PL173033B1

PL173033B1 - Sposób wykrywania swoistej immunoglobuliny w próbce

Info

Publication number: PL173033B1
Application number: PL93309004A
Authority: PL
Inventors: Niels Johansen; Hans-Henrik Ipsen
Original assignee: Alk As
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 1998-01-30
Also published as: FI952330L; NO951875L; JPH08503071A; KR950704686A; DE69310537T2; EP0669000B1; DK137992D0; DK0669000T3; NO951875D0; PL173049B1; PL309004A1; NO320170B1; ES2103559T3; JP3194585B2; FI111194B; DE69310537D1; CA2149340A1; RU2132070C1; KR100306433B1; AU682478B2

Abstract

1. Sposób wykrywania swoistej immunoglobuliny w próbce, polegajacy na zastosow a- niu przeciw cial kowalentnie zwiazanych z czastkami paramagnetycznymi um ozliwiajacym i ich oddzielanie i reakcje ze sw oista immunoglobulina oraz przeciw ciala, alergenu lub antygenu zw iazanego z biotyna, a takze chem ilum inescencyjnego zwiazku znakujacego, znam ienny tym , ze m iesza sie z próbka antygen, przeciw cialo lub hapten jako ligand zwiazany z biotyna lub jej funkcjonalna pochodna, przeciw cialo skierowane przeciw wykry- wanej im m unoglobulinie zwiazane z czastkami param agnetycznym i, oraz chem ilum inescen- cyjny zw iazek akrydynowy zw iazany z awidyna, streptawidyna lub ich funkcjonalna pochodna dla utworzenia kompleksu zwiazanego z faza stala, m agnetycznie oddziela sie faze stala od fazy cieklej, inicjuje sie stosujac nadtlenek wodoru reakcje chem ilum inescencyjna oraz mierzy sie em isje swiatla oddzielonej fazy stalej, w której w ystepow anie chem ilum ine- scencji jest wskaznikiem obecnosci immunoglobuliny w próbce. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania swoistej immunoglobuliny w próbce, zwłaszcza stosowany w teście dwustronnym chemiluminescencyjnego związku estru akrydynowego sprzężonego z awidyną lub streptawidyną oraz ligandu sprzężonego z biotyną, w którym kompleks powinowactwa jest wychwytywany na cząstkach paramagnetycznych, co umożliwia szybkie wykrycie immunologicznie aktywnych substancji takich, jak immunoglobuliny w

173 033 próbkach takich, jak płyny biologiczne oraz próbki tkanek, mleka, pokarmów, napojów, wody lub ścieków przemysłowych.

Sposób wykrywania przeciwciał klasy IgE w surowicy został ujawniony w broszurze Magie® LiteSQ ^M dla swoistej IgE opublikowanej przez Ciba Corning Diagnostics Corp. oraz ALK Laboratories we wrześniu 1990 roku. W wymienionym sposobie swoisty alergen kowalentnie związany z cząstkami paramagnetycznymi reaguje z przeciwciałem klasy IgE swoistym dla alergenu w próbce surowicy lub osocza. Po pierwszym okresie inkubacji i odpłukaniu nie związanej swoistej IgE dodawane jest przeciwciało monoklonalne znakowane chemiluminescencyjnym estrem akrydynowym skierowane przeciw IgE. Po drugim okresie inkubacji związane z fazą stałą i znakowane przeciwciało mierzone jest w analizatorze Magie Lite ® (nr kat. 472733 lub nr kat. 472270), który automatycznie dodaje odczynniki inicjujące reakcję chemiluminescencyjną. Przy użyciu wymienionej metody zautomatyzowany może być tylko ostatni etap inicjowania i mierzenia chemiluminescencji. Chemiluminescencyjny znakujący związek estru akrydynowego został opisany w amerykańskim opisie patentowym 4,745,181.

Opis patentowy amerykański 4,946,958 ujawnia chemiluminescencyjny ester akrydynowy związany z grupą N-sukcynimidylową, który może być dalej związany z białkiem lub polipeptydem dostarczając immunologicznie reaktywny odczynnik luminescencyjny. Wymieniony odczynnik może być użyty w teście immunologicznym, który może obejmować równoczesne wiązanie przeciwciała w fazie stałej, cząsteczki antygenu oraz znakowanego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału, oddzielanie i płukanie fazy stałej oraz ilościowe oznaczanie luminescencji fazy stałej. ,

W publikacji zamieszczonej w Methods in Enzymology, 184 (1990), str. 481-496 Strasburger i inni ujawniają użycie dwustronnego chemiluminescencyjnego testu immunologicznego, w którym hormony hGH oraz hCG są wychwytywane przez przeciwciała immobilizowane na płytkach mikrotitracyjnych oraz znakowane czynnikiem chemiluminescencyjnym sprzężonym z awidyną poprzez znakowane biotyną drugie przeciwciało. Wykrywane składniki antygenowe takie, jak hormony białkowe, mogą być badane bezpośrednio z próbek surowicy i porównywane z krzywymi standardowymi. Stężenie immunoglobulin takich, jak IgE jest jednak niezwykle zależne od pacjenta, a badanie swoistych IgE musi być porównywane z poziomem całkowitych IgE u danego pacjenta, a zatem wymaga testu o większym zakresie dynamicznym niż ten uzyskiwalny w teście ujawnionym przez Strasburgera i innych.

