ES2218524T3 - Modificacion genetica de celulas primordiales neurales. - Google Patents

Modificacion genetica de celulas primordiales neurales.

Info

Publication number
ES2218524T3
ES2218524T3 ES94907366T ES94907366T ES2218524T3 ES 2218524 T3 ES2218524 T3 ES 2218524T3 ES 94907366 T ES94907366 T ES 94907366T ES 94907366 T ES94907366 T ES 94907366T ES 2218524 T3 ES2218524 T3 ES 2218524T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
cns
growth factor
primordial
neural
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES94907366T
Other languages
English (en)
Inventor
Samuel Weiss
Brent A. Reynolds
Joseph P. Hammang
Edward E. Baetge
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Neurospheres Holdings Ltd
Original Assignee
Neurospheres Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Neurospheres Holdings Ltd filed Critical Neurospheres Holdings Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2218524T3 publication Critical patent/ES2218524T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/148—Transforming growth factor alpha [TGF-a]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

SE PRESENTAN CELULAS MADRE NERVIOSAS, GENETICAMENTE MODIFICADAS, CON FACTOR RESPUESTA DE CRECIMIENTO EPIDERMICO, QUE SON SUSCEPTIBLES DE DIFERENCIACION IN VITRO, EN FORMA DE NEURONAS, ASTROCITOS Y OLIGODENDROCITOS. LAS CELULAS MADRE PUEDEN REPRODUCIRSE IN VITRO PARA OBTENER ELEVADOS NUMEROS DE CELULAS DE UTILIZACION EN TRANSPLANTES PARA EL TRATAMIENTO DE DIFERENTES TRASTORNOS NEUROLOGICOS. LAS CELULAS MADRE PUEDEN OBTENERSE DE LOS SERES HUMANOS Y DE LOS ANIMALES, CULTIVARSE IN VITRO EN PRESENCIA DE UN FACTOR DE CRECIMIENTO Y MODIFICARSE CON EL ADN DESEADO UTILIZANDO TECNICAS CONOCIDAS EN LA PROFESION. DE MODO ALTERNATIVO, LAS CELULAS PRECURSORAS PUEDEN DERIVARSE DE UN ANIMAL TRANSGENETICO AL QUE SE LE HAYA INSERTADO EL GEN DESEADO EN SU GENOMA.

Description

Modificación genética de células primordiales neurales.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a métodos para producir células genéticamente modificadas útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con el sistema nervioso central (SNC). Más en particular, la presente invención se refiere a la modificación genética de células primordiales neurales sensibles al factor de crecimiento y de células gliales y neuronales diferenciadas derivadas de células primordiales neurales sensibles a factor del crecimiento, así como al uso de estas células para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.
Los trastornos del SNC abarcan numerosas afecciones tales como enfermedades neurodegenarativas (v.g., de Alzheimer y Parkinson), lesión cerebral aguda (v.g., apoplejía, lesión de la cabeza, parálisis cerebral) y un gran número de disfunciones del SNC (v.g., depresión, epilepsia y esquizofrenia). En los últimos años las enfermedades neurodegenerativas se han convertido en un importante punto de preocupación debido a la expansión de la población de edad que es la que está en mayor riesgo de padecer estos trastornos. Estas enfermedades, entre las que se incluyen la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad de Parkinson, han sido relacionadas con la degeneración de células neurales en localizaciones determinadas del SNC, que conduce a la incapacidad de estas células o de la región del cerebro de llevar a cabo su función concreta. Además de las enfermedades neurodegenerativas, las lesiones cerebrales agudas tienen como resultado frecuentemente una pérdida de células neurales, el funcionamiento inapropiado de la región cerebral afectada y posteriores anormalidades en la conducta. Probablemente, la mayoría de las disfunciones del SNC más extendidas (en lo que se refiere al número de personas afectadas) no se caracteriza por una pérdida de células neurales sino más bien por un funcionamiento anormal de células neurales existentes. Esto se puede deber a un consumo inapropiado de las neuronas, o la síntesis, liberación y procesamiento inapropiados de neurotransmisores. Estas disfunciones pueden ser el resultado de trastornos muy estudiados y caracterizados tales como la depresión y la epilepsia, o de trastornos menos comprendidos tales como neurosis y psicosis.
Hasta la fecha, el tratamiento de los trastornos del SNC ha consistido principalmente en la administración de compuestos farmacéuticos. Desgraciadamente, este tipo de tratamiento está asociado a numerosas complicaciones incluyendo la limitada capacidad de transportar fármacos a través de la barrera hemato-encefálica y la tolerancia a los fármacos que adquieren los pacientes a los que se administran estos fármacos a largo plazo. Por ejemplo, se ha conseguido la restauración parcial de la actividad dopaminérgica en pacientes de Parkinson con levodopa, que es un precursor de dopamina capaz de cruzar la barreara hemato-encefálica. Sin embargo, los pacientes se hacen tolerantes a los efectos de levodopa y, por tanto, cada vez se necesitan dosis más grandes para mantener su efecto. Por otra parte, existe una serie de efectos secundarios asociados con levodopa como por ejemplo un mayor movimiento incontrolado.
Recientemente, se ha aplicado el concepto de injerto de tejido neurológico para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson. Los injertos neurales pueden evitar la necesidad no solamente de una administración de fármaco continua, sino también de complicados sistemas de administración de fármaco que surgen como consecuencia de la barrera hematoencefálica.
Se han utilizado células genéticamente modificadas en injerto de tejido neurológico con el fin de reemplazar células perdidas que producen normalmente un neurotransmisor. Por ejemplo, se han modificado genéticamente fibroblastos con un vector de retrovirus que contiene un ADNc para tirosina hidroxilasa, que les permite producir dopamina, y han sido implantados en modelos animales de enfermedad de Parkinson (Gage y cols., patente EE.UU. Nº 5.082.670).
Al mismo tiempo que el uso de fibroblastos modificados genéticamente para tratar trastornos del SNC ha demostrado ser prometedor para mejorar algunos déficits de la conducta en modelos animales de enfermedad de Parkinson, y representa un nuevo método para suministrar un transmisor necesario al SNC, presenta también algunos inconvenientes significativos como tratamiento para la enfermedad de Parkinson y en general como método terapéutico para tratar enfermedades neurodegenerativas y lesiones cerebrales. En primer lugar, el SNC se compone principalmente de tres tipos de células - neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los fibroblastos no están presentes. Aún no se ha estudiado la implantación de una célula extraña en el SNC y sus efectos directos e indirectos en el funcionamiento de las células huésped. Sin embargo, es probable que la expresión de factores unidos a membrana y la liberación de moléculas solubles tales como factores de crecimiento y proteasas, altere el comportamiento normal del tejido circundante. Esto puede tener como resultado la interrupción de patrones de consumo neuronal ya sea por acción directa sobre las neuronas como por alteración del funcionamiento normal de células de glía.
Otra preocupación que surge cuando se implantan fibroblastos en el SNC es la posibilidad de que las células implantadas puedan conducir a la formación de tumor ya que la inhibición intrínseca de la división de fibroblastos se controla insuficientemente. Por el contrario, las señales extrínsecas desempeñan un papel principal en el control del número de divisiones que experimenta la célula. El efecto del entorno del SNC en a división de fibroblastos implantados y la alta probabilidad de formación de tumor fibroblástico no ha sido estudiada a largo plazo.
Un tercer punto de preocupación que supone el transplante de fibroblastos al SNC es que los fibroblastos no se pueden integrar con las células del SNC como lo hacen los astrocitos, los oligodendrocitos o las neuronas. Los fibroblastos están limitados intrínsecamente en su capacidad de prolongar los procesos de tipo neuronal y formar sinapsis con tejido huésped. Por lo tanto, aunque la modificación genética y la implantación de fibroblastos en el SNC supone una mejora con respecto a la tecnología actual para suministrar determinadas moléculas al SNC, la incapacidad de los fibroblastos de integrarse y funcionar como tejido del SNC, sus efectos negativos potenciales sobre las células del SNC, y su limitado control de proliferación intrínseco limitan su uso en la práctica para implantación para el tratamiento de lesiones o enfermedades del SNC agudas o crónicas.
