ES2216006T3

ES2216006T3 - Disposicion de secuencias de acido nucleico y su uso.

Info

Publication number: ES2216006T3
Application number: ES95904500T
Authority: ES
Inventors: Thomas Cremer; Thomas Ried; Michael Speicher; Anna Jauch; Peter Lichter
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1993-12-27
Filing date: 1994-12-17
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2014-12-17
Also published as: US20030157537A1; CA2179605A1; EP1260594A2; US6197501B1; AU687493B2; EP1260594A3; EP0731849B1; DE4344726C2; EP0731849A1; AU1316095A; WO1995018235A1; US20010036633A1; DE4344726A1

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UNA ORDENACION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS Y SU UTILIZACION. EL OBJETO DE LA INVENCION ES FORMAR UNA ORDENACION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS DE TAL MANERA, QUE CON POCOS MEDIOS TECNICOS SE OBTENGA UNA ALTA RESOLUCION EN LA HIBRIDACION GENOMICA COMPARADA. CON TAL FIN, TODOS LOS COMPONENTES DE ESTA ORDENACION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS ESTAN SEPARADOS UNOS DE OTROS.

Description

Disposición de secuencias de ácido nucleico y su uso.

La invención se refiere a un procedimiento, así como al uso de una disposición, para la hibridación comparativa de ácido nucleico.

Con procesos de hibridación genómica comparativa in situ (comparative genomic hybridization, CGH) sobre preparados de cromosomas con cariotipo normal, actualmente pueden registrarse en un ADN genómico de prueba (por ejemplo ADN de un tumor, ADN genómico de un sujeto sometido a examen en el que se sospecha una aberración cromosómica) la ganancia y la pérdida de segmentos del genoma de aproximadamente 10 Mpb. En el caso de las amplificaciones, también pueden mapearse segmentos de ADN esencialmente más pequeños por medio de la CGH sobre preparados de cromosomas de referencia. Estos procesos se conocen a partir de Du Manoir, S., Speicher, M.R., Joos, S., Schröck, E., Popp, S., Döhner, H., Kovacs, G., Robert-Nicoud, M., Lichter, P., Crewer, T.: Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridazation. Hum. Genet. 90: 590-610, 1993, o Joos, S., Scherthan, H., Speicher, M.R., Schlegel, J., Cremer, T., Lichter, P.: Detection of amplified genomic sequences by reverse chromosome painting using genomic tumor DNA as probe. Hum. Genet. 90: 584-589, 1993. Como ADN genómico de referencia puede tomarse ADN obtenido, en caso de estar disponible, de células con un complemento cromosómico normal de la misma o también de otra persona.

El estado de desarrollo de la CGH alcanzado hoy en día tiene dos limitaciones esenciales. Por un lado, se desea un aumento adicional en el poder de resolución. Es de esperar que sean posibles los análisis de CGH de trisomías y monosomías parciales sobre cromosomas en prometafase, con un poder de resolución de aproximadamente \geq 3 Mpb. Esto corresponde al contenido medio de ADN de una banda cromosómica, en el caso de un bandeo cromosómico con un alto poder de resolución, con aproximadamente 1000 bandas por dotación cromosómica haploide. Sin embargo, para muchos usos sería deseable un ensayo de CGH con la que también pudieran registrarse de manera segura ganancias y pérdidas de genes individuales o incluso de segmentos de ADN intragénico. Posiblemente, si los análisis de CGH se realizan sobre estructuras de cromatina aún más descondensada pueden conseguirse mejoras adicionales del poder de resolución. Por otro lado, los ensayos de CGH sobre cromosomas mitóticos de referencia tienen la desventaja de que la identificación completamente automática de cromosomas según el bandeo con fluorescencia, por ejemplo con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol (tinción de ADN de doble cadena), y la medición de los perfiles de los cocientes de fluorescencia de CGH a lo largo de los cromosomas individuales, es costosa técnicamente y lleva mucho tiempo.

Ahora, es tarea de la invención proporcionar un procedimiento, así como el uso de una disposición de secuencias de ácido nucleico, con el que pueda conseguirse una automatización y una resolución esencialmente mayor, con un menor coste técnico.

Esta tarea se soluciona por medio de las características de la reivindicación 1 ó 13. Las reivindicaciones dependientes describen conformaciones ventajosas de la disposición.

