ES2220006T3 - Ensalyos de union especificos usando anaranjado de metilo. - Google Patents
Ensalyos de union especificos usando anaranjado de metilo.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD DE UN ENSAYO DE UNIONES ESPECIFICAS A BASE DE AÑADIR NARANJA DE METILO A UNA SOLUCION DE REVESTIMIENTO EN UNA CANTIDAD SUFICIENTE PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD DE UN INMUNOENSAYO LLEVADO A CABO UTILIZANDO DICHO REVESTIMIENTO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS AL VIRUS DE LA HEPATITIS C QUE SE LLEVA A CABO I) FORMANDO UNA FASE SOLIDA QUE COMPRENDE UNA SOLUCION DE REVESTIMIENTO QUE CONTIENE NARANJA DE METILO Y AL MENOS UN PRIMER LIGANDO DE UNION PARA ANTICUERPOS AL VIRUS DE LA HEPATITIS C; II) PONIENDO EN CONTACTO LA FASE SOLIDA CON UNA MUESTRA QUE PUEDE CONTENER ANTICUERPOS AL VIRUS DE LA HEPATITIS C; III) PONIENDO EN CONTACTO LA FASE SOLIDA CON AL MENOS UN SEGUNDO LIGANDO DE UNION PARA ANTICUERPOS A LA HEPATITIS C, ETIQUETANDO DICHO SEGUNDO LIGANDO DIRECTA O INDIRECTAMENTE CON UN GRUPO DETECTABLE Y IV) MIDIENDO LA CANTIDAD DE GRUPO DETECTABLE UNIDO A LA FASE SOLIDA.
Description
Ensayos de unión específicos usando anaranjado de
metilo.
Los ensayos de unión específicos, por ejemplo los
inmunoensayos, que aprovechan las reacciones de unión naturales, han
encontrado un uso generalizado como técnicas analíticas en química
clínica. Debido a la especificidad de las reacciones, son
particularmente útiles para cuantificar analitos biológicos que
están presentes a concentraciones muy bajas en los líquidos
biológicos. Esos analitos incluyen, por ejemplo, antígenos,
anticuerpos, medicamentos terapéuticos, narcóticos, enzimas,
hormonas, proteínas, etc.
Muchos tintes o colorantes (de aquí en lo
sucesivo "colorantes") se usan en procedimientos comerciales de
revestimiento para inmunoensayos para ayudar a supervisar la
administración de un reactivo o para efectuar la supervisión
espectrofotométrica de la administración de un reactivo. Muchos de
los colorantes están disponibles en el mercado. Básicamente, el
colorante permite la detección visual. Esto puede ser
particularmente útil para supervisar la administración de soluciones
en el interior de recipientes, p. ej., micropocillos durante
procesos de fabricación para revestir la superficie de los
micropocillos con materiales biológicos. Los recipientes
recubiertos se usan posteriormente como fase sólida en
inmunoensayos. Es deseable que los colorantes que se usan no
interfieran con la naturaleza biológica de las proteínas, que
revisten el soporte de fase sólida. Sin embargo, algunas proteínas
pueden interactuar con los colorantes y, como consecuencia, esta
interacción reduce el rendimiento del ensayo. Por ejemplo, éste ha
sido un problema reconocido en la fabricación de micropocillos para
ensayos para detectar anticuerpos frente al virus de la hepatitis C
(VHC).
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es suministrar un colorante que se pueda usar en el revestimiento de
la fase sólida que comprenda antígenos del VHC y para ayudar a
supervisar el volumen de llenado de los micropocillos, y que además
no tenga un efecto perjudicial sobre las proteínas, específicamente
los antígenos del VHC, que están presentes en un ensayo
anti-VHC. Otro objeto de la presente invención es
suministrar un colorante que realmente mejore el rendimiento del
ensayo.
El documento WO 89/00292 describe el
revestimiento de una fase sólida para un ensayo de unión específico
con anaranjado de metilo.
