidroxiestilbeno (Resveratrol) inhibe ciertos sucesos asociados con el crecimiento tumoral. Por ejemplo, el resveratrol inhibe la formación de radicales libres, ED_{50} = 27 \muM, cuando las células leucémicas promielocíticas humanas se trataron con 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) (Shama, S. et al, Cancer Res. 54 5848 (1994). Además, Jang et al., investigaron la actividad antiinflamatoria del resveratrol. En el modelo de inflamación inducida por la carragenina en las ratas, el resveratrol redujo significativamente el edema pedio, tanto en la fase aguda (de 3 a 24 horas) como en la fase crónica (de 24 a 144 horas). La actividad supresora del edema del resveratrol fue superior a la de la fenilbutazona y similar a la de la indometacina. Jang et al. investigaron también el efecto del resveratrol en un modelo de carcinogénesis del cultivo de la glándula mamaria del ratón. El resveratrol, de forma dosis dependiente, inhibió el desarrollo de lesiones preneoplásicas inducidas por DMBA (ED_{50} = 3,1 \muM) (Jang et al., Science, 275, 218 (1997)).

Recientemente, ha habido un aumento de interés en el resveratrol y en los compuestos análogos como resultado de datos epidemiológicos que muestran una incidencia menor en la mortalidad debida al daño cardiovascular en poblaciones con una dieta alta en lípidos y en calorías, pero cuya dieta incluye también vino tinto, comparado con poblaciones que consumieron menos calorías y un porcentaje menor de lípidos, pero cuya dieta no incluye vino tinto (Seigneur, M. et al., J. Appl. Card., 5, 215 (1990); Siemann, E. H. y Creasy, L.L., Am. J. Enol. Vitic, 43, 49 (1992); Renaud, S. y De Lorgeril, M., Lancet, 339, 1523 (1992); Scharp, D., Lancet, 341 27 (1993)).

Las investigaciones llevadas a cabo han revelado que el resveratrol posee efectivamente muchas actividades farmacológicas que pueden explicar potencialmente los efectos protectores del vino tinto a nivel cardiovascular (Frankel, E.N. et al., Lancet 341 343 (1993)). Además, el resveratrol se ha mostrado capaz de promover la formación de nitróxidos que poseen una acción vasodilatadora e inhiben la agregación plaquetaria inducida por el colágeno o el ADP (Fitzpatrick, D. et al., Am. J. Physiol., 265 (Heart Circ. Physiol), 34 774 (1993)).

Los materiales vegetales que constituyen las fuentes naturales de los resveratroles incluyen Vitis vinifera y Polygonum cuspidatum (Huzhang). La concentración de resveratrol en P. cuspidatum es mucho más alta que en Vitis vinifera. Los procedimientos que se practican habitualmente para aislar los resveratroles a partir de materiales vegetales son métodos cromatográficos de fase normal muy dificultosos y de escaso rendimiento que utilizan también disolventes clorados que son tóxicos para el hombre y pueden dañar el medio ambiente.

El documento JP 60009455 describe un procedimiento para el aislamiento del resveratrol, mediante la extracción de las raíces de las plantas de Polygonum con acetona/metanol. La fracción, escasamente soluble en éter etílico, se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice y es recristalizada con etanol para obtener el resveratrol.

Tanaka, T. et al Phytochemistry 48 (7), 1241 (1998) describe el aislamiento del resveratrol y otros derivados del estilbeno originarios de Parthenocissus tricuspidata mediante extracción sucesivamente con acetona y metanol a temperatura ambiente, seguido por cromatografía en gel de sílice con cloroformo/metanol.

El aislamiento de los resveratroles procedentes de fuentes naturales representa una fuente de suministro fiable potencial. La presente invención proporciona una técnica de aislamiento y purificación que da lugar a altos rendimientos en la producción del resveratrol y compuestos relacionados con un bajo coste.

Sumario de la invención

Mediante la presente invención, los productos que contienen una fracción de estilbeno y las composiciones que contienen estos productos, pueden obtenerse mediante procedimientos de cromatografía líquida de fase inversa para aislar y purificar estos productos a partir del material vegetal.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el aislamiento de un producto purificado que comprende por lo menos un 85% en peso del 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno a partir de un material vegetal que contiene trihidroxiestilbenos y sus derivados glicosilados, el cual procedimiento comprende:

(a) poner en contacto trozos del material vegetal con un disolvente acuoso para formar una lechada;

(b) separar de la lechada el disolvente acuoso contactado para aislar un primer producto que incluye por lo menos el 10% en peso de una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados;

(c) disponer un concentrado de carga del primer producto en una columna MD-1 con una fase estacionaria que comprende un copolímero de un compuesto aromático vinílico entrecruzado con un compuesto aromático polivinílico;

(d) eluir una columna MD-1 con un volumen de elución que comprende un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 70 y el 80% para aislar un tercer producto que incluye por lo menos el 20% en peso de una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados;

(e) disponer un concentrado de carga del tercer producto en una columna MD-2 con una fase estacionaria que comprende una resina de poliamida;

(f) eluir la columna MD-2 con un primer volumen de gradiente MD-2 que comprende una mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 20 y el 40%;

(g) eluir la columna MD-2 con un segundo volumen de gradiente MD-2 que incluye una mezcla alcohol-agua que comprende por lo menos un porcentaje alcohólico de un 70% para aislar un cuarto producto que incluye por lo menos el 30% en peso de una fracción de estilbeno, en la que ésta comprende alrededor del 80% en peso de trihidroxiestilbenos;

(h) disponer un concentrado de carga del cuarto producto en una columna MD-3 con una fase estacionaria seleccionada del grupo formado por C-8 a C-18 y de gel de sílice unido a ciano;

(i) eluir la columna MD-3 con un primer volumen de gradiente que comprende una mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 35 y el 45%;

(j) eluir la columna MD-3 con un segundo volumen de gradiente que incluye una mezcla alcohol-agua que comprende un porcentaje alcohólico de entre 50 y 60% para aislar un sexto producto que incluye por lo menos el 70% en peso de una fracción de estilbeno, en la que ésta comprende por lo menos el 70% en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno; y

(k) cristalizar el producto purificado a partir del sexto producto.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el aislamiento de un producto purificado que comprende por lo menos el 85% en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno mono-\beta-D-glicosilado a partir de un material vegetal que contiene trihidroxiestilbenos y sus derivados glicosilados, el cual procedimiento comprende:

(f) eluir la columna MD-2 con un volumen que comprende una mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico del 30% para aislar un cuarto producto que incluye por lo menos un 40% en peso de una fracción de estilbeno que comprende un 90% de trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados;

(g) disponer un concentrado de carga del cuarto producto en una columna MD-3 con una fase estacionaria seleccionada del grupo formado por C-8 a C-18 y de gel de sílice unido a ciano;

(h) eluir la columna MD-3 con un volumen de elución que comprende una mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico del 5% para aislar un quinto producto que comprende por lo menos el 60% en peso de una fracción de estilbeno, en la que ésta comprende por lo menos el 90% en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno mono-\beta-D-glicosilado ; y

(i) cristalizar el producto purificado a partir del quinto producto.

Los procedimientos de la presente invención proporcionan generalmente un primer producto con un contenido sólido de por lo menos el 60%, en el que los sólidos incluyen por lo menos el 10% en peso de una fracción de estilbeno.

Los procedimientos de la presente invención proporcionan además un tercer producto compuesto por lo menos de un 20% en peso de una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados y una composición del tercer producto con un disolvente acuoso. Según la presente invención, la composición que incluye el tercer producto se obtiene mediante un proceso de cromatografía líquida de fase inversa MD-1.

