ES2216154T3

ES2216154T3 - Procedimiento y equipos para la deteccion de la endotoxina.

Info

Publication number: ES2216154T3
Application number: ES97926695T
Authority: ES
Inventors: Constance F. Neely
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-27
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2017-05-27
Also published as: AU3140497A; JPH11510904A; WO1997044665A1; DE69728665T2; EP0906574A1; EP0906574B1; CA2253236A1; EP0906574A4; JP3197280B2; US6908742B2; ATE264508T1; US20020182641A1; CA2253236C; DE69728665D1; US5773306A

Abstract

SE PRESENTAN METODOS PARA DETERMINAR LOS NIVELES DE ENDOTOXINAS EN UNA MUESTRA. ESTOS METODOS SON UTILES EN EL DIAGNOSTICO DE LA SEPTICEMIA. TAMBIEN SE PRESENTAN EQUIPOS PARA LA DETECCION DE ENDOTOXINAS.

Description

Procedimientos y equipos para la detección de la endotoxina.

Antecedentes de la invencion

La septicemia es la decimotercera causa que conduce a la muerte en el hombre, que causa hasta 100.000 muertes y de 5 a 10 billones de dólares de gastos sanitarios anualmente sólo en los Estados Unidos (Increase in National Hospital Discharge Survey rates for septicemia-United States, 1979-1987 MMWR 1990, 39:31-34; Skelter et al. Arch. Microbiol. 1995, 164:383-389). Es la causa más habitual de muerte en las unidades de cuidados intensivos médico-quirúrgicos, y se asocia con una tasa de mortalidad del 40 al 90%.

La septicemia está causada por la liberación de la endotoxina, a la que también se hace referencia en la presente memoria como lipopolisacárido (LPS), a partir de la membrana externa de las bacterias cuando éstas se multiplican, mueren, o se lisan (Rietschel et al. FASEB J. 1994, 8:217-225). Después de su liberación, esta toxina produce una cascada de eventos complejos que dan lugar finalmente al fallo orgánico, shock irreversible y muerte. Mediante la unión a las proteínas de la membrana celular o a receptores específicos de ésta, el LPS actúa sobre diversos tipos celulares distintos, que incluyen células endoteliales, neutrófilos, monocitos y macrófagos para inducir la liberación de distintos mediadores, incluyendo radicales libres de oxígeno, óxido nítrico, metabolitos del ácido araquidónico, tromboxano, prostaciclina, y factor activador de las plaquetas, quimioatractores, interleucina (IL)-8 y leucotrieno B4, citoquinas, IL-1, factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha), y proteasas que son importantes en la patofisiología del daño de los órganos y del choque séptico inducidos por la endotoxina (Akarasereenont et al. Eur. J. Pharmacol. 1995, 273:121-128; Brigham et al. Am. Rev. Respir. Dis. 1986, 133:913-927; Morrison Ann. Rev. Med. 1987, 38:417-432; Williams et al. Surgery 1992, 112:270-277; Wright Current Opinion in Immunol. 1991, 83-91).

A pesar del predominio y gravedad de esta enfermedad, todavía resulta difícil efectuar un diagnóstico rápido en una etapa temprana. El diagnóstico de septicemia se basa actualmente en síntomas y signos clínicos, que incluyen hipotensión clínicamente significativa (presión sanguínea sistólica \leq 90 mmg Hg) con presencia que se sospecha de infección, fiebre o hipotermia, taquicardia, taquipnea, acidosis láctica, contaje sanguíneo leucocitario > de 12.000 o < de 4.000, con o sin cultivos sanguíneos positivos. Sin embargo, cuando dichos síntomas y signos clínicos se manifiestan, ya puede haber tenido lugar el daño tisular y orgánico irreversible. Además, los resultados de los cultivos sanguíneos necesitan por lo menos 24 horas y no siempre proporcionan un diagnóstico definitivo, ya que sólo el 35% de los pacientes con septicemia muestran cultivos sanguíneos positivos.

Las únicas pruebas que están disponibles habitualmente para la detección de endotoxina en los líquidos biológicos, o en soluciones y productos industriales o farmacológicos se basan en la disponibilidad de los lisados de amebocitos que se aíslan a partir de la hemolinfa de Limulus y Tachypleus (raros cangrejos en forma de herradura). El ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) se basa en la capacidad de la endotoxina para coagularse con el lisado amebocítico. Se cree que estos amebocitos tienen un sistema de coagulación que constituye un prototipo de la coagulación de la sangre de los mamíferos que implica la activación secuencial de proenzimas (Zhang et al. J. Clin. Microbiol 1994 32:416-422). La endotoxina activa el enzima inicial (factor C) del sistema de coagulación LAL que lleva a la conversión de coagulógeno, una proteína capaz de coagularse, a coagulina y el péptido C. La formación visible de un coágulo de gel indica la activación de la endotoxina de LAL y sirve como base para el procedimiento de coagulación-gel para la detección de la endotoxina. Sin embargo, este procedimiento particular no es cuantitativo. Con objeto de hacer que este ensayo sea cuantitativo, se desarrolló un ensayo cinético turbidimétrico que utiliza un toxinómetro (Kambayashi et al., J. Biochem. Biophys. Methods 1991, 22: 93-100). Además, se desarrolló un substrato cromogénico para el enzima de coagulación (Thomas et al. Clinica Chimica Acta. 1981, 116:63-68). La adición de este substrato cromogénico al ensayo aumentó la sensibilidad del ensayo LAL en 10 a 100 veces más que la del procedimiento de coagulación-gel. Se desarrolló un ensayo espectrofotométrico y colorimétrico (toxicolor) añadiendo un colorante, N-(1-naftil)-etilen-diamina, al ensayo del substrato cromogénico (Minobe et al. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1991, 32:797-803).

