ES2219692T3 - Procedimiento para el cribado de farmacos. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para estimar un perfil de respuesta de un organismo diana a un agente que puede provocar una respuesta celular, que comprende: (a) poner en contacto cada una de una pluralidad de células diferentes aisladas por separado a partir de un organismo diana con dicho agente, conteniendo cada una de dichas células un constructo recombinante que comprende un gen indicador ligado operativamente a un elemento endógeno regulador de la transcripción diferente de dicho organismo diana, de forma que dicho elemento regulador de la transcripción regula la expresión de dicho gen indicador, en el que los diferentes elementos reguladores de la transcripción de dicha pluralidad de células comprenden elementos endógenos reguladores de la transcripción de la mayoría de los genes de dicho organismo; (b) detectar las señales de los productos de los genes indicadores de cada una de dichas células a las que se pone en contacto con dicho agente; (c) comparar dichas señales del producto del gen indicador procedentes de cada una de dichas células a las que se pone en contacto con dicho agente con un perfil de respuesta basal para obtener un perfil de respuesta a dicho agente.

Description

Procedimientos para el cribado de fármacos.

El campo de la invención es el cribado de fármacos farmacéuticos. La investigación y desarrollo farmacéuticos son una industria que mueve miles de millones de dólares. Muchos de estos recursos se consumen en esfuerzos para abordar la especificidad de los compuestos líder. Además, se suspenden muchos programas después de décadas de esfuerzos costosos aunque infructuosos para reducir los efectos adversos o la toxicidad de los fármacos candidatos. Según esto, son deseables herramientas que puedan acortar las fases de investigación y de descubrimiento del desarrollo de los fármacos. Se han descrito varios procedimientos in vitro o basados en cultivos celulares para identificar compuestos con un efecto biológico particular mediante la activación de un gen indicador ligado. Gadski y col. (1992), en el documento EP 92304902.7, describen procedimientos para identificar sustancias que regulan la síntesis de una apolipoproteína; Evans y col. (1991), en la Patente de EE.UU. Nº 4.981.784, describen procedimientos para identificar ligandos para un receptor, y Farr y col. (1994), en el documento WO 94/17208, describen procedimientos y kits que utilizan promotores de estrés para determinar la toxicidad de un compuesto.

En general, el principio que se ha aplicado en la industria farmacéutica existente para el descubrimiento y desarrollo de nuevos compuestos cabeza de serie para fármacos ha sido el establecimiento de ensayos in vitro sensibles y fiables para enzimas purificados, y posteriormente hacer el cribado de un gran número de compuestos y sobrenadantes de los cultivos en busca de cualquier capacidad de inhibir la actividad enzimática. La presente invención explota los recientes avances en ciencia genómica para permitir el cribado rápido de un gran número de compuestos frente a una diana sistémica que comprende sustancialmente todas las dianas de una ruta, organismo, etc., para los infrecuentes compuestos que tienen la capacidad de inhibir la proteína de interés. En efecto, la invención que se describe en la presente memoria descriptiva da un giro radical al proceso de descubrimiento de fármacos. Esta invención suministra información sobre el mecanismo de acción de cada uno de los compuestos que afecta a las células, independientemente de la diana. Además, se puede establecer inmediatamente la especificidad relativa de todos los compuestos cabeza de serie.

Resumen de la invención

La invención suministra procedimientos y composiciones para estimar la especificidad fisiológica de un fármaco candidato. En general, los procedimientos sujeto suponen (a) detectar las señales de los productos de los genes indicadores de cada una de una pluralidad de células diferentes aisladas por separado de un organismo diana, conteniendo cada una de dichas células un constructo recombinante que comprende un gen indicador ligado operativamente a diferentes elementos endógenos reguladores de la transcripción (p. ej., promotores) de dicho organismo diana, regulando dicho elemento regulador de la transcripción la expresión de dicho gen indicador, y comprendiendo dicha pluralidad de células comprende un grupo de elementos reguladores de la transcripción de dicho organismo suficiente para modelizar la capacidad de respuesta transcripcional de dicho organismo a un fármaco; (b) poner en contacto cada una de dichas células con un fármaco candidato; (c) detectar las señales de los productos de los genes indicadores de cada una de dichas células; (d) comparar dichas señales de los productos de los genes indicadores de cada una de dichas células antes y después de poner en contacto cada una de dichas células con dicho fármaco candidato, para obtener un perfil de respuesta al fármaco; suministrando dicho perfil de respuesta al fármaco una estimación de la especificidad fisiológica o de las interacciones biológicas de dicho fármaco candidato.

Descripción detallada de la invención Matriz de indicadores genómicos

La invención suministra procedimientos y composiciones para estimar la especificidad fisiológica de un fármaco candidato mediante la modelización de las respuestas transcripcionales del organismo diana con un grupo de indicadores, cuya expresión está regulada por elementos genéticos reguladores de la transcripción procedentes del genoma del organismo diana. El grupo de células indicadoras comprende una colección de elementos genéticos reguladores de la transcripción tan exhaustiva como sea convenientemente disponible para el organismo diana, de modo que permita modelizar de la manera más exacta la respuesta transcripcional sistémica. Los grupos adecuados comprenden generalmente miles de elementos indicadores; los grupos preferidos son sustancialmente completos, es decir, proporcionan una diversidad de respuestas transcripcionales comparable a la del organismo diana. Generalmente, un grupo sustancialmente completo requiere elementos genéticos reguladores de la transcripción de al menos una mayoría de los genes del organismo, e incluye preferiblemente todos o casi todos los genes. Dicho grupo sustancialmente completo se denomina matriz de indicadores genómicos.