Una mejora decisiva, tanto considerando el poder de resolución como también considerando una evaluación completamente automática, se consigue por medio de un ensayo de matriz de VNH (VNH = Vergleichende Nukleäure-Hybridisierung = hibridación comparativa de ácidos nucleicos), en la que, en lugar de cromosomas mitóticos, se aplican secuencias específicas de ácidos nucleicos (a continuación denominados ácidos nucleicos objeto, en el caso de ADN como ADN objeto, en el caso de ARN como ARN objeto) sobre un material de soporte adecuado (denominado a continuación matriz). Un ácido nucleico objeto puede estar compuesto por una o muchas secuencias diferentes de ADN o ARN. A este respecto, la complejidad de un ácido nucleico objeto se rige según el planteamiento del problema. El ensayo de matriz de VNH debe posibilitar un balance completamente automático de ganancia y pérdida de los desequilibrios genéticos en un ADN genómico de prueba, en el que el poder de resolución para los segmentos seleccionados del genoma, por ejemplo genes individuales, puede encontrarse en el intervalo de los kpb.

Los ácidos nucleicos objeto se inmovilizan sobre una matriz sólida, que, por ejemplo, está compuesta por papel de filtro o vidrio. El área de la matriz en la que se aplica un ácido nucleico objeto se denomina a continuación como Slot. A continuación tiene lugar la hibridación simultánea del ADN de prueba y el de referencia con el ácido nucleico objeto. Alternativamente a ello, la hibridación del ADN de prueba y de referencia con el ácido nucleico objeto también puede realizarse en disolución. A este respecto, para cada ácido nucleico objeto debe realizarse una hibridación separada. Entonces, la evaluación se realiza tras la unión de los productos de hibridación a una matriz sólida o directamente en disolución.

En contraposición con la disposición fuertemente variable de los cromosomas individuales en la extensión de metafase, tal como se utiliza en una hibridación genómica comparativa in situ, la posición de los segmentos de genoma que han de comprobarse en cuanto a ganancias y pérdidas en el ADN de prueba puede fijarse claramente sobre una matriz. Además, el tamaño y la forma de los cromosomas individuales muestran, de metafase a metafase, considerables variaciones, mientras que el tamaño y la geometría de los Slots individuales puede normalizarse. Estas posibilidades de normalización de la posición, el tamaño y la geometría de los Slots de ácidos nucleicos objeto facilitan decisivamente la evaluación completamente automática de una matriz, en comparación con la CGH sobre cromosomas en metafase. El tamaño y la separación de los Slots individuales pueden elegirse de manera que pueda realizarse fácilmente, con suficiente precisión, un manejo automático de una mesa con la matriz colocada sobre ella o, alternativamente, de un rayo de luz. En caso necesario, también pueden determinarse cocientes de fluorescencia dentro de un Slot en varias zonas separadas y determinar a partir de ello los valores medios.

A continuación, la invención se describe detalladamente mediante un ensayo de matriz de VNH para el análisis de desequilibrios de ADN genómico o ARN expresado en diferentes tejidos y tipos de células y mediante siete ejemplos.

Para la cuantificación comparativa de la expresión genética en diferentes tejidos y tipos de células, debe desarrollarse un ensayo basado en la hibridación comparativa de ARNm o ADNc marcado de diferentes maneras, de dos tejidos o tipos de células, sobre una matriz con los clones de ADNc correspondientes.

El principio del ensayo de matriz de VNH se basa en la hibridación comparativa de muestras de ácido nucleico de prueba y de referencia con muestras objeto, que se han aplicado sobre vidrio o un filtro, y en la determinación cuantitativa de los cocientes de fluorescencia para las muestras hibridadas. Los pasos de procedimiento individuales se presentan a continuación.

1. Selección de las muestras de ADN o ARN de prueba y de referencia

La selección de los ADN genómicos de prueba y de referencia se realiza según los mismos criterios que en el caso de los ensayos de CGH sobre cromosomas en metafase. Además de ADN del genoma completo, puede utilizarse también ADN genómico amplificado mediante DOP-PCR (Degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction; Reacción en cadena de la polimerasa usando como cebador oligonucleótidos degenerados). Esto se describe, por ejemplo, en Speicher, M.R., du Manoir, S., Schröck, E., Holtgreve-Grez, H., Schoell, B., Lengauer, C., Cremer, T., Ried, T.: Molecular cytogenetic analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded solid tumors by comparative genomic hybridization after universal DNA-amplification. Hum. Mol. Genet. 2: 907-1914, 1993. Como muestras de prueba y de referencia para los ensayos comparativos de la expresión genética pueden utilizarse preparados de ARNm o librerías de ADNc de células o tejidos seleccionados, pero también muestras individuales de ADNc y combinaciones de muestras de ADNc.