Sin embargo, el ensayo LAL no es lo suficientemente específico para el diagnóstico clínico de septicemia en el plasma humano. Los ensayos LAL están afectados por los \beta-glucanos, por los productos reactivos que contienen
\beta-glucanos micóticos, y enjuagues procedentes de dializadores basados en celulosa (Morita et al, FEBS Letters 1981 129: 318-321). Además, las sustancias en la sangre humana que no presentan actividades amidolíticas específicas, tales como el factor Xa, trombina y tripsina, actúan directamente sobre el substrato cromogénico (Obayashi J. Lab. Clin. Med. 1984, 104: 321-330) y producen resultados falsos positivos. Inhibidores tales como el inhibidor de la \alpha2-plasmina, antitrombina III, y \alpha1-antitripsina producen resultados falsos negativos (Obayashi et al. Clinica Chimica Acta 1985, 149:55-65). Además, el ensayo LAL es inhibido o potenciado por muchas sustancias, que incluyen antibióticos, hormonas, metales pesados, aminoácidos, alcaloides, hidratos de carbono, proteínas plasmáticas, enzimas y electrólitos en la solución de la muestra (Pfeiffer, M. y Weiss, A.R. "Removal of Lal-test interfering low moleculr weigh substances by ultrafiltration", "Detection of Bacterial Endotoxin with the Limulus Amebocyte Lysate Test", WW Levin y CT Novitsk (eds) Alan R. Liss. Inc., New York, NY, 1987, pp 251-262). Para eliminar dichas sustancias que provocan1 interferencias, se han probado procedimientos para el tratamiento de muestras plasmáticas, (con) calentamiento y dilución, tratamiento con ácido perclórico, cloroformo, éter, ácido, álcali, detergentes, o ultrafiltración (Pfeiffer M y Weiss, A.R. supra; Obayashi, T.J. Lab. Clin. Med. 1984, 14:321-330). Sin embargo, la dilución de la muestra da lugar a la dilución del nivel de la endotoxina y reduce la sensibilidad para la detección de sus bajos niveles en la muestra. Tampoco han tenido éxito los intentos de la ultrafiltración para eliminar las sustancias de peso molecular alto que dan lugar a interferencias, a causa de que el tamaño del poro es demasiado pequeño y la endotoxina puede ser adsorbida sobre la membrana de ultrafiltración (Nawata et al. J. Chromatography 1992, 597:415-424).

Minobe et al. desarrollaron un procedimiento para eliminar las sustancias interferentes en la solución de la muestra, mediante la adsorción de la endotoxina sobre la histidina inmovilizada, que se ensayó a continuación con el substrato cromogénico LAL y el ensayo toxicolor o del toxinómetro (Minobe et al. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1944, 32:797-803). Sin embargo, la unión de la endotoxina a la histidina inmovilizada puede estar afectada por las globulinas y la transferrina en el plasma humano que se unen a la endotoxina. Además, el procedimiento de movilización de la histidina depende del tiempo de reacción y de la dilución de la muestra para aumentar la sensibilidad de la medición.

Los ensayos LAL inmunoenzimáticos (ELISA) para la detección de la endotoxina se han desarrollado también con coagulógeno y el péptido C de Limulus (Zhang et al. J. Clin. Microbiol. 1994, 32:416:422). Sin embargo, estos ELISAs también están afectados por sustancias en la sangre humana que activan o inhiben LAL, tal como se describe anteriormente, y al igual que otros ensayos LAL, dependen de la disponibilidad de raros cangrejos en forma de herradura que están disminuyendo en las poblaciones.

De acuerdo con lo anterior, es necesario un ensayo rápido y fiable para la determinación de la endotoxina en una muestra.

Objetivos de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar procedimientos para la determinación de los niveles de endotoxina en una muestra. En una forma de realización, el procedimiento comprende la unión de un agente receptor de la adenosina A_{1} a receptores de la adenosina A_{1}, la puesta en contacto del agente unido y los receptores de la adenosina A_{1} con una muestra, de forma que cualquier endotoxina en la muestra desplace al agente unido uniéndose a los receptores de la adenosina A_{1}, y la determinación de la cantidad del agente desplazado. En otra forma de realización, el procedimiento comprende el revestimiento de un soporte de fase sólida con un primer elemento de emparejamiento de unión capaz de inmovilizar la endotoxina al soporte de fase sólida, poniendo en contacto en soporte de fase sólida con una muestra de la que se sospeche contenga la endotoxina, y poniendo en contacto el soporte de fase sólida con un medio para la detección de la endotoxina inmovilizada al soporte de fase sólida. Estos procedimientos son útiles para el diagnóstico de septicemia en un animal.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar equipos para la detección de la endotoxina y del diagnóstico de la septicemia en animales.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra el desplazamiento de [^{3}H] DPCPX desde los receptores de la adenosina A_{1} en las membranas cerebrales de la oveja mediante el LPS de E.coli 0111:B4. Los experimentos competitivos con LPS 0111:B4
(0,1 pg/ml -100 \mug/ml) para [^{3}H] DPCPX (0,5 nM) se llevaron a cabo por duplicado.

La Figura 2 muestra el desplazamiento de [^{3}H] DPCPX desde los receptores de la adenosina A_{1} en las membranas cerebrales del hamster mediante el LPS de E.coli 0111:B4. Los experimentos competitivos con LPS 0111:B4
(0,1 ng/ml -10 \mug/ml) para [^{3}H] DPCPX (0,5 nM) se llevaron a cabo por duplicado.

La Figura 3 muestra el desplazamiento de [^{3}H] DPCPX desde los receptores de la adenosina A_{1} en las membranas de las PAECs felinas con y sin hipoxia mediante el LPS de E.coli 0111:B4. Los experimentos competitivos con LPS 0111:B4 (0,01 pg/ml -10 \mug/ml) para [^{3}H] DPCPX (0,5 nM) se llevaron a cabo por duplicado.

La Figura 4 muestra el desplazamiento de [^{3}H] DPCPX desde los receptores de la adenosina A_{1} en las membranas cerebrales de los hamster mediante el LPS de E.coli 0111:B4. Los experimentos competitivos con LPS 0111:B4
(0,1 ng/ml -10 \mug/ml) para [^{3}H] DPCPX (0,5 nM) se llevaron a cabo en presencia de gentamicina (100 \muM) por duplicado.

La Figura 5 muestra el desplazamiento de [^{3}H] DPCPX desde los receptores de la adenosina A_{1} en las membranas cerebrales de los hamster mediante el LPS de E.coli 0111:B4. Los experimentos competitivos con LPS 0111:B4
(0,1 ng/ml -10 \mug/ml) para [^{3}H] DPCPX (0,5 nM) se llevaron a cabo en presencia de arginina (100 \muM) por duplicado.

Descripción detallada de la invencion

La septicemia es un problema sanitario mundial que da lugar a una enorme carga financiera sobre el sistema sanitario y conduce a la muerte en casi la mitad de los individuos infectados. La tasa de septicemia en los Estados Unidos aumentó más del 100% en la última década. La septicemia se asocia con infecciones con bacterias gram negativas que liberan la endotoxina. Además, la contaminación de los medios de cultivo del embrión con la endotoxina se asocia con tasas bajas de embarazos y de nacimientos después de la fertilización in vitro (Nagata, Y. y Shirakawa, K. Fertility and Sterility 1996, 65:614-619). El desarrollo del embrión y el ritmo cardíaco fetal no se detectaron con niveles de endotoxina > 2 pg/ml en el medio de cultivo embrionario. Se cree que la contaminación de los baños de órganos con órganos que contienen endotoxina para el transplante, contribuye al fallo de la función de los órganos y al rechazo del transplante después de la cirugía del transplante. La contaminación de soluciones industriales o farmacéuticas con la endotoxina se ha asociado con el aumento de la morbilidad y mortalidad y sus costes asociados. De acuerdo con ello, es necesario un ensayo para la endotoxina que sea sensible, específico, reproducible y fácil de llevar a cabo en un corto período de tiempo.