De modo similar, una forma de realización proporciona productos cuaternarios compuestos de por lo menos un 30% en peso de una fracción de estilbeno que incluye trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados y composiciones de estos productos cuaternarios con disolventes acuosos. Los productos cuaternarios se sintetizan utilizando un procedimiento MD-2 que se inicia con una composición que contiene el tercer producto en la que la fase estacionaria es una resina poliamídica. Una composición que contiene el tercer producto se concentra para formar un concentrado de carga que se dispone en una columna MD-2, utilizando opcionalmente un volumen de elución de lavado, seguido por la elución con uno o más volúmenes MD-2 de elución de un disolvente acuoso, especialmente una mezcla de un alcohol y agua para obtener un efluente de MD-2 que es una composición que contiene un cuarto producto. Este efluente se recoge in toto (en conjunto) o como fracciones de gradiente recogidas mediante una recuperación fraccionada. Los productos cuaternarios se obtienen eliminando el disolvente acuoso de un efluente de MD-2, recogiéndolo sin embargo.

Otra forma de realización de la presente invención proporciona productos de quinto orden que están constituidos por lo menos de un 60% de una fracción de estilbeno. Un producto de quinto orden puede contener por lo menos un 85% en peso de trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados o por lo menos un 85% de una aglicona suya. También se proporcionan composiciones que incluyen productos de quinto orden y un disolvente acuoso. Los productos de quinto orden se obtienen mediante un procedimiento MD-3 en el que la fase estacionaria está basada en gel de sílice. El material de partida para un procedimiento MD-3 es un efluente, especialmente una fracción de gradiente, a partir de un proceso MD-2. El efluente se concentra para formar un concentrado de carga que se eluye a través de la columna MD-3 y puede seguirse por un volumen de elución de lavado. La columna MD-3 se eluye entonces con uno o más volúmenes de elución de un disolvente acuoso. Cada volumen de elución puede consistir en uno o más volúmenes discretos de gradiente, formado cada uno por un disolvente acuoso diferente, o durante la elución del volumen de elución, [la composición de cada volumen de elución] puede variar lineal, exponencial, logarítmica o hiperbólicamente, o poco a poco. El efluente procedente de un primer proceso MD-3 es una composición que contiene un producto de quinto orden. El efluente puede recolectarse in toto o como fracciones de gradiente. Los productos de quinto orden se obtienen eliminando el disolvente acuoso del efluente o de las fracciones de gradiente de un primer proceso MD-3. Una fracción de gradiente de un primer proceso MD-3 es el material de partida para que un proceso de cristalización fría dé lugar a un quinto producto que contenga por lo menos el 85% en peso de trihidroxiestilbeno mono-\beta-D-glicosilado. La fracción de gradiente de un primer proceso MD-3 se concentra hasta un contenido en sólidos de por lo menos 20 g/l, diluyéndose entonces con agua. La mezcla resultante se enfría por debajo de 0ºC para formar una lechada a partir de la cual tal quinto producto puede aislarse, lavarse y entonces, secarse.

De modo similar, una forma de realización de la presente invención proporciona un segundo procedimiento MD-3 para obtener composiciones que contengan productos de sexto orden que son, por lo menos en un 70%, trihidroxiestilbenos. Los productos de sexto orden se aíslan eliminando el disolvente acuoso de las composiciones. El material de partida para un segundo procedimiento MD-3 es una fracción de gradiente MD-2 que se ha recogido fraccionadamente. La fracción de gradiente MD-2 se concentra hasta una concentración de carga que posee un contenido sólido de por lo menos 7 g/l. La columna MD-3 se eluye con el primer y segundo volúmenes de elución MD-3 que se obtienen a partir del disolvente acuoso. Cada uno de los volúmenes de elución MD-3 o ambos, pueden obtenerse a partir de los volúmenes de gradiente que incluyen disolventes acuosos diferentes o, la composición del disolvente acuoso de cada uno de los volúmenes de elución o de ambos puede variarse lineal, exponencial, logarítmica, hiperbólicamente o poco a poco durante la elución del respectivo volumen de elución. Los efluyentes que corresponden a los volúmenes respectivos de elución o a los volúmenes de gradiente pueden recogerse in toto o fraccionadamente. Los productos de sexto orden se obtienen eliminando el disolvente acuoso del efluente o de las fracciones de gradiente de un segundo proceso MD-3, recogiéndolo, sin embargo.

Un efluyente o fracción de gradiente de un segundo procedimiento MD-3 es un material de partida para obtener un producto de sexto orden que está formado, por lo menos, por un 85% en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno, en el que el efluente o fracción de gradiente se concentra hasta una composición concentrada, poniendo en contacto dos veces ésta con volúmenes de extracción separados de un disolvente orgánico polar volátil (por ejemplo, acetato de etilo), combinando los volúmenes de extracción y eliminando el disolvente orgánico polar volátil para obtener el producto del 85%. Se proporciona un procedimiento alternativo para obtener el producto del 85% en el que el volumen de elución o la fracción del gradiente de un segundo procedimiento MD-3 se evapora hasta sequedad, disolviéndose el residuo así formado en agua a una temperatura superior a 0ºC para formar una solución, enfriándose ésta hasta menos de 0ºC para formar cristales, y separando éstos del sobrenadante para obtener un producto de sexto orden del 85%.

A continuación, se describe un procedimiento para convertir un trihidroxiestilbeno \beta-D-glicosilado a la correspondiente aglicona. El procedimiento incluye las etapas de proveer una solución o suspensión de un trihidroxiestilbeno glicosilado, poniendo en contacto la solución o suspensión con HCl a una concentración total de entre 0,01 y 0,02 g/ml, y sometiendo a reflujo la solución acidificada o la suspensión durante 10 a 200 minutos. La aglicona correspondiente se aísla a partir de la mezcla reactiva mediante métodos tal como se conocen en la técnica. El procedimiento de conversión puede llevarse a cabo bajo una capa de gas inerte, por ejemplo, nitrógeno.

Definiciones

Alcohol. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término alcohol se refiere a un alcohol alifático inferior, en particular a uno que se selecciona a partir del grupo formado por metanol, etanol y propanoles, butanoles, pentanoles y hexanoles isoméricos.

Disolvente acuoso. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término disolvente acuoso se refiere a agua o a un disolvente orgánico polar que es miscible con agua en todas las proporciones, entre 1:99 y 99:1. Ejemplos de disolventes orgánicos polares que son o pueden utilizarse como componentes de un disolvente acuoso, tal como se utiliza el término en la presente memoria, incluyen pero no se limitan a metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, acetona, y acetonitrilo. Otros disolventes orgánicos polares apropiados son conocidos por el experto en la materia.

Volumen de la columna. Tal como se utiliza en la presente memoria, el volumen de columna se refiere al volumen del espacio que se define por la superficie interna de la columna o cámara cromatográfica que rodea a la fase estacionaria de RPLC. El volumen de la columna se abrevia como CV.

Composición. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término composición consiste en una lechada, suspensión, dispersión o especialmente, solución de un material, que es sólido normalmente a la temperatura ambiental, en un disolvente acuoso. Ejemplos de composiciones incluyen pero no se limitan a eluciones de carga, concentrados de carga, y efluentes o fracciones de gradiente de cualquier procedimiento de cromatografía líquida de fase inversa de la presente invención.

Recuperación fraccionada. Cuando se utiliza con relación a un efluente o a un efluente de gradiente, o a una fracción de gradiente, el término recuperación fraccionada significa que el efluente o el efluente de gradiente o la fracción de gradiente o la subfracción de gradiente se segrega en por lo menos dos porciones o alícuotas.

Columna MD-1. Una columna MD-1 es una columna de cromatografía líquida de fase inversa de cualquier tamaño en la que la fase estacionaria consiste en un copolímero de un compuesto aromático de vinilo, por ejemplo, estireno, que se entrecruza con un compuesto aromático polivinílico, por ejemplo, divinilbenceno, en el que la fase estacionaria posee un área superficial media de por lo menos 400 m^{2}/g aproximadamente, preferentemente de 800 m^{2}/g, y una porosidad de por lo menos 0,55 ml/ml aproximadamente, preferentemente de por lo menos 0,58 ml/ml. El diámetro promedio de las partículas que constituyen la fase estacionaria está entre 490 \mu y 700 \mu aproximadamente. El momento dipolo del polímero con entrecruzamiento que constituye la fase estacionaria es menor que 0,5 aproximadamente. El agua se utiliza para acondicionar una columna MD-1.