La invención está relacionada con la adición de
colorantes, particularmente, anaranjado de metilo, a una solución de
revestimiento que se usa en un procedimiento para preparar una fase
sólida para su uso en ensayos de unión específicos y para supervisar
el volumen de solución de revestimiento que se administra en el
interior de un recipiente. Se investigaron muchos colorantes para
su uso en las formulaciones de revestimiento en el inmunoensayo
anti-virus de la hepatitis C para permitir la
supervisión colorimétrica y el control del proceso de los volúmenes
de revestimiento que se administran en la fase sólida. Muchos de los
colorantes redujeron la actividad de las proteínas de revestimiento
recombinantes del VHC. De manera inesperada, el solicitante encontró
que, tras la adición de anaranjado de metilo, no sólo se podían
supervisar los volúmenes de solución de revestimiento, sino que
también el uso de anaranjado de metilo como colorante interactúa
positivamente con las proteínas, especialmente con los antígenos del
VHC, lo que da lugar a una mayor especificidad de los resultados
del ensayo. Por lo tanto, como se muestra mediante la comparación
de las figuras 1a y 1b, una solución para revestir una fase sólida
que comprenda anaranjado de metilo permite una mayor discriminación
entre muestras negativas y muestras positivas.
Por lo tanto, una forma de realización de la
presente invención es suministrar una fase sólida para un
inmunoensayo que comprende al menos un antígeno inmovilizado del VHC
que se ha tratado con anaranjado de metilo. Una forma de realización
preferida de la invención es aquélla en la que el antígeno del VHC
se expresa a partir de las regiones NS3 y/o NS4 del genoma vírico.
Una forma de realización más preferente es en la que el antígeno del
VHC es c200.
Otro objeto de la presente invención es
suministrar un procedimiento para mejorar la especificidad de un
inmunoensayo anti-VHC mediante la adición de
anaranjado de metilo a una solución de revestimiento en una cantidad
suficiente como para mejorar la especificidad de un inmunoensayo que
se realiza usando dicho revestimiento.
En una forma de realización preferente de este
aspecto de la invención, se lleva a cabo un procedimiento para la
detección de anticuerpos frente al virus de la hepatitis C: i)
suministrando una fase sólida que comprende una solución de
revestimiento que comprende anaranjado de metilo y al menos un
primer ligando de unión para los anticuerpos frente al virus de la
hepatitis C, ii) haciendo entrar en contacto la fase sólida con una
muestra que puede contener anticuerpos frente al virus de la
hepatitis C, iii) haciendo entrar en contacto la fase sólida con al
menos un segundo ligando de unión para los anticuerpos frente al
virus de la hepatitis C, estando marcado dicho segundo ligando
directa o indirectamente con un grupo detectable y iv) midiendo la
cantidad del grupo detectable unido a la fase sólida. De manera
alternativa, la cantidad de grupo detectable no unido a la fase
sólida se puede medir como indicación de la presencia de anticuerpos
frente al VHC. El grupo detectable puede ser, por ejemplo, un
enzima, un átomo radiactivo, una molécula fluorescente o una
molécula luminiscente. Cualquier experto habitual en la técnica
comprenderá que las etapas i) a iv) se pueden hacer secuencial o
simultáneamente. También se comprenderá que el primero y el segundo
ligandos de unión pueden ser iguales o diferentes. Además, la
cantidad medida de grupo detectable se puede correlacionar con la
cantidad de anticuerpos anti-VHC presentes en la
muestra.
Otras ventajas de la presente invención se
aclararán a partir de la siguiente descripción más detallada y de
los siguientes ejemplos.
La Figura 1a representa un histograma de las
muestras sin anaranjado de metilo en el revestimiento del
micropocillo.
La Figura 1b representa un histograma de las
muestras con anaranjado de metilo en el revestimiento del
micropocillo.
El colorante anaranjado de metilo es anfótero,
ligeramente soluble en agua y un colorante monoazoderivado (Reagent
Chemicals, 7ª Ed., Amer. Chem. Society, Washington, DC, 1986, p.
434-435). La fórmula empírica del anaranjado de
metilo es
(CH_{3})_{2}NC_{6}H_{4}N=NC_{6}H_{4}SO_{3}Na.
Sus aplicaciones más frecuentes han sido en la industria textil,
habitualmente para teñir lana y seda a partir de un baño ácido y
para valorar ácidos minerales (Analytical Chemistry [II], 9ª ed.,
John Wiley & Sons, 1942, p. 467-469), indicar
bases fuertes y estimar la alcalinidad de las aguas (Merck Index,
11ª ed., 6019). Las aplicaciones biológicas del anaranjado de metilo
incluyen la tinción de los acidófilos de la hipófisis (tinción de
Kreyberg) y de material para plantas (tinción de Flemmings).
En un "ensayo de unión específico" en el que
se utilizan dos asociados de unión, un "ligando de unión" puede
ser cualquier componente de un par de asociados de unión. Los
asociados de unión que se usan con más frecuencia son anticuerpos y
antígenos o haptenos, pero se pueden usar otras proteínas de unión,
receptores y moléculas biológicas que pueden participar en
reacciones de unión específicas. Para la reacción de unión entre el
anticuerpo y el antígeno, el anticuerpo o el antígeno puede ser un
ligando de unión.
Una "fase sólida", como se usa en la
presente memoria descriptiva, se refiere a cualquier material que es
insoluble y al que se puede fijar directa o indirectamente un
ligando de unión para su uso en un ensayo de unión específico. La
fase sólida se puede elegir por su capacidad intrínseca de atraer e
inmovilizar un ligando de unión. De manera alternativa, la fase
sólida puede conservar la capacidad de inmovilizar el ligando de
unión mediante una reacción de unión específica usando avidina o
estreptavidina y biotina. Se pueden usar como fase sólida materiales
naturales, materiales sintéticos o materiales naturales modificados
sintéticamente. Un material preferible para su uso en una fase
sólida es el poliestireno. Opcionalmente, una fase sólida puede
estar en forma de partículas, tiras reactivas o el recipiente en el
que se realiza el ensayo de unión específico.
Una "solución de revestimiento", como se usa
en la presente memoria descriptiva, se refiere a cualquier solución
o reactivo que se pone en contacto con la fase sólida antes de
realizar un ensayo de unión específico. El revestimiento puede
contener, aunque no está limitado a ello, proteínas y/o tampones. Un
experto en la materia comprenderá cómo hacer y aplicar
revestimientos adecuados para fases sólidas adecuadas.
Una "muestra", como se usa en la presente
memoria descriptiva, se refiere a cualquier sustancia que puede
contener el analito de interés. Una muestra puede ser un líquido
biológico, como sangre entera o componentes de la sangre entera
incluyendo eritrocitos, leucocitos, plaquetas, suero y plasma,
líquido ascítico, orina, líquido cefalorraquídeo y otros
constituyentes del cuerpo que pueden contener el analito de interés.
Opcionalmente, se pueden obtener muestras de agua, suelo y
vegetación.
Los antígenos del VHC que se expresan a partir de
las regiones NS3/NS4, particularmente c200, se pueden preparar, por
ejemplo, usando técnicas conocidas de ADN recombinante. La
secuencia del VHC ("VHC-1") está disponible en
GENBANK, Consulta Nº M62.321 (Nucleic Acid Res.,
22:3441-3444 [1994]). Además, la preparación de
proteínas recombinantes del VHC se describe en la Patente de Estados
Unidos Número 5.705.330.
Uyttendaele y col. muestran el genoma del VHC y
las proteínas recombinantes deducidas en Vox Sang.,
66:122-129 (1994). En concreto, la secuencia de
aminoácidos de c200 es AA1192-1931. Se puede
encontrar un análisis de la organización del genoma del VHC en
The Lancet, 344:1475-1479 (1994), por Cees
L. Van der Poel y col.
La presente invención usa anaranjado de metilo
para las soluciones de revestimiento de la fase sólida, para
permitir el control colorimétrico de los procesos, y que
inesperadamente mejora el rendimiento del ensayo. Se mostró que la
adición de anaranjado de metilo a las soluciones de revestimiento
interactúa positivamente con las proteínas recombinantes del VHC
para permitir el control colorimétrico de procesos y mejorar la
especificidad del ensayo.
La eficacia y las ventajas de la invención se
ilustran adicionalmente con los siguientes ejemplos. Los ejemplos
tienen como objetivo ilustrar la invención.
Se revistieron micropocillos de poliestireno
AMERLITE (Ortho-Clinical Diagnostics, RU) con
antígenos del VHC (c22-3, c200 y
NS-5, obtenidos de Chiron Corporation, Emeryville,
CA, EE.UU.), incubando los micropocillos con 200 \mul de tampón de
revestimiento 1 o de tampón de revestimiento 2, cuyas composiciones
se presentan a continuación. Se incubaron los pocillos durante 16
horas a temperatura ambiente. Después de lavar con un tampón TRIS a
pH 8,5 que contiene sacarosa, suero salino y albúmina sérica bovina
(ASB), se secaron los micropocillos y se almacenaron con un
desecante a 2-8ºC.
Tampón de revestimiento 1, pH
6,95-7,05
| Fosfato sódico dibásico | 5,45 g/l |
| Fosfato potásico monobásico | 1,55 g/l |
| 2-cloroacetamida | 1,00 g/l |
| EDTA | 0,744 g/l |
| ASB (sin proteasas) | 0,004 g/l |
| c22-3 | 0,6 mg/l |
| c200 | 1,0 mg/l |
| NS-5 | 0,25 mg/l |
| Agua desionizada | hasta 1 l |
Tampón de revestimiento 2, pH
6,95-7,05
Anaranjado de metilo en tampón de revestimiento 1
0,003 g/l
Se evaluó el rendimiento de los micropocillos
recubiertos usando el siguiente protocolo de ensayo para medir los
anticuerpos frente al VHC: se añadieron 20 \mul de una muestra
(plasma humano combinado con una actividad anti-VHC
conocida) y 160 \mul de diluyente de muestra (suero salino
tamponado con fosfato a pH 7,4) a los micropocillos recubiertos de
VHC y se incubaron los micropocillos durante 30 minutos a 37ºC en un
incubador AMERLITE. Después de lavar los micropocillos en un lavador
AMERLITE, se añadieron 180 \mul de anticuerpo monoclonal marcado
con peroxidasa del rábano (PR) dirigido frente a la IgG humana, y se
incubaron los micropocillos durante otros 15 minutos. Después de
lavar otra vez los micropocillos en un lavador AMERLITE, se midió
la actividad de la PR mediante una reacción potenciada de
luminiscencia (Whitehead y col. [1983], Nature 305,
1158-159). Se añadió a los micropocillos el reactivo
de señales AMERLITE, que contiene substratos luminógenos (un
derivado de luminol y una sal perácida) y un potenciador (un fenol
sustituido) para iniciar la reacción emisora de luz. Las señales
luminosas se leyeron en un analizador AMERLITE.
Se estableció un punto de corte a la señal
luminosa que se obtenía para una muestra positiva conocida (que
contiene actividad anti-VHC) en el ensayo,
multiplicada por un factor de conversión, de modo que para muestras
desconocidas un valor del cociente señal/punto de corte (S/C) \geq
1 indica una muestra reactiva y la posible presencia de anticuerpos
anti-VHC. Un resultado < 0,9 indica una muestra
no reactiva, negativa para anticuerpos anti-VHC. Un
resultado \geq 0,9 y < 1 indica una muestra en la zona
gris.
Los micropocillos preparados usando el colorante
anaranjado de metilo en las soluciones de revestimiento (pocillos
con AM) dio señales lumínicas más bajas para los controles en el
ensayo anti-VHC que los micropocillos preparados
usando las soluciones de revestimiento sin el colorante (pocillos
control) (Tabla 1). El factor de conversión para establecer el
punto de corte con respecto al control positivo se estableció en
0,25. El rendimiento de los controles con respecto a S/C permaneció
relativamente inalterado (Tabla 1), lo que indica que la adición de
anaranjado de metilo al tampón de revestimiento no tuvo efectos
perjudiciales sobre la sensibilidad del ensayo, es decir, la
capacidad del ensayo de detectar una muestra débilmente
positiva.
Se revistieron los micropocillos con antígenos
del VHC como en el Ejemplo 1. Se ensayaron 430 sueros de donantes
humanos de sangre, que se asumió que eran negativos para anticuerpos
anti-VHC, usando los micropocillos, siguiendo el
protocolo de ensayo anti-VHC en el Ejemplo 1. Los
valores de S/C de los sueros negativos fueron generalmente menores
usando los pocillos con AM que con los pocillos de control (S/C
medio = 0,13 y 0,16, respectivamente) (Figura 1). Los valores de S/C
\leq 0,1 se obtuvieron en el 42% de los donantes usando pocillos
con AM en comparación con 17% usando pocillos de control. Estos
valores se relacionan con los resultados que se obtienen en el
suero de donantes individuales, y por lo tanto puede que no sean
comparables directamente con los resultados para el control de los
sueros combinados del Ejemplo 1. Los menores valores de S/C de las
muestras negativas dan lugar a una mejora de la especificidad y a
una mejor discriminación de las muestras negativas respecto al
punto de corte. Esta mejor distribución se podría usar para
optimizar la sensibilidad y la especificidad del ensayo colocando
adecuadamente el punto de corte. Por ejemplo, en el Ejemplo 3 el
factor de conversión para establecer el punto de corte en relación
con el control positivo se estableció en 0,33 para optimizar el
rendimiento del ensayo.
Se revistieron los micropocillos con antígenos
del VHC como en el Ejemplo 1. Se usaron paneles comerciales de
seroconversión, que se compraron a Boston Biomedica Inc., West
Bridgewater, MA, EE.UU., para evaluar la sensibilidad clínica del
ensayo anti-VHC siguiendo el protocolo de ensayo en
el Ejemplo 1. Se calculó el cociente S/C usando un valor del punto
de corte de la señal del control positivo multiplicado por un factor
de conversión de 0,33. Los resultados de los paneles de
seroconversión en los ensayos fueron los mismos usando pocillos con
AM y pocillos de control (Tablas 2a-e). No hubo
cambios del estado de negatividad o de positividad de las muestras,
y por lo tanto la adición de anaranjado de metilo a las
formulaciones de revestimiento no tuvo efectos perjudiciales sobre
la sensibilidad del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios de seroconversión con los paneles de
Boston Biomedica Inc. en el ensayo anti-VHC usando
micropocillos con anaranjado de metilo (AM) y sin anaranjado de
metilo (control) en las soluciones tampón de revestimiento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un experto en la materia comprendería que la
concentración del colorante se podría supervisar
espectrofotométricamente a 450 nm y que, de esta manera, se podría
usar como ayuda en el control de procesos para el revestimiento de
pocillos, permitiendo la medición del volumen de la solución de
revestimiento que se administra a micropocillos ópticamente claros a
intervalos durante el proceso de administración.
Claims (9)
1. Una fase sólida para un ensayo de unión
específico que comprende un antígeno inmovilizado del virus de la
hepatitis C tratado con anaranjado de metilo.
2. La fase sólida de la reivindicación 1, en la
que el antígeno del virus de la hepatitis C se expresa a partir de
las regiones NS3 o NS4 del genoma del virus de la hepatitis C.
3. La fase sólida de la reivindicación 2, en la
que el antígeno del virus de la hepatitis C es c200.
4. Un procedimiento para mejorar la especificidad
de un inmunoensayo anti-virus de la hepatitis C que
comprende la exposición de un antígeno del VHC a anaranjado de
metilo, el acoplamiento del antígeno del VHC a una fase sólida y la
realización del inmunoensayo usando la fase sólida.
5. Un procedimiento para la detección de
anticuerpos frente al virus de la hepatitis C, que comprende:
- i.)
- suministrar una fase sólida que comprende una solución de revestimiento que comprende anaranjado de metilo y al menos un primer ligando de unión para los anticuerpos frente al virus de la hepatitis C,
- ii.)
- poner en contacto la fase sólida con una muestra que puede contener anticuerpos frente al virus de la hepatitis C,
- iii.)
- poner en contacto la fase sólida con al menos un segundo ligando de unión para los anticuerpos frente al virus de la hepatitis C, estando marcado dicho segundo ligando con un grupo detectable y
- iv.)
- medir la cantidad del grupo detectable unido a la fase sólida o no unido a la fase sólida.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que el grupo detectable se selecciona del grupo formado por: un
enzima, un átomo radiactivo, una molécula fluorescente y una
molécula luminiscente.
7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que los primeros ligandos de unión son c200, c22-3 y
NS5, y el segundo ligando de unión es un anticuerpo frente a la IgG
humana.
8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que los primeros ligandos de unión son c200, c22-3 y
NS5.
9. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que el segundo ligando de unión es un anticuerpo frente a la IgG
humana.
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