Se ha encontrado ahora que la endotoxina, a la que se alude también como LPS, se une y activa a los receptores de la adenosina A_{1}. Se ha desarrollado actualmente un procedimiento para la detección fiable y segura de la endotoxina en una muestra que comprende la medición del desplazamiento de un agente unido a los receptores de la adenosina A_{1} mediante la endotoxina en una muestra. Los agentes que se unen a los receptores de la adenosina A_{1} son bien conocidos por los expertos en la materia. Tanto los agonistas como los antagonistas se han sintetizado para los receptores de la adenosina A_{1}. Por ejemplo, la 1,3-dipropil-8-ciclopentilxantina (DPCPX) es un antagonista de los receptores de la adenosina A_{1} muy selectivo con una unión no específica despreciable (menor que el 1%) en los tejidos (Jacobson et al. J.Med. Chem. 1992, 35:407-422; Bruns, R.F. "Adenosine Receptor Binding Assays", Receptor Biochemistry and Methodology, Volume II: Adenosine Receptors, DMF Cooper and C. Londos (eds), Allen Liss, Inc., New York, NY, 1988, pp 43-62. Otros ejemplos de antagonistas incluyen, pero no se limitan al congénere xantina amina (XAC); congénere xantina carboxílica (XCC); 1,3-dipropil-xantinas tales como 1,3-dipropil-8-(3-noradamantil)xantina (KW 3902), 1,3-dipropil-8- diciclopropilmetil)xantina (KF 15372), 1,3-dipropil-8-[2-(5,6-epoxi)norbonil]xantina (ENX), 8-(1-aminociclopentil)-1,3-dipropilxantina (IRFI 117), 1,3-dipropil-8-(3-noradamantil)xantina (NAX) y 1,3-dipropil-8-(3-oxociclopentil xantina (KFM 19); 1-propil-3-(4-amino)fenetil)-8-ciclopentilxantina (BW-A844U), 1-3-dipropil-8-sulfofenilxantina (DPSPX), ciclopentil teofilina (CPT) y 7-[2-etil(2-hidroxietil)amino]-etil]-3,7-dihidro-1,3-dimetil-8-(fenilmetil)-1H-purina-2,6-diona (Bamifilina (BAM)); N^{6},9-metil adenina tales como (\pm)-N^{6}-endonorbornan-2-il-9-metiladenina (N-0861) y 8-(N-metilisopropil)amino-N^{6}-(5'-endohidroxi-endonorbornil)-9-metiladenina (WRC-0571); N^{6}, adeninas 9-disustituídas; 2-fenil-7-deazaadeninas tales como (R)-7,8-dimetil-2-fenil-9-(1-feniletil)-7-deazaadenina; 7, 8-dihidro-8-etil-2-(3-noradamantil)-4-propil-1-H-imidazo[2,1-il]purin-5(4H)-ona;(\pm)R-1-[(\in)-3[2-[ fenilpirazolo(1,5-a)piridin-3-il]acriloil]-2-piperidina etanol; 8-azaxantinas tales como 7-ciclopentil-1,3-dipropil-8-azaxantina, y tetrahidrobenzotiofenonas tales como etil-3-(benziltio)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[c]tiofeno-1-carboxilato. Ejemplos de agonistas de los receptores de adenosina A_{1} incluyen, pero no se limitan a R-N^{6}-isopropiladenosina (R-PIA); 2-cloro-N^{6}-ciclopentiladenosina (CCPA); ciclohexiladenosina (CHA); y N^{6}-(4-amino-3-bencil)adenosina (ABA).

La medición del desplazamiento de estos agentes mediante LPS puede ser llevada a cabo según varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia. En una forma de realización preferida, el agente se marca de forma detectable y el desplazamiento se determina midiendo el marcador desplazado. Ejemplos de marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, o radionúclidos. El descubrimiento por parte de los presentes inventores de que el LPS se une a los receptores de la adenosina A_{1}, puede utilizarse para desarrollar ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA) para detectar la presencia de endotoxina en una muestra, utilizando principios de ELISA y RIA que son bien conocidos en la técnica. En estos ensayos, un soporte de fase sólida es revestido con un primer elemento de emparejamiento de unión, capaz de inmovilizar la endotoxina al soporte de fase sólida, o con un primer elemento de emparejamiento de unión capaz de inmovilizar los receptores de la adenosina A_{1} al soporte, mientras deja que sean libres de unirse al LPS, o un primer elemento de emparejamiento de unión capaz de inmovilizar el complejo LPS-receptores de adenosina A_{1} o los anticuerpos monoclonales al complejo LPS -receptor de adenosina A_{1}. Ejemplos de los primeros elementos de emparejamiento de la unión incluyen pero no se limitan a, receptores de la adenosina A_{1}, complejo LPS-receptor de adenosina A_{1} ó anticuerpos monoclonales para receptores de adenosina A^{1} o complejo LPS-receptor de adenosina A_{1}.

Una muestra de ensayo de la que se sospeche que contiene endotoxina puede ponerse en contacto directamente con el soporte de fase sólida (por ejemplo, en el lugar en el que el soporte de fase sólida está recubierto con un primer elemento de emparejamiento de unión de la endotoxina), o puede ponerse en contacto, en primer lugar, con una preparación que contiene receptores de la adenosina A_{1} y, a continuación, con el soporte de fase sólida (por ejemplo, en el lugar en el que el soporte de fase sólida contiene un primer elemento de emparejamiento de unión capaz de unirse a los receptores de la adenosina A_{1} o a los complejos LPS-receptores de adenosina A_{1}). Alternativamente, en el caso en que el soporte de fase sólida contenga en primer lugar elementos de emparejamiento de unión capaces de unirse a los receptores de adenosina A_{1}, el soporte de fase sólida puede ponerse en contacto en primer lugar con una preparación de receptores de adenosina A_{1} y seguidamente con la muestra de ensayo. El soporte puede lavarse para eliminar el exceso de material no unido cuando resulte apropiado, como es bien conocido en la técnica.