Columna MD-2. Una columna MD-2 es una columna de cromatografia líquida de fase inversa de cualquier tamaño en la que la fase estacionaria es una resina poliamídica. Tal como se utiliza en la presente memoria, la resina poliamídica es un polímero de un lactamo o un copolímero de una diamina y un ácido dicarboxílico (o de la sal formada entre el diácido y la diamina). Ejemplos de resinas poliamídicas incluyen poli(caprolactam) y poli(hexametilen adipamida). Una mezcla alcohol-agua que comprende un volumen de metanol del 10% se utiliza para preparar una columna
MD-2.

Columna MD-3. Una columna MD-3 es una columna de cromatografia líquida de fase inversa de cualquier tamaño en la que la fase estacionaria está constituida por partículas de fase inversa basadas en gel de sílice con fracciones C_{8} a C_{18} alcano o fracciones ciano unidas a su superficie. Un material apropiado es el medio de fase inversa WP Octadecyl, disponible en J.T. Baker, Phillipsburg, New Jersey (Cat. \neq 7248-2). Una columna MD-3 se prepara con una mezcla de metanol y agua que comprende un volumen de metanol del 20% aproximadamente.

Porcentaje de sólidos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el porcentaje de la cantidad de los sólidos se refiere al peso de una composición nominalmente sólida que comprende un disolvente acuoso, cuya composición sólida permanece después de que el disolvente acuoso se elimine. Si no se indica lo contrario, el porcentaje de la cantidad del sólido se expresa como la relación del peso de la composición que permanece después de la eliminación del disolvente acuoso dividido por el peso de la composición antes de la eliminación del disolvente acuoso, multiplicado por 100. Una composición nominalmente sólida es aquélla que, a temperatura ambiente, no fluye bajo su propio peso.

Excipientes farmacéuticamente aceptables del procedimiento. Los excipientes farmacéuticamente aceptables del procedimiento son sustancias transportadoras inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables que no reaccionan o interfieren de otra forma con componentes biológicamente activos de sustancias farmacéuticas o neutriceúticas y que ayudan al procesamiento de componentes biológicamente activos o de los productos que los contienen, en una forma conveniente para la administración de éstos a un animal, incluyendo el hombre. Muchos de dichos excipientes farmacéuticamente aceptables de procesamiento, son conocidos en la técnica. En éstos, se prefieren particularmente el fosfato tricálcico y la maltodextrina.

SDA. Tal como se utiliza en la presente memoria, SDA se refiere al alcohol especialmente desnaturalizado. Véase la Farmacopea de Estados Unidos.

Componente de sólidos. Parte de una lechada, suspensión, dispersión o solución en un disolvente acuoso, que permanece después de que éste se elimina. Sinónimo de parte sólida.

Contenido en sólidos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término contenido en sólidos cuantifica la parte de una solución, lechada, suspensión o dispersión en un disolvente acuoso que permanece cuando éste se elimina y que se expresa en unidades de gramos de sólido que restan por litro de solución o de lechada, y que se abrevia g/l.

Fracción de estilbeno. Fracción de estilbeno se refiere colectivamente a los constituyentes o componentes de un material, especialmente de un componente sólido, que está formado esencialmente por 1,2-difeniletenos y 1,2-difeniletenos sustituidos, en los que cualquiera de los anillos fenilo o los dos pueden llevar uno o más sustituyentes.

Porcentaje de volumen. El término porcentaje de volumen, abreviado vol. %, tal como se utiliza en la presente memoria, describe la composición de un disolvente acuoso. El vol. % de un componente representa la proporción del volumen del componente que se añade a una composición respecto al total de los volúmenes de todos los componentes añadidos a 100 veces la composición. El porcentaje del volumen de un disolvente acuoso puede calcularse fácilmente en el momento en que se formula o puede determinarse posteriormente utilizando técnicas estándar, por ejemplo, cromatografía GL utilizando mezclas apropiadas de referencia.

En una forma de realización, los procedimientos de la presente invención proporcionan un primer producto que comprende por lo menos un 60%, preferentemente un 65%, en peso, de los sólidos, los cuales incluyen preferentemente, por lo menos, el 10%, por lo menos el 12%, en peso, de una fracción de estilbeno. Según la presente invención, el primer producto puede obtenerse proporcionando un material vegetal sólido, preferentemente, V. vinifera, más preferentemente P. cuspidatum, el cual material vegetal se ha seccionado o molido a piezas con un volumen promedio de entre 0,001 mm^{3} a 15 mm^{3}, y poniendo en contacto este material con un disolvente acuoso, preferentemente una mezcla alcohol-agua que comprende un porcentaje de volumen (vol-%) de SDA de alrededor del 75%. El contacto puede realizarse mediante cualquier medio apropiado tal como son conocidos en la técnica; por ejemplo, filtración, extracción en cuba, extracción contracorriente, y similares. El primer producto puede obtenerse entonces eliminando el disolvente acuoso o un componente suyo a partir de la composición resultante. En esta o cualquier forma de realización, el disolvente acuoso puede eliminarse mediante cualquiera de los medios que son conocidos en la técnica, tales como evaporación, destilación, y liofilización, para mencionar algunos.

El primer producto puede utilizarse para preparar un segundo producto que puede administrarse directamente a un animal, incluyendo el hombre, el cual segundo producto posee una fracción de estilbeno, por lo menos, del 8% en peso y como mínimo, un excipiente de procesamiento farmacéuticamente aceptable.

El segundo producto puede obtenerse mezclando el primer producto con agua y homogeneizando la lechada con uno o más excipientes de procesamiento farmacéuticamente aceptables. Con este objeto, es apropiado un homogenizador Silverson modelo 14 RT-A, Silverson Corporation, East Longmeadow, MA. La mezcla homogeneizada se seca entonces mediante secado al vacío o por rociado.

Según la invención, el primer producto se utiliza como un material de partida para la preparación de productos que tengan una fracción estilbeno de por lo menos un 20% en peso y para la preparación de trihidroxiestilbenos y sus derivados glicosilados utilizando procedimientos de cromatografía líquida de fase inversa.

En la cromatografía líquida de fase inversa (RPLC), tal como se lleva a cabo en las formas de realización de la presente invención, el empaquetamiento columnar (fase estacionaria, o adsorbente) es no polar, con un momento bipolo, típicamente, de 3 o menor. El gel de sílice que se ha tratado para suministrarle una capa superficial unida, que es de naturaleza parafínica, constituye un ejemplo de una fase estacionaria para la cromatografía de fase inversa. Los geles de sílice que poseen grupos alquilo C_{8} a C_{18} unidos permanentemente están disponibles comercialmente como fase estacionaria. Las columnas de la cromatografía líquida de fase inversa se eluyen con eluyentes de polaridad decreciente, lo que provoca que eluyan en primer lugar los compuestos más polares que se cargaron en la columna.

Las fases estacionarias de la cromatografía líquida de fase inversa del material orgánico, también son conocidas. Los polímeros de los compuestos aromáticos vinílicos, el estireno por ejemplo, que muestran un acusado entrecruzamiento con los hidrocarburos aromáticos polivinílicos, por ejemplo, divinilbenceno, pueden utilizase como fases estacionarias para la cromatografía líquida de fase inversa. Estas fases estacionarias poliméricas orgánicas se obtienen mediante procedimientos que producen pequeñas partículas macroreticulares, extremadamente rígidas. Los polímeros acrílicos con un entrecruzamiento acusado son también útiles como fases estacionarias para la cromatografía líquida de fase inversa. Están disponibles comercialmente fases orgánicas estacionarias apropiadas. Por ejemplo, están disponibles a partir de Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA, y con la denominación registrada de Amberlite®, fases estacionarias acrílicas y estirénicas. También están disponibles con la denominación registrada de Amberchrom® de Tossohass, Montgomeryville, PA, fases estacionarias estireneicas. Las resinas poliamídicas (por ejemplo, nylons), las resinas poliester, y las resinas fenólicas también constituyen fases estacionarias útiles para los procedimientos de cromatografía de fase inversa de la presente invención.