Europejski opis patentowy 425217 ujawnia badanie hybrydyzacji, w którym tworzony jest kompleks chemiluminescencyjny składający się z kwasu nukleinowego hybrydyzowanego z pierwszą znakowaną sondą nukleotydową sprzężoną z cząstkami paramagnetycznymi oraz drugą sondą nukleotydową znakowaną biotyną i sprzężoną z estrem awidynowoakrydynowym. Jednakże osoba wyszkolona, stając przed problemem zapewnienia w pełni zautomatyzowanego sposobu wykrywania przeciwciał, będzie poszukiwała sposobu, który można przeprowadzić w jednym naczyniu reakcyjnym i korzystnie w warunkach reakcji w temperaturze otoczenia. Test przedstawiany w wymienionym opisie jest zasadniczo odmienny jako, że wykorzystuje wykrywanie swoistych sekwencji nukleotydowych, które nie są antygenami, dla których można wytworzyć swoiste przeciwciała. Bardziej szczegółowo, w wymienionym teście konieczne jest użycie do hybrydyzacji podwyższonej temperatury oraz sondy haptenowo-oligonukleotydowej, która nie jest ani konieczna, ani pożądana w testach immunologicznych.

Ponadto, handlowe testy dla oznaczania swoistych IgE (CAP, RAST dostarczany przez Pharmacia, Uppsala) oraz test Magic®Lite SQ™ dla swoistych IgE wykorzystują test odniesienia dla całkowitej IgE, o nie identycznym protokole, co powoduje otrzymanie nieprecyzyjnych danych. Tylko testy wykorzystujące te same procedury wychwytywania i wykrywania są bezpośrednio porównywalne. Na przykład, wszystkie krzywe odpowiedzi dla swoistych IgE muszą być równoległe do krzywych odpowiedzi dla całkowitej IgE. Jest tak dlatego, że wymagany zakres dynamiczny dla badania swoistych IgE wynosi 2 dekady, wymagany zakres dynamiczny dla badanej całkowitej IgE wynosi 2 do 7 dekad, a istniejące testy immunologiczne nie pozwalają na przeprowadzenie pomiarów powyżej całkowitego zakresu. Tak więc dotychczas do badania swoistych i całkowitej IgE konieczne było wykorzystywanie różnych protokołów z użyciem różnych odczynników.

173 033

Ze względu na rosnące zainteresowanie bezpiecznymi procedurami laboratoryjnymi istnieje potrzeba całkowicie zautomatyzowanego sposobu wykrywania substancji takich, jak przeciwciała w płynach biologicznych takich, jak surowica ludzka, osocze, krew, mleko, mocz lub ślina, który to sposób powinien zapewniać zmniejszenie ryzyka kontaktu z niebezpiecznymi płynami. Rosnące zainteresowanie testami laboratoryjnymi w diagnostyce wymaga również sposobów o krótkim czasie trwania, korzystnie tylko kilku minut.

Dlatego celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu wykrywania swoistej immunoglobuliny jako przeciwciała w próbce, który to sposób jest bezpieczny, szybki i w pełni zautomatyzowany.

Cel ten jest uzyskany przez sposób według wynalazku, polegający na zastosowaniu przeciwciał kowalentnie związanych z cząstkami paramagnetycznymi umożliwiającymi ich oddzielanie i reakcję ze swoistą immunoglobuliną oraz przeciwciała, alergenu lub antygenu związanego z biotyną a także chemiluminescencyjnego związku znakującego, który to sposób charakteryzuje się tym, że miesza się z próbką antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand związany z biotyną lub jego funkcjonalną pochodną, przeciwciało skierowane przeciw wykrywanej immunoglobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi oraz chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia kompleksu związanego z fazą stałą, magnetycznie oddziela się fazę stałą od fazy ciekłej, inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną, oraz mierzy się emisję światła oddzielonej fazy stałej, w której występowanie chemiluminescencji jest wskaźnikiem obecności badanej immunoglobuliny w próbce.

Jakkolwiek sposób według wynalazku może być przeprowadzony przez powyżej określone etapy, to korzystnie jest dodać związek znakujący w osobnym etapie, i korzystne jest wykonanie sposobu, w którym miesza się z próbką antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną oraz przeciwciało skierowane przeciw wykrywanej immunoglobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi dla utworzenia pierwszego kompleksu fazy stałej, dodaje się chemiluminescencyjny związek akrydynowy kowalentnie związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia drugiego kompleksu fazy stałej, magnetycznie oddziela się fazę stałą od ciekłej, a także inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną oraz mierzy się emisję światła oddzielonej fazy stałej na obecność kompleksu chemiluminescencyjnego.