Para determinar la presencia y/o cantidad de endotoxina en una muestra de ensayo, se utilizan medios para la detección de la endotoxina unida al soporte de fase sólida. "Medios para detectar endotoxina" significa una molécula marcada que se une al primer elemento de emparejamiento de unión y que es desplazada de éste por la endotoxina, o se une al primer elemento de emparejamiento de unión en ausencia de cualquier endotoxina unida allí, o se une al complejo del primer elemento de emparejamiento de unión y la endotoxina. Los medios de detección de la endotoxina se ponen en contacto con el soporte de fase sólida como es apropiado, dada la particular combinación del primer elemento de emparejamiento de unión y los medios de detección, basada en principios conocidos en la técnica. Ejemplos de medios para la detección de la endotoxina unida, incluyen, pero no se limitan al complejo marcado LPS-adenosina A_{1}, a anticuerpos monoclonales marcados para el receptor de la adenosina A_{1}, o anticuerpos monoclonales marcados para el complejo LPS-receptor de adenosina A_{1}. La cantidad de endotoxina que está contenida en una muestra de ensayo puede calcularse midiendo la cantidad de moléculas marcadas en una etapa dada en el ensayo, tal como será evidente para los expertos en la materia. Ejemplos de marcadores incluyen enzimas detectables o radionúclidos conjugados a la proteína. Alternativamente, la proteína puede conjugarse a un antígeno seleccionado y detectarse con un segundo anticuerpo para el antígeno seleccionado, el cual segundo anticuerpo se conjuga a a un enzima detectable o radionúclido. Los enzimas detectables que pueden utilizarse en los ensayos ELISAs son bien conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos de enzimas detectables incluyen, pero no se limitan a la acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, \alpha-glicerofosfato deshidrogenasa, asparaginasa, \beta-galactosidasa, \beta-V-esteroide isomerasa, catalasa, glucoamilasa, glucosa oxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, p peroxidasa de rábano picante, malatodeshidrogenasa, ribonucleasa, nucleasa estafilocócica, triosa fosfatoisomerasa, o ureasa y alcoholdeshidrogenasa de levadura.

Fuentes convenientes de receptores de adenosina A_{1} incluyen, pero no se limitan a los cerebros de cabra y hamster. El cerebro de la oveja contiene una alta densidad de receptores de adenosina A_{1} con alta y baja afinidad
(2150 \pm 165 fmol/mg) y los cerebros de hamsters tienen una cantidad doble de receptores de la adenosina A_{1}
(4090 \pm 720 fmol/mg). La densidad de los receptores de adenosina A_{1} con alta afinidad, determinada utilizando [^{3}H] CCPA es 1920 \pm 250 fmol/mg y 1630 \pm 60 fmol/mg en ovejas y hamsters, respectivamente. Alternativamente, los receptores de la adenosina A^{1} pueden obtenerse a partir de células endoteliales arteriales pulmonares felinas cultivadas (PAECS) con y sin hipoxia. Además, los receptores de la adenosina A^{1} pueden derivarse de otras células de mamífero o de insectos.

Progenies celulares tales como células ováricas del hamster Chino (células CHO, células COS-7, células renales embrionales humanas (HEK-293), de riñón enbriónico humano (HEK-293) o células Sf9 de insectos, pueden ser transfectadas con cADN de receptores de adenosina A_{1} humanos, o de rata, de perro, de hamster, de cabra, o bovinos, y/o tratadas con promotores de receptores de adenosina A_{1} para aumentar la expresión y densidad de los receptores de adenosina A_{1} utilizados en estos ensayos. Por ejemplo, receptores de adenosina A_{1} recombinantes de cerebros de rata se han expresado en células Sf9 de insectos. En una forma de realización, los cADNs pueden marcarse con hexahistidina y epítopo FLAG (H/F) para crear un vector de expresión que puede transfectarse a células mediante procedimientos de lipofectina o DEAE/dextrano para aumentar la expresión de receptores de adenosina A_{1} en los tejidos. Membranas de células que contienen receptores de adenosina A recombinantes o nativos se marcan con un agente detectable receptor de adenosina A_{1}. Los receptores se solubilizan entonces y se purifican utilizando cromatografía de afinidad y electroforesis en gel de poliamida SDS. Se producen e entonces anticuerpos monoclonales contra los receptores purificados para la detección de la endotoxina mediante ELISA.

Los antígenos seleccionados que pueden conjugarse a los medios para detectar la endotoxina son bien conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a biotina y FITC. Asimismo, son bien conocidos en la técnica los procedimientos para conjugar un antígeno seleccionado a una proteína. Por ejemplo, el LPS puede ser biotinilado mediante diversos medios tales como biotina-LC-hidrazida (biotinamido hexanoil hidrazida) o biotin-LC-ASA (1-(4-azidosalicilamido-)-6-(biotinamido)-hexano y conjugarse entonces con un marcador detectable tal como un enzima, fluoróforo o radionúclido. El LPS m biotinilado y marcado puede entonces utilizarse como una sonda para unir y detectar a los receptores de adenosina A_{1} en membranas preparadas a partir de distintos tejidos o progenies celulares. Los receptores en estas membranas pueden entonces fraccionarse, reducirse y solubilizarse sobre geles de poliacrilamida bidimensionales. Después de la purificación, pueden producirse anticuerpos monoclonales contra el complejo LPS-receptor de adenosina A_{1} para la detección de la endotoxina mediante ELISA.

En el procedimiento de la presente invención, un agente receptor de la adenosina A_{1} se une a receptores de adenosina A_{1}. El agente unido y los receptores de la adenosina A_{1} se ponen entonces en contacto con una muestra, de forma que cualquier endotoxina en ella desplaza al agente unido, uniéndose a los receptores de la adenosina A_{1}. En una forma de realización preferida, muestras de ensayo que contienen cualesquiera proteínas tales como muestras biológicas, son desproteinizadas tratándolas con ácido perclórico, previamente al contacto. El suero pretratado con ácido perclórico sin endotoxina no tuvo efecto sobre la unión de [^{3}H]DPCPX en las membranas. Además, existió una tasa de recuperación del 98% del pico plasmático con endotoxina tratado con ácido perclórico. Puede utilizarse el calentamiento y la dilución según procedimientos bien conocidos en la técnica. La cantidad del agente desplazado se mide entonces. En una forma de realización preferida, el agente se marca radioactivamente y la cantidad del agente desplazado se determina midiendo la radioactividad con un contador de centelleo. Sin embargo, como será obvio para los expertos en la materia después de esta exposición, pueden utilizarse otros procedimientos para la determinación de la cantidad del agente desplazado. Los niveles de endotoxinas en la m muestra se determinan entonces mediante comparación con una curva patrón derivada midiendo el agente desplazado mediante concentraciones conocidas de una endotoxina conocida.