Muchos disolventes orgánicos polares constituyen eluyentes apropiados para la cromatografía líquida de fase inversa. Los alcoholes inferiores, tales como metanol, etanol y propanol, así como nitrilos tal como acetonitrilo, se utilizan como eluyentes orgánicos. Las cetonas alifáticas inferiores, tal como la acetona,la metiletilcetona, y la dietil cetona, así como éteres cíclicos como el tetrahidrofurano, pueden también utilizarse. La dimetilformamida, el dimetilsulfóxido y los ésteres alquilos del ácido acético tal como el acetato de etilo, también pueden emplearse. Las mezclas de dichos disolventes en varias proporciones pueden utilizarse cuando se desee eluir o lavar la columna con disolventes de polaridad variable; desde una polaridad alta a una relativamente baja. Los solicitantes encontraron que mezclas de agua y de un alcohol, por ejemplo, metal, etanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, y n-y sec-hexanol, son particularmente útiles como fases móviles o eluyentes para separar y purificar compuestos de estilbeno, especialmente los que se obtuvieron a partir de material vegetal. Los procedimientos RPLC de la presente invención se llevan a cabo ventajosamente utilizando un eluyente de composición variable, lo que se denomina eluyente de gradiente. Los límites de la concentración de los eluyentes de gradiente se determinan por la concentración del disolvente orgánico polar necesario para eluir los productos a partir de la fase estacionaria, con la condición de que el disolvente orgánico polar pueda mezclarse para formar una fase única con la concentración requerida.

En ciertas formas de realización de la presente invención, la concentración alcohólica inicial muestra un porcentaje de volumen de 10 (10 vol-%) o menor y aumenta cuando tiene lugar la separación y la purificación.

Los sistemas de cromatografía líquida de fase inversa utilizados para poner en práctica la presente invención pueden ser preparatorios o analíticos. Las columnas preparatorias necesitan una capacidad de carga más grande y presentan típicamente un tamaño más voluminoso.

Las velocidades de flujo del eluyente se ajustan según las dimensiones de la columna, el grado de separación deseado, el tamaño de las partículas de la fase estacionaria, y la presión anterior en la columna. La separación se realiza típicamente entre 20ºC y 30ºC. Sin embargo, puede utilizarse una temperatura de hasta 45ºC. La separación puede llevarse a cabo con una presión alta (3,4-1,4 MPa (500-200 psi)) o con presiones moderadas (0,7 a 3,4 MPa (100-500 psi)) o, preferentemente, con presiones más bajas (70-700 kPa (10-100 psi)).

Respecto a las dimensiones de la columna de cromatografía líquida de fase inversa, la carga de la columna, la temperatura, y la velocidad del flujo, un experto en la materia sabrá variar estos parámetros que se basaron primariamente en consideraciones prácticas conocidas en la técnica.

El producto que va a ser tratado cromatográficamente se suministra generalmente como una solución o suspensión en un disolvente acuoso. Preferentemente, el disolvente acuoso es una mezcla de un alcohol y de agua que posee un porcentaje volumétrico de alcohol (vol-% alcohol) entre el 5 y el 20%, tal como se determinó mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, cromatografía gaseosa. La concentración del producto en la solución o suspensión que va a ser tratada cromatográficamente también es variada, según la forma de realización particular, pero está generalmente entre 0,1 y 10 g/l. Preferentemente, la concentración del producto que va a ser tratado es tal que la carga de la columna está entre 1 g/l y 12 g/l.

La columna de la cromatografía líquida de fase inversa puede prepararse eluyéndola con un volumen de acondicionamiento de un líquido de acondicionamiento, preferentemente un disolvente acuoso. El volumen de acondicionamiento está preferentemente entre 1 y 10 volúmenes de la columna.

El producto que va a ser tratado se carga en la fase estacionaria condicionada de la columna de la cromatografía de fase inversa mediante una solución, lechada, o un concentrado de carga obtenido evaporando un disolvente acuoso, preferentemente alcohol, a partir de una composición que contenga el producto. La carga de la columna se lleva a cabo eluyendo la solución, lechada, o concentrado de carga a su través. Preferentemente, la elución de la solución, la lechada, o el concentrado de carga es seguida por la elución con un volumen de elución de lavado que comprende un disolvente acuoso que tiene la misma composición que el disolvente acuoso de la solución, lechada, o concentrado de carga utilizados para cargar la fase estacionaria de la columna. El volumen de elución de lavado, cuando se utiliza uno, está preferentemente entre 1 y 10 volúmenes de columna.

En los procedimientos de la presente invención, se prepara un tercer producto a partir de un procedimiento

\hbox{MD-1}

de cromatografía líquida de fase inversa que tiene por lo menos un 20% en peso y más preferentemente, por lo menos, un 24% en peso de una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados. En una forma preferida de realización del procedimiento MD-1, el primer producto de la presente invención se mezcla con un disolvente acuoso, preferentemente una mezcla que incluye un porcentaje volumétrico de entre 3% y un 7% de alcohol, preferentemente metanol. El primer producto se carga en un soporte columnar MD-1 eluyendo la lechada a través de la columna MD-1, y puede seguirse por un volumen de elución de lavado que incluye un disolvente acuoso que es preferentemente una mezcla de alcohol y agua que presenta un porcentaje volumétrico entre 5% y 20% de alcohol, preferentemente metanol. Una composición que incluye el tercer producto puede eluirse a partir de la fase estacionaria de la columna MD-1 cargada con un primer volumen de elución MD-1 para producir un primer efluente MD-1. El primer volumen de elución de MD-1 incluye un disolvente acuoso, preferentemente una mezcla de alcohol y agua que presentan un porcentaje volumétrico de entre 70 y 80%, preferentemente de un volumen del 75%, de un alcohol, preferentemente metanol. El disolvente acuoso puede eliminarse a partir de la primera composición del efluente de MD-1 mediante cualquier procedimiento apropiado tal como se considera anteriormente, para obtener el tercer producto.

Una forma de realización de la presente invención proporciona un cuarto producto que presenta, por lo menos, alrededor del 30% en peso de una fracción de estilbeno que es una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono \beta-D glicosilados. El cuarto producto puede obtenerse mediante un primer procedimiento M-2 de cromatografía líquida de fase inversa.

El material de iniciación para un primer procedimiento MD-2 es un primer concentrado de carga MD-2 que tiene un tercer producto de la presente invención en un disolvente acuoso, preferentemente una mezcla de alcohol y agua que incluye un porcentaje volumétrico de alcohol no superior al 20%, preferentemente de metanol. El concentrado de carga MD-2 puede obtenerse eliminando suficiente disolvente acuoso a partir del primer efluente MD-1 que proviene del primer volumen de elución MD-1, de forma que el contenido en sólidos del primer concentrado de carga MD-2 es por lo menos de 10 g/l, preferentemente por lo menos de 13 g/l. El tercer producto se carga en una fase estacionaria de la columna MD-2 eluyendo el primer concentrado de carga MD-2 a través de la columna MD-2, que puede seguirse de un volumen de elución de lavado. La columna MD-2 se eluye entonces con un primer volumen de elución MD-2 para obtener un primer efluente MD-2. En una forma de realización, el primer volumen de elución MD-2 es una mezcla de un alcohol, preferentemente metanol, y agua, la cual mezcla presenta por lo menos un porcentaje volumétrico del 60% y preferentemente, por lo menos, de un 70% de alcohol, más preferentemente de un porcentaje del 75% de alcohol, por lo menos.

En otra forma de realización, en un segundo procedimiento MD-2, que incluye las etapas del primer procedimiento MD-2, la columna MD-2 es eluída con un primer volumen de elución MD-2 de un segundo procedimiento MD-2 que incluye por lo menos un primer volumen de gradiente y un segundo volumen de gradiente, constituyendo ambos mezclas de un alcohol, preferentemente metanol y agua, las cuales pueden dividirse en varios volúmenes subgradiente. En una forma de realización preferida, el primer volumen de gradiente incluye un porcentaje volumétrico de entre el 20 y el 40%, y por lo menos, preferentemente, de un porcentaje volumétrico de un alcohol del 30%, preferentemente metanol, incluyendo el segundo volumen de gradiente, preferentemente, entre el 70% y el 80%, y por lo menos, el 75% de un alcohol, preferentemente metanol.