2. Selección del ADN objeto o ARN objeto

Como ácidos nucleicos objeto, que se aplican en la matriz en la manera descrita posteriormente, se consideran segmentos genómicos, clonados, de ADN de una especie (por ejemplo, el hombre), por ejemplo preparados a partir de ADN de clones de plásmidos, clones de cósmidos, clones de P1, clones de YAC, que comprenden segmentos de genoma desde pocas kpb hasta varias Mpb. En lugar de ácidos nucleicos purificados, también pueden aplicarse directamente sobre la matriz cromosomas o microorganismos seleccionados, que contengan los ácidos nucleicos correspondientes.

Debería conocerse el mapeo físico de la muestra utilizada. Para segmentos de genoma aún más grandes, por ejemplo determinadas bandas cromosómicas, brazos cromosómicos, cromosomas enteros, pueden combinarse mezclas del ADN de clones de ADN genómicos seleccionados o puede utilizarse ADN de librerías de clones, producidas a partir de cromosomas del hombre o de otras especies, seleccionados u obtenidos por microdisección. Para los ensayos comparativos, como ácidos nucleicos objeto de la expresión genética pueden utilizarse muestras de ADNc, combinaciones de muestras de ADNc o librerías de ADNc, así como fracciones de ARNm.

Preparación de la matriz para el ensayo de VNH

Los ácidos nucleicos necesarios para un ensayo de matriz de VNH deseado se aplican sobre un filtro en una disposición geométrica deseada por el experimentador, por ejemplo de manera que la secuencia de los ácidos nucleicos genómicos objeto sobre la matriz corresponda, desde arriba hacia abajo, a la secuencia de su mapeo físico sobre un cromosoma desde pter a qter. Por consiguiente, cada muestra está asignada a un Slot con una posición definida sobre el filtro. Como filtro pueden utilizarse filtros de papel habituales para la unión de ácidos nucleicos. En el caso de procesos de fluorescencia, los filtros deben seleccionarse de manera que sus propiedades, como por ejemplo la fluorescencia propia, no interfieran en la medición de las señales de fluorescencia. De esta manera, los Slots pueden disponerse uno junto al otro, en filas paralelas, para diferentes cromosomas, segmentos de cromosomas y genes. La selección de los ácidos nucleicos objeto depende del objetivo del diagnóstico y del poder de resolución necesario del ensayo de matriz de VNH. Una matriz de Slots puede contener ácidos nucleicos objeto para secuencias expresadas o segmentos genómicos de genes seleccionados, al igual que ADN objeto para segmentos de cromosomas, cromosomas individuales o también la dotación completa de cromosomas. Su cantidad puede variar, según el objetivo del diagnóstico, desde unos pocos hasta algunos cientos de ácidos nucleicos objeto. En cuanto a los ácidos nucleicos objeto, puede tratarse de muestras de cadena simple o de muestras de cadena doble. En el último caso, los ácidos nucleicos objeto deben transformarse a cadena simple, por medio de un paso adecuado de desnaturalización, antes del ensayo de VNH. Los ácidos nucleicos objeto deben unirse al filtro, por medio del tratamiento adecuado del filtro, de manera que no puedan desprenderse durante el proceso de VNH.

Para la preparación de la matriz para el ensayo de VNH sobre vidrio se requieren procedimientos que garanticen la unión del ADN objeto o el ARN objeto al vidrio. Para ello existen ya diferentes protocolos, como por ejemplo el revestimiento del portaobjetos con una película delgada de poliacrilamida y la inmovilización subsiguiente de las muestras que han de aplicarse según un procedimiento de Khrapko et al. (Khrapko, K.R., Lysov, Y.P., Khorliin, A.A., Ivanov, I.B., Yershov, G.M., Vasilenko, S.K., Florentiev, V.L., Mirzabekov, A.D.: A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. DNA-Sequence-J, DNA-Sequencing and Mapping 1: 375-388, 1991). Otra posibilidad consiste en la adición de sustancias de soporte a los ácidos nucleicos objeto, como por ejemplo proteínas, que conducen a lo sumo a señales de fondo leves o diferenciables, la aplicación de la mezcla sobre la matriz y la fijación subsiguiente, como por ejemplo con metanol/ácido acético glacial o formaldehído. La selección y disposición de las muestras sobre la matriz de vidrio se realiza como se ha descrito anteriormente. En lugar de vidrio también pueden considerarse otros materiales duros. Parecen especialmente adecuadas las microplacas con cavidades previamente formadas.