Un tejido preferible para la modificación genética y la implantación serían las células del SNC - neuronas, astrocitos u oligodendrocitos. Una fuente de células SNC es el tejido fetal humano. Se ha demostrado a través de varios estudios mejoras en pacientes afectados por la enfermedad de Parkinson después de recibir implantes de tejido CNS fetal. Los implantes de tejido mesencefálico embriónico que contiene células de dopamina en el núcleo caudado y putamen de pacientes humanos fue demostrado por Freed y cols. (N Engl J. Med. 327: 1549-1555 (1992) demostrándose que ofrecía un beneficio clínico a largo plazo a algunos pacientes en un estadio avanzado de la enfermedad de Parkinson. Spencer y cols. (N. Engl. J. Med. 3271541-1548 (1992)) han demostrado un éxito similar. Widner y cols. (N. Engl J. Med. 327: 1556-1563 (1992)) han demostrado mejoras funcionales a largo plazo en pacientes con Parkinson inducido por MPTP que recibieron implantación bilateral de tejido mesencefálico fetal.
Si bien los estudios indicados resultan alentadores, el uso de tejido fetal abortado para el tratamiento de enfermedades despierta consideraciones éticas y obstáculos políticos, existiendo además otras consideraciones. El tejido del SNC fetal se compone de más de un tipo de células y, por tanto, no es una fuente de tejido bien definida. Por otra parte, existen serias dudas sobre si sería asequible un suministro adecuado y constante de tejido fetal para transplantes. Por ejemplo, en el tratamiento de Parkinson inducido por MPTP (Widner, supra) se utilizó tejido de 6 a 8 fetos para implantes en el cerebro de un solo paciente. Existe además el problema adicional del potencial de contaminación durante la preparación del tejido fetal. Asimismo, es posible que el tejido esté ya infectado con bacterias o virus, requiriéndose así una cara prueba de diagnóstico para cada feto que se utilice. Sin embargo, es posible que ni siquiera las pruebas de diagnóstico puedan descubrir todo el tejido infectado. Por ejemplo, el diagnóstico de tejido libre de VIH no está garantizado ya que los anticuerpos para el virus no están presentes generalmente hasta que no transcurren varias semanas después de la infección.
En lugar de tejido fetal, sería más preferible contar con una fuente de tejido reproducible y bien definida para transplante que fuera asequible en cantidades ilimitadas. Dado que el tejido neural experimenta una división mínima, no satisface fácilmente estos criterios. Si bien que los astrocitos retienen su capacidad de dividirse y probablemente son sensibles a la infección con genes extraños, su capacidad de formar sinapsis con células neuronales está limitada y, en consecuencia, también lo está su regulación extrínseca de la expresión y liberación del producto génico extraño.
Los oligodendrocitos adolecen de algunos de estos mismos problemas. Adicionalmente, los oligodendrocitos maduros no se dividen limitando la infección de oligodendrocitos a sus células progenitoras (es decir, células 02A). Sin embargo, dada la limitada capacidad de proliferación de los progenitores de oligodendrocitos, la infección y la cosecha de estas células no representa una fuente práctica.
La infección de neuronas con genes extraños y el implante en el SNC sería ideal dada su capacidad de extender procesos, hacer sinápsis y ser regulados por el entorno. No obstante, las neuronas diferenciadas no se dividen y la transfección con genes extraños por medios físicos y químicos no es eficaz, ni tampoco son estables durante períodos de tiempo prolongados. La infección de precursores neuronales primarios con vectores retrovíricos in vitro no resulta práctica tampoco ya que los neuroblastos están intrínsecamente controlados para experimentar un limitado número de divisiones haciendo la selección de un gran número de neuronas, que incorporan y expresan el gen extraño, prácticamente imposible. Existe una serie de informes sobre la inmortalización de células neurales con oncogenes, por ejemplo, consultar Renfranz y cols. (Cell, 1991, vol.6, pp. 713-729), Synder y cols. (Cell, 1992, vol. 68, pp 33-51), Galiana y cols. (Journal of Neuroscience Research, 1990, vol. 26, pp. 269-277), Constance L. Cepho (Ann. Rev. Neurosci. 1989, vol. 12, pp. 47-65) y WO 89/03872. La posibilidad de inmortalizar precursores neuronales por transferencia retroviral de oncogenes y su subsiguiente infección de un gen deseado no es preferible dada la posibilidad potencial de formación de tumor a partir de las células implantadas.
El crecimiento de células estriatales no inmortalizadas aisladas de cerebro de ratón embriónico y adulto en presencia de factores de crecimiento se describe en Reynolds y cols. en Society for Neurosciences, 16 1147 Co 2, abstract Nº 474,2 y Science, 1992, vol. 255, pp. 1707-1710.
Una tentativa para superar los problemas asociados con la incapacidad de las neuronas de pasar por un número significativo de divisiones se describe en Ronnett y cols., que han establecido una línea celular neuronal (Science, 248: 603-605 (1990)). La línea celular es no-maligna, pero se deriva de tejido cortical cerebral obtenido de un paciente con megalocefalia unilateral, un trastorno de neuronas de desplazamiento y proliferación de tipo bajo. Sin embargo, dadas las características de esta línea celular, es cuestionable en cuanto a que las células sean capaces de detener la división una vez implantada en un SNC huésped.
Otro método para introducir genes extraños en el SNC es el sugerido por Morshead and Van Der Koy (J. of Neurosci., 12(1): 249-256 (1992)). Se infectaron células subependimarias con retrovirus recombinantes deficientes en replicación que llevaban el gen para E. coli \beta-galactosidasa. Se observó utilizando incorporación de ^{3}H-timidina y BrdU que había una división mitótica continua en esta región del SNC. Morshead and Van Der Koy sugieren que las células en proliferación son células primordiales basándose en el hecho de que las células se dividen continuamente al modo de las células primordiales asimétricas; es decir, la célula en división da lugar a una célula multipontencial, al tiempo que el destino de la otra célula hija es la muerte celular. La base para esta idea es que, mientras que hay una velocidad de división constante, no se produce ningún aumento significativo del número de células en esa región del SNC. La transfección de cultivos del cerebelo de rata primario con retrovirus que llevan el gen E-coli Lac Z también ha sido descrita por McKay y cols. (Cold Spring Harbour Symposia on quantitative Biology, 1990, vol. LV, Cold Spring Laboratory Press). Geller and Breakfield (1988) vol. 241, pp. 1667-1669 han emprendido un método similar, según el cual se transfectan neuronas adultas con un virus herpes simplex defectuoso que lleva el gen E-coli Lac Z.
El hecho de que las células primordiales endógenas se dividan de forma continua las convierte en dianas adecuadas de modificación genética vía infección retriviral. Sin embargo, estas células existen dentro del SNC a una densidad de menos de aproximadamente 5 células/100 micrómetros cúbicos y es probable que la velocidad y número de divisiones sea al menos parcialmente bajo control epigenético. Por consiguiente, una de las principales limitaciones de la células primordiales subependimarias de proliferación endógena es que están presentes en el SNC en un número fijo y la introducción de genes nuevos sería difícil de controlar. Una segunda importante limitación es que, en roedores y primates, las células aparecen restringidas en el espacio a la capa subependimaria y ni la célula primordial ni su progenie se desplazan a otras regiones del SNC (Smart, J. of Comp. Neurology, 116: 325-347 (1961); Lewis, Nature, 217: 974-975, (1968)). No se han descrito células similares en otras regiones del SNC y, si no existen, no están caracterizadas.
La incapacidad de la técnica anterior de realizar transplantes de tejido no-SNC para su completa integración en el tejido huésped, y la falta de disponibilidad de células del SNC integrables no tumorigénicas en cantidades ilimitadas a partir de una fuente fiable para injerto constituyen tal vez las limitaciones máximas del neurotransplante.
Compendio de la invención
Teniendo en cuenta las deficiencias que se han mencionado en relación con la técnica anterior, incluyendo métodos de cultivo y transplante de células neurales, debería quedar puesto de manifiesto que aún existe la necesidad dentro de la técnica de contar con una fuente fiable de un número ilimitado de células no transformadas para neurotransplante, que se puedan modificar genéticamente y que puedan diferenciarse entre neuronas y células de glía, y que se puedan integrar en el SNC de mamíferos.
Por consiguiente, uno de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar una fuente de células epigenéticamente reguladas y genéticamente modificadas para transplante que, tras el transplante en el SNC, se diferencian además en neuronas y células gliales y se integran en la estructura de SNC existente.