En aquéllas formas de realización del segundo procedimiento MD-2 en las que el primer volumen de elución
MD-2 de un segundo procedimiento MD-2 posee un primer y segundo volúmenes de gradiente, el efluente que resulta de la elución del primer y segundo volúmenes de gradiente puede recuperarse fraccionadamente y segregarse en las primera y segunda fracciones del gradiente, respectivamente del segundo procedimiento MD-2 que son composiciones que contienen formas de realización específicas del cuarto producto.

Además, cualquier fracción de gradiente puede ella misma recuperarse fraccionadamente para obtener subfracciones de gradiente.

En formas de realización preferidas del segundo procedimiento MD-2 en el que el primer volumen de gradiente es una mezcla de alcohol y agua con un porcentaje volumétrico del 30% de metanol aproximadamente y el segundo volumen de gradiente es una mezcla de alcohol y agua con un porcentaje volumétrico del 70% de metanol aproximadamente, la primera fracción de gradiente es una composición que incluye un cuarto producto, que incluye por lo menos un 40% en peso de una fracción de estilbeno que incluye por lo menos un 90% de trihidroxiestilbenos mono-\beta-glicosilados, y la segunda fracción de gradiente es una composición que incluye también un cuarto producto, que incluye por lo menos un 30% en peso de una fracción de estilbeno que posee por lo menos un 80% de trihidroxiestilbenos, preferentemente 3,4',5-trihidroxiestilbenos.

Los productos de cuarto orden respectivos pueden obtenerse eliminando la mezcla alcohol-agua a partir de las respectivas fracciones de gradiente.

Otra forma de realización de la presente invención proporciona un tercer procedimiento MD-2 para obtener una composición que incluye una fracción de estilbeno que posee por lo menos el 80% aproximadamente, y preferentemente, por lo menos alrededor del 90% en peso de 3,4',5-trihidroxiestilbeno mono-\beta-D glicosilado. En un tercer procedimiento MD-2, se carga un tercer producto en una fase estacionaria de la columna MD-2 mediante un concentrado de carga MD-2. La columna MD-2 se eluye con un primer volumen de elución MD-2 de un tercer procedimiento MD-2. En una forma preferida de realización, el primer volumen de elución MD-2 de un tercer procedimiento
MD-2 es un volumen de elución de gradiente MD-2 que incluye una mezcla de alcohol y agua, cuya composición puede variarse lineal, exponencial, logarítmica o parabólicamente; poco a poco, o según cualquier combinación de las anteriormente mencionadas. El efluente MD-2 se recupera fraccionadamente para obtener un o más composiciones, cada una de las cuales contiene un producto de cuarto orden.

Otra forma de realización de la presente invención proporciona un quinto producto que contiene por lo menos un 60%, preferentemente por lo menos un 65% de una fracción de estilbeno que contiene por lo menos el 90% en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno mono-\beta-D-glicosilado. Este quinto producto de una forma de realización de la presente invención puede obtenerse en un primer procedimiento de cromatografía MD-3 de fase inversa. El material de partida para este primer procedimiento de cromatografía MD-3 de fase inversa es un concentrado de carga realizado eliminando suficiente disolvente acuoso de la primera fracción gradiente segregada del segundo procedimiento MD-2 o una fracción segregada del tercer proceso MD-2 que incluye una fracción de estilbeno que posee por lo menos el 50% de los 3,4'5-trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados, de forma que el concentrado de carga posee un contenido de sólidos de por lo menos 3 g/l. En formas de realización preferidas en las que el primer volumen gradiente del segundo volumen de elución MD-2 es una mezcla de alcohol y agua, el concentrado de carga, preferentemente, no tiene más del 5% de alcohol aproximadamente. El concentrado de carga se eluye a través de una columna MD-3 para cargar la fase estacionaria de ésta y, en formas de realización preferidas, es seguido a continuación por una elución de lavado que es un disolvente acuoso, preferentemente una mezcla de alcohol y agua con un porcentaje de 5% de volumen de alcohol, preferentemente metanol, correspondiendo el volumen de la elución de la carga a 0,5-10 volúmenes de la columna. La columna MD-3 se eluye entonces con un primer volumen de elución de MD-3 del primer procedimiento MD-3 para obtener un primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD-3, que se recupera fraccionadamente para obtener una primera fracción de un primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD-3, y una segunda fracción de un primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD3. En formas de realización preferidas, la primera fracción del primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD-3 asciende a 0,5-3, preferentemente a 1,5 aproximadamente volúmenes de columna, y la segunda fracción del primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD-3 asciende a 0,5-3 volúmenes de columna, preferentemente 1 volumen de columna. El producto de quinto orden que posee por lo menos un 60% de una fracción de estilbeno que comprende por lo menos un 90% de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno mono-\beta-D-glicosilado, puede obtenerse eliminando el disolvente acuoso de un primer efluente MD-3 recuperado fraccionadamente de un primer procedimiento MD-3.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento de cristalización mediante evaporación para obtener un producto de quinto orden que contiene por lo menos 85% aproximadamente y preferentemente alrededor por lo menos del 90% en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno-3-\beta-mono-D-glucósido. El punto inicial de un procedimiento de cristalización mediante evaporación es la recuperación fraccionada de un primer efluente
MD-3 de un primer procedimiento MD-3, recuperándose preferentemente una segunda fracción de un primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD-3 que se recupera fraccionadamente después de una primera fracción de un primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD-3 que asciende a 0,5-3 volúmenes de columna. La segunda fracción de un primer efluente MD-3 de un primer procedimiento MD-3 se evapora 0,1-0,2 su volumen original y se enfría, preferentemente a 4ºC o menos, para formar cristales que constituyen un quinto producto que contiene por lo menos un 85% de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno-3-\beta-mono-D-glucósido.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona un sexto producto que tiene por lo menos un 70% y preferentemente, por lo menos, un 75% de una fracción de estilbeno que incluye por lo menos un 70% aproximadamente en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno. El sexto producto puede prepararse mediante un segundo procedimiento MD-3. El material de partida para el segundo procedimiento MD-3 es la segunda fracción de gradiente del segundo procedimiento MD-2. El disolvente acuoso se elimina de la segunda fracción de gradiente MD-2 del segundo procedimiento MD-2 para formar un concentrado de carga con un contenido en sólidos de por lo menos 7 g/l. El concentrado de carga se eluye a través de una columna MD-3, y, en formas de realización preferidas, puede seguirse de un volumen de elución de lavado que incluya un disolvente acuoso, preferentemente una mezcla de alcohol y agua que incluye un porcentaje volumétrico de entre el 10% y el 20% de alcohol, preferentemente metanol. La columna
MD-3 es eluída entonces con un primer volumen de elución MD-3 de un segundo procedimiento MD-3 que tiene primero y segundo volúmenes de gradiente. El primer volumen gradiente del primer volumen de elución MD-3 del segundo procedimiento MD-3 es preferentemente un disolvente acuoso que es preferentemente una mezcla de alcohol y agua que posee un volumen de entre 35% y 45%, preferentemente un 40% de alcohol, preferentemente metanol, y eluye una primera fracción de gradiente MD-3 de un segundo procedimiento MD-3, siendo seguido por la elución con el segundo volumen de gradiente MD-3 de un primer volumen de elución MD-3 del segundo procedimiento MD-3 que incluye un disolvente acuoso, preferentemente una mezcla alcohol-agua que tiene un porcentaje de volumen de entre 50 y 60, aproximadamente 65% de un alcohol, preferentemente metanol, para eluir una segunda fracción de gradiente MD-3 del segundo procedimiento MD-3. El sexto producto de la presente invención puede obtenerse eliminando el disolvente acuoso a partir de la segunda fracción de gradiente MD-3 del segundo procedimiento MD-3.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona un sexto producto que incluye por lo menos un 85% aproximadamente, y preferentemente, por lo menos, alrededor del 90% del trans-resveratrol (3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno) que puede obtenerse mediante un proceso de extracción. En una forma de realización, el proceso de extracción incluye la eliminación del disolvente acuoso a partir de la segunda fracción del gradiente MD-3 de un segundo procedimiento MD-3, para alcanzar un contenido en sólidos de por lo menos 1,5 g/l, y poniendo en contacto dos veces el segundo volumen de gradiente MD-3, así concentrado, con uno o más volúmenes de extracción, cada uno preferentemente de 0,5 a 2 veces el del segundo volumen del gradiente MD-3 así concentrado, de un disolvente orgánico polar, preferentemente acetato de etilo. Los volúmenes de extracción se combinan y el disolvente orgánico polar se elimina para obtener el sexto producto que posee, por lo menos, el 85% en peso de trans-resveratrol.