Con la utilización de anticuerpos monoclonales para los receptores de la adenosina A_{1} purificados (Ku, H-H et al. J. Immunol. 1987 139:2376-2384) o el complejo purificado LPS-receptor de adenosina A_{1}, pueden utilizarse también radioinmunoensayos (RIA) y los ELISAs para la detección de la endotoxina. En estos ensayos, una muestra tal como plasma o solución salina con LPS, se añade a un soporte de fase sólida revestido con un elemento de emparejamiento de unión para la endotoxina, tal como los receptores purificados de adenosina A_{1}, recombinantes o nativos, un complejo LPS-receptor de adenosina A_{1},o anticuerpos monoclonales a éstos. El término "soporte de fase sólida" se refiere a cualquier soporte al cual pueden unirse los elementos de emparejamiento de unión de la endotoxina. Un soporte de fase sólida preferido que se utiliza en estos ensayos consiste en una placa de microtitulación, de plástico. Ejemplos de otros soportes de fase sólida que pueden también utilizarse en la presente invención, incluyen pero no se limitan a perlas y y superficies resbaladizas de poliestireno. El soporte de fase sólida se trata entonces con medios para detectar cualquier endotoxina unida en la muestra. Ejemplos de dichos medios incluyen proteínas tales como anticuerpos monoclonales para los receptores de la adenosina A_{1} (MabA_{1}, AR), anticuerpos monoclonales para un complejo LPS-receptor de adenosina A_{1}, receptores purificados de adenosina A_{1}, un complejo LPS-receptor de adenosina A_{1}, o LPS conjugado con: un radionúclido; un enzima detectable, es decir, peroxidasa de rábano, y una solución de substrato capaz de detectar el enzima, es decir, una solución de tetrametilbenceno (TMB) o de o-fenilendiamina (OPD); o un antígeno y un segundo anticuerpo para el antígeno marcado con un enzima detectable o radionúclido. La determinación de la endotoxina en una muestra se basa en la detección del enzima o del radionúclido unido directamente o mediante el segundo anticuerpo. También se determinan mediante estos ensayos, curvas patrón para concentraciones conocidas de endotoxina. Las curvas generadas para las muestras de ensayo se comparan con las curvas patrón para la cuantificación del nivel de endotoxina en la muestra del ensayo.

"Muestra" o "muestra de ensayo" incluye, pero no se limita a, muestras biológicas que se derivan de un animal, tales como la sangre entera, el plasma, el suero, CSF, orina, saliva, líquido pleural, líquido peritoneal (incluyendo el ascítico), el líquido del lavado broncoalveolar (BAL), el líquido sinovial, el líquido sinusal, y el líquido cístico; medios de cultivo embrionales; baños de órganos; soluciones y productos farmacéuticos; y soluciones y productos industriales.

Los niveles de endotoxina en el suero de voluntarios sanos normales es menor que 3 pg/ml (Obayashi et al. Clinica Chimica Acta 1985, 149:55-65). Se ha informado de que 0,5 ng/kg (7 pg/ml en un adulto de 70 kg) de endotoxina produce una granulocitosis del 200-300% a las 4 horas en voluntarios sanos normales (Wessels et al. Crit. Care. Med. 1988 16: 601-605). Una dosis ligeramente mayor de endotoxina, 0,8 ng/kg (10 pg/ml) es pirogénica. Los niveles superiores a 20 pg/ml se han asociado con septicemia (Zhang et al. J. Clin. Microbiol. 1994 32:416-422).

De acuerdo con lo anterior, los procedimientos de la presente invención pueden utilizarse para el diagnóstico de septicemia en un animal. "Animal" incluye, pero no se limita a, mamíferos, peces, anfibios, reptiles, aves, marsupiales, y muy preferentemente, el hombre. Así, en una forma de realización preferida, un clínico puede medir los niveles de endotoxina en una muestra procedentes de un hombre y diagnosticar septicemia rápidamente y de modo seguro. En esta forma de realización, una muestra, preferentemente una muestra plasmática, se obtiene a partir de un hombre del que se sospeche que tiene o muestre el riesgo de septicemia. Los signos o síntomas que pueden conducir al clínico a sospechar que un individuo humano presenta septicemia, incluyen pero no se limitan a fiebre o hipotermia, escalofríos, rigidez, sudor, frecuencia respiratoria aumentada, incremento del ritmo cardíaco, estado mental alterado, confusión, y presión sanguínea disminuída conjuntamente con choque. Ejemplos de individuos con riesgo de septicemia incluyen, pero no se limitan a aquéllos con sondas permanentes tales como catéteres urinarios, intravenosos o endotraqueales,tubos de drenaje de líquido cefalorraquídeo, tubos de drenaje de heridas o de articulaciones, sondas pleurales, o catéteres peritoneales para diálisis, e individuos inmunodeprimidos tales como los que presentan cáncer, leucemia, SIDA, u otras alteraciones inmunológicas, diabetes, enfermedad renal, enfermedad hepática e individuos a quienes se les está siendo tratando el cáncer mediante quimioterapia. Los niveles de endotoxina en una muestra se determinan entonces según un procedimiento de la presente invención.

En membranas preparadas a partir de PAECs felinos cultivados y cerebro de oveja, un agonista selectivo del receptor de la adenosina A_{1}, R-N^{6}-isopropiladenosina (R-PIA), desplaza la unión del radioligando antagonista altamente selectivo del receptor de la adenosina A_{1}, [^{3}H]-1,3-dipropil-8-ciclopentiladenosina xantina, [^{3}H]DPCPX. En las PAECs felinas cultivadas, un agonista selectivo del receptor de la adenosina A_{2}, el 2-fenilaminoadenosina (CV 1808) no desplazó al [^{3}H]DPCPX unido. De acuerdo con esto, se desmostró la capacidad de la endotoxina para unirse a los receptores de la adenosina A_{1} en distintos tejidos y especies. El LPS desplaza al ligando [^{3}H]DPCPX antagonista altamente selectivo de la adenosina A_{1} de forma dosis dependiente en membranas preparadas a partir de cerebros de cabra y hamster y de las PAECs felinas cultivadas (con y sin hipoxia). La sensibilidad más baja del ensayo para el LPS en las soluciones salinas y en el plasma está en 100 pg/ml en las membranas cerebrales del hamster. Además, con la utilización de membranas preparadas a partir de los cerebros de hamster, el suero pretratado con PCA no tuvo efecto sobre la unión de [H^{3}]DPCPX. No existió diferencia en el efecto sobre las muestras en bruto (sin LPS) de la solución salina y del plasma (desproteinizado con PCA) sobre la unión de [^{3}H]DPCPX a las membranas del cerebro del hamster. Además, existió una tasa de recuperación del 98% del LPS (E.coli 0111:B4) del plasma en este ensayo de unión utilizando membranas cerebrales del hamster y [^{3}H]DPCPX.