Otro de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar una fuente abundante de células que se puedan manipular en gran medida con fines de modificación genética.
Otro objeto más de la presente invención consiste en proporcionar células genéticamente modificadas que se pueden implantar fácilmente en cualquier región próxima al SNC.
Tanto éstos como otros objetos y rasgos de la presente invención se pondrán de manifiesto para las personas especializadas en este campo a partir de la descripción detallada que se expone a continuación y de las reivindicaciones adjuntas.
Se describe un método para producir células genéticamente modificadas útil en el tratamiento de trastornos del SNC. Dicho método incluye las etapas de (a) aislamiento de células primordiales neurales desde tejido donador, (b) proliferación de las células primordiales neurales en un medio de cultivo que contiene uno o más factores de crecimiento para obtener células precursoras, y (c) modificación genética de las células primordiales y precursoras para producir células que son útiles en el tratamiento de trastornos del SNC.
En particular, la invención se refiere a un método para producir células primordiales neurales del sistema nervioso central (SNC) multipotentes genéticamente modificadas no tumorigénicas que consiste en las siguientes etapas:
(a) aislamiento de células primordiales neurales del SNC multipotentes desde tejido neural excluyendo tejidos/células embriónico humano, no habiéndose inmortalizado las células primordiales neurales con un oncogen, siendo capaces dichas células primordiales neurales del SNC de producir progenie con la capacidad de diferenciarse entre neuronas, astrocitos y oligodendrocitos;
(b) proliferación de dichas células primordiales neurales del SNC multipotentes en un medio de cultivo sin suero que contiene factor de crecimiento efectivo para inducir la proliferación de células primordiales neurales del SNC multipotentes,
(c) posterior propagación de las células proliferadas y
(d) modificación genética de dichas células propagadas mediante la introducción de un polinucleótido exógeno en las células proliferadas.
Las células primordiales neurales del SNC modificadas genéticamente no tumorigénicas de la invención son útiles en un método de tratamiento de trastornos del SNC en virtud del cual se transplantan células precursoras modificadas genéticamente que producen una sustancia biológicamente activa útil para el tratamiento de un trastorno del SNC en el SNC de un receptor.
Se cree que ninguno de los documentos de referencia mencionados describe la presente invención tal como se reivindica y no se considera como técnica anterior. Los documentos de referencia se indican con el propósito de proporcionar información de los antecedentes.
Breve descripción de los gráficos
Figura 1: fotografía de células precursoras genéticamente modificadas infectadas con un retrovirus que contiene el gen \beta-galactosidasa. Las células que contienen el gen presentan un producto de reacción azul característico.
Figura 2: fotografía de una sección de implantación tras 2-4 semanas de cortex de ratón recién nacido en el que se habían implantado células precursoras con contenido en \beta-galactosidasa. Las células implantadas que contienen el gen \beta-galactosidasa presentan un producto de reacción azul característico.
Descripción detallada de los modos de realización preferibles
Reynolds y Weiss, Science 255: 1707 (1992) han descrito células primordiales neurales (CPN) y su uso potencial. El 'término "célula primordial" se refiere a una célula no diferenciada que es capaz de una proliferación ilimitada y de dar lugar a más células primordiales que tienen la capacidad de generar un gran número de células progenitoras que pueden dar lugar a su vez a células hijas diferenciadas o diferenciables. El término "célula primordial neural" (CPN) se refiere a las células primordiales de la presente invención, cuya progenie, en condiciones de cultivo apropiadas, incluye células progenitoras tanto gliales como neuronales. Se ha demostrado que las CPN dan lugar a neuroblastos (Reynolds and Weiss, Restorative Neurology & Neuroscience 4: 208 (1992). Se sabe asimismo que las CPN dan lugar a tipos celulares macrogliales principales (astrocitos y oligodendrocitos).
Las células primordiales neurales se pueden generar a partir de diversos tejidos donadores entre los que se incluyen tejido neural fetal o adulto de origen humano o de otro animal y cultivados según el método de Reynolds and Weisss (supra). El término "donador" se refiere al ser humano o animal que sirve como fuente de las células primordiales neurales utilizadas en la presente invención. En algunas situaciones, el donador puede ser un animal transgénico. El término "animal transgénico" se refiere a animales no humanos en los que se ha integrado físicamente un segmento de ADN en el genoma de todas las células, incluyendo células germinales, de manera que se puede transmitir el ADN a la descendencia.
Las células primordiales neurales de la presente invención son sensibles al factor de crecimiento. Cuando se cultivan en un medio de cultivo sin suero definido, y en presencia de un factor de crecimiento o mitógeno, como por ejemplo un factor de crecimiento epidérmico (EGF) o similar, se induce la división de las células dando lugar a racimos de células no diferenciadas. El término "neuroesfera" se utiliza para referirse a los racimos de células. Al menos parte de las células son del fenotipo nestina (+). El racimo consiste en células primordiales y/o células progenitoras y puede incluir o no células diferenciadas. El término "células progenitoras" se refiere a células no diferenciadas derivadas de células primordiales neurales, cuya progenie puede incluir, en condiciones apropiadas, células progenitoras neuronales y/o gliales.
Tal como se utiliza aquí, el término "células precursoras" se refiere a células vivas de la presente invención que se derivan de células primordiales neurales proliferadas en un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento o una combinación de factores de crecimiento, e incluye células tanto progenitoras como primordiales. Las células de la neurospera se denominan en adelante células precursoras. Las células precursoras se cultivan típicamente en forma de neuroesferas, pero pueden presentar diferentes patrones de crecimiento dependiendo de las condiciones de cultivo. El término "factor de crecimiento", tal como se utiliza aquí se refiere a una proteína, péptido, mitógeno, u otras moléculas que tienen un efecto de crecimiento, proliferativo, diferenciador o trófico. El término factor de crecimiento también abarca cualquier combinación de factores de crecimiento. Entre los factores de crecimiento se incluyen factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento de fibroblasto ácido y básico (aFGF, bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), hormona de liberación de tirotropina (TRH), EGF, y ligando de tipo EGF, anfirregulina, factor alfa y beta de crecimiento de transformación (TGF\alpha, TGF\beta), factores de crecimiento de tipo insulina (IGFs), y similares.
Si bien las células precursoras son células primarias no transformadas, poseen características de una línea celular continua. En el estado no diferenciado en presencia de un factor de crecimiento como EGF, las células se dividen de forma continua y por consiguiente son excelentes dianas de modificación genética. El término "modificación genética", tal como se utiliza aquí, se refiere a una alteración estable o transitoria del genotipo de una célula precursora por introducción de ADN exógeno. El ADN puede ser sintético, o de origen natural, y puede contener genes, porciones de genes, u otras secuencias de ADN útiles. No se pretende incluir en el término "modificación genética", tal como se utiliza aquí, alteraciones naturales tales como las que se dan a través de actividad viral natural, recombinación genética natural, o similares. El ADN exógeno puede introducirse en una célula precursora a través de vectores virales (retrovirus, herpes viral modificado, herpes viral, adenovirus, virus adeno-asociado, y similares) o transfección de ADN directa (lipofección, transfección de fosfato cálcico, DEAE-dextrano, electroporación, y similares). Las células genéticamente modificadas de la presente invención poseen la ventaja adicional de tener la capacidad de diferenciarse completamente para producir neuronas o células macrogliales de un modo reproducible utilizando una serie de protocolos de diferenciación.
Las células precursoras se pueden derivar de animales transgénicos no humanos y, por lo tanto, en cierto sentido, están ya genéticamente modificadas. Existen varios métodos que se utilizan actualmente para generar animales transgénicos. La técnica que se utiliza con mayor frecuencia consiste en la microinyección directa de ADN en óvulos fertilizados de una sola célula. Otras técnicas incluyen transferencia mediada por retrovirus, o transferencia génica en células primordiales embriónicas. Estas técnicas, junto con otras, se describen detalladamente en Hogan y cols., en Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Ed., 1986), que se incorpora al presente documento como referencia. El uso de estos animales transgénicos presenta determinadas ventajas entre las que se incluyen el hecho de que no existe necesidad de transfectar neuroesferas sanas. Las células precursoras de animales transgénicos presentarán una expresión génica estable. Si se utilizan animales transgénicos, es posible criar nuevas combinaciones genéticas. El animal transgénico puede tener integrado en su genoma cualquier gen útil que se exprese a través de células neurales. En la explicación de células precursoras de modificación genética se dan ejemplos de ADN útil.