Korzystnie jest, gdy mierzona w próbce immunoglobulina jest swoistą immunoglobuliną, która wybiera się z grupy składającej się ze swoistych IgA, IgD, IgE, IgG, IgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand jest alergenem, oraz korzystnie, gdy swoista immunoglobulina w próbce należy do klasy immunoglobulin wybranej z grupy składającej się z całkowitej IgA, całkowitej IgD, całkowitej IgE, całkowitej IgG, całkowitej IgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand jest przeciwciałem skierowanym przeciwko wymienionej klasie immunoglobulin.

Korzystnie jest, gdy swoistą immunoglobuliną jest swoista IgE, a klasą immunoglobulin jest całkowita IgE.

Korzystnie jest, gdy przeciwciało skierowane przeciw wykrywanej immunoglobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi wybiera się z grupy składającej się z przeciwciał poliklonalnych, monoklonalnych, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi i przeciwciałami fragmentaiyzowanymi, korzystnie, gdyjest to monoklonalne mysie przeciwciało antyimmunoglobulinowe.

Korzystnie, chemiluminescencyjnym związkiem akrydynowym jest ester dwumetyloakrydynowy N-hydroksysukcynimidu związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną.

Zaletą takiego rozwiązania jest to, że wszystkie odczynniki mogą być mieszane równocześnie w jednym naczyniu reakcyjnym, co minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia, błędy i liczbę etapów procedury, zmniejsza znacznie czas trwania testu immunologicznego i w znacznym stopniu ułatwia automatyzację procesu, a przy tym poprawia dokładność, oraz że uzyskana większa wydajność i czułość ułatwia możliwość wykrycia nawet bardzo niskich stężeń immunoglobulin oraz niskich stężeń swoistych immunoglobulin.

173 033

Korzystny przykład wykonania wynalazku stanowi test immunologiczny do wykrywania w próbce, takiej jak surowica lub ślina, immunoglobulin takich, jak swoiste immunoglobuliny (IgA, IgE, IgG, IgM i ich izotypy).

W szczególności wynalazek może być zastosowany do wykrywania swoistych IgE w próbce. Gdy próbka jest płynem, np. surowicą lub osoczem, może być dodana bezpośrednio do naczynia reakcyjnego zawierającego korzystnie monoklonalne mysie przeciwciało anty-IgE związane z zawieszonymi cząstkami paramagnetycznymi i swoisty alergen (ligand) związany z biotyną w środowisku wodnym. Dlatego korzystnie jest, gdy biotyna jest w postaci estru N-hydroksysukcynimidylowego amidokapronianu biotyny (Sigma nr kat. B2643). Gdy próbka nie jest płynna, np. jest to próba tkanki, korzystnie jest, gdy jest ona homogenizowana i zawieszona w płynie wodnym. Równoczesna reakcja między swoistą IgE w próbce, alergenem i monoklonalnym przeciwciałem anty-IgE w środowisku wodnym powoduje utworzenie koniugatu. Znakujący związek chemiluminescencyjny, korzystnie, gdy jest to ester akrydynowy sprzężony ze streptawidyną (Sigma, nr kat. S4762) (DMAE-awidyna) dodawany jest do naczynia reakcyjnego i zachodzi reakcja wiązania między DMAE-awidyną i biotyną związaną z koniugatem i nie skoniugowaną biotyną związaną z alergenem. Znacznik związany z koniugatem oddzielany jest od nie związanego, znakowanego DMAE przeciwciała za pomocą magnetycznego oddzielenia mieszaniny reakcyjnej i zlania supematantu. Chemiluminescencja oddzielonego koniugatu jest mierzona w sposób opisany przez Pazzagli M. i wsp. (wyd.) Studies and applications in Biology & Medicine, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 4(1), 1-646, 1989.

Jako odniesienie używany jest wykonywany równocześnie, faktycznie równoległy test immunologiczny dla całkowitej IgE, różniący się tylko tym, że korzystnie jest, aby jako ligand używane było poliklonalne przeciwciało anty-IgE związane z biotyną.

Sposób według wynalazku zostanie wyjaśniony przykładowo w nawiązaniu do rysunku, na którym fig. 1 - jest schematycznym przedstawieniem badania swoistej IgE, wg wynalazku, i zawierającym równoległe badanie odniesienia całkowitej IgE, fig. 2 oraz fig. 3 - ilustruje odpowiednio wyniki z badania całkowitej IgE i IgE swoistych dla Phleum pratense, fig. 4 przedstawia wykres rozrzutu dla porównania sposobów mierzenia IgE, fig. 5 - wykres rozrzutu dla porównania sposobów mierzenia IgE swoistej dla Phleum pratense, a fig. 6 - podaje wyniki testów, które nie potwierdzają korelacji między stężeniem całkowitej IgE i swoistej IgE dla Phleum pratense.