Frecuentemente es conveniente usar un grupo o una matriz de indicadores genómicos procedentes de un modelo eucariota inferior o de un modelo animal habitual para obtener información preliminar sobre la especificidad del fármaco en eucariotas superiores, como los seres humanos. Puesto que la levadura, como Saccharomyces cerevisiae, es un eucariota bona fide, hay una conservación sustancial de la función bioquímica entre la levadura y las células humanas en la mayoría de las rutas, desde la ruta biosintética de los esteroles hasta el oncogén Ras. De hecho, la ausencia de muchos compuestos antifúngicos efectivos ilustra hasta qué grado ha sido difícil encontrar dianas terapéuticas que matasen de manera selectiva células fúngicas pero no células humanas. Un ejemplo de una ruta de respuesta compartida es la biosíntesis de los esteroles. En las células humanas, el fármaco Mevacor (lovastatina) inhibe la HMG-CoA reductasa, el enzima regulador clave de la ruta biosintética de los esteroles. En consecuencia disminuye la concentración de un esterol regulador particular, y las células responden mediante un aumento de la transcripción del gen que codifica el receptor de las LDL. En la levadura, Mevacor también inhibe la HMG-CoA reductasa y reduce la concentración de un esterol regulador clave. Las células de la levadura responden de una manera análoga a las células humanas. Sin embargo, la levadura no tiene un gen para el receptor de LDL. En cambio, se mide el mismo efecto mediante el aumento de la transcripción del gen ERG10, que codifica la acetoacetil CoA tiolasa, un enzima que también participa en la síntesis de los esteroles. Así, se conserva la respuesta reguladora entre la levadura y los seres humanos, aun cuando la identidad del gen que responde es diferente.

Ventajas de la matriz de indicadores genómicos como vehículo para el desarrollo farmacéutico

Las ventajas de los procedimientos sujeto sobre los procedimientos de cribado de la técnica previa se pueden ilustrar con ejemplos. Considérese la diferencia entre un ensayo in vitro para los inhibidores de la HMG-CoA reductasa tal y como lo realiza en la actualidad la industria farmacéutica, y un ensayo para la biosíntesis de los esteroles tal y como la revela el indicador ERG10. En el caso del primero, la información se obtiene sólo para los infrecuentes compuestos que resultan inhibir este enzima concreto. Por el contrario, en el caso del indicador ERG10, cualquier compuesto que inhibe casi cualquiera de las aproximadamente 35 etapas de la ruta biosintética de los esteroles podrá inducir la síntesis del indicador mediante la reducción de la concentración de los esteroles intracelulares. Así, el indicador puede detectar una gama mucho más amplia de dianas que el enzima purificado, en este caso 35 veces más que el ensayo in vitro.

Los fármacos con frecuencia tienen efectos adversos que se deben en parte a la ausencia de especificidad de diana. Sin embargo, el ensayo in vitro de la HMG-CoA reductasa no suministra información sobre la especificidad de un compuesto. Por el contrario, una matriz de indicadores genómicos revela el espectro de otros genes del genoma que también se afectan por el compuesto. Cuando se consideran dos compuestos diferentes, de los que ambos inducen el indicador ERG10, si un compuesto afecta a la expresión de otros 5 indicadores y un segundo compuesto afecta a la expresión de otros 50 indicadores, a priori es más probable que el primer compuesto tenga menos efectos adversos. Puesto que la identidad de los indicadores se conoce o se puede determinar, la información sobre otros indicadores que se afectan aporta información sobre la naturaleza del efecto adverso. Se puede usar un panel de indicadores para estudiar derivados del compuesto cabeza de serie para determinar cuáles de los derivados tienen una especificidad mayor que el primer compuesto.

Por poner otro ejemplo, considérese el caso de un compuesto que no afecta al ensayo in vitro de la HMG-CoA reductasa ni induce la expresión del indicador ERG10. En el enfoque tradicional del descubrimiento de fármacos, un compuesto que no inhibe la diana que se estudia no suministra información útil. Sin embargo, un compuesto que tiene cualquier efecto significativo sobre un proceso biológico generalmente tiene alguna consecuencia sobre la expresión del gen. Una matriz de indicadores genómicos puede de esta manera suministrar dos tipos diferentes de información para la mayoría de los compuestos. En algunos casos la identidad de los genes indicadores a los que afecta el inhibidor pone de manifiesto cómo funciona el inhibidor. Por ejemplo, un compuesto que induce un promotor dependiente de AMPc en la levadura puede afectar a la actividad de la ruta Ras. Incluso cuando el compuesto afecta a la expresión de un conjunto de genes que no ponen de manifiesto la acción del compuesto, la matriz permite hacer una evaluación exhaustiva de la acción del compuesto, que se puede almacenar en una base de datos para un análisis posterior. Una biblioteca de esos perfiles de respuesta de la matriz se puede investigar continuamente, del mismo modo que los Compendios Espectrales de la química son continuamente objeto de referencia en las técnicas químicas. Por ejemplo, si la base de datos revela que el compuesto X altera la expresión del gen Y, y se publica un trabajo que describe que la expresión del gen Y es sensible a, por ejemplo, la ruta de señalización del inositol fosfato, el compuesto X es un candidato a la modulación de la ruta de señalización del inositol fosfato. En efecto, la matriz de indicadores genómicos es un traductor de información que traslada información sobre un gen directamente a un compuesto que ya se puede haber encontrado que afecta a la expresión de ese gen. Esta herramienta debería acortar mucho la etapa de investigación y descubrimiento del desarrollo de fármacos, e influir de manera efectiva sobre el valor de la cartera de investigación de todos los genes de que se dispone públicamente.

En muchos casos un fármaco de interés actuaría sobre dianas proteicas cuyo impacto sobre la expresión génica no se conocería a priori. Sin embargo, la matriz de indicadores genómicos se puede usar para estimar qué genes serían inducidos o reprimidos por el fármaco. En una forma de realización, se introduce una forma mutante dominante del gen que codifica una proteína dirigida a un fármaco en el interior de todas las cepas de la matriz de indicadores genómicos, y se evalúa para cada indicador el efecto del mutante dominante, que interfiere con la función normal del producto del gen. Este ensayo genético nos informa sobre qué genes se afectarían por un fármaco que tiene un mecanismo de acción similar. En muchos casos se podría usar el propio fármaco para obtener la misma información. Sin embargo, incluso si no se dispusiera del propio fármaco, se puede usar la genética para predeterminar cuál sería su perfil de respuesta en la matriz de indicadores genómicos. Además, no es necesario conocer la identidad de ninguno de los genes que responden. En cambio, el control genético con el mutante dominante permite clasificar el genoma en los genes que responden y los que no lo hacen. De esta manera, si se descartan los fármacos que bloquean una función celular dada, la introducción de mutantes dominantes para esa función en la matriz de indicadores genómicos revela qué perfil de respuesta se puede esperar para ese agente.