Un reto significativo para el transplante celular en el SNC es la identificación de las células donadoras tras la implantación dentro del huésped. Se han empleado diversas estrategias para marcar las células donadoras, incluyendo etiquetas tritiadas, colorantes fluorescentes, dextranos y vectores virales que llevan genes informadores (reporter). Sin embargo, estos métodos adolecen de problemas inherentes de toxicidad, estabilidad, o dilución a largo plazo. El uso de células neurales derivadas de animales transgénicos puede proporcionar un medio perfeccionado a través del cual se puede conseguir la identificación de células neurales transplatadas. Un sistema de marcado transgénico proporciona un método más estable y eficaz para etiquetar células. En dicho sistema, elementos promotores, como por ejemplo para proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) y proteína básica de mielina (MBP), pueden dirigir la expresión de gen informador E. coli \beta-galactosidasa en ratones transgénicos. En estos sistemas, la expresión específica de célula del gen informador se da en astrocitos (GFAP-lacZ) y en oligodendrocitos (MBP-lacZ) en una forma regulada con el desarrollo.
Una vez propagadas, las células de neuroesfera se disocian mecánicamente en una suspensión celular única y se colocan en placa en placas petri en un medio en el que se les permite unirse durante toda la noche. A continuación, se modifican genéticamente las células precursoras. Si las células precursoras se generan desde animales transgénicos, pueden someterse o no a posterior modificación genética, dependiendo de las propiedades que se deseen de las células. Entra dentro del alcance de la presente invención cualquier modificación genética de las células útil. Por ejemplo, se pueden modificar células precursoras para producir o aumentar la producción de una sustancia biológicamente activa como, por ejemplo, un neurotransmisor o un factor de crecimiento, o similar. La modificación genética se lleva a cabo tanto por infección con retrovirus recombinantes como por transfección utilizando métodos conocidos dentro de la técnica (véase Maniatis y cols., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982)). Brevemente, los constructos de gen híbridos tendrán un contenido viral, por ejemplo repetición terminal larga de retrovirus (LTR), virus de simio 40 (SV40), citomegalovirus (CMV); o promotores específicos de células de mamífero tales como tirosina hidroxilasa (TH), dopamina \beta-hidroxilasa (DBH), feniletanolamina N-metiltransferasa (PNMT), colina acetiltransferasa (ChAT), proteína ácida fibrilar de glía (GFAP), enolasa específica de neurona (NSE), proteínas de neurofilamento (NF) (NF-L, NF-M, NF-H, y similares) que dirigen la expresión de los genes estructurales que codifican la proteína deseada. Por otra parte, los vectores incluirán un marcador de selección de fármaco, como por ejemplo el gen E. coli aminoglicosida fosfatransferasa, que al co-infectarse con el gen experimental confiere resistencia a la geneticina (G418), un inhibidor de síntesis de proteína.
Cuando la modificación genética es para la producción de una sustancia biológicamente activa, la sustancia será por lo general una sustancia que sea útil para el tratamiento de un trastorno del SNC determinado. Por ejemplo, puede ser deseable modificar genéticamente células para que segreguen un determinado producto de factor de crecimiento. Tal como se utiliza aquí, el término "producto de factor de crecimiento" se refiere a una proteína, péptido, mitógeno, u otra molécula que tiene un efecto de crecimiento, proliferativo, diferenciador, o trófico. Los productos de factor de crecimiento útiles en el tratamiento de trastornos del SNC incluyen, sin limitarse sólo a ellos, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), las neurotrofinas (NT-3, NT-4/NT-5), factor neurotrófico ciliar (CNTF), anfirregulina, bFGF, aFGF, EGF, TGF\alpha, TGF\beta, PDGF, IGFs e interleucinas.
Se pueden modificar las células también para expresar determinado receptor de factor de crecimiento (r) incluyendo, sin limitarse sólo a ellos, NGFr de baja afinidad p75, CNTFr, la familia trk de receptores de neurotrofina (trk, trkB, trkC), EGFr, FGFr y receptores de anfirregulina. Se pueden manipular por ingeniería las células para producir diversos neurotransmisores o sus receptores tales como serotonina, L-dopa, dopamina, norepinefrina, epinefrina, taquicina, sustancia-P, endorfina, encefalina, histamina, N-metil D-aspartato (NMDA), glicina, glutamato, ácido \gamma-amino butírico (GABA), acetilcolina y similares. Entre los genes de síntesis de neurotransmisor útiles se incluyen TH, dopa decarboxilasa (DDC), DBH, PNMT, decarboxilasa de ácido glutámico (GAD), triptofano hidroxilasa, ChAT e histidina decarboxilasa. Entre los genes que codifican los diversos neuropéptidos que pueden resultar útiles en el tratamiento de trastornos del SNC se incluyen sustancia P, neuropéptido Y (NP-Y), encefalina, vasopresina, péptido intestinal vasoactivo (VIP), glucagòn, bombesina, colecistoquinina (CCK), somatostatina, péptido relacionado con gen cacitonina (CGRP) y similares.
Después de seleccionar con éxito las células transfectadas/infectadas, se clonan utilizando placas de multi-pocillo 96 de dilución limitada y se ensayan para determinar la presencia de la sustancia biológicamente activa deseada. Se cultivan los clones que expresan niveles altos de la sustancia deseada y se expande su número en matraces en T. Se puede ciro-preservar entonces la línea celular específica. Se puede utilizar la línea celular precursora genéticamente modificada para terapia de célula/gen, e implantar de esta forma en el SNC de un receptor que necesita la molécula biológicamente activa producida a través de células genéticamente modificadas. Se obtendrán múltiples clones de células precursoras genéticamente modificadas. Algunas pueden dar lugar preferencialmente a células neuronales y algunas a células gliales.
Alternativamente, se pueden someter las células precursoras genéticamente modificadas a diferentes protocolos de diferenciación in vitro antes de la implantación. Por ejemplo, se pueden separar células precursoras genéticamente modificadas del medio de cultivo que permite la proliferación y tratarlas con un medio de cultivo que contenga un factor de crecimiento o una combinación de factores de crecimiento que induzca la diferenciación de las células en neuronas o células macrogliales. Los protocolos de diferenciación se exponen en la solicitud de patente co-pendiente U.S.S.N. 07/967.622, registrada el 28 de octubre de 1992 y publicada como WO94/10292 el 11 del 5 de 1994. El protocolo utilizado dependerá del tipo de célula genéticamente modificada deseada. La diferenciación puede ser inducida también por colocación en placa de células precursoras sobre un sustrato fijo, incluyendo recipientes recubiertos con poli-L-ornitina o poli-L-lisina o similares.
Se utilizan diversos marcadores para identificar las células diferenciadas. Las células precursoras de oligodendrocitos, que pueden dar lugar a oligodendrocitos pueden tener el fenotipo A2B5 (+), 04(+)/GalC(-), MBP(-) y GFAP(-) [pero no se limitan a este fenotipo]. Los oligodendrocitos, que son células gliales que forman la mielina que rodea los axones en el SNC, tienen el fenotipo galactocerebrosida (+), proteína básica de mielina (+), y proteína ácida fibrilar de la glía (-) [GalC(+), MBP(+), GFAP(-)].
Las neuronas pueden poseer uno o más de los siguientes marcadores fenotípicos: enolasa específica de neurona (NSE), las proteínas de neurofilamento (NF), tau-1 y MAP-2. Las neuronas también se pueden identificar en función de la expresión de cualquiera de una serie de enzimas de neurotransmisor clásicas. Por otra parte, las neuronas se pueden identificar en función de criterios morfológicos y otras medidas funcionales tales como registro electrofisiológico. Dicha identificación se puede llevar a cabo en combinación con la identificación de uno o más de los marcadores fenotípicos que se han enumerado anteriormente.
Los astrocitos de tipo I son células gliales que tienen una morfología de tipo protoplásmico/fibroblasto. Estas células tienen el fenotipo GFAP(+), A2B5 (-), GalC (-), y MBP(-). Los astrocitos de tipo II, que son células gliales que presentan una morfología que lleva proceso de estelato, tienen el fenotipo GFAP(+), A2B5(+), GalC(-) y MBP(-).