Na fig. 1 oznaczenie 1 przedstawia wykrywane swoiste przeciwciało IgE, 2 jest swoim alergenem związanym z biotyną, 3 jest monoklonalnym przeciwciałem mysim anty-IgE związanym z cząstkami paramagnetycznymi, 4 jest estrem awidynowo-akrydynowym, a 5 przedstawia znakowany kompleks fazy stałej utworzony między 1, 2, 3 oraz 4 i obejmuje optymalne etapy inkubacji, oddzielania i dodatkowego płukania, a 6 przedstawia ostateczny etap inicjowania reakcji chemiluminescencji i mierzenia emisji światła. Na fig. 1 dla testu odniesienia dla całkowitej IgE - 7 oznacza IgE (WHO 75/502 j.m./ml), 8 jest poliklonalnym przeciwciałem anty-IgE związanym z biotyną, 9 jest monoklonalnym mysim przeciwciałem anty-IgE związanym z zawieszonymi cząstkami paramagnetycznymi, 10 jest estrem awidynowoakrydynowym, a 11 oznacza znakowany kompleks fazy stałej utworzony między 7,8,9 i 10 oraz obejmuje etapy dodatkowej inkubacji oddzielenia oraz płukania, a 12 jest ostatecznym etapem inicjowania reakcji chemiluminescencji i pomiaru emisji światła. W szczególności, test immunologiczny wykorzystujący sposób według wynalazku może być wykonany na w pełni automatycznym analizatorze ACS: 180 produkowanym przez Ciba Corning Diagnostics Corp., Meafield. Mass., Stany Zjednoczone Ameryki. W jednym z korzystnych przykładów wykonania wynalazku wykrywana immunologicznie aktywna substancja jest przeciwciałem, np. przeciw penicylinie lub jej pochodnym takim jak penicylina benzylowa, pochodna penicylinoilowa, itd., a ligandem związanym z biotyną jest hapten taki, jak penicylina lub jej pochodne.

Definicje

W sposobie według wynalazku wykrywana immunoglobulina jest swoistą immunoglobuliną, korzystnie swoistą IgA, IgD, IgE, IgG, IgM i ich izotypami, korzystnie, gdy swoistą IgE, lub klasą immunoglobulin, korzystnie wybraną spośród grupy składającej się z całkowitej

173 033

IgA, całkowitej IgD, całkowitej IgE, całkowitej IgG, całkowitej IgM i ich izotypów, korzystnie całkowitą IgE.

Przez próbkę, rozumie się każdą próbkę płynną Iub przeprowadzoną w stan płynny, w tym roztwory, emulsje, próbki rozproszone i zawiesiny.

Antygenem, przeciwciałem Iub haptenem jako ligandem związanym z biotyną może być każda immunologicznie aktywna substancja taka, jak alergen, przeciwciała takiejak przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi Iub fragmentaryzowanymi, korzystnie alergen i/lub poliklonalna anty-immunoglobulina taka, jak np. poliklonalna surowica kozia anty-ludzka dostarczana przez Ventrex Laboratories, Inc. Portland, Maine, Nr kat. 77660. Korzystnie, gdy w immunologicznym teście odniesienia wymienione przeciwciało jest skierowane przeciw stałej części mierzonej klasy immunoglobulin, tj. przeciwciałem skierowanym przeciwko immunoglobulinom klasy IgE.

Przez płyn biologiczny rozumie się każdą próbkę kliniczną taką, jak krew, osocze, surowicę, mocz Iub ślinę, która zawiera również każdy płyn biologiczny wydalany, wydzielany Iub .transportowany wewnątrz organizmu.

Przez cząstki paramagnetyczne (PMP) rozumie się cząstki, które mogą być rozproszone Iub zawieszone w środowisku płynnym. We wszystkich przykładach użyto cząstek BioMag (cząstek .tlenku żelaza pokrytych grupami zakończonymi grupami aminowymi) sprzedawanych przez wiodącą firmę Magnetics Inc. Cambridge, Massachusetts. Przeciwciała sprzężone z PMP są korzystnie skierowane przeciw stałej części mierzonych immunoglobulin i mogą to być przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi Iub fragmentaryzowanymi, korzystnie gdy jest to przeciwciało monoklonalne MAb A 56971 A3(920325) dostarczane przez Biolnvent International AB, Lund, Szwecja.

Korzystnie jest, gdy chemiluminescencyjnym związkiem akrydynowym jest ester dwumetyloakrydynowy N-hydroksysukcynimidu, związany kowalentnie z awidyną Iub streptawidyną (DMAE-awidyna). Awidyna i DMAE są sprzężone według sposobów Weeks’a i wsp., Clin. Chem. 29/8, 1474-1479 (1983). W sposobie według wynalazku mogą być użyte inne luminescencyjne związki znakujące, które mogą być związane z awidyną Iub streptawidyną, na przykład, luminol, lucigenina Iub lofina.