Por ejemplo, se ha mostrado que el taxol, que es un reciente avance en losposibles tratamientos para el cáncer de mama, interfiere con los elementos citoesqueléticos que se basan en la tubulina. Por lo tanto, una forma mutante dominante de tubulina suministra un perfil de respuesta informativo para los tratamientos del cáncer de mama con un mecanismo de acción similar al del taxol. De manera específica, se introduce una forma mutante dominante de tubulina en todas las cepas de la matriz de indicadores genómicos y se evalúa para cada indicador el efecto de este mutante dominante, que interfiere con el citoesqueleto de los microtúbulos. Así, cualquier nuevo compuesto que induce el mismo perfil de respuesta que el mutante dominante de tubulina sería un candidato a ser un fármaco farmacéutico similar al taxol.

Además, la matriz de indicadores genómicos se puede usar para crear genéticamente o para modelizar varias enfermedades. De esta manera se pueden abordar rutas que están presentes específicamente en la enfermedad. Por ejemplo, el perfil específico de respuesta del mutante de transformación Ras2^{val19} identifica los indicadores inducidos por Ras2^{val19}. Aquí se usa la matriz, en la que todas las unidades contienen la mutación Ras2^{val19}, para hacer el cribado de compuestos que restauran el perfil de respuesta al de la matriz que carece de la mutación.

Aunque estos ejemplos se dirigen al desarrollo de la terapéutica humana, con frecuencia se pueden obtener perfiles de respuesta informativos a partir de matrices de indicadores no humanos. Por lo tanto, para los genes productores de enfermedades con homólogos en la levadura, incluso si se desconoce la función del gen, se puede introducir una forma dominante del gen en una matriz de indicadores basada en la levadura para identificar rutas específicas de enfermedad para dirigirse a ellas. Por ejemplo, una matriz de indicadores que comprende el mutante de levadura Ras2^{val19} es un vehículo para el descubrimiento de rutas específicas del análogo humano, el oncogén Ras2^{val12}.

Aplicación de la novedosa química combinatoria con la matriz de indicadores genómicos

Entre los avances más importantes en el desarrollo de fármacos se cuentan los avances en la síntesis combinatoria de bibliotecas químicas. En el cribado convencional de fármacos con dianas enzimáticas purificadas, la química combinatoria con frecuencia puede ayudar a crear nuevos derivados de un compuesto líder que también inhibirá el enzima diana, pero con alguna propiedad diferente y deseable. Sin embargo, los procedimientos convencionales no pueden reconocer una molécula que tiene una especificidad sustancialmente divergente. La matriz de indicadores genómicos ofrece una solución sencilla al reconocimiento de nuevas especificidades en bibliotecas combinatorias. Específicamente, se estudian mezclas de nuevos compuestos como mezclas en toda la matriz. Si la mezcla tiene cualquier actividad nueva que no está presente en el compuesto líder original, se afectan nuevos genes entre los indicadores. La identidad de ese gen suministra una guía sobre la diana del nuevo compuesto. Además, la matriz ofrece un valor añadido que compensa el punto débil común de la mayoría de las síntesis químicas. Específicamente, la mayoría de las síntesis produce el producto deseado en mayor cantidad y otros varios productos relacionados como contaminantes debido a reacciones colaterales en la síntesis. Tradicionalmente la solución a los contaminantes es eliminarlos mediante purificación. Sin embargo, la matriz de indicadores genómicos aprovecha la presencia de estos contaminantes. Se pueden ajustar las síntesis para hacer que sean menos específicas, con un mayor número de reacciones colaterales y más contaminantes, para determinar si algo de la síntesis total afecta a la expresión de los genes diana de interés. Si hay un componente de la mezcla con la actividad deseada sobre un indicador particular, se puede usar el indicador para ensayar la purificación del componente deseado a partir de la mezcla. En efecto, la matriz de indicadores permite una búsqueda dirigida del efecto sobre genes aislados para compensar la impureza de la mezcla que se estudia.

Los isoprenoides son una clase especialmente atractiva para la matriz de indicadores genómicos. En la naturaleza los isoprenoides son las principales moléculas de señalización. Los isoprenoides son derivados del compuesto de cinco átomos de carbono isopreno, que se forma como intermediario en la biosíntesis del colesterol. Los isoprenoides incluyen muchas de las fragancias más famosas, pigmentos y otros compuestos con actividad biológica, como los sesquiterpenoides antifúngicos, que las plantas utilizan de manera defensiva frente a la infección fúngica. Se han caracterizado alrededor de 10.000 derivados de isopreno y muchos más posibles. Puesto que estos compuestos se usan en la naturaleza para señalizar procesos biológicos, es probable que incluyan algunas de las mejores moléculas permeantes de membrana.

Los isoprenos poseen otra característica que se presta bien al descubrimiento de fármacos mediante la matriz de indicadores genómicos. Los compuestos isoprenoides puros se pueden tratar químicamente para crear fácil y rápidamente una extensa mezcla de diferentes compuestos, debido a la disposición particular de los dobles enlaces de las cadenas hidrocarbonadas. En efecto, los isoprenoides se pueden mutagenizar desde una forma a muchas formas diferentes, del mismo modo que un gen natural se puede mutagenizar a muchos mutantes diferentes. Por ejemplo, la vitamina D que se usa para suplementar la leche se produce mediante irradiación ultravioleta del derivado de isopreno conocido como ergosterol. Los nuevos isoprenoides con actividad biológica se generan y analizan con una matriz de indicadores genómicos como sigue. Primero se estudia un isoprenoide puro, como el limoneno, para determinar su perfil de respuesta en toda la matriz. A continuación se altera químicamente el isoprenoide (p. ej., limoneno) para crear una mezcla de compuestos diferentes. Posteriormente se estudia esta mezcla en toda la matriz. Si se observa alguna respuesta nueva, entonces la mezcla contiene una nueva especie con actividad biológica. Además, la identidad de los genes indicadores suministra información relativa a lo que hace la nueva especie, una actividad que se va a usar para monitorizar su purificación, etc. Esta estrategia también se aplica a otras familias químicas que se pueden someter a mutación, además de los isoprenoides.