La Kd (constante de disociación o afinidad del receptor) y la B_{max} (densidad de receptores) de los receptores de la adenosina AA_{1} para el antagonista [^{3}H] DPCPX selectivo del receptor de la adenosina A_{1} se determinaron en experimentos de saturación tanto en los cerebros de las ovejas como en los de los hamster y en los PAECs felinos con y sin hipoxia (a ésta se la denomina también en la presente memoria como normoxia). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Experimentos de saturación con [^{3}H]-DPCPX en las membranas cerebrales de ovejas y hamsters y en las PAECs felinas

	B_{max} (fmoles/mg proteína)	Kd(nM)
Cerebro de oveja	2251	0,37
Cerebro de hamster	3733	0,32
Normoxia celular	1064	0,33
Hipoxia celular	1458	0,26

También se llevaron a cabo experimentos de unión competitiva con LPS en membranas preparadas a partir de cerebros de ovejas y de hamster y de PAECs felinas. Se determinaron la constante de inhibición (K_{1}) para LPS, la dosis a la cual LPS inhibe el 50% de la unión de [^{3}H]DPCPX (IC_{50}) y el límite más bajo de detección para LPS en estas membranas. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 2 y en las Figuras 1, 2 y 3.

TABLA 2 Experimentos de competición con LPS (0111:B4) en los cerebros de ovejas y hamster y en las PAECs felinas

	K_{1}(ng/ml)	IC_{50} (ng/ml)	Detección límite (ng/ml)
Cerebro de oveja	48	100	1-10
Cerebro de hamster	147	277	0,1-1
Normoxia celular	k_{11} 0,625,	IC_{50-1} 1,	1-10
	K_{12} 1000	IC_{50-2} 1750
Hipoxia celular	k_{11} 0,267	IC_{50-1} 0,4,	1-10
	K_{12} 607	IC_{50-2} 986

La endotoxina (LPS, E.coli 0111:B4) desplazó también a [^{125}I]BW -A844U (0,2 nm) en membranas preparadas a partir de las PAECs felinas cultivadas, así como también a partir de cerebros de hamster. Además, esta endotoxina desplazó a [^{3}H]CCPA de las membranas preparadas a partir de los cerebros de hamster, mientras que la endotoxina (LPS, E.coli 055:B5) desplazó a [^{3}H]DPCPX de las membranas cerebrales de la oveja. En las membranas preparadas a partir de las células Sf9 de insectos que expresaban a los receptores de adenosina A_{1} recombinantes de los cerebros de rata, la endotoxina (LPS, E.coli 0111:B4) desplazó a [^{3}H]DPCX (0,2-0,5 nM) o a [^{125}I]BW-A844U (0,2 nm). Se encontró que la competición de E. coli 0111:B4 para la unión de [^{3}H] DPCPX en los cerebros del hamster podía evitarse completamente mediante un tratamiento previo con la toxina tosferínica (100 ng/ml). De modo similar, la EC_{50} para la E.coli 0111:B4, para la unión de [^{3}H]DPCPX en los cerebros del hámster, aumentó mediante tratamiento previo con un análogo GTP no hidrolizable [GppNHp (100 \muM] (0,38 \mug/ml sin Gpp NHP respecto a 0,9 \mug/ml en presencia de Gpp NHp). La endotoxina no se unió a los receptores de la dopamina (D2) en experimentos de competición con el [^{3}H] sulpride en las membranas cerebrales del hámster.

La sensibilidad del ensayo de la presente invención se verificó en experimentos competitivos con concentraciones conocidas de endotoxina (1 pg/ml a 1 \mug/ml) de 4 tipos diferentes de LPS: E.coli 055:B5; E.coli 0111:B4, Serratia marcescens, y Salmonella typhimurium en soluciones salinas o plasma, en presencia de [^{3}H] DPCPX (0,2-0,5 nM) o [^{3}H] CCPA (0,2-0,5 nM). La sensibilidad más baja del ensayo de unión del radioligando que utilizaba [^{125}I]BW-A844U (0,2 nm) y membranas cerebrales del hamster, para detectar la endotoxina (LPS, E.coli 0111:B4) fue de 2 a 5 pg/ml. La sensibilidad más baja del ensayo con [^{3}H]DPCPX y las membranas cerebrales del hamster o las membranas de las células Sf9 que expresan los receptores de la adenosina A_{1} del cerebro de la rata para detectar la endotoxina (Endotoxin Standard, U.S. Pharmacopeial (USP) Convention, Inc), fue de 0,5 pg/ml o de 0,1 a 1,0 pg/ml, respectivamente. La liofilización de las membranas de las células Sf9 no afectó a la sensibilidad del ensayo. Los datos de unión del radioligando se analizaron mediante un análisis de regresión no lineal equipado con un empaquetamiento estadístico. Estos datos se utilizaron entonces como curvas patrón para la determinación de las concentraciones de endotoxina en las muestras.

La selectividad del ensayo de la presente invención se confirma en experimentos de competición con concentraciones conocidas de un agonista selectivo del receptor de la adenosina A_{2}, la 2-fenilaminoadenosina (CV1808)(10^{-12} a 10^{-4} M), un compuesto que imita al tromboxano, U46619 (10^{-12} a 10^{-4} M), prostaciclina (10^{-12} a 10^{-4} M), epinefrina (10^{-12} a 10^{-4} M), TNF-á ((10^{-12} a 10^{-4} M), IL-1 (10^{-12} a 10^{-4} M), o (1\rightarrow3)-\beta-D-glucano, procedente de Alcaligenes faecalis var. Myxogenes IFO13140 (Curdlan: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka, Japón) (0-50 pg/ml) y bacterias Gram positivas, Staphylococcus epidermis o Staphylococcus aureus (1 pg/ml a 10 \mug/ml) en solución salina, en presencia de [^{3}H]DPCPX (0,2 a 0,5 nM) o [^{3}H] CCPA (0,2 a 0,5 nM). Un ensayo de la endotoxina con LAL y substrato cromogénico (Endospecy, ES test: Seikagaku Corp., Tokyo), se lleva a cabo según el protocolo del fabricante y se utiliza a efectos comparativos. Se determinan la sensibilidad y la especificidad del ensayo de la unión del radioligando para la endotoxina o del ensayo del LAL más el substrato cromogénico. También se determinan las influencias de las sustancias que interfieren sobre las curvas patrón para la endotoxina en el ensayo de la unión del radioligando o en el ensayo del substrato cromogénico más el substrato cromogénico.