Przygotowanie przeciwciał biotynylowanych

Biotynylowane anty-IgE oraz Phleum pratense

Poliklonalna surowica kozia anty-ludzka (Ventrex Laboratories, Inc. MA, Stany Zjednoczone) jest oczyszczana w chromatografii powinowactwa na aktywowanej bromocyjanem sefarozie 4B (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) ze szpiczakową IgE (OEM concepts, Stany Zjednoczone), jako ligandem. Anty-IgE jest biotynylowane przy stosunku molowym biotyny do anty-IgE = 41:1.

pl biotyny (ester N-hydroksysukcynimidylowy amidokapronianu biotyny) (Sigma) o stężeniu 25 mg/ml w dwumetyloformamidzie (Merck) jest dodawane do 0,4 ml anty-IgE o stężeniu 4,5 mg/ml w 0,1 M NaHCCb (Merck). Odczynniki są inkubowane w mieszadle o ruchu pionowym przez 2 godziny w temperaturze 25°C. Dodawane jest 0,9 ml roztworu lizyny (Sigma) o stężeniu· 20 mg/ml NaHC O3. Roztwór jest przesączany, a biotynylowane przeciwciało jest oczyszczane chromatograficznie na sicie superdex 75 Hiload 16/60 (Pharmacia Uppsala, Szwecja). Pulowane frakcje są rozcieńczane w buforowanym roztworze soli fizjologicznej PBS o pH 7,2, zawierającym 0,1% albuminy surowicy ludzkiej (Sigma) i 0,1% NaN 3 (Sigma).

Ekstrakt Phleum pratense (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania) jest biotynylowany w stosunku molamym 10:1. 0,65 ml roztworu biotyny o stężeniu 10 mg/ml jest dodawane do 0,43 ml ekstraktu Phleum pratense o stężeniu 10 mg/ml w 0,1 M NaHCO3. Odczynniki są inkubowane przez 2 godziny w temperaturze 25°C w mieszadle o ruchu pionowym, po inkubacji dodawane jest 40 pl roztworu lizyny (Sigma) o stężeniu 50 mg/ml. Roztwór jest sączony, a biotynylowane przeciwciało jest oczyszczane z nadmiaru biotyny w chromatografii ekskluzyjnej na sicie superdex 75 Hiload 16/60 (Pharmacia). Pulowane są frakcje zawierające alergen. Biotynylowany ekstrakt Phleum pratense jest rozcieńczany za pomocą PBS o pH 7,2, zawierającego 0,1% albuminy surowicy ludzkiej (Sigma) oraz 0,1% NaN 3 (Sigma).

173 033

Przygotowanie znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego

Streptawidynę skoniugowano z DMAE-NHS [metosiarczan 2’,6’-dimetylo-4’-(Nsukcynimidyloksykarbonylo)fenylo-10-metyloakrydynio-9-karboksylowy] z wykorzystaniem sposobów Weeks’a i wsp., Clin. Chem. 29/8, 1474-1479 (1983).

Przygotowanie znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego

0,96 mg estru dwumetyloakrydynowego N-hydroksysukcynimidu DMAE (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA, Stany Zjednoczone) rozpuszcza się w 1,92 ml dwumetyloformamidu. 250 gl tego roztworu pobiera się pipetą do 2,5 ml streptawidyny (Sigma) o stężeniu 1 mg/ml 0,1 M dwuwodorofosforanu sodowego w 0,15 M NaCl o pH 8,15.

Powietrze powyżej roztworu w naczyniu jest wymieniane z azotem (AGA). Odczynniki są inkubowane przez 30 min. w 25°C z mieszaniem, po inkubacji dodaje się 2250 μΐ lizyny o stężeniu 10 mg/ml 0,1 M dwuwodorofosforanu sodowego (Merck) w 0,15 M NaCl (Merck) o pH 8 ,15. Aby usunąć nie związany DMAE roztwór jest nakładany na kolumnę PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Eluat jest zbierany i oczyszczany metodą ultrafiltracji z użyciem filtra celulozowego Minitan-S 10.000 NMWL (Millipore). Filtracja jest wykonywana z 1,5 1 buforowanego roztworu soli fizjologicznej, PBS, o pH 7,2. Faza zatężana jest dalej zatężana do 25 ml i dodaje się 25 ml PBS o pH 7,2 zawierającego 0,5% albuminy surowicy ludzkiej (Sigma) oraz. 0,1% NaN 3 (Sigma).

Wynalaz.ek zostanie opisany szczegółowo w następujących przykładach.