Aplicaciones de la matriz de indicadores genómicos en el descubrimiento de antibióticos y antifúngicos

Los hongos son patógenos importantes para las plantas y los animales, y tienen un impacto importante sobre la producción de muchos cultivos alimenticios y sobre la salud animal, incluyendo la humana. Una dificultad importante en el desarrollo de compuestos antifúngicos ha sido el problema de encontrar dianas farmacéuticas en los hongos que sean específicas de los hongos. La matriz de indicadores genómicos ofrece una nueva herramienta para resolver este problema. Específicamente, todas las moléculas que no desencadenan ninguna respuesta en el indicador de Saccharomyces se recogen en un conjunto, que por definición debe carecer de actividad biológica o debe tener una elevada especificidad. Se crea una biblioteca de indicadores a partir del patógeno diana, como Cryptococcus, Candida, Aspergillus, Pneumocystis, etc. Se estudian en el patógeno todas las moléculas del conjunto que no afectan a Saccharomyces, y cualquier molécula que desencadena un perfil de respuesta alterado en el patógeno en principio identifica una diana que es específica del patógeno. A modo de ejemplo, un patógeno puede tener un nuevo enzima señalizador, como una inositol cinasa que altera una posición del anillo del inositol que no se altera en otras especies. Un compuesto que inhibe ese enzima afectaría a la ruta de señalización del patógeno, y alteraría un perfil de respuesta, pero debido a ausencia de ese enzima en otros organismos no tendría ningún efecto. Mediante la secuenciación de los genes indicadores que se afectan de manera específica en el hongo diana y la comparación de la secuencia de otros del banco de genes, se pueden identificar rutas bioquímicas que son exclusivas de la especie diana. Los productos útiles que se han identificado incluyen no sólo agentes que matan el hongo diana, sino también la identificación de dianas específicas en el hongo para otros ensayos de cribado farmacéutico.

La industria farmacéutica ha perseguido con éxito durante décadas la identificación de compuestos que matan bacterias. Es bastante sencillo detectar un compuesto que mata bacterias en una prueba rápida en una placa de Petri. Lamentablemente, el cribado mediante inhibición del crecimiento ha suministrado una diversidad muy escasa de compuestos cabeza de serie. Sin embargo, hay una gran complejidad en la fisiología y ecología bacterianas, lo que podría abrir el camino al desarrollo de tratamientos de combinación frente a las bacterias, incluso de compuestos que realmente no matan la célula bacteriana. Considérense por ejemplo las bacterias que invaden la uretra y que persisten en la misma mediante la elaboración de los dispositivos de fijación a la superficie conocidos como fimbrias. Los antibióticos en torrente urinario tienen un acceso limitado a las bacterias porque el torrente urinario es breve e infrecuente. Sin embargo, si se pudiera bloquear la síntesis de las fimbrias para separar a las bacterias, los tratamientos existentes se harían más efectivos. De manera similar, si se inactivara el mecanismo de quimiotaxis bacteriana, en algunas especies se vería comprometida la capacidad de las bacterias de establecer una infección efectiva. Por ejemplo, una matriz de indicadores genómicos para un patógeno bacteriano que contiene indicadores para la expresión de los genes implicados en la quimiotaxis o en la síntesis de las fimbrias identifica no sólo los compuestos que matan las bacterias en una prueba rápida, sino también los que interfieren con etapas clave de la biología del patógeno. Estos compuestos serían extremadamente difíciles de descubrir mediante procedimientos convencionales.

Aplicación de las matrices de indicadores genómicos basadas en células humanas

Una matriz de indicadores genómicos basada en células humanas suministra muchas aplicaciones importantes. Por ejemplo, una aplicación interesante es el desarrollo de compuestos antivíricos. Cuando las células humanas son infectadas por una amplia gama de virus, las células responden de una manera compleja en la que sólo se han identificado unos pocos componentes. Por ejemplo, se inducen ciertos interferones a la vez que una ARNasa de doble hebra. Estas dos respuestas individualmente suministran cierta medida de protección. Una matriz que sirve como indicador de la inducción de los genes del interferón y de la ARNasa de doble hebra puede detectar compuestos que podrían proteger profilácticamente a las células antes de la llegada del virus. Se pueden inducir en paralelo otros efectos protectores. La incorporación de un panel de otros genes indicadores a la matriz se usa para identificar los compuestos que tienen el máximo grado de especificidad.

Uso de la matriz de indicadores genómicos

A continuación se perfila el procedimiento que se va a seguir en los procedimientos sujeto. La etapa inicial supone la determinación del perfil de respuesta basal o de fondo mediante la detección de las señales de los productos de los genes indicadores a partir de cada una de una pluralidad de células diferentes aisladas por separado de un organismo diana en una o más de una variedad de condiciones físicas, como temperatura y pH, medio y osmolaridad. Como se analiza más arriba, el organismo diana puede ser una levadura, un modelo animal, un ser humano, una planta, un patógeno, etc. Generalmente las células se disponen en una matriz física como una placa de microtitulación. Cada una de las células contiene un constructo recombinante que comprende un gen indicador operativamente ligado a un elemento endógeno regulador de la transcripción diferente de dicho organismo diana, de modo que dicho elemento regulador de la transcripción regula la expresión de dicho gen indicador. Se incluye un número suficiente de células recombinantes diferentes para suministrar un conjunto de elementos reguladores de la transcripción de dicho organismo suficiente como para modelizar la capacidad de respuesta de la transcripción de dicho organismo a un fármaco. En una forma de realización preferida, la matriz es sustancialmente exhaustiva para los elementos reguladores seleccionados, p. ej., se incluyen esencialmente todos los promotores génicos del organismo diana. También se pueden evaluar otras regiones reguladoras de la transcripción del organismo diana de acción cis o trans. En una forma de realización, se construye una matriz de indicadores genómicos a partir de un conjunto de fusiones lacZ para obtener un conjunto sustancialmente exhaustivo de genes de levadura. Las fusiones se construyen preferentemente en una célula diploide del tipo de emparejamiento a/a para permitir la introducción de mutaciones dominantes mediante emparejamiento, aunque las cepas haploides también se pueden usar con indicadores particularmente sensibles para ciertas funciones. Las fusiones se disponen convenientemente en una placa de microtitulación que tiene 96 pocillos que separan fusiones distintas en pocillos que tienen coordenadas alfanuméricas X-Y definidas, donde cada pocillo (definido como una unidad) confina una célula o colonia de células que tiene un constructo de un gen indicador unido operativamente a un promotor transcripcional diferente. Las colecciones permanentes de estas placas se mantienen con facilidad a -80ºC y se pueden hacer y propagar copias de esta colección mediante mecánica simple y se pueden automatizar con robótica comercial.