Una vez que se han diferenciado las células, se vuelven a ensayar para determinar la expresión de la proteína deseada. Las células que tienen el fenotipo deseado se pueden aislar e implantar en receptores que necesitan la proteína o la molécula biológicamente activa que se expresa a través de la célula genéticamente modificada.
Se puede aplicar cualquier método adecuado para la implantación de células precursoras en el SNC de manera que las células se integren apropiadamente en el SNC. Son preferibles los métodos de inyección que se ilustran a través de los empleados por Duncan y cols., J. Neurocytology, 17:351-361 (1988) y que se aumentan a escala y modifican para su uso en seres humanos. Se pueden emplear asimismo para la inyección de células precursoras los métodos instruidos por Gage y cols., patente EE.UU. Nº 5.082.670, para la inyección de suspensiones celulares tales como fibroblastos en el SNC. Otros planteamientos y métodos adicionales se pueden encontrar en Neural Grafting in the Mammalian CNS, Bjorkund and Stenevi, eds., (1985). El número de células genéticamente modificadas inyectadas será el que sea necesario para proporcionar un efecto terapéutico y variará dependiendo del estado patológico que se esté tratando. Generalmente, las células precursoras neurales modificadas genéticamente estarán presentes en el cerebro en una concentración superior a 10 células/100 micrómetros cúbicos.
Cuando se van inyectar las células precursoras en el receptor y se derivan de un tejido no-huésped (es decir un aloinjerto o xenoinjerto), pueden ser necesarias técnicas de inmunosupresión para asegurar la longevidad del transplante. Gruber, Transplantation 54:1-11 (1992), que se incorpora al presente documento como referencia, describe la inmunosupresión local. Rossini, patente EE.UU. Nº 5.026.365, describe métodos de encapsulación adecuados para inmunosupresión local.
Como alternativa al uso de técnicas de inmunosupresión, se pueden aplicar métodos de reemplazamiento o eliminación progresiva genética utilizando recombinación homóloga en células primordiales embriónicas, tal como instruye Smithies y cols. (Nature, 317: 230-234 (1985)), y reemplazamiento o eliminación progresiva genética en líneas celulares (H. Zheng 35 y cols., PNAS, 88: 8067-8071 (1991)), a las células precursoras para la ablación de genes de complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Las células precursoras que carecen de expresión MHC permitirían el injerto de poblaciones celulares neurales enriquecidas a través de barreras de hitocompatibilidad alogénicas, y tal vez xenogeneicas, sin necesidad de inmunosuprimir el receptor. Gruber (supra) también describe informes generales y citas sobre el uso de métodos recombinantes para reducir la antigenicidad de células donantes. Faustman WO 92/04033 (1992) describe métodos ilustrativos para la reducción de inmunogenicidad de transplantes por modificación superficial.
A pesar de que los fragmentos de tejido sólidos y las suspensiones celulares de tejido neural son inmunogénicos globalmente, podría ser posible que los tipos celulares individuales dentro del injerto sean en sí mismos inmunogénicos en un menor grado. Por ejemplo, Barlett y cols. (Prog. Brain Res. 82: 153-160 (1990)), han abolido el rechazo a aloinjerto neural a través de la pre-selección de una subpoblación de células neuroepiteliales embriónicas para injerto mediante el uso de separación de inmunoperla en función de la expresión de MHC. Así pues, se proporciona otro método para reducir la posibilidad de rechazo a aloinjerto y xenoinjerto por parte del receptor sin aplicar técnicas de inmunosupresión.
Los resultados de las pruebas de transplante humano han demostrado que la supervivencia de aloinjerto de tejido mesencefálico fetal en cerebro afectado por Parkinson es relativamente es relativamente escasa (Freed y cols., and Spencer y cols. supra). La escasa supervivencia del material injertado podría estar causada por los mismos factores asociados a la enfermedad que causaron la neurodegeneración original. Se podría predecir que el entorno, que era tóxico para las propias neuronas del receptor, podría ser tóxico similarmente para el tejido o células injertadas. Esto se corrobora con los informes de una significativa mejora funcional proporcionada por el tejido mesencefálico fetal implantado en seres humanos lesionados con MPTP (Widner y cols., supra). En contraposición con la situación del cerebro afectado por la enfermedad de Parkinson, el Parkinson inducido por MPTP es principalmente una pérdida funcional de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra sin los procesos idiopáticos subyacentes asociados con la enfermedad de Parkinson. En contraposición con el cerebro de la enfermedad de Parkinson, es probable que el cerebro humano lesionado con MPTP esté despejado de sustancias neurotóxicas en el momento del implante.
Recientemente, Liu y cols. (Cell, 70: 539-551 (1992)) ha descrito un nuevo ADNc transportador de amina de gránulo de cromafín (CGAT) que proporciona resistencia a la neurotoxina MPP+ en células CHO in vitro. Dado que las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra son eliminadas específicamente por MPP+, la expresión de gen CGAT en células precursoras puede mejorar la viabilidad de las células después de ser implantadas en el cerebro afectado por Parkinson.
Con el propósito de explicar con mayor profundidad la invención que se ha descrito, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos tienen como único propósito un fin ilustrativo y no debe considerarse en absoluto que limiten el alcance de la invención en ningún modo.
Ejemplo Ejemplo 1 Propagación de células precursoras
Se decapitaron ratones albinos CD_{1} de 14 días embriónicos (E14) (Charles River) y se extirparon el cuerpo estriado y el cerebro utilizando un procedimiento esterilizado. Se disoció mecánicamente el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego en un medio sin suero compuesto de una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) y una mezcla de nutrientes F-12 (Gibco). Se centrifugaron las células a 800 r.p.m. durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en medio DMEM/F-12 para el recuento.
Se suspendieron las células en un medio sin suero, denominado a continuación "medio completo", compuesto de DMEM/F-12 (1:1) que incluía glucosa (0,6%), glutamina (2 mM), bicarbonato sódico (3 mM), tampón HEPES (ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperacinaetanosulfónico) (5 mM) y una mezcla de hormonas definida y una mezcla de sales (para reemplazar el suero) que incluía insulina (25 \mug/ml), transferrina (100 \mug/ml), progesterona (20 nM), putrescina (60 \muM) y cloruro de selenio (30 nM) (todos de Sigma a excepción de la glutamina [Gibco]). Por otra parte, el medio contenía 16-20 ng/ml de EGF (purificado de glándula submaxilar de ratón, Collaborative Research) o TGF\alpha (recombinante humano, Gibco). Se colocaron en placa las células a 0,2 x 10^{6} células/ml en matraces de cultivo de tejido de 75 cm^{2} (Corning) sin tratamiento previo de sustrato y se alojaron en una incubadora a 37ºC, 100% de humedad, 95% de aire/5% de CO_{2}.
Las células proliferaron en las primeras 48 horas y a los 3-4 días in vitro (DIV) formaron pequeños racimos, conocidos como neuroesferas, que hicieron despegar el sustrato entre 4-6 DIV.
Al cabo de 7 DIV, se sacaron las neurosferas, se centrifugaron a 400 r.p.m. durante 2-5 minutos y se disoció mecánicamente el aglomerado en células individuales con una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego en 2 mls de medio completo.
Se volvieron a colocar en placa 1 x 10^{6} células en matraz de cultivo de tejido de 75 cm^{2} con 20 mls de medio completo con contenido en EGF. Se reinició la proliferación de las células primordiales y la formación de nuevas neuroesferas. Se puede repetir este procedimiento cada 6-8 días para generar un número ilimitado de células primordiales.
Ejemplo 2 Modificación genética de células precursoras con un retrovirus que contiene el gen \beta-galactosidasa bacteriano
Se propagaron células precursoras tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Se agitó un matraz grande de paso 1 de neuroesferas (4-5 días de vida) para desalojar las esferas del matraz. Se centrifugó el matraz a 400 r.p.m. durante 3-5 minutos. Se eliminó aproximadamente la mitad del medio sin perturbar las neuroesferas. Se sacaron las esferas y el resto del medio, se colocaron en un tubo de centrífuga de 12 ml Falcon, y centrifugó a 600 r.p.m. durante 3-5 minutos. Se sacó el medio que quedaba, dejando unos cien microlitros.