Por ejemplo, la especificidad del ensayo de la presente invención para la detección de la endotoxina, respecto al ensayo LAL, se comparó para las sustancias que pueden encontrarse en el s suero de pacientes con endotoxemia. Ni la arginina (100 \muM), la gentamicina (100 \muM), ni la IL-1 (40 ng/ml) tuvieron ningún efecto sobre el desplazamiento de la unión de [^{3}H] DPCPX por E.coli 011:B4 LPS en las membranas cerebrales del hámster; sin embargo, estas sustancias de interferencia produjeron todas resultados falsos positivos en el ensayo LAL. Las sustancias que se encuentran habitualmente como conservantes en las soluciones farmacéuticas tales como el propilenglicol (5%), fenol (0,01%), timerosal (0,01%), alcohol bencílico (1%), clorobutanol (0,5%), metilparabén (0,2%) y cloruro de benzalconio (0,01%) se ensayaron también utilizando [^{3}H]DPCPX y membranas liofilizadas de células Sf9 y se encontró que no tenían efecto de interferencia, tal como se determinó mediante la sensibilidad del ensayo. Posteriormente, utilizando este ensayo de unión del radioligando, se determinaron las curvas patrón para otras endotoxinas, incluyendo Salmonella typhimurium (0,1 ng/ml-100\mug/ml) y Pseudomonas aeruginosa (0,1 ng/ml-100 \mug/ml)y fueron similares a las de E.coli 0111.B4: sin embargo, la enterotoxina (0,1 ng/ml-100 \mug/ml) derivada del organismo Gram positivo Staphylococcus aureus, no tuvo efecto sobre la unión de [^{3}H]DPCPX.

La presente invención proporciona asimismo equipos para la detección de la endotoxina en una muestra y del diagnóstico de s septicemia en un animal. En una forma de realización, se proporcionan equipos para la medición del desplazamiento de un agente receptor de la adenosina A_{1}, marcado de manera detectable. En esta forma de realización, el equipo comprende una fuente de receptores de adenosina A_{1}, tales como membranas que contienen receptores de adenosina A_{1}, o receptores de adenosina A_{1} purificados, un agente receptor de la adenosina A_{1} marcado de forma detectable, y patrón de endotoxina. En esta forma de realización, los equipos pueden también incluir ácido perclórico, tampones de dilución tales como soluciones salinas tamponadas de fosfato o Tris-HCl, filtros no pirogénicos, pipetas y tubos de ensayo. Alternativamente, los equipos están provistos para la m medición de la endotoxina mediante RIA o ELISA. En esta forma de realización, los equipos comprenden un soporte de fase sólida revestido con un primer elemento de emparejamiento de unión capaz de unirse a la endotoxina, un medio para la detección de la endotoxina unida al primer elemento de emparejamiento de unión, y patrones de endotoxina.

Los siguientes ejemplos no limitativos se proporcionan para ilustrar de forma más completa la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de los receptores de adenosina A_{1} para e experimentos de unión

Cerebros congelados de ovejas (Pel Freeze, Rodgers, Arkansas) o cerebros de hamster (Harlan Bioproducts, Indianapolis, Indiana) se descongelaron y homogeneizaron en 10 volúmenes de sacarosa 0,32 M enfriada a 4ºC. Este homogenado se centrifugó a 1.000 x g durante 10 minutos para eliminar la fracción nuclear. El sobrenadante se centrifugó a 30.000 x g durante 30 minutos. El sedimento resultante se volvió a suspender en 10 ml de agua y se dejó en el hielo durante 30 minutos para obtener membranas sinaptosómicas. La suspensión se centrifugó entonces a 48.000 x g durante 10 minutos y las membranas se volvieron a suspender en 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) a una concentración de 8 mg de proteínas/ml, congelándose en nitrógeno líquido, y guardándose a -20ºC hasta que se realizara el ensayo de unión.

Células PAECs felinas se desarrollaron hasta su confluencia e en placas de cultivo de 75 mm^{2}. Las células confluentes se lavaron dos veces con tampón KSP (10 mM KH_{2}PO_{4}, 50 mM sacarosa). Las células se rasparon y se suspendieron en tampón KSP a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml en dos tubos cónicos de centrífuga. Los tubos se centrifugaron a 1000 g x 2 minutos, desechándose el tampón. Las células procedentes de un tubo se suspendieron entonces en tampón desoxigenado (haciéndolo burbujear con gas N_{2} durante 10 minutos) y haciéndolo burbujear (otra vez) con gas N_{2} durante 30 segundos para asegurar condiciones hipóxicas. Estas células se incubaron entonces durante 2 horas en este tampón hipóxico. Las células del otro tubo se suspendieron en tampón KSP normal y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Al final de la incubación, las células se homogeneizaron inmediatamente para la preparación de las membranas.

Para llevar ésta a cabo, las células se homogeneizaron mediante tratamiento con ultrasonidos y se centrifugaron a 1000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se centrifugó otra vez a 30.000 x g durante 30 minutos. La fracción membranal se reconstituyó con tampón Tris para realizar estudios de unión del radioligando.

Ejemplo 2 Experimentos de saturación

La unión de [^{3}H] DPCPX o [^{3}H] CCPA a membranas, se llevó a cabo en un volumen de ensayo de 500 \mul Tris-HCl, pH 7,4, MgCl_{2}, (10 mM) (solamente para las membranas de las PAECs de felino) que contenían [^{3}H] DPCPX o [^{3}H] CCPA (0,01 a 4 nM). La unión no específica de [^{3}H]DPCPX o [^{3}H] CCPA se determinó en presencia de R-PIA (100 \muM) o teofilina 1 mM), respectivamente. Para eliminar la adenosina endógena, en todos los ensayos de unión se encontraba la adenosina desaminasa a una concentración de 0,2 U/ml. Se llevaron a cabo incubaciones durante 2 horas a temperatura ambiente para las membranas cerebrales de las ovejas y de los hámsters y a una temperatura de 4ºC para las membranas de las PAEC. Las incubaciones finalizaron por la rápida eliminación del tampón de incubación mediante filtración a través de filtros Whatman GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ). La radioactividad unida a la membrana se midió mediante contaje de centelleo del papel de filtro. Para determinar Kd, Bmax y la unión no específica en las membranas cerebrales de ovejas y hamsters y en las de las PAEC de felino, se realizaron los experimentos por duplicado.

Ejemplo 3 Experimentos competitivos

Después de la determinación de Kd, Bmax y de la unión no específica de [^{3}H]DPCPX o [^{3}H]CCPA en las membranas preparadas a partir de cerebros de ovejas y de hamsters y de las células endoteliales arteriales pulmonares con y sin hipoxia, se llevaron a cabo en presencia de [^{3}H]DPCPX o [^{3}H] CCPA (0,2-5 nM) experimentos competitivos con concentraciones conocidas de endotoxina [LPS de E.coli 055:B5; E.coli 0111:B4, Serratia marcescens, y Salmonella typhimurium; 0,1 pg/ml-10 \mug/ml en soluciones salinas o plasma. Las mediciones de todas las muestras (soluciones salinas y plasma) se llevaron a cabo por duplicado.