Otra forma de realización, todavía, de la presente invención es un procedimiento de cristalización para obtener el producto sustancialmente decolorado, que comprende la eliminación del disolvente acuoso a partir del segundo volumen del gradiente MD-3 de un primer volumen de elución MD-3 de un segundo procedimiento MD-3, la disolución del sólido resultante en metanol a una temperatura superior a 10ºC, el enfriamiento a una temperatura menor de 0ºC, que forma los cristales del producto sustancialmente decolorado y la recuperación de estos cristales del producto sustancialmente decolorado mediante medios convencionales.

En otra forma de realización, la invención proporciona un procedimiento de cristalización dividido, para obtener un sexto producto que contiene por lo menos un 80% y preferentemente por lo menos un 85% de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno. El punto de partida para el procedimiento de cristalización dividido es un segunda fracción de gradiente MD-3 de un segundo procedimiento MD-3. La segunda fracción de gradiente MD-3 se concentra al vacío hasta 0,35 a 0,40 veces su volumen original y a una concentración de sólidos de por lo menos 1,5 g/l. La fracción de gradiente concentrada se pone en contacto con un disolvente orgánico polar, preferentemente acetato de etilo. Preferentemente, el volumen del disolvente orgánico polar utilizado está entre 0,75 y 0,85 veces el volumen de la segunda fracción de gradiente concentrada. En las formas de realización preferidas, la fracción del gradiente se pone en contacto de forma seriada con dos volúmenes separados del disolvente orgánico polar, combinándose los volúmenes. El disolvente orgánico polar, a partir de contactos únicos o múltiples, se evapora hasta sequedad para dar lugar a un sexto producto que tiene por lo menos un 80% de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno.

En los siguientes ejemplos, "% de alcohol" indica el porcentaje de volumen (vol-%) del alcohol en una mezcla alcohol-agua. El análisis de las fracciones de estilbeno se realizó utilizando HPLC en una serie de cromatógrafos HPLC 1100 de Hewlett Packard utilizando una columna ODS Hypersil.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra un procedimiento MD-1.

De las raíces de Huzhang (Polygonum cuspidatum), secas del suelo, se obtuvieron tres veces extractos mediante filtración con etanol al 75%. El extracto etanólico se concentró a presión reducida hasta conseguir un semisólido gomoso de color pardo (denominado Extracto original y abreviado NE). La temperatura durante la evaporación se mantuvo entre 35 y 40ºC y la presión entre 42 y 70 Pa (15-25 mm). 1,4 kg aproximadamente del NE (sólido húmedo, Lote No 7-1752) se disolvieron en 4,9 L MeOH a 45ºC y se agitaron durante 30 minutos. 44,1 L de H_{2}O se añadieron a la mezcla (para producir 10% MeOH). La mezcla resultante se cargó en una columna MD-1 de 4 pulgadas x 35 pulgadas, acondicionada con agua (que contenía resina de Amberlite®, XAD-16HP). La columna se eluyó con un volumen de elución de lavado (2 CV de MeOH al 10%), eluyéndose entonces con un primer volumen de elución de MD-1 (7,7 CV de MeOH al 75%) para obtener un primer efluente de MD-1. El primer efluente de MD-1 (el conjunto mejor de fracciones) a partir de la columna MD-1 se concentró desde 126,4 L (MeOH al 75%) hasta 35,5 L (MeOH al 19,5%) a 45ºC durante 1,5 horas al vacío en una destilación para formar un concentrado de carga de MD-2. Los análisis indicaron que la recuperación de los sólidos es cuantitativa y que la fracción de estilbeno del componente sólido del primer efluente de MD-1 llega al 24,2%.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra un segundo procedimiento MD-2.

El concentrado de carga MD-2 del Ejemplo 1 se cargó en una columna MD-2 de 4'' x 49'', acondicionada con MeOH al 10%, con una resina poliamídica como fase estacionaria. La columna se eluyó como gradiente con un primer volumen gradiente de un primer volumen de elución de MD-2 de un segundo procedimiento MD-2 (8 CV de MeOH al 35%) y un segundo volumen gradiente de un primer volumen de elución de MD-2 de un segundo procedimiento

\hbox{MD-2}

(6CV de MeOH al 75%). Las fracciones del primer y segundo gradiente de los volúmenes de gradiente de MeOH al 35% y de MeOH al 75% se recuperaron fraccionadamente.

Los componentes sólidos de la primera fracción del gradiente mostraron una fracción de estilbeno del 44,4%, de la cual el 60% consistió en trihidroxi-trans-estilbeno mono-\beta-D-glicosilado. El componente de los sólidos de la segunda fracción del gradiente mostraron una fracción de estilbeno del 35%, del cual el 86% eran trihidroxiestilbenos.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la eliminación del disolvente acuoso de una composición.

La mezcla alcohol-agua se eliminó a partir de la segunda gracción del gradiente del Ejemplo 2 utilizando un evaporador rotatorio (Büchi Rotavapor modelo R-187), seguido por el secado en una estufa al vacío. 2L aproximadamente de la segunda fracción del gradiente (conjunto del resveratrol BZ1-57-3, 75% MeOH, 35% del estilbeno total, 86% de sus trans-resveratrol y cis-resveratrol) se evaporaron rotatoriamente hasta 555 ml (10% MeOH aproximadamente) a 32ºC y hasta 480-760 kPa (70-110 psi) durante 7 horas. 30 ml aproximadamente de la solución resultante se transfirieron a un disco metálico y se secaron en una estufa al vacío a 42ºC, 7,4 kPa (30'' de agua) durante 15 horas. Se obtuvieron alrededor de 281,4 mg del cuarto producto (resveratrol) seco.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la obtención de un sexto producto de la presente invención mediante un segundo procedimiento MD-3.

20 L de una segunda fracción de gradiente MD-2 de un segundo procedimiento MD-2 (BZ1-57-3: 16,1% trans-resveratrol, 8,4 g; 13,9% cis-resveratrol, 7,2 g; 1,4% trans-piceído, 0,7 g; 3,6% cis-piceído, 1,8 g; estilbeno total, 18,2; 75% MeOH) se evaporaron rotatoriamente para formar un concentrado de carga MD-3 (6,28L, aprox 20% MeOH) que se eluyó a través de una columna MD-3 4'' x 52'' (20% MeOH) condicionada (C18 unida a gel de sílice) para cargar la fase estacionaria de la columna. La columna se eluyó como gradiente con 3,7 CV de un primer volumen de elución MD-3 de un segundo procedimiento MD-3 (40% MeOH), seguido por 1,5 CV de un segundo volumen de elución MD-3 de un segundo procedimiento MD-3 (55% MeOH) que dio lugar a 1,5 CV de un segundo efluente de MD3 de un segundo procedimiento MD-3. El mejor conjunto de trans-resveratrol se recuperó fraccionadamente como el primer 1,1 CV del segundo efluente de MD-3 de un segundo procedimiento MD-3, que contenía un sexto producto con una fracción de estilbeno que era trihidroxi-trans-estilbeno en un 74,7%. De este modo, se recuperaron el 86,2% de los trihidroxi-trans-estilbenos que se encuentran en el segundo volumen de gradiente del segundo procedimiento MD-2.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra un procedimiento de cristalización dividido para la purificación del trihidroxi-trans-estilbeno.

15 L aproximadamente del segundo efluente MD-3 anteriormente mencionado del segundo procedimiento

\hbox{MD-3}

del Ejemplo 4 (mejor conjunto de resveratrol BZ1-60-13 \sim17, 75% MeOH-agua, 9,723 g 74,7% trihidroxi-trans-estilbeno) se evaporaron rotatoriamente hasta un volumen de 5,7 L (aprox. 33% de MeOH). La solución se extrajo dos veces con 0,79 veces su volumen de acetato de etilo. Las capas de acetato de etilo de cada extracción se combinaron entonces y se evaporaron hasta sequedad. Se obtuvieron 7,8 g aproximadamente de sólidos secos que contenían 6,7 g de trihidroxi-trans-estilbeno al 82% (trans-resveratrol). Los sólidos cristalizaron en 40 ml de metanol a -10ºC. Se obtuvieron 5,8 g aproximadamente del cristal decolorado (pureza del 90%, 81,1% de recuperación). Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la obtención de un sexto producto mediante un primer procedimiento MD-3.

37 L aproximadamente (75 g de sólidos) de una primera subfracción del gradiente de una primera fracción del gradiente de un segundo procedimiento MD-2 (BZ1-57-1:34. 15% trans-resveratrol, 22 g; 0,49% cis-resveratrol, 0,31 g; 0,25% trans-piceído, 0,16 g; 4,54% cis-piceído, 2,9 g: 39,4% estilbeno total, 29,4; en 35% MeOH) se evaporaron rotatoriamente hasta 24,7 L (5% MeOH) y se cargaron en una columna MD-3, 40'' x 52'', acondicionada con H_{2}O
(C-18 unida a gel de sílice). La columna se eluyó con un primer volumen de elución MD-3 de un primer procedimiento MD-3 (3,6 CV de 30% MeOH). El primer efluente MD-3 resultante de un primer procedimiento MD-3 se recuperó fraccionadamente. El mejor conjunto de trans-piceído se recuperó fraccionadamente entre 1,68 CV y 2,20 CV (total de 0,52 CV) del primer efluente de MD-3 de un primer procedimiento MD-3. El contenido de trans-piceído en la fracción de estilbeno del componente sólido del mejor conjunto fue 66% y se recuperó el 94% del trans-piceído que se cargó en la columna MD-3.

Ejemplo 7

Este Ejemplo ilustra la cristalización de evaporación para aumentar la pureza del trans-piceído.

9 L aproximadamente del mejor conjunto anterior de las fracciones trans-piceído recuperadas fraccionadamente a partir del primer efluente MD-3 del primer procedimiento MD-3 del Ejemplo 7 (BZ1-64-6\sim8, 30% MeOH, 31,47 g de 65,7% trans-piceído) se concentraron (evaporación rotatoria) hasta 1,3 L, se enfriaron y se cristalizaron a 4ºC (73 ml de H_{2}O fría/g de cristal), y se filtraron con papel \neq 5 Whatman. El cristal en bruto de color melocotón se lavó con 100 ml de H_{2}O fría tres veces, para eliminar completamente el color. Este procedimiento dio lugar a 18 g de cristales trans-piceído decolorados de una pureza del 90%; con la recuperación del 80% del trans-piceído cargado en la columna MD-3.

Ejemplo 8

El Ejemplo siguiente ilustra la obtención del tercer producto mediante un procedimiento MD-1.

1,5 kg (peso húmedo, 0,95 kg de peso seco) de NE (Lote \neq 7-1752, 5,9% de trans-piceído, 0,96% cis-piceído, 2,1% de trans-resveratrol, 2,9% de cis-resveratrol, 11,9% de estilbeno total) se disolvieron en 3,5 L de SDA (95% EtOH) y se completó hasta 35 L con H_{2}O para obtener una solución de SDA al 10%. La solución se cargó en una columna MD-1 de 15 x 99 cm (resina poliestirénica de Amberlite®, XAD-16HP, 17,5 L por volumen de columna). Antes de utilizarla, la columna se acondicionó con 1 CV de SDA al 10% con 7,2 g de estilbeno/L resina. La columna se eluyó con un volumen de elución de lavado (1 CV de SDA al 10%) y se eluyó entonces con un primer volumen de elución de MD-1 (3 CV de SDA al 90%) hasta producir un primer efluente MD-1. El primer efluente de MD-1 se recuperó fraccionadamente (1/2 CV por fracción) y el posterior 2 1/2 CV (CK2-25-3\sim4) se reunieron y recuperaron como una composición que contenía el tercer producto. Los componentes sólidos del conjunto 21/2 que se combinó posteriormente y que se recuperó fraccionadamente, dieron lugar a una cantidad de 424, 2 g, con una fracción de estilbeno del 25,5%.

Ejemplo 9

El Ejemplo siguiente ilustra un primer procedimiento MD-2 para obtener un cuarto producto que tenga un 40% de una fracción de estilbeno.

44,4 L aproximadamente de SDA al 90% que contenía un tercer producto de un procedimiento MD-1 (319 g de sólidos, 27% de estilbeno total, 13% de trans-piceído, 2,3% de cis-piceído, 4,7% trans-resveratrol, 5,6% de cis-resveratrol), se evaporaron hasta 9,6 L de SDA al 35%, utilizando un Rotavapor Büchi R-187, para formar un primer concentrado de carga MD-2. Alrededor de 7 L del primer concentrado de carga de MD-2 se diluyeron hasta 9,8 L con H_{2}O, para llevar el contenido de SDA hasta un porcentaje de volumen del 25%. El concentrado de carga diluido se cargó en una columna MD-2 acondicionada con agua, de 10 x 117 cm (poliamida, 9,6 L/CV). La carga fue de 8.9 g de estilbeno/L de la fase estacionaria. La columna se eluyó con un volumen de elución de lavado (4 CV de SDA al 20%) y se eluyó con un primer volumen de elución de MD-2 de un primer procedimiento MD-2 (4 CV de SDA al 75%) para obtener un primer efluente MD-2.

La mezcla SDA-agua se eliminó a partir del primer efluente MD-2. Se obtuvieron 195 g del tercer producto sólido con una fracción de estilbeno del 40% (22% de trans-piceído, 2,4% de cis-piceído, 5,7% de trans-resveratrol, 9,4% de cis-resveratrol). Aproximadamente, el 90% de los estilbenos en el concentrado de carga, se recuperaron.

Ejemplo 10

2 g de NE (primer producto de Polygonum cuspidatum, lote \neq 7-1752, 5,9% de trans-piceído, 1% de cis-piceído, 2,1% trans-resveratrol, 2,9% de cis-resveratrol, 11,9% de estilbeno total) se mezclaron con 5 ml de ácido clorhídrico concentrado y 95 ml de DI-agua (5% de HCl). La solución se sometió a reflujo con agitación a 80ºC bajo nitrógeno durante 60 minutos, aislándose trans-resveratrol (0,13 g) de la solución. Así, el 81,3% de todos los trihidroxiestilbenos se convirtieron al trans-resveratrol (trans-3,4',5-trihidroxiestilbeno).

Ejemplo 11

El ejemplo siguiente ilustra la conversión de un estilbeno \beta-D-glicosilado en la aglicona. 200 mg de trans-piceído al 90% (3,4',5-trans-trihidroxiestilbeno-3-\beta-mono-D-glucósido, BZ1-69-1) se mezclaron con 5 ml de ácido clorhídrico concentrado y 95 ml de agua (5% HCl v/v) y se sometieron a reflujo con agitación a 100ºC durante 90 minutos, para dar lugar a 114 g (rendimiento del 57%) de trans-resveratrol (trans-3,4',5-trihidroxiestilbeno).

Ejemplo 12

El ejemplo siguiente describe un estudio in vivo que mostró que los niveles de síntesis de ADN en las células HL-60 se inhibieron el 87%, 89% y 79%, respectivamente, cuando las células se trataron con concentraciones de 80 \mug/ml de mezclas que contenían productos terciarios que presentaban el 30% de resveratrol, 40% de estilbeno, y el 40% de piceído, respectivamente. Los niveles de síntesis del ARN también fueron inhibidos por los compuestos anteriormente mencionados a concentraciones de 80 \mug/ml por el 93%, 91% y 81%, respectivamente. La cantidad de 3[H_{2}O] liberada como un producto de desecho del metabolismo de DMBA fue inhibida por porcentajes del 69%, 70% y 58% de los tres compuestos previamente mencionados respectivamente, también a una concentración de 80 \mug/ml. Los resultados de la prueba se dan en las Tablas a continuación.

TABLA 1 Efecto inhibitorio de un tercer producto (Resveratrol al 30%) sobre la síntesis del ADN en células HL-60

Composición que contiene producto	Incorporación en el ADN de timidina [^{3}H]	Porcentaje
terciario (Resveratrol al 30%) (\mug)	(cmp)	inhibición
0	32880 \pm 432	-
2,5	23166 \pm 3178	30
5,0	14575 \pm 1165	56
10,0	10856 \pm 1004	67
20,0	6307 \pm 828	81
40,0	5762 \pm 652	83
80,0	4328 \pm 337	87

El producto terciario utilizado en este experimento se obtuvo a partir de la segunda fracción del gradiente de un segundo procedimiento MD-2, según el método del Ejemplo 2. Células HL-60 (5 x 10^{5}) en 1 ml de medio RPMI se incubaron con varias concentraciones de resveratrol al 30% a 37ºC, en un incubador con una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 90 minutos. Se determinó la incorporación de la timidina [^{3}H] en el ADN.

TABLA 2 Efecto inhibitorio de un producto terciario (piceído al 40%) sobre la síntesis del ADN en las células HL-60

Composición que contiene producto	Incorporación en el ADN de timidina [^{3}H]	Porcentaje
terciario (piceído al 40%) (\mug)	(cmp)	inhibición
0	32880 \pm 432	-
2,5	22733 \pm 864	31
5,0	21266 \pm 206	35
10,0	19740 \pm 1234	40
20,0	16507 \pm 864	50
40,0	10704 \pm 1058	67
80,0	7194 \pm 746	87

El producto terciario utilizado en este ejemplo se obtuvo a partir de la primera fracción de un segundo procedimiento MD-2, según el método del Ejemplo 2. Células HL-60 (5 x 10^{5}) en 1 ml de medio RPMI se incubaron con varias concentraciones de resveratrol al 30%, a 37ºC, en un incubador con una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 90 minutos. Se determinó la incorporación de la timidina [^{3}H] en el ADN.

TABLA 3 Efecto inhibitorio de un producto terciario (estilbeno al 40%) sobre la síntesis del ADN en las células HL-60

Composición que contiene producto	Incorporación en el ADN de timidina [^{3}H]	Porcentaje
terciario (fracción estilbeno al 40%) (\mug)	(cmp)	inhibición
0	32880 \pm 432	-
2,5	18123 \pm 2037	45
5,0	15483 \pm 631	53
10,0	14410 \pm 144	56
20,0	7888 \pm 86	76
40,0	5388 \pm 360	84
80,0	3775 \pm 137	89

El producto terciario utilizado en este Ejemplo se obtuvo a partir del primer volumen de elución de un primer procedimiento MD-2. Células HL-60 (5 x 10^{5}) en 1 ml de medio RPMI se incubaron con varias concentraciones de 30% de resveratrol a 37% en un incubador con una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 90 minutos. Se determinó la incorporación de la timidina [^{3}H] en el ADN.

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra las propiedades antitumorales de un producto secundario.

TABLA 4 Efecto de un segundo producto (fracción de estilbeno al 8%) y de sulforfano sobre la carcinogénesis mamaria inducida por DMBA en las ratas

2

Se administró a ratas hembras Sprague -Dawley dieta AIN 76A ó dieta AIN 76A que contenía 1% de un segundo producto (aproximadamente 0,08% de resveratrol) 2 semanas antes de la administración oral de 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA), continuando hasta el final del experimento. Se administró oralmente el Sulforfano mediante sonda nasogástrica (50 mg/kg de peso corporal en 0,1 ml de aceite de maíz) a ratas una vez al día en los días 46, 47, 48, 49, 50 y 51 de su edad. El DMBA (8 mg/rata) en 1 ml de aceite de maíz, se intubó en ratas de 50 días de edad. Se detectaron tumores mamarios palpables cada semana después de la administración.

Ejemplo 14

El Ejemplo siguiente ilustra las propiedades antitumorales contra varias progenies de células tumorales humanas que mostraron varios productos, según los resultados del ensayo clínico in vitro de 6 progenies celulares.

Los ensayos se llevaron a cabo según el ensayo MTT (Véase, Mosmann, T., J.Immun. Meth, 65, 55 (1983).

Las células se sembraron en placas de fondo plano con 96 pocillos, placas provistas de tapaderas de escasa evaporación. Se sembraron tres progenies celulares por placa en un medio de 0,2 ml por pocillo. Cada progenie celular se sembró a la concentración óptima para su particular velocidad de crecimiento: H-29 y A-549, 5000 c/ml, MCF-7, 15000 c/pocillo, células KB y similares, 2500 c/ml, células P388 y similares, 15000 c/ml. Los productos se ensayaron a varias diluciones (por lo menos diez) para determinar la ED50.

TABLA 5 Resultados del ensayo clínico de 6 progenies celulares

3

Claims

1. Procedimiento para el aislamiento de un producto purificado que comprende por lo menos un 85% en peso del 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno a partir de un material vegetal que contiene trihidroxiestilbenos y sus derivados glicosilados, comprendiendo dicho procedimiento:

(f) eluir la columna MD-2 con un primer volumen de gradiente MD-2 que comprende una mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 20 y el 40%

(h) disponer un concentrado de carga del cuarto producto en una columna MD-3 con una fase estacionaria seleccionada del grupo formado por C-8 a C-18 y gel de sílice unido a ciano;

(k) cristalizar el producto purificado a partir del sexto producto.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el material vegetal es Vitis vinefera o Polygonum cuspidatum.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el disolvente acuoso de (a) es una mezcla alcohol-agua que comprende un porcentaje de volumen de SDA del 75%.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alcohol es metanol o etanol.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase estacionaria de la columna MD-1 de (c) es un copolímero de estireno y divinil benceno.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase estacionaria de la columna de MD-2 de (e) se selecciona a partir de poli(caprolactam) y poli(hexametilen adipamida).

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase estacionaria de la columna MD-3 de (h) es C-18 unida a gel de sílice.

8. Procedimiento para el aislamiento de un producto purificado que comprende por lo menos el 85% en peso de 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno mono-\beta-D-glicosilado a partir de un material vegetal que contiene trihidroxiestilbenos y sus derivados glicosilados, comprendiendo dicho procedimiento:

\newpage

(d) eluir una columna MD-1 con un volumen de elución que comprende un porcentaje de volumen alcohólico de entre el 70% y el 80% para aislar un tercer producto que incluye por lo menos el 20% en peso de una mezcla de trihidroxiestilbenos y trihidroxiestilbenos mono-\beta-D-glicosilados;

(f) eluir la columna MD-2 con un volumen que comprende una mezcla alcohol-agua que incluye un porcentaje de volumen alcohólico del 30% para aislar un cuarto producto que incluye por lo menos un 40% en peso de una fracción de estilbeno que comprende un 90% de trihidroxiestilbenos mono-\beta-D- glicosilados;

(i) cristalizar el producto purificado a partir del quinto producto.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el material vegetal es Vitis vinefera o Polygonum cuspidatum.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que el disolvente acuoso de (a) es una mezcla alcohol-agua que comprende un porcentaje de volumen de SDA del 75%.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el alcohol es metanol o etanol.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la fase estacionaria de la columna MD-1 de (c) es un copolímero de estireno y divinil benceno.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que la fase estacionaria de la columna MD-2 de (e) es seleccionada a partir de poli(caprolactam) y poli(hexametilen adipamida).

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que la fase estacionaria de la columna MD-3 de (g) es C-18 unida a gel de sílice.