Se empaquetó y segregó un retrovirus que contenía el gen \beta-galactosidasa bacteriano, de un modo deficiente en replicación, a través de la línea celular CRE BAG2 producida por C. Cepko. Un día después de que las células CRE alcanzaran la confluencia, se lavaron las células con PBS y se recogió el retrovirus en DMEM/F12/HM/20 ng/ml EGF durante cuatro días. Se filtró el medio que contenía virus a través de in filtro de jeringuilla de 0,45 \mum. Se resuspendieron las neuroesferas en los medios que contenían virus, se transfirieron a un matraz grande, y se dejaron en una incubadora durante toda la noche a 37ºC. Al día siguiente, se transfirió el contenido del matraz a un tubo de centrífuga de 12 ml y se centrifugó a 800 rpm. Se resuspendieron las células en el medio contenido en EGF/HM, se disoció en células únicas y se hizo el recuento. Se colocaron en placa las células en un matraz grande a 50.000 células /ml en un total de 20 mls.
Cuatro días después, se seleccionaron las células transformadas con G418 a una concentración de 300 \mug/ml. Se colocaron en placa las esferas transformadas en un portaobjetos de vidrio recubierto con poliornitina en una placa de 24 pocillos. Una vez que se adhirieron las neuroesferas a la placa, se fijaron las células con glutarladehído al 0,1% durante 5 minutos a 4ºC. Una vez que se fijaron las células, se lavaron dos veces con PBS durante 10 minutos. A continuación, se lavaron las células con Triton® al 0,1% en PBS durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió una solución de X-Gal 1 mg/ml a cada pocillo y se incubó durante toda la noche a 37ºC. Después de incubarlo durante toda la noche, se lavaron las células tres veces con PBS durante 10 minutos cada vez y se observó para detectar los productos de reacción. Una reacción positiva tuvo como resultado un color azul que indicó células que contenían el gen transferido.
Ejemplo 3 Preparación de células precursoras de ratones transgénicos
Se produjeron ratones transgénicos utilizando una inyección pronuclear normal de gen híbrido MBP-lacZ, en la que el promotor para MBP dirige la expresión de E.coli \beta-galactosidasa (lacZ). Se identificaron los animales transgénicos por PCR utilizando oligonucleótidos específicos para lacZ.
Se prepararon neuroesferas a partir de ratones transgénicos E15 y compañeros de camada ADN negativos aplicando los procedimientos expuestos en el ejemplo 1. Se propagaron las neuroesferas en el medio de cultivo definido en presencia de 20 ng/ml de EGF y se pasaron semanalmente durante 35 semanas. Para el pasaje, se recogieron las neuroesferas, se centrifiguraon suavemente a 800 rpm, y se disociaron mecánicamente por trituración con una pipeta Pasteur pulida al fuego. En varios de los pasajes, se indujeron las células para diferenciarse entre oligodendrocitos, astrocitos y neuronas alterando las condiciones de cultivo. Se centrifugaron suavemente los racimos de células primordiales que flotaban libremente, se suspendieron en el mismo medio definido base sin EGF y con suero bovino fetal al 1% y se colocaron en placa sobre un porta-objetos de vidrio tratado con poliornitina para favorecer la unión celular. Los racimos se unen firmemente al vidrio y las células se dividen más lentamente o dejan de dividirse y empiezan a diferenciarse.
Se llevó a cabo la identificación de los diversos tipos de células aplicando microscopía de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para neuronas (MAP-2, NF-L, y NF-M), astrocitos (GFAP) y oligodendrocitos y precursores de oligodendrocito (A2B5, O_{1}, O_{4}, Gal C, y MBP). De 1 a 14 días después de la colocación en placa, se incubaron las células sobre los porta- objetos sin fijar, durante 30 minutos a temperatura ambiente con los anticuerpos primarios O1, O4, GalC y A2B5 (sobrenadantes), se diluyeron en medio esencial mínimo con suero de cabra normal al 5% y tampón HEPES 25 mM, pH 7,3 (MEM-HEPES, NGS). Después de los anticuerpos primarios, se lavaron suavemente los portaobjetos 5 veces en anticuerpos secundarios conjugados con rodamina (Sigma) diluidos en MEM-HEPES, NGS. A continuación, se lavaron los portaobjetos 5 veces en MEM-HEPEs y se fijaron con alcohol ácido (ácido glacial al 5%/etanol al 95%) a -20ºC. A continuación, se lavaron los portaobjetos 5 veces con MEM-HEPES y se montaron y se examinaron utilizando microscopía de fluorescencia o se hicieron inmunorreaccionar con antisuero policlonal de conejo desarrollado contra GFAP, nestin, MBP, o proteína de proteolípido (PLP). Cuando se sometió a una segunda vuelta de inmunoetiquetado, se incubaron los portaobjetos primero durante una hora con suero de cabra normal al 5% (NGS) en tampón fosfato 0,1M con NaCl al 0,9% a un pH 7,4 (PBS) y después se incubó en anticuerpos primarios de conejo diluidos en NGS durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron los portaobjetos con PBS y después se incubaron con los conjugados de anticuerpo secundarios apropiados diluidos en NGS, se lavaron de nuevo con PBS y después se montaron finalmente en portaobjetos de microscopio de vidrio con un medio de montaje antidecoloración Citifluor y se examinó utilizando un microscopio de fluorescencia. En los casos en los que no se incubaron primero con los sobrenadantes de anticuerpo monoclonales, se fijaron los portaobjetos durante 20 minutos con paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4), se lavaron con PBS, se permeabilizaron con etanol al 100%, se lavaron de nuevo con PBS y se incubaron con NGS al 5% en PBS durante 1 hora. Se aplicaron los anticuerpos primarios y los conjugados de anticuerpo secundarios tal como se ha indicado anteriormente.
Las células primordiales neurales derivadas de animales transgénicos no se distinguían de las células primordiales no transgénicas en su potencial para diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El promotor de MBP dirigió la expresión del gen informador \beta-galactosidasa en un modo apropiado según el desarrollo y específico para la célula. La expresión de transgen es altamente estable ya que los oligodendrocitos derivados de neuroesferas MBP-lacZ de paso tardío (20 pasajes), expresaron el gen \beta-galactosidasa. Por lo tanto, es probable que las neuroesferas marcadas transgénicamente constituyan una fuente excelente de células para transplante de células de glía.
Ejemplo 4 Modificación genética de células precursoras utilizando transfección de fosfato cálcico
Se propagan células precursoras tal como se ha descrito en el ejemplo 1. A continuación, se infectan las células aplicando una técnica de transfección de fosfato cálcico. Para una transfección de fosfato cálcico normal, se disocian mecánicamente las células en una suspensión celular única y se colocan en placa sobre placas tratadas con cultivo de tejido a una confluencia de 50% (50.000-75.000 células/cm^{2}) y se deja que se unan durante toda la noche.
Se realiza el procedimiento de transfección de fosfato cálcico modificado del siguiente modo: se añade ADN (15-25 \mug) en tampón TE estéril (Tris 10 mM, EDTA 0,25 mM, pH 7,5) diluido hasta 440 \mul con TE, y 60 \mul de CaCl_{2} 2M (pH a 5,8 con tampón HEPEs 1M) al tampón ADN/TE. Se añade un total de 500 \mul de 2 x HeBS (HEPES-solución salina tamponada; NaCl 275 mM; KCl 10 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,4 mM, dextrosa 12 mM, tampón HEPES 40 mM en polvo, pH 6,92), gota a gota a la mezcla. Se deja en reposo la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se lavan las células brevemente con 1 x HeBs y 1 ml de la solución de ADN preciptiada con fosfato cálcico a cada placa y se incuban las células a 37ºC durante 20 minutos. Tras la incubación, se añaden 10 mls de medio completo a las células y se colocan las placas en una incubadora (37ºC, 0,5% CO_{2}) durante 3-6 horas más. Se retiran el ADN y el medio por aspiración al final del período de incubación y se lavan las células 3 veces con medio de crecimiento completo y después se retornan a la incubadora.
Ejemplo 5 Células precursoras modificadas genéticamente que expresan NGF
Utilizando la técnica de retrovirus recombinante o de transfección de ADN directa, se introduce en las células de neuroesfera un gen híbrido compuesto de promotor CMV de citomegalovirus humano dirigiendo la expresión del gen de NGF de rata. Por otra parte, el vector incluye el gen de resistencia E. coli neomicina despegado de un promotor viral. Al cabo de 2 semanas de selección de G418, se clonan las células utilizando una dilución de limitación en placas de multipocillo de 96 y se ensayan los clones reultantes para determinar la expresión de proteína de neurotrofina utilizando un bioensayo de autofosforilación (familia trk) de receptor de neurotrofina.
Se expanden los clones que expresan altos niveles de NGF en matraces en T antes de la diferenciación. A continuación, se sacan las células de medio completo con contenido en EGF y se tratan con una combinación de suero y un cocktail de factores de crecimiento para inducir la diferenciación de astrocitos. Se vuelven a ensayar los astrocitos para determinar la expresión de NGF para asegurar que las células diferenciadas continúan expresando factores tróficos. Los astrocitos que segregan NGF se inyectan después en cerebros de rata lesionados con fimbria/fornix inmediatamente después de la lesión con el fin de proteger las neuronas colinérgicas. Se inyectan astrocitos de control que no segregan NGF en animales lesionados de manera similar. Se valora el resto de neuronas colinérgicas en el modelo de lesión utilizando inmunocitoquímica para ChAT, el marcador de estas neuronas colinérgicas.
Ejemplo 6 Células precursoras modificadas genéticamente que expresan CGAT
Se propagan células precursoras como en el ejemplo 1. Se disocian mecánicamente las células y se colocan en placa sobre platos plásticos y se infectan con un retrovirus que contiene el CGAT cADN. Se dirige la expresión del CGAT cADN (Liu y cols. supra) a través de un promotor constitutivo (CMV o SV40, o un LTR retroviral) o un promotor específico de célula (TH u otro elemento regulador específico de célula dopaminérgico o catecolaminérgico o similar). Se realiza una detección selectiva de las células para determinar la expresión de la proteína CGAT. A continuación, se pueden diferenciar las células seleccionadas in vitro utilizando un factor de crecimiento o una combinación de factores de crecimiento para producir neuronas dopaminérgicas o predopaminérgicas.

Claims (20)

1. Un método para producir células del sistema nervioso central (SNC) multipotentes modificadas genéticamente no tumorigénicas, que consiste en las etapas de:
(a) aislamiento de células primordiales neuronales del SNC multipotentes desde tejido neural excluyendo tejidos/células embriónico humano, no habiéndose inmortalizado las células primordiales neurales con un oncogen, siendo capaces dichas células primordiales neuronales del SNC de producir progenie con la capacidad de diferenciarse entre neuronas, astrocitos y oligodendrocitos;
(b) proliferación de dichas células primordiales neurales del SNC multipotentes en un medio de cultivo sin suero que contiene un factor de crecimiento eficaz para inducir la proliferación de células primordiales neurales del SNC multipotentes,
(c) posterior propagación de las células proliferadas y
(d) modificación genética de dichas células propagadas mediante la introducción de un polinucleótido exógeno en las células proliferadas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el factor de crecimiento eficaz para inducir la proliferación de células primordiales neurales del SNC multipotentes en el medio de cultivo de la etapa (b) se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblasto ácido, factor de crecimiento de fibroblasto básico, factor de crecimiento epidérmico, anfirregulina, factor alfa de crecimiento de transformación, y combinaciones de ellos.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que dicho tejido neural se obtiene de un feto.
4. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho tejido neural se obtiene de un adulto.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, en el que dicho tejido neural se obtiene de un ser humano.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células proliferadas se modifican genéticamente para producir un producto de factor de crecimiento.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el producto de factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado de cerebro, neurotrofinas, factor neurotrófico ciliar, anfirregulina, factor de crecimiento de fibroblasto básico, factor de crecimiento de fibroblasto ácido, factor de crecimiento epidérmico, factor alfa de crecimiento de transformación, factor beta de crecimiento de transformación, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento de tipo insulina, e interleucinas.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células proliferadas se modifican genéticamente para producir un receptor de factor de crecimiento.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el receptor de factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en receptor de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad p75, receptor de factor de neurotrófico ciliar, receptores de neurotrofina, receptor de factor de crecimiento epidérmico, receptor de factor de crecimiento de fibroblasto, receptor de anfirregulina.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células proliferadas se modifican genéticamente para expresar un neurotransmisor.
11. El método de la reivindicación 10, en el que el neurotransmisor se selecciona del grupo que consiste en serotonina, L-dopa, dopamina, norepinefrina, epinefrina, taquicinina, endorfina, histamina, N-metil-D-aspartato, glicina, glutamato, ácido \gamma-amino-butírico y acetilcolina.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células proliferadas están genéticamente modificadas para contener un gen de síntesis de neurotransmisor.
13. El método de la reivindicación 12, en el que el gen de síntesis de neurotransmisor se selecciona del grupo que consiste en tirosina hidroxilasa, dopa decarboxilasa, dopamina-\beta-hidroxilasa, feniletanolamina N-metiltransferasa, decarboxilasa de ácido glutámico, triptofano hidroxilasa, colina acetiltransferasa e histidina decarboxilasa.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células proliferadas están genéticamente modificadas para producir neuropéptido.
15. El método de la reivindicación 14, en el que el neuropéptido se selecciona del grupo que consiste en sustancia-P, neuropéptido-\gamma, encefalina, vasopresina, péptido intestinal vasoactivo, colecistocinina, glucagon, bombesina, somatostatina, y péptido relacionado con gen calcitonina.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células proliferadas están genéticamente modificadas para expresar transportador de amina de gránulo de cromafín.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye además:
(d) diferenciación de la célula genéticamente modificada.
18. Un cultivo que comprende células primordiales neurales del sistema nervioso central (SNC) multipotentes modificadas genéticamente que no han sido inmortalizadas con un oncogen, y que:
(a) manchan positivamente para nestina;
(b) son capaces de producir progenie que es capaz de diferenciarse en oligodendrocitos, astrocitos y neuronas; y
(c) son no-tumorigénicas,
y en el que el cultivo de células se puede obtener a través de las etapas de:
(a) aislamiento de células primordiales neurales del SNC multipotentes desde tejido neural, no habiéndose inmortalizado las células primordiales neurales con un oncogen, siendo capaces dichas células primordiales neurales del SNC de producir progenie con la capacidad de diferenciarse entre neuronas, astrocitos y oligodendrocitos;
(b) proliferación de dichas células primordiales neurales del SNC multipotentes en un medio de cultivo sin suero que contiene factor de crecimiento eficaz para inducir la proliferación de células primordiales neurales del SNC multipotentes,
(c) posterior propagación de las células proliferadas y
(d) modificación genética de dichas células propagadas mediante la introducción de un polinucleótido exógeno en las células proliferadas.
19. El cultivo de la reivindicación 18, en el que la célula es célula humana.
20. El cultivo de la reivindicación 19 ó 19, en el que las células están genéticamente modificadas para expresar una sustancia biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste en productos de factor de crecimiento, receptores de factor de crecimiento, neurotransmisores, receptores de neurotransmisor y neuropéptidos.
ES94907366T 1993-01-29 1994-01-28 Modificacion genetica de celulas primordiales neurales. Expired - Lifetime ES2218524T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1082993A 1993-01-29 1993-01-29
US10829 1993-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2218524T3 true ES2218524T3 (es) 2004-11-16

Family

ID=21747648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES94907366T Expired - Lifetime ES2218524T3 (es) 1993-01-29 1994-01-28 Modificacion genetica de celulas primordiales neurales.