Ejemplo 4 Análisis estadístico

Los datos de la unión del radioligando se analizaron utilizando Graph Pad Prism mediante análisis de regresión no lineal equipado con un empaquetamiento estadístico. Los datos se expresan como valores medios \pm SEM. Para cada tipo de LPS en los experimentos competitivos, se determinan representaciones gráficas en forma de colina y de Schild, y se utilizan como curvas patrón para las determinaciones de la concentración de endotoxina en las muestras con concentraciones desconocidas de ésta.

Ejemplo 5 Construcción de una curva de unión de LPS

La solución salina se trata con concentraciones de distintos tipos de LPS: E.coli 055:B5; E.coli 0111:B4, Serratia marcescens, y Salmonella typhimurium para producir una concentración final de 0,1 pg/ml, 10 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml y 1 \mug/ml y 10 \mug/ml de LPS para construir curvas patrón para el Ensayo Endotoxínico de Unión del Radioligando, tal como se describe en los Ejemplos 2-4, o el Ensayo Endotoxínico del LAL más substrato cromogénico.

En jeringas libres de endotoxina, se obtuvo sangre del hombre (5 ml) y de animales (2 ml), evitando que se coagulara en tubos de ensayo que contenían heparina sin endotoxina (4 IU/ml) (Endo Tube ET, Chromogenix AB, Molndal, Suecia), enfriándose dichos tubos en un baño de hielo inmediatamente después de obtener la muestra. Se centrifugó la sangre a 150 x g durante 10 minutos a 4ºC y 0,5-1,0 ml de la capa plasmática se eliminaron de forma estéril utilizando pipetas disponibles (Steriltips, 1000 11L, Eppendorf, Darmstadt, Alemania), conservándose en tubos de polipropileno estériles y libres de LPS (Rorchen, 115271, 12.0/75 mm, Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Alemania) a -23ºC hasta que se lleve a cabo el ensayo. Se trató una muestra de plasma con concentraciones de distintos tipos de LPS: E.coli 055:B5; E.coli 0111:B4, Serratia marcescens, y Salmonella typhimurium para producir una concentración final de 0,1 pg/ml, 10 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 \mug/ml y 10 \mug/ml de LPS, disponiéndola en un baño de hielo para construir curvas patrón para el Ensayo Endotoxínico de Unión del Radioligando, o el Ensayo Endotoxínico del LAL más substrato cromogénico. La precipitación del plasma con ácido perclórico para eliminar factores que interfieren con el ensayo de unión del radioligando o el del LAL, se lleva a cabo tal como se describe por Obayashi, T.J. Lab. Clin. Med. 1984, 104:321-330. Dos décimas partes de un mililitro de
0,32 mol/L de ácido perclórico (PCA), se añadieron a una muestra de 0,1 ml en un baño de hielo, incubándose la muestra a 37ºC durante 20 minutos. El material desnaturalizado se precipitó mediante centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos, y el sobrenadante es neutralizado con un volumen igual de 0,18 M NaOH.

Ejemplo 6 Determinación de la endotoxemia en muestras de individuos afectados

En jeringas libres de endotoxina, se recogió sangre del hombre (5 ml) y de animales (2 ml) que se suponía tenía septicemia, evitando que se coagulara en tubos de ensayo que contenían heparina sin endotoxina (4 IU/ml) (Endo Tube ET, Chromogenix AB, Molndal, Suecia), enfriándose dichos tubos en un baño de hielo inmediatamente después de obtener la muestra. Se centrifugó la sangre a 150 x g durante 10 minutos a 4ºC y 0,5-1,0 ml de la capa plasmática se eliminaron de forma estéril utilizando pipetas disponibles (Steriltips, 1000 11L, Eppendorf, Darmstadt, Alemania), conservándose en tubos de polipropileno estériles y libres de LPS (Rorchen, 115271, 12.0/75 mm, Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Alemania) a -23ºC hasta que se lleve a cabo el ensayo respecto a la presencia de endotoxina, según los procedimientos que se describen en la presente memoria.

Claims

1. Procedimiento para la determinación de los niveles de endotoxina en una muestra, que comprende:

a) la unión de un agente receptor de la adenosina A_{1} a receptores de la adenosina A_{1},

b) la puesta en contacto del agente unido y de los receptores de la adenosina A_{1} con una muestra, de forma que cualquier endotoxina en la muestra desplace al agente unido, uniéndose a los receptores de la adenosina A_{1}, y

c) la determinación de la cantidad del agente desplazado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente receptor de la adenosina A_{1} es un antagonista del receptor de la adenosina A_{1}.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente receptor de la adenosina A_{1} es un agonista del receptor de la adenosina A_{1}.

4. Procedimiento para diagnosticar la septicemia en un animal, que comprende:

b) la puesta en contacto del agente unido y de los receptores de la adenosina A_{1} con una muestra procedente de un animal del que se sospeche que padezca septicemia, de forma que cualquier endotoxina en la muestra desplace al agente unido, uniéndose a los receptores de la adenosina A_{1},

c) la determinación de una cantidad del agente desplazado; y

d) la determinación del nivel de endotoxina en la muestra, de forma que la septicemia pueda ser diagnosticada.

5. Equipo para la detección de endotoxina en una muestra, que comprende:

(a): una fuente de receptores de adenosina A_{1};

(b): un agente receptor de adenosina A_{1} que se marca de forma detectable; y

(c): patrones de endotoxina.

6. Procedimiento para la determinación de niveles de endotoxina en una muestra, que comprende:

(a) el revestimiento de un soporte de fase sólida con un primer elemento de emparejamiento de unión capaz de inmovilizar la endotoxina;

(b) la puesta en contacto en soporte de fase sólida con una muestra de la que se sospeche que contenga la endotoxina; y

(c) la puesta en contacto del soporte de fase sólida con un medio para la detección de la endotoxina inmovilizada al soporte de fase sólida, en el que el primer elemento de emparejamiento de unión o el medio para detectar la endotoxina inmovilizada se selecciona de entre el grupo formado por receptores de la adenosina A_{1}, complejos lipopolisacárido-receptor de adenosina A_{1} o anticuerpos monoclonales para los receptores de adenosina A_{1} o complejos lipopolisacárido-receptores de adenosina A_{1}.

7. Equipo para la detección de endotoxina, que comprende:

(a) un soporte de fase sólida revestido con un primer elemento de emparejamiento de unión capaz de inmovilizar la endotoxina;

(b) un medio para detectar la endotoxina inmovilizada al soporte sólido; y

(c) patrones de endotoxina, en los que el primer elemento de emparejamiento de unión o el medio para detectar la endotoxina inmovilizada se selecciona de entre el grupo formado por receptores de la adenosina A_{1}, complejos lipopolisacárido-receptor de adenosina A_{1} o anticuerpos monoclonales para los receptores de adenosina A_{1} o complejos lipopolisacárido-receptores de adenosina A_{1}.