Immobilizacja przeciwciała na cząstkach paramagnetycznych

6,5 g cząstek paramagnetycznych (Ciba Corning Diagnostics Corp., MA, Stany Zjednoczone) jest płukane trzy razy w 650 ml metanolu (Merck) wykorzystując rozdział magnetyczny. Płukanie 650 ml 0,01 M buforu octanowego o pH 5,5 jest wykonywane dwukrotnie. Cząstki są aktywowane w 6,25% roztworze aldehydu glutarowego (Merck) w 0,01 M buforze octanowym 0 pH 5,5 przez 3 godziny w 25°C. Cząstki są płukane trzy razy w 650 ml 0,01 M buforu octanowego o pH 5,5. Cząstki są sprzęgane z 1083 mg przeciwciała monoklonalnego anty-IgE (ALK Laboratories, H0rsholm, Dania) swoistego dla domeny Fc IgE, przez 24 godziny w 25°C. Cząstki są płukane dwukrotnie w 0,01 M buforze octanowym o pH 5,5. Blokowanie nadmiaru grup aktywnych jest wykonywane za pomocą 200 ml 10% surowicy IgE (ALK Laboratories, H0rsholm, Dania) przez 24 godziny w 25°C. Cząstki są płukane w 650 ml 0,01 M buforu octanowego (Merck), po czym następują 3 płukania w 650 ml 1 M NaCl (Merck). Cząstki są płukane 3 razy w 0,01 M buforze fosforanowym. Cząstki są ponownie zawieszane w 650 ml PBS o pH 7,2 z dodatkiem 0,1% wag./obj. albuminy surowicy bydlęcej (Sigma), 0,001% gamma globuliny bydlęcej (Sigma) i poddawane działaniu ciepła przez 18 godzin w 50°C. Cząstki są płukane 3 razy w 650 ml PBS o pH 7,2 z dodatkiem 0,1% wag./obj. albuminy surowicy bydlęcej (Sigma, 0,001% gamma globuliny bydlęcej (Sigma). Cząstki są poddawane działaniu ciepła przez 7 dni w 37°C. Cząstki są płukane dwukrotnie w 0,01 M buforze fosforanowym. Cząstki są rozcieńczane do 0,5 g na 1 [ml] w PBS o pH 7,2 z 0,5% dodatkiem albuminy surowicy ludzkiej (Sigma).

Przykład I. Wykrywanie antygenu (całkowita IgE)

Określenie całkowitych immunoglobulin IgE, zgodnie z wynalazkiem, zostało przeprowadzone na analizatorze typu ACS: 180 firmy Ciba Corning opisane w Clinical Chemistry 36/9, 1598-1602 (1990) z wykorzystaniem następującego protokołu:

gl próbki i 50 μΐ biotynylowanych antyJgE jest odmierzone do ku wety precz dozownik . Kuweta dochodzi do pierwszego dozownika odczynników R1, gdzie 100 gl cząstek paramagnetycznych z immobilizowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-IgE (ALK Laboratories A/S . H0rsholm, Dania) swoistych dla domeny Fc IgE jest dozowane łącznie z 200 gl znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania). Kuweta przesuwa się wzdłuż prowadnicy w kierunku magnesów i stanowiska płukania. Dwukrotnie jest wykonywane płukanie za pomocą 750 git wody dejonizowanej . Po zakończeniu cyklu płukania cząsóil są ponownie zawieszane w 300 gl H2O2 o stężeniu 0,5 g/l w 0,1 M HNO 3. Kuweta wchodzi do komory luminometru, a przed fotopowielaczem dodawane jest 300 gl 25 mM roztworu NaOH i mierzonajest ilość emitowanych fotonów światła, którajest wyrażanajako względne jednostki światła (RLU). Ilość RLU jest bezpośrednio proporcjonalna do ilości IgE w próbce. Czas od

173 333 odmierzenia przez dozowanie próbki do pierwszego wyniku wynosi 15 min, a nowe wyniki następują co 20 sekund. Wyniki są wyrażone w postaci stosunku RLU badane/RLU tła, gdzie RLU tła jest reakcją chemiluminescencji obserwowaną w braku całkowitej IgE.

Wykorzystując powyżej opisany protokół badano dziewięć 'standardów całkowitej IgE, kalibrowanych w zestawie Magie Lite dla całkowitej IgE (ALK Laboratories A/S Horsholm, Dania) wobec standardu WHO 2nd 1RP nr 75/502 dla IgE surowicy ludzkiej i wykazano, że można wykryć 0,1 j.m./ml całkowitej IgE surowiczej (określanej przez tło x 10 odchyleń standardowych), patrz fig. 2.

Przykład E. Wykrywanie swoistej immunoglobuliny (swoista IgE)

Zgodnie z wynalazkiem oznaczenie immunoglobulin IgE swoistych dla Phleum pratense (IgE swoista dla tymotki) zostało przeprowadzone na analizatorze typu ACS: 180 firmy Ciba Corning opisanym w Clinical Chemistry 36/9,1598-1602 (1990), z wykorzystaniem następującego protokołu:

pl próbki i 50 pl biotynylowanego ekstraktu Phleum pratense zostało odmierzone do kuwety przez dozownik. Kuweta dochodzi do pierwszego dozownika odczynników R1, gdzie 100 pl cząstek paramagnetycznych z immobilizowanym przeciwciałem monoklonalnym antyIgE (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania) swoistym dla domeny Fc IgE jest dozowane łącznie z 200 pl znacznika estru streptawidynowo-akrydynowego (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania). Kuweta przesuwa się wzdłuż prowadnicy w kierunku magnesów i stanowiska płukania. Płukanie za pomocą 750 pl wody dejonizowanej wykonywane jest dwukrotnie. Po zakończeniu cyklu płukania cząstki są ponownie zawieszane w 300 pl H2O2 o stężeniu 0,5 g/l 0,1 M HNO3. Kuweta wchodzi do komory luminometru, a przed fotopowielaczem dodawane jest 300 pl 25 mM roztworu NaOH i mierzona jest ilość emitowanych fotonów światła, która jest wyrażana jako względne jednostki światła (RLU). Dość RLU jest bezpośrednio proporcjonalna do ilości IgE w próbce. Czas od odmierzenia przez dozownik próbki do pierwszego wyniku wynosi 15 min., a nowe wyniki następują co 20 sekund. Wyniki są wyrażone w postaci stosunku RLU badane/RLU tła, gdzie RLU tła jest reakcją chemiluminescencji obserwowaną przy braku całkowitej lgE.