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0681477B1 (es)
JP (1) JP3583778B2 (es)
KR (1) KR960700067A (es)
AT (1) ATE262912T1 (es)
AU (1) AU687785B2 (es)
CA (1) CA2155024C (es)
DE (1) DE69433661T2 (es)
ES (1) ES2218524T3 (es)
FI (1) FI953569L (es)
NO (1) NO322466B1 (es)
WO (1) WO1994016718A1 (es)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3952508B2 (ja) * 1993-11-09 2007-08-01 ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド 中枢神経系の幹細胞の原位置修飾及び操作
WO1996015226A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Neurospheres Holdings Ltd. Regulation of neural stem cell proliferation
US5798223A (en) 1995-03-01 1998-08-25 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human amine transporter and methods of using the same
JPH11506309A (ja) * 1995-03-01 1999-06-08 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド ヒトアミン輸送体
US5824789A (en) * 1995-06-07 1998-10-20 Systemix, Inc. Human growth factors, nucleotide sequence encoding growth factors, and method of use thereof
US6969608B1 (en) 1996-08-26 2005-11-29 Mcgill University Pharmaceuticals containing multipotential precursor cells from tissues containing sensory receptors
US6787355B1 (en) 1996-08-26 2004-09-07 Mcgill University Multipotent neural stem cells from peripheral tissues and uses thereof
US6713247B1 (en) 1996-09-03 2004-03-30 Signal Pharmaceuticials, Inc. Human CNS cell lines and methods of use therefor
CA2216439A1 (en) * 1996-09-25 1998-03-25 Derek Van Der Kooy Pharmaceuticals containing retinal stem cells
US5876946A (en) * 1997-06-03 1999-03-02 Pharmacopeia, Inc. High-throughput assay
WO1999006060A1 (en) * 1997-08-04 1999-02-11 The Regents Of The University Of California Methods for treating neurological deficits
US7795202B2 (en) 1997-08-04 2010-09-14 Neurorepair, Inc. Methods for treating a neurological disorder by peripheral administration of a transforming growth factor alpha (TGF-a)
US20020123143A1 (en) 1997-08-22 2002-09-05 Jean Toma Multipotent stem cells from peripheral tissues and uses thereof
US5968829A (en) * 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6787356B1 (en) 1998-07-24 2004-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cell expansion system for use in neural transplantation
JP3291698B2 (ja) * 1998-07-24 2002-06-10 スティーブン・カーティン 可変眼鏡用レンズ
EP1112348B1 (en) * 1998-09-18 2005-11-30 Massachusetts Institute Of Technology Use of growth factors and hormones for expansion of mammalian cells and tissue engineering
US6291516B1 (en) 1999-01-13 2001-09-18 Curis, Inc. Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto
DE60035192T2 (de) 1999-04-26 2008-02-14 Applied Protein Sciences, LLC, Mountain View Tgf-alpha polypeptide, funktionelle fragmente und verfahren zu ihrer anwendung
US20020099008A1 (en) 1999-04-26 2002-07-25 Daniel R. Twardzik Method for stimulating hematopoiesis using tgf-alpha
US20020193301A1 (en) 1999-08-19 2002-12-19 Stem Cell Pharmaceuticals, Inc. TGF-alpha polypeptides, functional fragments and methods of use therefor
US6815418B2 (en) 1999-08-19 2004-11-09 Kaleidos Pharma, Inc. TGF-α polypeptides, functional fragments and methods of use therefor
US6677307B2 (en) 1999-08-19 2004-01-13 Kaleidos Pharma, Inc. TGF-α polypeptides, functional fragments and methods of use therefor
US7544509B2 (en) 2000-01-24 2009-06-09 Mcgill University Method for preparing stem cell preparations
ATE473751T1 (de) 2000-02-11 2010-07-15 Schepens Eye Res Inst Isolierung und transplantation von retinalen stammzellen
US8852937B2 (en) 2000-03-30 2014-10-07 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6613798B1 (en) 2000-03-30 2003-09-02 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6683108B1 (en) 2000-03-30 2004-01-27 Curis, Inc. Agonists of hedgehog signaling pathways and uses related thereto
US7115653B2 (en) 2000-03-30 2006-10-03 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
AU2001283504A1 (en) * 2000-07-27 2002-02-13 The Mclean Hospital Corporation Cell implantation therapy for neurological diseases or disorders
US6908732B2 (en) 2000-10-13 2005-06-21 President & Fellows Of Harvard College Compounds and methods for regulating cell differentiation
US8735153B2 (en) 2001-09-24 2014-05-27 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
US8153424B2 (en) 2001-10-03 2012-04-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of in vitro differentiation of neural stem cells, motor neurons and dopamine neurons from primate embryonic stem cells
US7588937B2 (en) 2001-10-03 2009-09-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of in vitro differentiation of neural stem cells, motor neurons and dopamine neurons from primate embryonic stem cells
AU2003202988A1 (en) 2002-01-14 2003-07-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of modified pyrimidine compounds to promote stem cell migration and proliferation
AU2003231032B2 (en) 2002-04-22 2008-07-10 Johns Hopkins University School Of Medicine Modulators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto
WO2004053084A2 (en) 2002-12-09 2004-06-24 The Mclean Hospital Corporation Dopaminergic neurons differentiated from embryonic cells for treating neurodegenerative diseases
GB2414995B (en) 2004-06-09 2006-11-15 Univ Edinburgh Neural stem cells
US20110218176A1 (en) 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
CN102325878A (zh) 2008-12-23 2012-01-18 斯特姆塞尔思加利福尼亚有限公司 少突胶质前体细胞的靶向细胞群及制备与使用方法
EP2380972B1 (en) 2010-04-19 2012-09-19 Technische Universität Dresden Methods and compositions for the expansion of somatic stem cells and progenitor cells
BR112014019328A8 (pt) 2012-02-17 2017-07-11 The Schepens Eye Res Institute Perfil de fenótipo de células progenitoras retinais humanas
WO2013158309A2 (en) * 2012-04-18 2013-10-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-disruptive gene targeting
MX392639B (es) 2014-03-21 2025-03-24 Univ Leland Stanford Junior Vectores virales recombinantes para la integración de transgenes
CA2978109A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Delivery vehicles for stem cells and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ226750A (en) * 1987-10-29 1990-09-26 Amrad Corp Ltd Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene
US5082670A (en) * 1988-12-15 1992-01-21 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system
WO1994002593A1 (en) * 1992-07-27 1994-02-03 California Institute Of Technology Mammalian multipotent neural stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
FI953569A0 (fi) 1995-07-26
KR960700067A (ko) 1996-01-19
JPH08505762A (ja) 1996-06-25
FI953569A7 (fi) 1995-09-25
FI953569L (fi) 1995-09-25
AU687785B2 (en) 1998-03-05
EP0681477A1 (en) 1995-11-15
NO952985D0 (no) 1995-07-27
EP0681477B1 (en) 2004-03-31
DE69433661T2 (de) 2005-02-10
NO322466B1 (no) 2006-10-09
CA2155024A1 (en) 1994-08-04
JP3583778B2 (ja) 2004-11-04
NO952985L (no) 1995-07-27
EP0681477A4 (en) 1998-07-15
DE69433661D1 (de) 2004-05-06
WO1994016718A1 (en) 1994-08-04
ATE262912T1 (de) 2004-04-15
CA2155024C (en) 1999-12-14
AU6098394A (en) 1994-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3583778B2 (ja) 神経幹細胞の遺伝子修飾
ES2194016T5 (es) Factores biologicos y celulas germinales neurales.
JP4416837B2 (ja) 試験管内で増殖し得る新規な成長因子応答性の前駆細胞
US7115418B2 (en) Methods of proliferating undifferentiated neural cells
US7105342B2 (en) Multipotent neural stem cell cDNA libraries
US6294346B1 (en) Use of multipotent neural stem cells and their progeny for the screening of drugs and other biological agents
US6071889A (en) In vivo genetic modification of growth factor-responsive neural precursor cells
US5750376A (en) In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
US5851832A (en) In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny
US5980885A (en) Growth factor-induced proliferation of neural precursor cells in vivo
EP0792350A1 (en) Regulation of neural stem cell proliferation
JPH09507747A (ja) 中枢神経系の幹細胞の原位置修飾及び操作
Williams et al. Lentiviral expression of retinal guanylate cyclase-1 (RetGC1) restores vision in an avian model of childhood blindness
ES2241297T3 (es) Celulas madre no embrionarias neuronales ependinales y metodo que sirvve para aislar estas.
US7361505B1 (en) Multipotent neural stem cell compositions
KR20120003098A (ko) ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법
US7166277B1 (en) Remyelination of neurons using multipotent neural stem cell progeny
WO2004050865A1 (en) Method for culturing neural stem cells using hepatocyte growth factor
MXPA00005880A (es) Celulas precursoras neurologicas, metodo para la produccion y uso de las mismas en la terapia para defectos neurologicos
MXPA97003492A (es) Regulacion de proliferacion de celulas germinalesneurales
WO2011021916A2 (ko) 히레귤린 베타1의 ｅｇｆ-성 도메인 펩타이드의 용도
CA2399589A1 (en) Novel growth factor-responsive progenitor cells which can be proliferated in vitro