Como alternativa a la preparación de una matriz para VNH sobre vidrio o sobre filtro, la hibridación puede realizarse también en disolución, para cada ácido nucleico objeto por separado. En este método debe dársele especial importancia a la separación cuantitativa de las moléculas de muestra no hibridadas.

Esto puede realizarse con métodos convencionales, como por ejemplo filtración en gel, electroforesis en gel, cromatografía o por degradación enzimática. Las intensidades de señal de los ADN de prueba y de referencia no se miden hasta después de esta separación. Esta medición puede realizarse tanto después de la unión de los productos de hibridación a una matriz sólida o, para cada ácido nucleico objeto por separado, en disolución. La medición tras la unión a una matriz sólida se realiza como se explica posteriormente, la medición en disolución puede realizarse estacionaria para cada mezcla básica de reacción o en forma automática, por ejemplo en el espectrofotómetro de flujo. En lo anterior, las señales de los ácido nucleicos de prueba y de referencia pueden medirse de manera correspondiente a la característica de las señales. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de prueba y de referencia pueden marcarse a través de diferentes fluorocromos. Entonces, ambos pueden estimularse y medirse por separado, en la fluorometría según el estado de la técnica, y estimularse simultáneamente y medirse por separado, en la citometría de flujo según el estado de la técnica.

El marcaje de las muestras de ácidos nucleicos con haptenos (por ejemplo biotina o digoxigenina) o directamente con un fluorocromo, se realiza mediante procedimientos estándar de genética molecular (por ejemplo nick translation, random priming), tal como se describe en Lichter, P., Cremer, T.: Chromosome analysis by non-isotopic in situ hybridization, en: Human cytogenetics: A practical approach; editado por: Rooney, D.E., Czepulkowski, B.H., IRL Press, Oxford: 157-192, 1992, y Raap, A.K., Wiegant, J., Lichter, P.: Multiple Fluorescence in situ hybridization for molecular cytogenetics, en: Techniques and Methods in Molecular Biology: Non-radioactive labeling and detection of biomolecules; editado por: Kessler, C., Editorial Springer, Berlín, Heidelberg, Nueva York: 343-354, 1992.

La realización de la hibridación comparativa de ácidos nucleicos tiene lugar como se describe en Du Manoir, S., Speicher, M.R., Joos, S., Schröck, E., Popp, S., Döhner, H., Kovacs, G., Robert-Nicoud, M., Lichter, P., Cremer, T.: Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization. Hum. Genet. 90: 592-593, 1993, o Speicher, M.R., du Manoir, S., Schröck, E., Holtgreve-Grez, E., Schoell, B., Lengauer, C., Cremer, T., Ried, T.: Molecular cytogenetic analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded solid tumors by comparative genomic hybridization after universal DNA-amplification. Hum. Mol. Genet. 2: 1913-1914, 1993. La hibridación de muestras de ARN se realiza de manera análoga y considerando las medidas precautorias habituales en la hibridación de ARN.

La detección de las secuencias hibridadas de la muestra se realiza a través de moléculas que producen señales que pueden registrarse cuantitativamente, que se diferencian lo suficiente de las señales "de fondo" sobre la matriz. Para ello se prefieren actualmente las propiedades de fluorescencia. En el caso de los ácidos nucleicos marcados con fluorocromos, la detección se lleva a cabo directamente tras la realización de los pasos habituales de lavado. En el caso de las muestras de ácidos nucleicos marcados con haptenos, la realización de las reacciones de detección por fluorescencia tiene lugar según procesos estándar como se describe, por ejemplo, Lichter, P., Cremer, T.: Chromosome analysis by non-isotopic in situ hybridization, en: Human cytogenetics: A practical approach; editado por: Rooney, D.E., Czepulkowski, B.H., IRL Press, Oxford: 157-192, 1992. Para la detección directa o indirecta de ácidos nucleicos, además de la fluorescencia también pueden utilizarse otros procesos de detección que produzcan señales que puedan cuantificarse bien, como por ejemplo la quimioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad. También pueden combinarse en un experimento diferentes tipos de detección para los ácidos nucleicos de prueba y de referencia.

A continuación del procedimiento de VNH se determinan cuantitativamente las señales de fluorescencia para cada Slot de la matriz (por ejemplo con una cámara CCD) y, a partir de ello, se calcula con un microprocesador el cociente de fluorescencia (ácido nucleico de prueba)/(ácido nucleico de referencia). La determinación de los cocientes de fluorescencia se realiza como se describe en du Manoir et al. (1993) (páginas 592-593) o Speicher et al. (1993) (páginas 1913-1914), con la diferencia de que las mediciones con ayuda de máscaras no se realizan en los cromosomas individuales sino dentro de los Slots individuales de ácido nucleico objeto. En los experimentos de control de VNH con ADN genómico de células con cariotipo normal, marcado de diferentes maneras, o muestras de ADNc o ARN idéntico, marcado de diferentes maneras, se determinan las fluctuaciones de estos cocientes, que normalmente también son de esperar, a un nivel de confianza indicado. En el caso de probandos con una duplicación genómica o delección de un cromosoma, de un segmento de cromosoma de o un gen, registrable por medio del ensayo, es de esperar un aumento o disminución sistemáticos de los cocientes, en los Slots que contienen los ácidos nucleicos objeto correspondientes. Por el contrario, los cocientes de fluorescencia para los restantes Slots deberían encontrarse en el intervalo de control.

Debido a que la señal de hibridación que procede del genoma de prueba en cada Slot se compara con la señal de hibridación que procede del ADN normal de referencia, el ensayo de matriz de VNH debería ser insensible frente a las variaciones de la cantidad de ácido nucleico objeto en los Slots individuales durante la producción de la matriz. Las variaciones en la proporción de mezcla de ADN del tumor y ADN de referencia, que se dan entre los diferentes experimentos, tienen un efecto en igual sentido sobre todos los cocientes y pueden normalizarse fácilmente.

Un aspecto importante concierne a la selección del equipo adecuado para el registro cuantitativo de las señales de hibridación. Generalmente, los instrumentos de detección deben ser aptos para medir diferencias lineares de las intensidades de señal en un amplio margen. Actualmente, para detectar señales de fluorescencia se consideran diferentes configuraciones de instrumentos, como por ejemplo microscopios de fluorescencia, equipados con una cámara CCD (charged coupled device) (enfriada); o dispositivos de barrido de fluorescencia, en los que se realiza una operación de barrido por medio de un rayo láser controlado electrónicamente y la detección con un fotomultiplicador sensible. En la espectrofotometría de flujo, la estimulación también se realiza a través de una lámpara o de un láser y la detección a través de un fotomultiplicador.

Según el tipo de señales de detección (véase lo expuesto anteriormente) también son apropiados otros procedimientos como, por ejemplo, la densitometría (véase por ejemplo la resonancia magnética de fósforo).

Todos los datos medidos deben registrarse y grabarse en forma digital. Las relaciones de intensidad de señal de los ácidos nucleicos de prueba y de referencia se calculan entonces con ayuda del software adecuado.

Ejemplos de aplicación

Aplicaciones importantes se encuentran en el campo de la genética clínica, el diagnóstico de tumores, la patología clínica, el análisis de modelos animales para enfermedades genéticas, incluso tumores, así como de la investigación de cultivos.

La selección de ácidos nucleicos objeto para la matriz se realiza según los requisitos del diagnóstico. Si se conocen los posibles desequilibrios cromosómicos para un determinado planteamiento diagnóstico, entonces puede producirse una matriz con ácidos nucleicos objeto, que se seleccionan de manera selectiva para detectar o descartar estos desequilibrios específicos (véase en el ejemplo 3). Sin embargo, para otro planteamiento es deseable realizar un análisis lo más detallado posible del genoma en cuanto a desequilibrios desconocidos. Por ejemplo, esto se realiza mediante la desintegración del genoma completo en una serie de ácidos nucleicos. En lo anterior, el poder de resolución y la sensibilidad de un ensayo de VNH de este tipo están determinados por la cantidad y la distribución genómica de los ácidos nucleicos objeto (véase en el ejemplo 2). Por ejemplo, para conseguir un poder de resolución de un análisis de bandeo citogenético con 400 u 800 bandas cromosómicas por dotación cromosómica haploide, cada banda debería estar representada por un ácido nucleico objeto adecuado sobre la matriz, denominada a continuación "matriz de 400 u 800 bandas" (véase el ejemplo 2). Con esta matriz podrían determinarse ganancias y pérdidas de regiones cromosómicas al nivel de resolución así prefijado, que corresponde al poder de resolución de CGH sobre cromosomas en metafase que se consigue hoy en día.

En caso de necesidad, puede realizarse una verificación secuencial de diferentes matrices con diferentes poderes de resolución. Por ejemplo, si se descubre la ganancia o pérdida de un segmento cromosómico determinado sobre cromosomas normales o sobre una matriz de 400 bandas, en un segundo paso puede utilizarse una matriz, con cuya ayuda se limitan más exactamente los puntos de rotura de la región desequilibrada. Para esta matriz se utilizan ácidos nucleicos objeto que caracterizan las subregiones definidas del segmento cromosómico identificado anteriormente (ejemplo 3).

Ejemplo 1

Detección de aberraciones cromosómicas numéricas. Para ello se necesitan 24 ADN objeto, que representan los 24 diferentes cromosomas humanos. Estos se combinan según los requisitos del diagnóstico (véase lo expuesto posteriormente). Como ADN objeto se consideran: ADN de cromosomas humanos clasificados; ADN de células híbridas somáticas, que contienen respectivamente un cromosoma humano (células híbridas monocromosómicas); productos de amplificación de ADN de cromosomas humanos clasificados o células híbridas monocromosómicas; reservas de fragmentos clonados, específicos en cuanto a los cromosomas, como por ejemplo YAC, clones P1, cósmidos, o, de manera correspondiente, contigs de estas muestras. En lugar de ADN, también podrían aplicarse directamente cromosomas o microorganismos clasificados, que contienen los ácidos nucleicos correspondientes, sobre la matriz (véase lo expuesto anteriormente).

Aplicaciones posibles

a) Detección prenatal de alteraciones numéricas en células embrionales. Las alteraciones numéricas más importantes afectan a los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. En este caso, la matriz contiene, de manera correspondiente, los ADN objeto de los 5 cromosomas mencionados. Si debe descartarse una detección en los cromosomas sexuales debido a consideraciones éticas y legales, entonces se aplicarían únicamente los ADN objeto de los cromosomas 13, 18, 21.

b) Detección de hiperploidia en pacientes con leucemia linfática aguda, dado que las hiperploidias con n>50 tienen un pronóstico clínico favorable. En este caso resulta práctico aplicar ADN objeto para los 24 cromosomas humanos.

c) Detección de tumores, en los que las aberraciones numéricas desempeñan una función importante, como por ejemplo carcinoma celular cromófobo de los riñones, carcinoma de la vejiga. También aquí pueden utilizarse matrices que contienen ADN objeto de los 24 cromosomas (esto resulta práctico en el caso del carcinoma de vejiga) o ADN objeto de las aberraciones de consideración en las entidades de los tumores individuales (por ejemplo carcinoma celular cromófobo de los riñones).

Ejemplo 2

Detección universal de desequilibrios cromosómicos parciales, desconocidos. Para ello se necesita ADN objeto, que represente diferentes segmentos de los cromosomas humanos. De esta manera pueden utilizarse, de forma análoga a los métodos actuales de biología molecular para el análisis de pérdidas genómicas ("loss of heterozygosity, LOH"), matrices con 42 ADN objeto, para representar todos los brazos cromosómicos de consideración: 1p, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 4p, 4q, 5p, 5q, 6p, 6q, 7p, 7q, 8p, 8q, 9p, 9q, 10p, 10q, 11p, 11q, 12p, 12q, 13q, 14q, 15q, 16p, 16q, 17p, 17q, 18p, 18q, 19p, 19q, 20p, 20q, 21q, 22q, Yq.

En el caso necesitarse una mayor resolución pueden utilizarse matrices más complejas, como las "matrices de 400 u 800 bandas" descritas anteriormente.

Aplicaciones posibles

a) Revisión de pacientes, en los que se sospecha una aberración cromosómica estructural desconocida.

b) Detección de desequilibrios cromosómicos desconocidos en cualquier tumor. Ante todo, este planteamiento tiene importancia en la investigación biológica de tumores, dado que aún no se han identificado los desequilibrios genómicos de consideración en cuanto al diagnóstico y el pronóstico de muchos tumores.

Ejemplo 3

Detección de alta resolución de desequilibrios genómicos en determinados segmentos cromosómicos. En este caso se elaboran matrices que tienen ADN objeto únicamente para segmentos cromosómicos seleccionados y consideran un planteamiento diagnóstico específico.

Aplicaciones posibles

a) En el caso del asesoramiento genético a familias con translocaciones recíprocas es importante saber si en la zona de los puntos cromosómicos de rotura se produjeron desequilibrios genéticos. Para un análisis de este tipo puede prepararse una matriz de alta resolución con ADN objeto, mapeado en las regiones dudosas de puntos de rotura.

b) En el caso de un diagnóstico de portador de enfermedades recesivas del cromosoma X, como la distrofia muscular de Duchenne, puede prepararse una matriz, que contiene ADN objeto para segmentos del gen correspondiente.

Ejemplo 4

Detección de desequilibrios genómicos en genomas de consideración para los tumores. Para ello se necesita ADN objeto, que represente los protooncogenes, genes de supresión tumoral u otros genes de un tumor, de consideración en cuanto a crecimiento y metastatización.

Aplicaciones posibles

a) Detección de la amplificación de oncogenes de consideración para el pronóstico, por ejemplo amplificación de N-myc en el caso del neuroblastoma.

b) Detección de la delección de genes de supresión tumoral de consideración para el diagnóstico, por ejemplo la delección en lp36 en el caso del neuroblastoma.

Ejemplo 5

Detección de sobre o subexpresión de determinados genes. Para ellos se necesitan ácidos nucleicos objeto que contengan secuencias que codifiquen los genes seleccionados. Para ello, también se consideran, además de las matrices descritas en el ejemplo 4, matrices con ARN o ADN de los genes. Como ácido nucleico de prueba se aísla ARN completo de una población celular que ha de someterse a prueba; como ácido nucleico de referencia sirve el ARN completo de una población celular de control adecuada, con expresión normal de los genes de consideración.

Aplicación posible

En el caso de una amplificación genómica de N-myc (véase el ejemplo 4a), con este ensayo puede llevarse a cabo un registro cuantitativo de la sobreexpresión real.

Ejemplo 6

Los ejemplos descritos anteriormente para enfermedades humanas pueden ampliarse de manera análoga para modelos animales de estas enfermedades. Una condición para ello es la preparación de matrices, cuyos ácidos nucleicos objeto provengan de las especias correspondientes o presenten una conservación evolutiva suficiente para el objetivo de un ensayo de VNH.

Aplicación posible

En el caso de muchos modelos animales para tumores específicos, en principio no se conoce si el mecanismo genético en que se basa coincide con el tumor que aparece en el humano. En este caso, en una verificación de los genes de consideración en cuanto a tumores (véase el ejemplo 4) o en el análisis de expresión (véase el ejemplo 5), puede esperarse una conformidad de los resultados del ensayo de VNH en el tumor humano y en el animal.

Ejemplo 7

En el caso de la producción de organismos transgénicos, pueden desarrollarse ensayos de VNH con matrices que contienen ácidos nucleicos de los genes a transferir. Con estos ensayos pueden determinarse cuantitativamente los números de copias de los genes transferidos y la expresión en el organismo receptor.

Aplicaciones posibles

a) Análisis de animales transgénicos, con genes de consideración en cuanto a tumores, mutados de forma correspondiente.

b) Reproducción de animales y plantas con propiedades modificadas.

Claims

1. Procedimiento para detectar el número relativo de copias de secuencias de ácido nucleico en células de prueba, mediante la hibridación comparativa de ácido nucleico de una mezcla de ácidos nucleicos marcados de prueba, con una mezcla de diferentes ácidos nucleicos marcados de células de referencia (ácidos nucleicos de referencia), con ácidos nucleicos objeto, de manera que pueda medirse, por separado, con ayuda de los marcajes, el número relativo de copias de los ácidos nucleicos individuales dentro de los ácidos nucleicos de prueba, en comparación con los ácidos nucleicos de referencia, disponiéndose los ácidos nucleicos objeto por separado sobre un soporte de un material adecuado, de una manera prefijada claramente, caracterizado porque los ácidos nucleicos objeto se aplican sobre áreas predeterminadas sobre el soporte.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico objeto está compuesto por una o varias secuencias de ADN o ARN diferentes.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque como ácido nucleico objeto se utilizan cromosomas clasificados o segmentos de cromosomas obtenidos por microdisección o segmentos genómicos clonados de ADN de una especie o librerías de ADN de cromosomas o segmentos de cromosomas o combinaciones de muestras de ADNc o librerías de ADNc o fracciones de ARNm, solos o en combinaciones adecuadas.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque como soporte para los ácidos nucleicos objetos se utiliza vidrio o material de filtro o geles o plástico o microplacas con cavidades previamente formadas.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las áreas para los cromosomas, segmentos de cromosomas y genes están dispuestas unas junto a otras en filas paralelas.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los ácidos nucleicos de prueba y de referencia están marcados con moléculas que producen señales que pueden registrarse cuantitativamente, que se diferencian lo suficiente de las señales de fondo sobre la matriz.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula es un fluorocromo.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque se determinan cuantitativamente los cocientes de fluorescencia de los fluorocromos.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el cociente de fluorescencia se determina dentro de un área en varias zonas separadas y, a partir de ello, se determina el valor medio.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la detección de señales de fluorescencia se realiza con un microscopio de fluorescencia, que está equipado con una cámara CCD.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la detección de señales de fluorescencia se realiza con un dispositivo de barrido de fluorescencia, en el que se realiza una operación de barrido por medio de un rayo láser controlado electrónicamente y la detección con un fotomultiplicador sensible.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los ácidos nucleicos de prueba y de referencia se seleccionan de ADN del genoma completo, ADN genómico amplificado mediante DOP-PCR, preparados de ARNm o librerías de ADNc de células seleccionadas o tejido, muestras de ADNc y combinaciones de muestras de ADNc.

13. Uso de una disposición de secuencias de ácido nucleico objeto sobre un soporte, estando aplicadas las secuencias de ácido nucleico objeto en áreas predeterminadas sobre el soporte, para la hibridación comparativa de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque como soporte para los ácidos nucleicos objeto se utiliza vidrio o material de filtro o geles o plástico o microplacas con cavidades previamente formadas.

15. Uso según las reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque como ácidos nucleicos objeto se utilizan cromosomas clasificados o segmentos de cromosomas obtenidos por microdisección o segmentos genómicos clonados de ADN de una especie o librerías de ADN de cromosomas o segmentos de cromosomas o combinaciones de muestras de ADNc o librerías de ADNc o fracciones de ARNm, solos o en combinaciones adecuadas.

16. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque los ácidos nucleicos objeto están inmovilizados sobre un portaobjetos revestido con una película delgada de poliacrilamida.

17. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque como ácidos nucleicos objeto se utilizan ácidos nucleicos genómicos objeto, que se aplican sobre el soporte de manera que la secuencia de los ácidos nucleicos genómicos objeto sobre el soporte corresponda desde arriba hacia abajo a la secuencia de su mapeo físico sobre un cromosoma desde pter a qter.

18. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque las áreas para los cromosomas, segmentos de cromosomas y genes están dispuestas unas junto a otras en filas paralelas.

19. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el soporte contiene 24 ácidos nucleicos objeto, que representan los 24 cromosomas humanos diferentes.

20. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el soporte contiene los cromosomas 13, 18, 21, X e Y como ácidos nucleicos objeto.

21. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el soporte contiene 42 ácidos nucleicos objeto, que representan los brazos cromosómicos de consideración: 1p, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 4p, 4q, 5p, 5q, 6p, 6q, 7p, 7q, 8p, 8q, 9p, 9q, 10p, 10q, 11p, 11q, 12p, 12q, 13q, 14q, 15q, 16p, 16q, 17p, 17q, 18p, 18q, 19p, 19q, 20p, 20q, 21q, 22q, Yq.

22. Uso según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque para conseguir el poder de resolución de un análisis de bandeo citogenético con 400 u 800 bandas cromosómicas por dotación cromosómica haploide, cada banda está representada por un ácido nucleico objeto adecuado sobre el soporte.