Wykorzystując powyżej opisany protokół zbadano dziesięć standardów lgE swoistych dla Phleum pratense, kalibrowanych w zakresie Magie Lite SQ dla swoistych lgE (ALK Laboratories A/S H0rsholm, Dania) wobec próbek klinicznie scharakteryzowanych pacjentów z alergią na Phleum pratense i wyrażono w postaci j.s./ml (jednostki standaryzowane - j.s.) i wykazano, że w teście Magie Lite SQ dla swoistych lgE można zmierzyć między 1,43 a 800j.s./ml lgE swoistej dla Phleum pratense, patrz fig. 3.

Przykład Dl. Porównanie metod dla całkowitej lgE.

Trzydzieści trzy próbki pacjentów mierzono na zawartość całkowitej lgE surowiczej za pomocą zestawu Magie Lite dla całkowitej lgE (ALK Laboratories A/S, H0rsholm, Dania). Badanie przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. W tych samych próbkach mierzono całkowitą lgE w surowicy w analizatorze ACS :180, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie l.

Figura 4 przedstawia wykres rozrzutu dla porównania metod mierzenia całkowitej lgE surowiczej. Stwierdzono, że współczynnik korelacji wynosi r = 0,90.

Przykład lV. Porównanie metod dla swoistej lgE.

Trzydzieści pięć próbek pacjentów mierzono na zawartość lgE swoistej dla Phleum pratense za pomocą zestawu Magie Lite dla swoistej lgE (ALK Laboratories A/S H0rsholm, Dania). Badania przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. W tych samych próbkach mierzono lgE swoiste dla Phleum pratense w analizatorze ACS: 180, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie ll.

Figura 5 przedstawia wykres rozrzutu dla porównania metod mierzenia lgE swoistej dla Phleum pratense. Stwierdzono korelację o współczynniku r = 0,80.

Przykład V. Porównanie dokładności testów.

Rozrzut w obrębie serii oznaczenia całkowitej lgE dla analizatora ACS z wykorzystaniem protokołu opisanego w przykładzie l porównano z rozrzutem przy badaniu z wykorzystaniem zestawu Magie Lite do oznaczania całkowitej lgE. Próbki pacjentów były badane w trzech powtórzeniach w badaniach opisanych w przykładzie lV. Pulowany współczynnik zmienności

173 033 w obrębie serii (CVpwr) obliczono według Krouwera i Rabinowitza, Clinical Chemistry, 30, 290 (1984). Uzyskano następujące wyniki:

	Magic Lite	ACS
% CVpwr	4,69	2,75
Min. %CV	0,80	0,70
Maks. %CV	11,-70	8,40

Jak widać z wyników automatyzacja i zmniejszenie liczby etapów procedury poprawia dokładność analizy (testem F:F = 1,71, p = 0,049).

Przykład VI. Porównanie całkowitej i swoistej IgE w próbkach pacjentów.

Próbki, w których mierzono IgE swoiste dla Phleum pratense za pomocą analizatora

ACS: 180 według protokołu opisanego w przykładzie II i kalibrowane względem całkowitej IgE odniesienia (WHO 75/502), jak to opisano w przykładzie III, analizowano także pod względem całkowitej IgE w sposób opisany w przykładzie I. Stosunek między zmierzoną IgE swoistą a IgE całkowitą obliczono dla każdej próbki i wyrażono jako % stosunek (j.m. swoiste/j.m. całkowite * 100).

Uzyskano następujące wyniki:

Nr	IgE swoista dla Phleum pratense j.m./ml	Całkowite IgE j.m./ml	Stosunek %
1	0,973	208,300	0,467
2	0,000	153,330	0,000
3	0,000	25,119	0,000
4	0,000	43,980	0,000
5	0,082	51,997	0,158
6	0,586	30,807	1,902
7	9,130	20,796	43,903
8	2,125	168,771	1,259
9	1,545	321,553	0,480
10	0,000	299,105	0,000
11	1,664	248,660	0,669
12	8,553	46,635	18,340
13	19,427	234,858	8,272
14	0,000	178,304	0,000
15	2,380	428,987	0,555
16	4,342	112,457	3,861
17	3,975	173,793	2,287
18	0,220	206,580	0,106
19	0,158	298,630	0,053
20	4,936	17,116	28,839
21	0,376	146,939	0,256

22	4,865	23,521	20,684
23	3,115	281,804	1,105
24	0,017	17,937	0,095
25	3,446	160,651	2,145
26	1,485	167,427	0,887
27	2,763	124,309	2,223
28	3,705	247,679	1,496
29	1,289	196,314	0,657
30	8,967	416,528	2,153
31	0,355	29,784	1,192
32	15,173	290,670	5,220
33	2,141	63,847	3,353
34	3,929	96,951	4,053
35	0,154	>620	nieozn.