Los procedimientos suponen detectar una señal de un producto de un gen indicador para cada una de las células de la matriz. Se puede usar una amplia variedad de indicadores, de modo que los indicadores preferidos suministran señales que se pueden detectar convenientemente (p. ej. mediante espectroscopia). Típicamente la señal es una modificación de una o más propiedades electromagnéticas, particularmente las propiedades ópticas, de la unidad. A modo de ejemplos, un gen indicador puede codificar un enzima que cataliza una reacción en la unidad que altera las propiedades de absorción de la luz de la unidad, se pueden incorporar nucleótidos radiomarcados o marcados con una marca fluorescente a los transcritos nacientes que posteriormente se identifican cuando se unen a sondas de oligonucleótidos, etc. Los ejemplos incluyen \beta-galactosidasa, invertasa, proteína fluorescente verde, etc. Las fusiones de la invertasa tienen la virtud de que se pueden seleccionar las fusiones funcionales a partir de bibliotecas complejas por la propiedad de la invertasa de detectar aquellos genes cuya expresión aumenta o disminuye mediante la medición del crecimiento relativo en un medio que contiene sacarosa con o sin el compuesto de interés. Se dispone comercialmente de detectores electrónicos de señales ópticas, radiactivas, etc., p. ej., detectores colorimétricos multipocillo automatizados, similares a los lectores automatizados de ELISA. También se pueden monitorizar las señales de los productos de los genes indicadores como una función de otras variables como la intensidad o duración del estímulo, tiempo (para el análisis de respuesta dinámica), etc.

En una forma de realización preferida, los perfiles de respuesta basal se determinan mediante la detección colorimétrica de un producto de la reacción lacZ. La señal óptica que se genera en cada uno de los pocillos se detecta y se transduce linealmente para generar la señal de salida eléctrica digital correspondiente. Las señales de salida eléctricas se almacenan en la memoria de un ordenador en forma de estructura de datos de la matriz de señales de salida de los indicadores genómicos que asocia cada señal con las coordenadas del correspondiente pocillo de la placa de microtitulación y con el estímulo o el fármaco. Esta información se indexa respecto a la matriz para formar perfiles de respuesta de referencia que se usan para determinar la respuesta de cada indicador a cualquier medio en el que se puede suministrar un estímulo.

Después de establecer un perfil de respuesta basal para la matriz, se ponen en contacto todas las células con un fármaco candidato. El término fármaco se utiliza de manera laxa para referirse a agentes que pueden provocar una respuesta celular específica. Los fármacos preferidos son agentes farmacéuticos, particularmente agentes terapéuticos. El fármaco induce un patrón complejo de respuesta de represión, silencio e inducción en toda la matriz (es decir, descenso de la actividad del indicador en algunas unidades, aumento en otras y ausencia de cambios en otras). El perfil de respuesta refleja los ajustes transcripcionales de la célula para mantener la homeostasis en presencia del fármaco. Mientras que se puede evaluar una amplia variedad de fármacos candidatos, es importante ajustar las condiciones de incubación (p. ej., concentración, tiempo, etc.) para impedir el estrés celular, y de esta manera garantizar las mediciones de perfiles de respuesta farmacológicamente relevantes. Por lo tanto, los procedimientos monitorizan los cambios transcripcionales que la célula usa para mantener la homeostasis celular. El estrés celular se puede monitorizar de cualquier manera adecuada como el potencial de membrana (p. ej., exclusión de colorantes), morfología celular, expresión de genes de respuesta al estrés, etc. En una forma de realización preferida, el tratamiento con el compuesto se realiza transfiriendo una copia de toda la matriz a un medio nuevo que contiene el primer compuesto de interés.

Después de poner en contacto las células con el fármaco candidato, se miden de nuevo las señales de los productos del gen indicador procedentes de cada una de dichas células para determinar un perfil de respuesta estimulada. Posteriormente se compara el perfil de respuesta basal o de fondo con (p. ej., se resta de o se divide por) el perfil de respuesta estimulada para identificar el perfil de respuesta celular al fármaco candidato. Se puede caracterizar la respuesta celular de diversas maneras. Por ejemplo, se puede restar el perfil basal del perfil estimulado para obtener un perfil de estimulación neta. En otra forma de realización el perfil estimulado se divide entre el perfil basal para obtener un perfil de cociente de inducción. Esos perfiles de comparación suministran una estimación de la especificidad fisiológica del fármaco candidato.

En otra forma de realización de la invención se usa una matriz de sondas de hibridación correspondiente a una población predeterminada de genes del organismo seleccionado para detectar específicamente cambios de la transcripción génica que se deben a la exposición del organismo seleccionado o de células del mismo a un fármaco candidato. En esta forma de realización se expone una o más células procedentes de organismo al fármaco candidato in vivo o ex vivo en condiciones en las que el fármaco produce un cambio de la transcripción del gen en la célula para mantener la homeostasis. En consecuencia, los transcritos de los genes, principalmente ARNm, de la célula o de las células se aíslan por medios convencionales. Posteriormente se pone en contacto a los transcritos aislados o a los ADNc complementarios de los mismos con una matriz ordenada de sondas de hibridación, de modo que cada sonda es específica para cada uno de los diferentes transcritos, en condiciones en las que cada uno de los transcritos se hibrida con una de las sondas correspondientes para formar pares de hibridación. La matriz ordenada de sondas suministra posteriormente complementos para un grupo de genes del organismo suficiente para modelizar la capacidad de respuesta transcripcional del organismo a un fármaco. Las sondas generalmente se inmovilizan y se disponen formando una matriz en un sustrato sólido, como una placa de microtitulación. Se puede realizar la hibridación específica, por ejemplo, lavando la matriz hibridada con un exceso de oligonucleótidos inespecíficos. Posteriormente se detecta una señal de hibridación en cada par de hibridación para obtener un perfil de señales de toda la matriz. Se puede usar una amplia variedad de señales de hibridación; convenientemente las células se marcan previamente con radionucleótidos de modo que los transcritos de los genes suministran una señal radiactiva que se puede detectar en los pares de hibridación. El perfil de señales de toda la matriz de las células estimuladas con el fármaco se compara posteriormente con un perfil de señales de toda la matriz de las células controles negativas para obtener un perfil de respuesta específica al fármaco.

La invención también suministra medios para el análisis cualitativo computarizado de los fármacos candidatos y de compuestos desconocidos. En esos análisis se puede generar y se puede usar una amplia variedad de perfiles de respuesta de referencia. Por ejemplo, se evalúa la respuesta de una matriz a la pérdida de función de cada una de las proteínas o genes o ARN en la célula introduciendo un alelo dominante de un gen en cada una de las células indicadoras, y determinando la respuesta del indicador como una función de la mutación. Para este fin se prefieren las mutaciones dominantes, aunque se pueden usar otros tipos de mutaciones. Las mutaciones dominantes se crean mediante mutagénesis in vitro de genes clonados seguida de cribado en células diploides en busca de alelos mutantes.

En una forma de realización alternativa, la matriz de indicadores se desarrolla en una cepa deficitaria en la función del gen UPF, en la que la mayoría de las mutaciones terminadoras producen un fenotipo dominante, lo que permite que se construyan mutaciones dominantes para cualquier gen. UPF1 codifica una proteína que produce la degradación de los ARNm que, debido a la mutación, contienen codones de terminación prematura. En los mutantes que carecen de la función UPF1, la mayoría de las mutaciones terminadoras codifica fragmentos proteicos truncados cortos. Muchos de éstos interfieren con la función normal de las proteínas y por tanto tienen un fenotipo dominante. Así, en un mutante para upf1, muchos alelos terminadores se comportan como mutaciones dominantes (véase, p. ej., Leeds P., y col. [1992] Molec. Cell Biology. 12:2165-2177).

Los datos resultantes identifican perfiles de respuesta genética. Estos datos se clasifican mediante la respuesta individual a un gen para determinar la especificidad de un gen a un estímulo particular. Se establece una matriz ponderada que asigna a las señales pesos proporcionales a la especificidad de los indicadores correspondientes. La matriz ponderada se revisa dinámicamente, incorporando datos de cada uno de los cribados. Posteriormente se usa una función de regulación génica para construir tablas de regulación que identifican qué células de la matriz responden a qué mutación de un gen indexado, y qué mutaciones afectan a qué células de la matriz.

Los perfiles de respuesta a un estímulo desconocido (p. ej., nuevos productos químicos, compuestos desconocidos o mezclas desconocidas) se pueden analizar comparando los nuevos perfiles de respuesta al estímulo con los perfiles de respuesta a estímulos químicos conocidos. Esos análisis de comparación generalmente adoptan la forma de un informe indexado de las coincidencias con los perfiles de respuesta química de referencia, ordenados según el valor ponderal de cada indicador que coincide. Si hay coincidencia (es decir, una puntuación perfecta), el perfil de respuesta identifica un estímulo que tiene la misma diana que uno de los compuestos conocidos en base a los que se ha construido la base de datos del perfil de respuestas. Si el perfil de respuesta es un subconjunto de células de la matriz estimuladas por un compuesto conocido, el nuevo compuesto es candidato a ser una molécula con una mayor especificidad que el compuesto de referencia. En particular, si los indicadores que responden de manera exclusiva al producto químico de referencia tienen un valor de respuesta con un peso bajo, se concluye que el nuevo compuesto tiene una mayor especificidad. Alternativamente, si los indicadores que responden de manera exclusiva al compuesto de referencia tienen un valor de respuesta con un peso elevado, se concluye que el nuevo compuesto es activo corriente abajo en la misma ruta. Si los datos de salida se solapan con el perfil de respuesta de un compuesto de referencia conocido, se ordena el solapamiento mediante una evaluación cuantitativa con la matriz ponderada para obtener indicadores frecuentes y exclusivos. Posteriormente se clasifican los indicadores exclusivos según las tablas de regulación y se usan las mejores coincidencias para deducir la diana candidata. Si el perfil de respuesta no se solapa ni coincide con un perfil de respuesta química, entonces la base de datos no es adecuada para inferir la función, y se puede añadir el perfil de respuesta a los perfiles de respuesta química de referencia.

El perfil de respuesta de un nuevo estímulo químico se puede comparar también con un perfil de respuesta genética conocida para gen(es) diana. Si hay coincidencia entre los dos perfiles de respuesta, el gen diana o su ruta funcional es la diana de presunción del producto químico. Si el perfil de respuesta del producto químico es un subconjunto de un perfil de respuesta genética, la diana del fármaco está corriente abajo del gen mutante, pero en la misma ruta. Si el perfil de respuesta química incluye como subconjunto un perfil de respuesta genética, se deduce que la diana del producto químico está en la misma ruta que el gen diana, pero corriente arriba y/o el producto químico afecta a otros componentes celulares. Si no, el perfil de respuesta química es novedoso y define una ruta huérfana.

Mientras que se describe en términos de células que comprenden indicadores bajo el control transcripcional de las regiones reguladoras endógenas, hay otros medios diferentes de poner en práctica la invención. Por ejemplo, cada unidad de una matriz de indicadores genómicos que indica sobre la expresión de un gen podría aislar una sonda de oligonucleótidos diferente capaz de hibridarse con el transcrito correspondiente de un indicador diferente. Alternativamente, cada unidad de una matriz que indica sobre la interacción ADN-proteína podría aislar una célula que tiene un primer constructo de un gen indicador vinculado operativamente al punto de unión de un factor de transcripción diana y un segundo constructo híbrido que codifica un dominio de activación de la transcripción fusionado a un gen estructural diferente, es decir, una matriz de un sistema unidimensional de un solo híbrido. Alternativamente, cada unidad de una matriz que indica sobre la interacción proteína-proteína podría aislar una célula que tiene un primer constructo de un gen indicador vinculado operativamente al punto de unión de un factor de transcripción diana, un segundo constructo híbrido que codifica un dominio de activación de la transcripción fusionado a un gen diferente que se expresa constitutivamente y un tercer constructo que codifica un dominio de unión al ADN fusionado a otro gen diferente que se expresa constitutivamente, es decir, una matriz de un sistema bidimensional de dos híbridos.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación.

Ejemplos 1. Matriz de genes indicadores-promotores de la transcripción A) Construcción de una matriz física estimulada con el fármaco mevinolina (lovastatina, Mevacor)

La mevinolina es un compuesto que se sabe que inhibe la biosíntesis del colesterol. Inicialmente, se determinó mediante diluciones seriadas que la concentración no tóxica máxima (medida mediante el crecimiento y la viabilidad celular) de mevinolina en las células indicadoras es 25 \mug/ml. Para producir una matriz estimulada con mevinolina se llena cada uno de los pocillos de 60 placas de microtitulación con 100 \mul de medio de cultivo que contiene 20 \mug/ml de mevinolina en una solución de etanol al 2%. Se añade una alícuota de cada miembro de la matriz de indicadores a cada pocillo, hasta obtener una dilución de aproximadamente 1:100. Las células se incuban en el medio hasta que la turbidez del indicador medio aumenta 20 veces. Posteriormente se cuantifica la turbidez de cada pocillo como medida del crecimiento, y se trata con una solución de lisis para permitir la medición de la \beta-galactosidasa procedente de cada fusión.

B) Generación de una estructura de datos de la matriz de señales de salida

Tanto la turbidez como la \beta-galactosidasa se leen con lectores de placas de microtitulación disponibles comercialmente (p. ej., BioRad) y los datos se capturan en forma de fichero ASCII. A partir de este fichero se resta el valor de las células individuales de la matriz de indicadores con una solución de etanol al 2% al perfil de respuesta de referencia. La diferencia corresponde al perfil de respuesta de mevinolina. El fichero se convierte en el ordenador en una tabla indexada según la respuesta de cada célula al inhibidor. Por ejemplo, los genes que codifican la acetoacetil-CoA tiolasa y la escualeno sintasa aumentan 10 veces, mientras que SIR3 y LEU2, dos genes no relacionados, permanecen sin modificaciones. La respuesta de la matriz de indicadores a otros compuestos se determina de manera similar y se almacena como perfiles de respuesta de salida.

C) Comparación de la estructura de datos de la matriz de señales con una base de datos de matrices de señales

Se construye una matriz física como se describe más arriba excepto que mevinolina se sustituye por un compuesto de prueba desconocido. El perfil de respuesta resultante se compara con los perfiles de respuesta de una biblioteca de compuestos con actividad biológica conocidos y se analiza como se ha descrito más arriba. Por ejemplo, si el perfil de salida del compuesto de prueba muestra inducción de los genes de la acetoacetil-CoA tiolasa y de la escualeno sintasa, entonces el perfil de salida coincide con el que se espera de un inhibidor de la síntesis de colesterol. Si el perfil de salida tiene menos células diferentes afectadas que el perfil de respuesta a mevinolina, el compuesto desconocido es candidato a una mayor especificidad. Si el perfil de respuesta del nuevo producto químico afecta a menos indicadores diferentes que el perfil de respuesta a la mevinolina, y si los otros indicadores a los que afecta la mevinolina tienen un menor valor ponderado, entonces el compuesto es candidato a una mayor especificidad. Si el perfil de respuesta tiene más células diferentes afectas que el perfil de respuesta a la mevinolina, entonces el compuesto es candidato a una menor especificidad. En el caso en el que se estudian mezclas de compuestos, se evalúan las respuestas ponderadas máximas para determinar si se pueden diferenciar los perfiles de respuesta de dos compuestos diferentes, o dos perfiles de respuesta genética diferentes.

2. Matriz de sondas de hibridación transcrito del indicador-oligonucleótido construcción de una matriz física estimulada y generación de una estructura de datos de una matriz de datos de salida

Se disponen sondas de hibridación de oligonucleótidos no marcados complementarias al transcrito del ARNm de cada gen de la levadura en un sustrato de silicio en el que se han hecho marcas mediante técnicas estándar (p. ej., Fodor y col. [1991] Science 252, 767). Las sondas tienen una longitud y secuencia tales que garantizan la especificidad del gen de la levadura correspondiente, típicamente aproximadamente 24-240 nucleótidos de longitud.

Un cultivo confluente de células HeLa se trata con mevinolina 15 \mug/ml en etanol al 2% durante 4 horas a la vez que se mantiene en una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5% a 37ºC. Se extrae un ARN mensajero, se somete a transcripción inversa y se marca con fluoróforo según procedimientos estándar (Sambrook y col, Molecular Cloning, 3ª ed.). El ADNc resultante se hibrida con la matriz de sondas, se lava la matriz para eliminar el ADNc marcado no hibridado, se cuantifica la señal de hibridación de cada unidad de la matriz usando un escáner microscópico confocal (instrumentos de Molecular Devices y Affymetrix), y los datos resultantes de respuesta de la matriz se almacenan en formato digital.

3. Matriz bidimensional de dos híbridos A) Construcción de la matriz física estimulada

La matriz bidimensional de dos híbridos (véase, p. ej., Chien y col. [1991] PNAS, 88, 9578) se diseña para hacer el cribado de compuestos que afectan específicamente a la interacción entre dos proteínas, p. ej. la interacción de un transductor de señales humano y un activador de la transcripción (STAT) con un receptor de interleucina. Las dos fusiones híbridas se generan mediante procedimientos estándar: cada cepa contiene una porción del gen STAT humano diana, que se fusiona con una porción de un gen fúngico o bacteriano que codifica un dominio de unión a ADN (p. ej., GAL4:1-147). La secuencia de ADN que reconoce ese dominio de unión al ADN (p. ej., UAS_{G}) se inserta en el indicador seleccionado (p. ej., lacZ) en lugar de la secuencia potenciadora 5'. la cepa también contiene otra fusión formada por una porción intracelular del gen del receptor diana cuyo producto proteico interactúa con el STAT. Este gen del receptor se fusiona con un fragmento del gen que codifica un dominio de activación transcripcional (p. ej., GAL4:768-881).

B) Generación de la estructura de datos de la matriz de señales

Tanto la turbidez como la galactosidasa se leen con lectores comerciales de placas de microtitulación (BioRad) y los datos se capturan como ficheros
ASCII.

C) Comparación de la estructura de datos de la matriz de señales con la base de datos

Se analizan los datos de aquellos compuestos que bloquean la interacción de las dos proteínas humanas mediante la reducción de la señal que se produce a partir del indicador en las diferentes cepas que contienen pares de proteínas humanas. La salida se procesa para identificar compuestos que tienen un gran impacto sobre un indicador cuya expresión depende de un solo par de proteínas humanas que interactúan. Se usa una matriz ponderada invertida para evaluar estos datos, puesto que los compuestos preferidos no afectan incluso a los indicadores menos específicos de la matriz.

Claims (18)

1. Un procedimiento para estimar un perfil de respuesta de un organismo diana a un agente que puede provocar una respuesta celular, que comprende:

(a)

poner en contacto cada una de una pluralidad de células diferentes aisladas por separado a partir de un organismo diana con dicho agente, conteniendo cada una de dichas células un constructo recombinante que comprende un gen indicador ligado operativamente a un elemento endógeno regulador de la transcripción diferente de dicho organismo diana, de forma que dicho elemento regulador de la transcripción regula la expresión de dicho gen indicador, en el que los diferentes elementos reguladores de la transcripción de dicha pluralidad de células comprenden elementos endógenos reguladores de la transcripción de la mayoría de los genes de dicho organismo;

(b)

detectar las señales de los productos de los genes indicadores de cada una de dichas células a las que se pone en contacto con dicho agente;

(c)

comparar dichas señales del producto del gen indicador procedentes de cada una de dichas células a las que se pone en contacto con dicho agente con un perfil de respuesta basal para obtener un perfil de respuesta a dicho agente.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha pluralidad de células comprende constructos recombinantes que comprenden elementos reguladores de la transcripción de miles de genes de dicho organismo.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha pluralidad de células comprende constructos recombinantes que comprenden elementos reguladores de la transcripción de casi todos los genes de dicho organismo.

4. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el gen indicador es el gen lacZ, el gen suc2 o un gen que codifica una proteína fluorescente verde.

5. Un procedimiento para estimar un perfil de respuesta de un organismo diana a un agente que puede provocar una respuesta celular, que comprende:

(a)

poner en contacto transcritos génicos, o ADNc procedentes de los mismos, con una matriz ordenada de sondas de hibridación, siendo cada sonda específica para uno diferente de dichos transcritos, o para los ADNc procedentes de los mismos, en condiciones en las que cada uno de dichos transcritos génicos, o los ADNc procedentes de los mismos, se hibridan con la sonda correspondiente de dichas sondas para formar pares de hibridación, suministrando dicha matriz ordenada de sondas sondas que son específicas para los transcritos de la mayoría de los genes de dicho organismo o para los ADNc procedentes de los mismos, y dichos transcritos génicos, o los ADNc procedentes de los mismos, se aíslan a partir de células de dicho organismo diana al que se pone en contacto con dicho agente;

(b)

detectar una señal de hibridación en cada par de hibridación para obtener un perfil de señales de toda la matriz; y

(c)

comparar dicho perfil de señales de toda la matriz procedente de células a las que se ha puesto en contacto con dicho agente con un perfil de señales de toda la matriz de células de control negativo para obtener un perfil de respuesta a dicho agente.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5 en el que dicha matriz ordenada de sondas suministra sondas que son específicas para los transcritos de miles de genes de dicho organismo o de los ADNc procedentes de los mismos.

7. Un procedimiento según la reivindicación 5 o la reivindicación 6 en el que dicha matriz ordenada de sondas suministra sondas que son específicas para los transcritos de casi todos los genes de dicho organismo o de los ADNc procedentes de los mismos.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en el que dichas sondas comprenden oligonucleótidos de entre 24 y 240 ácidos nucleicos de longitud.

9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que además comprende la etapa de seleccionar dicho agente como candidato a producto terapéutico en humanos.

10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicho organismo diana es una levadura.

11. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicho organismo diana es una bacteria.

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicho organismo diana es un ser humano.

13. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que además comprende:

(a)

almacenar todos los perfiles de respuesta como datos digitales en una estructura de datos de perfiles de respuesta asociada al agente que genera el perfil de respuesta, y

(b)

comparar dicha estructura de datos de perfiles de respuesta con una base de datos de perfiles de respuesta, comprendiendo dicha base de batos perfiles de respuesta para una pluralidad de agentes conocidos.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13 en el que dicha comparación determina si dicho agente que se asocia a dicho perfil de respuesta tiene la misma diana que un agente que se asocia a una estructura de datos de perfiles de respuestas de la base de datos de perfiles de respuestas, o si tiene una mayor especificidad que un agente de la base de datos, o si es un agente novedoso.

15. Un sustrato sólido para estimar un perfil de respuesta de un organismo diana a un agente que puede suministrar una respuesta celular, comprendiendo dicho sustrato sólido una pluralidad de células aisladas de dicho organismo diana,

en el que cada una de dichas células contiene un constructo recombinante que comprende un gen indicador ligado operativamente a un elemento endógeno regulador de la transcripción diferente de dicho organismo diana, de modo que dicho elemento regulador de la transcripción regula la expresión de dicho gen indicador,

en el que los diferentes elementos reguladores de la transcripción de dicha pluralidad de células comprenden elementos reguladores de la transcripción de la mayoría de los genes de dicho organismo.

16. Un sustrato sólido según la reivindicación 15 en el que los diferentes elementos reguladores de la transcripción de dicha pluralidad de células comprenden elementos reguladores de la transcripción de miles de genes de dicho organismo.

17. Un sustrato sólido para estimar un perfil de respuesta de un organismo diana a un agente que puede provocar una respuesta celular, comprendiendo dicho sustrato sólido una pluralidad de sondas de hibridación en las que cada sonda se puede hibridar de manera específica con los transcritos de un gen diferente de dicho organismo diana o con el ADNc procedente de los mismos, y

en el que dicha pluralidad de sondas se puede hibridar de manera específica con transcritos de la mayoría de los genes de dicho organismo o con los ADNc procedentes de los mismos.

18. Un sustrato sólido según la reivindicación 17 en el que dicha pluralidad de sondas se puede hibridar de manera específica con transcritos, o con ADNc procedentes de los mismos, de más de mil de genes de dicho organismo.