Jak widać z wyników test dla IgE swoistej dla Phleum pratense pozwalał zmierzyć IgE swoistą dla Phleum pratense, gdy stanowiła ona zaledwie 0,05% całkowitej IgE. Niskie względne ilości IgE swoistej dla Phleum pratense wskazują, że w próbkach są obecne IgE swoiste dla innych alergenów. W jednej próbce stwierdzono, że do 44% całkowitej IgE było swoistej dla Phleum pratense. Nie stwierdzono korelacji między stężeniem całkowitej IgE a stężeniem IgE swoistej dla Phleum pratense, jak to przedstawiono na fig. 6.

173 033

Test wykrywania swoistej IgE

Test wykrywania całkowitej IgE

BIOTYNĄ

Faza stała (anty-IgE)

Próbka Biotynylowany (IgE) alergen +

Faza stała Próbka Biotynylowane przeciw^ (anty-IgE) (IgE) ciało (anty-IgE) ⁴' EHAE-ANIDYNA

10-> ΕΜΑΕ-ΑΗΙΒΥΝΔ

G ^}- BIOTYNA-AWUJYNA-BHAE a

& BIOTYNA-AWIDYNA-BMAE

11E BIOTYNĄ-AHIBYNA-DHAE

E ^=>· BIOTYNĄ-AHIDYKA-DMAE

Fig.<L

6—>

12173 033

100 ο

(Μ

Η c

u η

σι

0.1

j.m./ml

100

1000 e Tło x 10 sd O- Standardy WHO dla całkowitej IgE

Stężenie całkowitej IgE

173 033

Standardy Magie Lite SQ — Punkt odcięcia Magie Lite SQ ( 1,43 j.s./ml )

j.s./ml

Stężenie IgE swoistej dla Phleum pratense

Całkowita IgE Korelacja: r = 0,90221

j.m./ml

Całkowita IgE Magie Lite

173 033

IgE swoista dla Phleum pratense Korelacja: r = 0,79645

.

10 20 30 40 50 60 70 80 ^Resres₃a

Magie Lite SQ j.s./ml ^Fig ⁵

IgE całkowita ( j.m./ml

Korelacja: r = 0,16960, p = 0,338

ACS

Fig 6

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wykrywania swoistej immunoglobuliny w próbce, polegający na zastosowaniu przeciwciał kowalentnie związanych z cząstkami paramagnetycznymi umożliwiającymi ich oddzielanie i reakcję ze swoistą immunoglobuliną oraz przeciwciała, alergenu lub antygenu związanego z biotyną, a także chemiluminescencyjnego związku znakującego, znamienny tym, że miesza się z próbką antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand związany z biotyną Iub jej funkcjonalną pochodną, przeciwciało skierowane przeciw wykrywanej immunoglobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi, oraz chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia kompleksu związanego z fazą stałą, magnetycznie oddziela się fazę stałą od fazy ciekłej, inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną oraz mierzy się emisję światła oddzielonej fazy stałej, w której występowanie chemiluminescencji jest wskaźnikiem obecności immunoglobuliny w próbce.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że miesza się z próbką antygen przeciwciało lub hapten jako ligand związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną oraz przeciwciało skierowane przeciw wykrywanej immunoglobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi, dla utworzenia pierwszego kompleksu fazy stałej, dodaje się chemiluminescencyjny związek akrydynowy kowalentnie związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia drugiego kompleksu fazy stałej, magnetycznie oddziela się fazę stałą od fazy ciekłej, a także inicjuje się stosując nadtlenek wodoru reakcję chemiluminescencyjną oraz mierzy się emisję światła oddzielonej fazy stałej pod kątem obecności kompleksu chemiluminescencyjnego.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że swoistą immunoglobulinę wybiera się spośród grupy składającej się ze swoistych IgA, IgD, IgE, IgG, IgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało Iub hapten jako ligand jest swoistym alergenem.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że swoistą immunoglobuliną jest swoista IgE.
5. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że swoista immunoglobulina w próbce należy do klasy immunoglobulin wybranej spośród grupy składającej się z całkowitej IgA, całkowitej IgD, całkowitej IgE, całkowitej IgG, całkowitej IgM oraz ich izotypów, a antygen, przeciwciało lub hapten jako lingad jest przeciwciałem skierowanym przeciwko wymienionej klasie immunoglobulin.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że klasą immunoglobulin jest całkowita IgE.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przeciwciało skierowane przeciwko wykrywanej swoistej immunoglobulinie związane z cząstkami paramagnetycznymi wybiera się z grupy składającej się z przeciwciał poliklonalnych, monoklonalnych, łącznie z przeciwciałami rekombinacyjnymi i przeciwciałami fragmentaryzowanymi, korzystnie, gdy jest to monoklonalne mysie przeciwciało anty-immunogiobulinowe.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że chemiluminescencyjnym związkiem akrydynowym jest ester dwumetyloakrydynowy N-hydroksysukcynimidu kowalentnie związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną.