ES2220141T3 - Reactivos lipidizantes sensibles a ph acuosos reversibles, composiciones y metodos de uso. - Google Patents

Reactivos lipidizantes sensibles a ph acuosos reversibles, composiciones y metodos de uso.

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ES2220141T3 ES99967238T ES99967238T ES2220141T3 ES 2220141 T3 ES2220141 T3 ES 2220141T3 ES 99967238 T ES99967238 T ES 99967238T ES 99967238 T ES99967238 T ES 99967238T ES 2220141 T3 ES2220141 T3 ES 2220141T3
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Abstract

Un compuesto de fórmula general I en la que R2 se selecciona del grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde el alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, aciloxi, alquilo o átomos de halógeno; R3 es un grupo lipófilo; uno de R4 y R5 es una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionada entre el grupo compuesto por un fármaco que contiene amina, un aminoácido natural o no natural, un péptido y una proteína y el otro de R4 y R5 es OR6, donde R6 se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno, un metal alcalino o una carga negativa; X es oxígeno o azufre; Y es un aminoácido de unión natural o no natural; n es cero o 1; y m es un número entero de cero a 10.

Description

Reactivos lipidizantes sensibles a pH acuosos reversibles, composiciones y métodos de uso.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a los campos de la biología y la medicina. Más particularmente, la presente invención se refiere a compuestos, métodos y composiciones útiles para aumentar el transporte y la liberación de moléculas hidrófilas que tienen un grupo amino, en particular péptidos y proteínas, en mamíferos.
Técnica relacionada
Los avances en bioquímica han hecho posible la producción de grandes cantidades de proteínas y péptidos terapéuticamente activos y puros. Actualmente, los efectos terapéuticos de la mayoría de estos agentes se pueden conseguir sólo cuando se administran mediante vías invasivas, tales como inyección. Como la mayoría de las proteínas tienen vidas medias muy cortas, las concentraciones eficaces de estos agentes se pueden mantener sólo cuando se administran mediante inyecciones frecuentes.
Aunque la administración de proteínas mediante inyección es el medio más eficaz para su liberación in vivo, la tolerancia del paciente a múltiples inyecciones es muy mala. Además, la inyección del fármaco necesita entrenamiento y experiencia que no siempre se puede transferir a los pacientes. En los casos en los que los fármacos proteicos tienen un papel de salvamento, los pacientes pueden aceptar la administración mediante inyección. Sin embargo, en los casos en los que los fármacos proteicos sólo son una de varias terapias posibles, es probable que los pacientes no acepten las inyecciones de proteínas y péptidos. Por lo tanto, es necesario desarrollar vías alternativas de liberación de proteínas y péptidos.
Tales vías alternativas pueden incluir las vías bucal, nasal, oral, pulmonar, rectal y ocular. Sin excepción, estas vías son menos eficaces que las vías de administración parenterales, pero son bastante más atractivas que las vías parenterales porque ofrecen comodidad y control para los pacientes. La vía oral es particularmente atractiva porque es la más conveniente y cómoda para los pacientes.
Las barreras mucosas, que separan el interior del cuerpo del exterior (por ejemplo, la mucosa gastrointestinal, ocular, pulmonar, rectal y nasal), comprenden una capa de monocapas celulares unidas firmemente que regulan estrictamente el transporte de moléculas. Las células individuales en las barreras están unidas por uniones firmes que regulan la entrada en el espacio intercelular. Por lo tanto, la mucosa es, en un primer nivel, una barrera física, dependiendo el transporte a su través tanto de la ruta transcelular como de la ruta paracelular (Lee, V.H.L., Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5: 69-97 (1988)).
El transporte paracelular a través uniones firmes llenas de agua está restringido a moléculas pequeñas (PM < 1 kDa) y es básicamente un proceso de difusión dirigido por un gradiente de concentración a través de la mucosa (Lee, V.H.L., Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5: 69-97 (1988)); Artursson, P. y Magnusson, C., J. Pharm. Sci. 79: 595-600 (1990)). Las uniones firmes constituyen menos del 0,5% del área superficial total de la mucosa (González-Mariscal, L.M., et al., J. Membrana Biol. 86: 113-125 (1985); Vetvicka, V. y Lubor, F., Critical Rev. Ther. Drug Deliv. Sys. 5: 141-170 (1988)); por lo tanto, sólo juegan un papel minoritario en el transporte de los fármacos proteicos a través de la mucosa.
El transporte transcelular de fármacos pequeños ocurre eficazmente siempre que las propiedades fisicoquímicas del fármaco sean adecuadas para el transporte a través de barreras celulares hidrófobas. Sin embargo, el transporte transcelular de proteínas y péptidos está restringido por el proceso de transcitosis (Shen, W.C., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 8: 93-113 (1992)). La transcitosis es un proceso complejo en el que proteínas y péptidos se recogen conjuntamente en vesículas desde un lado de una célula y posteriormente se transportan a través de la células hasta el otro lado de la célula, donde se descargan de las vesículas endocíticas (Mostov, K.E. y Semister, N.E., Cell 43: 389-390 (1985)). La membrana celular de las barreras mucosas es una bicapa lipídica hidrófoba que no tiene afinidad por macromoléculas hidrófilas cargadas tales como las proteínas y los péptidos. Además, las células de la mucosa pueden secretar mucina, que puede actuar como barrera para el transporte de muchas macromoléculas (Edwards, P., British Med. Bull. 34: 55-56 (1978)). Por lo tanto, a menos que existan mecanismos de transporte específicos para proteínas y péptidos, su transporte inherente a través de las barreras de la mucosa es casi insignificante.
Además de proporcionar una barrera física firme para el transporte de proteínas y péptidos, las barreras mucosas poseen enzimas que pueden degradar las proteínas y los péptidos antes, después y durante su paso a través de la mucosa. Esta barrera se denomina barrera enzimática. La barrera enzimática consta de enzimas endo y exopeptidasas que escinden proteínas y péptidos en sus extremos terminales o dentro de sus estructuras. Se ha estudiado la actividad enzimática de varias mucosas y los resultados demostraron que existe una actividad proteasa substancial en el homogeneizado de la mucosa bucal, nasal, rectal y vaginal de conejos albinos y que estas actividades son comparables a las presentes en el íleon (Lee, V.H.L., Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5: 69-97 (1988)). Por lo tanto, cualquiera que sea la mucosa considerada, la barrera enzimática presente participará fuertemente en la degradación de las moléculas de proteínas y péptidos.
Los extremos N y C de los péptidos están cargados, y la presencia de cadenas laterales cargadas imparte características muy hidrófilas a estas macromoléculas. Además, la presencia de cadenas laterales cargadas significa que las proteínas y péptidos tienen fuertes capacidades de unión a hidrógeno; se ha demostrado que esta capacidad de unión a hidrógeno juega un papel fundamental en la inhibición del transporte incluso de pequeños péptidos a través de las membranas celulares (Conrado, R.A. et al., Pharm. Res. 8: 1453-1460 (1991)). Por lo tanto, el tamaño y la naturaleza hidrófila de las proteínas y péptidos se combina para restringir rigurosamente su transporte a través de las barreras mucosas.
Una estrategia que se ha usado para alterar la naturaleza física de las barreras mucosas es el uso de potenciadores de la penetración. El uso de potenciadores de la penetración se basa en la alteración de las barreras celulares por agentes de bajo peso molecular que pueden fluidizar las membranas celulares (Kaji, H., et al., Life Sci. 37: 523-530 (1985)), abrir uniones firmes (Inagaki, M., et al., Rhinology 23: 213-221 (1985)) y crear poros en la membrana celular (Gordon, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 7419-7423 (1985); Lee, V.H.L., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 8: 91-192 (1991)). El uso de estos agentes conduce a una pérdida no específica de integridad de la barrera y puede conducir a la absorción de diversas moléculas grandes que pueden ser tóxicas para las células in vivo.
Se han coadministrado inhibidores de proteasa con proteínas y péptidos y han mostrado alguna actividad limitada para potenciar la absorción de estas macromoléculas in vivo (Kidron, M., et al., Life Sci. 31: 2837-2841 (1982); Takaroi, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 682-687 (1986)). La seguridad y los efectos a largo plazo de esta estrategia todavía se tienen que investigar exhaustivamente.
La estrategia del profármaco se basa en la modificación de péptidos de una manera que los proteja de la degradación y el reconocimiento enzimático. Esto se ha conseguido mediante el bloqueo de grupos vulnerables en péptidos mediante amidación y acilación. La estrategia del profármaco ha resultado ser útil sólo para péptidos pequeños que tienen dominios de actividad fácilmente identificables.
La reducción de tamaño es otra estrategia posible para aumentar el transporte potencial de proteínas. Sin embargo, es necesario crear un mapa de los sitios activos de las proteínas antes de que pueda intentarse la reducción de tamaño. En general, esta estrategia es difícil de aplicar a la mayoría de las proteínas.
Los ligandos de transporte, gracias a sus propiedades, pueden alterar la captación celular y las características de transporte de proteínas y péptidos. La esencia de esta estrategia es que una proteína o péptido impermeable para la célula se une covalentemente a un vehículo que se transporta en gran medida al interior de las células. Los mecanismos mediante los que los ligandos de transporte pueden someterse a endocitosis o transcitosis son importantes para decidir la adecuabilidad del vehículo para potenciar el transporte de proteínas y péptidos. Los vehículos macromoleculares son hidrófilos y no se dividen dentro de la membrana. Por lo tanto, el transporte de grandes vehículos poliméricos al interior de las células está mediado por la afinidad del vehículo por la membrana celular. Generalmente, la captación de un conjugado macromolecular empieza con la unión a la membrana celular. La unión del vehículo a las células puede ser específica (por ejemplo, unión de anticuerpos a antígenos de la superficie celular), no específica (unión de un ligando catiónico o lectinas a azúcares de la superficie celular) o mediada por receptores (unión de transferrina o insulina a sus receptores). Una vez que el vehículo se ha unido a la superficie celular, se recoge en vesículas. Después, estas vesículas se procesan progresivamente y se pueden dirigir a varias rutas. Una ruta es el reciclado de la vesícula de nuevo a la membrana. Otra ruta, que es destructiva para el conjugado, es la fusión con lisosomas. Una ruta alternativa, y una que conduce a la transcitosis del conjugado, es la fusión de la vesícula con la membrana del lado opuesto del que procede.
El equilibrio correcto entre los procesos de endocitosis y transcitosis determina la liberación de un conjugado proteico a su diana. Por ejemplo, la endocitosis puede determinar la extensión en la que un conjugado es recogido por la célula diana, pero la transcitosis determina si un conjugado alcanza o no su diana (Shen, W.C., et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. 8: 93-113 (1992)). Para una absorción satisfactoria a través del tracto gastrointestinal, un conjugado se debe unir a la membrana apical de la mucosa gastrointestinal, internalizarse en las células de la mucosa, suministrarse a través de las células y finalmente liberarse de la membrana basolateral.
La bibliografía actual contiene muchos informes que demuestran que ciertos vehículos no específicos, tales como polilisinas (Shen, W.C. y Ryser, H.J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7589-7593 (1981)) y lectinas (Broadwell, R.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 632-646 (1988)), y vehículos específicos tales como transferrina (Wan, J., et al., J. Biol. Chem. 257: 13446-13450 (1992)), asialoglicoproteína (Seth, R., et al., J. Infect. Diseases 168: 994-999 (1993)), y anticuerpos (Vitetta, E.S., J. Clin. Immunol. 10: 15S-18S (1990)) pueden potenciar la endocitosis de las proteínas en las células. Los informes relacionados con los vehículos de transcitosis para proteínas son menos numerosos, y muy pocos estudios han cuantificado el transporte de conjugados proteicos a través de barreras celulares. Se ha demostrado que la aglutinina de germen de trigo (Broadwell, R.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 632-646 (1988)) y un conjugado de anti-transferrina/metotrexato (Friden, P.M. y Walus, L.R., Adv. Exp. Med. Biol. 331: 129-136 (1993)) pueden experimentar transcitosis a través de la barrera hematoencefálica in vivo. También se ha demostrado que los conjugados de polilisina de peroxidasa de rábano picante (HRP) y un conjugado de transferrina de HRP pueden experimentar transcitosis a través de monocapas celulares in vitro (Wan, J. y Shen, W.C., Pharm. Res. 8: S-5 (1991); Taub, M.E. y Shen, W.C., J. Cell. Physiol. 150: 283-290 (1992); Wan, J., et al., Biol. Chem 267: 13446-13450 (1992)).
Los ácidos grasos, como constituyentes de los fosfolípidos, constituyen el grueso de las membranas celulares. Están disponibles en el mercado y son relativamente baratos. Debido a su naturaleza lipídica, los ácidos grasos pueden repartirse fácilmente e interactuar con la membrana celular de una manera no tóxica. Por lo tanto, los ácidos grasos representan potencialmente el ligando de transporte más útil para la liberación de proteínas y péptidos. Las estrategias que pueden usar ácidos grasos en la liberación de proteínas y péptidos incluyen la modificación covalente de proteínas y péptidos y el uso de emulsiones de ácidos grasos.
Algunos estudios han informado sobre el uso satisfactorio de emulsiones de ácidos grasos para liberar péptidos y proteínas in vivo (Yoshikawa, H., et al., Pharm. Res. 2: 249-251 (1985); Fix, J.A., et al., Am. J. Physiol. 251: G332-G340 (1986)). Aún se desconoce el mecanismo mediante el cual las emulsiones de ácidos grasos influyen sobre la absorción de proteínas y péptidos. Las emulsiones de ácidos grasos pueden abrir las uniones firmes, solubilizar membranas, simular las proteínas y péptidos del medio gastrointestinal, y llevar proteínas y péptidos a través de la mucosa gastrointestinal como parte de su absorción (Smith, P., et al., Adv. Drug Delivery Rev. 8: 253-290 (1992)). Se ha propuesto el último mecanismo, pero es inconsistente con el conocimiento actual sobre el mecanismo de absorción de grasas.
Una estrategia más lógica para liberar proteínas y péptidos a través del epitelio gastrointestinal es utilizar ácidos grasos como agentes de adsorción de membrana no específicos. Varios estudios han demostrado que un agente de unión a la membrana no específico unido a una proteína puede promover la transcitosis de un conjugado proteico a través de las células in vitro (Wan, J., et al., J. Cell Physiol. 145: 9-15 (1990); Taub, M.E. y Shen, W.C., J. Cell Physiol. 150: 283-290 (1992)). También se ha demostrado que la conjugación con ácidos grasos mejora la captación de macromoléculas hacia el interior y a través de las membranas celulares (Letsinger, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556 (1989); Kabanov, A., et al., Protein Eng. 3: 39-42 (1989)). Sin embargo, ha habido dificultades en la conjugación de ácidos grasos a péptidos y proteínas, incluyendo: (1) la falta de solubilidad de ácidos grasos en la solución acuosa para la reacción de conjugación; (2) la pérdida de actividad biológica de péptidos y proteínas después de la acilación del ácido graso; y (3) la falta de solubilidad de los péptidos conjugados con ácidos grasos en soluciones acuosas (véase, por ejemplo, Hashimoto, M., et al., Pharm. Res. 6: 171-176 (1989); Martins, M.B.F., et al., Biochimie 72: 671-675 (1990); Muranishi, S., et al., Pharm. Res. 6: 171-176 (1989); Martins, M.B.F., et al., Biochimie 72: 671-675 (1990); Muranishi, S., et al., Pharm. Res. 8: 649-652 (1991); Robert, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 447-454 (1993)).
Una vez liberado en el interior de la célula, los péptidos y proteínas se deben liberar de su vehículo. Las Solicitudes PCT Publicadas Nº WO 96/22773 y WO 98/13007 describen l suministro transcelular y liberación de péptidos y proteínas que contienen sulfhidrilo. La absorción celular de moléculas hidrófilas que contienen sulfhidrilo puede aumentarse por la conjugación con un ácido graso mediante un enlace disulfuro. El enlace disulfuro lábil se reduce fácilmente, proporcionando un mecanismo para la liberación de los compuestos hidrófilos del resto de ácido graso una vez dentro del cuerpo.
Además de la reducción del enlace disulfuro, otros mecanismos para la liberación de compuestos hidrófilos biológicamente activos desde los sistemas de transporte incluyen la hidrólisis y la escisión fotolítica del enlace. (Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.505.931 y las referencias allí citadas). Se conocen sistemas de liberación basados en la hidrólisis en los que una amina biológicamente activa se conjuga con un ácido orgánico que incorpora un anticuerpo monoclonal u otro substrato para dirigirse a células específicas. (Véase las Patentes de Estados Unidos Nº 4.764.368, 4.618.492, 5.505.931 y 5.563.250). Después de la unión específica a la célula diana, estos conjugados suministran la amina activa (típicamente en forma de una amida) dentro de la célula, donde la hidrólisis (de la amida) libera la amina libre dentro de la célula.
El éxito de los sistemas de liberación basados en hidrólisis de la técnica anterior han inspirado la búsqueda de conjugados fármaco-vehículo mejorados capaces de liberar un grupo amino biológicamente activo que contiene el compuesto en el interior de las células. Las estrategias de síntesis mejoradas y las técnicas de tratamiento se están desarrollando actualmente.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a nuevos conjugados de fármaco-vehículo y a estrategias de síntesis convenientes para su producción. En consecuencia, la presente invención se refiere a métodos de síntesis, intermedios y por último a productos finales útiles para la absorción y liberación de compuestos que contienen un grupo amino biológicamente activo.
En particular, la invención se refiere a compuestos de fórmula general I
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en la que R^{2} se selecciona del grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde los grupos alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
uno de R^{4} y R^{5} es una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionada entre el grupo compuesto por un fármaco que contiene amina, un aminoácido natural o no natural, un péptido y una proteína y el otro de R^{4} y R^{5} es OR^{6} donde R^{6} es hidrógeno, un metal alcalino o una carga negativa;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero entre cero y 10.
La presente invención se refiere también a compuestos de fórmula general II
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2 
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en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde los grupos alquilo y arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un lípido de origen natural, un hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que comprende de 4 a 26 átomos de carbono, un ácido graso o un éster del mismo, o un tensioactivo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
La presente invención se refiere también a compuestos de fórmula general III
3
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos,
en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde los grupos alquilo y arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
La presente invención se refiere también a métodos de formación de conjugados de fórmula general I a partir de compuestos de fórmula general II y una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo.
La presente invención se refiere también a métodos de formación de compuestos de fórmula general II a partir de derivados de ácido maleico y los tioles o alcoholes correspondientes.
La presente invención se refiere también a métodos para aumentar la absorción o prolongar la retención en sangre y en tejidos en un mamífero de una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo, en los que un conjugado de fórmula general I se administra al mamífero en una forma farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere también a métodos para aumentar la liberación de compuestos que contienen amina hidrófila en el interior de una célula que tiene una barrera mucosa, en los que un conjugado de fórmula general I se pone en contacto con la célula con lo que el conjugado penetra la barrera mucosa de la célula y la amina libre se libera mediante la hidrólisis de un enlace amida.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula general I.
Las anteriores y otras características, ventajas, realizaciones, aspectos y objetos de la presente invención serán evidentes para los especialistas en la técnica en las áreas de la técnica pertinente, basándose en la descripción, contenido y directrices presentadas en este documento.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 muestra la dependencia del pH de la liberación de tiramina de un reactivo vehículo de lipidización (REAL-tiramina) de acuerdo con la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica de 3 experimentos.
La fig. 2 muestra la producción acumulativa de orina de ratas diabéticas después de la inyección subcutánea de 5 \mug/kg de AVP (arginina vasopresina), palmitil-AVP y REAL-AVP de acuerdo con la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica de las mediciones de 3 ratas.
La fig. 3 muestra la producción acumulativa de orina de ratas diabéticas durante 24 horas después de la inyección subcutánea de 5 \mug/kg de AVP, palmitil-AVP y REAL-AVP de acuerdo con la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica de 3 experimentos.
La fig. 4 muestra el cambio en el nivel de glucosa en sangre en ratas diabéticas en ayunas después de la inyección subcutánea de 0,35 U/kg de insulina en comparación con la inyección subcutánea de 0,35 U/kg de REAL-insulina de la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica de las mediciones realizadas con 2 ratas.
La fig. 5 muestra el efecto prolongado sobre los niveles de glucosa en sangre en ratas diabéticas en ayunas de la inyección subcutánea de 0,5 U/kg de insulina en comparación con la inyección subcutánea de 0,5 U/kg de REAL-insulina de la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica de las mediciones realizadas con 2 ratas.
La fig. 6 muestra el efecto a corto plazo sobre el nivel de glucosa en sangre de ratas diabéticas en ayunas después de la administración oral de 10 U/kg de REAL-insulina, insulina y placebo. Los datos muestran la media y la desviación típica de las mediciones realizadas con cuatro ratas.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo con la presente invención, un compuesto que contiene una amina biológicamente activa (por ejemplo, un aminoácido, péptido o proteína) se une a un derivado lipófilo mediante un enlace amida reversible. El grupo lipófilo de tal conjugado se une al lado apical de una membrana celular y facilita el transporte del conjugado a través de la membrana celular. Una vez dentro de la membrana celular, el compuesto que contiene la amina biológicamente activa se libera dentro del fluido intersticial como resultado de la hidrólisis del enlace amida.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan conjugados de fórmula general I
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en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde los grupos alquilo y arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
uno de R^{4} y R^{5} representa una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionado entre el grupo compuesto por fármacos que contienen amina, aminoácidos naturales o no naturales, péptidos y proteínas y el otro de R^{4} y R^{5} es OR^{6}, donde R^{6} representa hidrógeno, un metal alcalino o una carga negativa;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan compuestos de fórmula general II
5
en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde los grupos alquilo y arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un lípido de origen natural, un hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que comprende de 4 a 26 átomos de carbono, un ácido graso o éster del mismo, o un tensioactivo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan compuestos de fórmula general III
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o una sal inocua farmacéuticamente aceptable de los mismos,
en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o arilo, en la que los grupos alquilo y arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
Los grupos alquilo típicos incluyen grupos alquilo con 1 a 6 átomos de carbono que incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, neopentilo, hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-1-pentilo, 3-metil-1-pentilo, 4-metil-1-pentilo y similares.
Los grupos alcoxi típicos incluyen oxígeno substituido con cualquiera de los grupos alquilo mencionados anteriormente.
Los grupos alcoxialquilo típicos incluyen cualquiera de los grupos alquilo anteriores substituido con un grupo alcoxi, tales como metoximetilo, etoximetilo, propoximetilo, butoximetilo, pentoximetilo, hexoximetilo, metoxietilo, metoxipropilo, metoxibutilo, metoxipentilo, metoxihexilo y similares.
Los grupos arilo preferidos son grupos arilo con 6 a 14 átomos de carbono y típicamente incluyen grupos fenilo, naftilo, fluorenilo, fenantrilo y antracilo.
Los grupos arilo substituidos con alcoxi típicos incluyen los grupos arilo anteriores substituidos con uno o más de los grupos alcoxi anteriores, por ejemplo, 3-metoxifenilo, 2-etoxifenilo y similares.
Los grupos arilo substituidos con alquilo típicos incluyen cualquiera de los grupos arilo anteriores substituidos con cualquiera de los grupos alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, incluyendo el grupo Ph(CH_{2})_{n}, donde n es 1-6, por ejemplo, tolilo, o-, m- y p-xililo, etilfenilo, 1-propilfenilo, 2-propilfenilo, 1-butilfenilo, 2-butilfenilo, t-butilfenilo, 1-pentilfenilo, 2-pentilfenilo, 3-pentilfenilo.
Los grupos alquenilo típicos incluyen grupos alquenilo con 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, grupos etenilo, 2-propenilo, isopropenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 4-pentenilo, 3-pentenilo, 2-pentenilo, 5-hexenilo, 4-hexenilo, 3-hexenilo y 2-hexenilo.
Los grupos alquinilo típicos incluyen grupos alquinilo con 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, grupos etinilo, 2-propenilo, 2-butinilo, 3-butinilo, 4-pentinilo, 3-pentinilo, 2-pentinilo, 5-hexinilo, 4-hexinilo, 3-hexinilo y 2-hexinilo.
Los grupos arilo substituidos con alquenilo o alquinilo típicos incluyen cualquiera de los grupo arilo con 6 a 14 átomos de carbono anteriores substituidos con cualquiera de los grupo alquenilo con 2 a 6 átomos de carbono o alquinilo con 2 a 6 átomos de carbono anteriores, por ejemplo, grupos etenilfenilo, 1-propenilfenilo, 2-propenilfenilo, 1-butenilfenilo, 2-butenilfenilo, 1-pentenilfenilo, 2-pentenilfenilo, 3-pentenilfenilo, 1-hexenilfenilo, 2-hexenilfenilo, 3-hexenilfenilo, etinilfenilo, 1-propinilfenilo, 2-propinilfenilo, 1-butinilfenilo, 2-butinilfenilo, 1-pentinilfenilo, 2-pentinilfenilo, 3-pentinilfenilo, 1-hexinilfenilo, 2-hexinilfenilo y 3-hexinilfenilo.
Los grupos halo típicos incluyen flúor, cloro, bromo y yodo.
Los grupos alquilo substituidos con halo típicos incluyen grupos alquilo con 1 a 6 átomos de carbono substituidos con uno o más átomos de flúor, cloro, bromo o yodo, por ejemplo, grupos fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, pentafluoroetilo, 1,1-difluoroetilo y triclorometilo.
Los grupos alcanoílo típicos incluyen grupos alcanoílo C_{1-5}C(O), por ejemplo, grupos acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo y hexanoílo, o con un grupo arilalcanoílo, por ejemplo, un grupo alcanoílo C_{1-5}C(O) substituido con cualquiera de los grupos arilo anteriores.
Los grupos cicloalquilo típicos incluyen grupos cicloalquilo con 3 a 8 átomos de carbono, e incluyen grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos de formación de conjugados de fórmula general I a partir de compuestos de fórmula general II y una substancia que contiene un grupo amino.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan métodos de formación de compuestos de fórmula II a partir de derivados de ácido maleico, tioles y alcoholes.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan métodos para aumentar la absorción o prolongar la retención en sangre y tejidos en un mamífero de una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo, en los que un conjugado de fórmula general I se administra al mamífero (por ejemplo, en forma de emulsiones, nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas sólidas), liposomas, microesferas, microcápsulas, aerosoles, por inhalación y formas de dosificación transdérmica).
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporcionan métodos para aumentar la liberación de compuestos hidrófilos que contienen amina en el interior de una célula que tiene una barrera mucosa, en los que un conjugado de fórmula general I se pone en contacto con la célula con lo que el conjugado penetra la barrera mucosa de la célula y la amina libre se libera por hidrólisis de un enlace amida.
El término "grupo lipófilo" según se usa en este documento se refiere a un lípido de origen natural per se, un hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que comprende de 4 a 26 átomos de carbono, preferiblemente de 5 a 19 átomos de carbono, un ácido graso o un éster del mismo, o un tensioactivo. Los grupos lipófilos adecuados incluyen, pero sin limitación, grupos alcanoílo de cadena larga incluyendo: palmitilo (C_{15}H_{31}), oleílo (C_{15}H_{29}), estearilo (C_{17}H_{35}), laurilo (C_{11}H_{23}), colilo y miristilo (C_{13}H_{27}).
El término "aminoácido natural o no natural" según se usa en este documento se refiere a cualquiera de los 21 aminoácidos de origen natural así como a la forma D de los aminoácidos, a la forma L- y D- de aminoácidos bloqueados tales como los bloqueados por amidación o acilación, aminoácidos substituidos (por ejemplo, los substituidos con un grupo alquilo impedido estéricamente o un grupo cicloalquilo tal como ciclopropilo o ciclobutilo) en el que la substitución introduce una restricción conformacional en el aminoácido. Los aminoácidos de origen natural preferidos para uso en la presente invención como aminoácidos o componentes de un péptido o proteína son alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, citrulina, cisteína, cistina, ácido \gamma-glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, norleucina, leucina, lisina, metionina, ornitina, fenilalanina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, \gamma-carboxiglutamato o O-fosfoserina. Los aminoácidos de origen no natural preferidos para uso en la presente invención como aminoácidos o componentes de péptidos o proteínas son cualquiera de los \beta-aminoácidos, por ejemplo, \beta-alanina, ácido \alpha-amino butírico, ácido \gamma-amino butírico, ácido \gamma-(aminofenil)butírico, ácido \alpha-amino isobutírico, ácido \varepsilon-amino caproico, ácido 7-amino heptanoico, ácido amino benzoico, ácido aminofenil acético, ácido aminofenil butírico, cisteína (ACM), metionina sulfona, fenilglicina, norvalina, ornitina, \delta-ornitina, p-nitro-fenilalanina, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico y tioprolina. También se contemplan derivados de aminoácido de la fórmula:
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en la que p es 1-10.
La expresión "substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo" según se usa en este documento se refiere a cualquier substancia que tiene actividad biológica cuando se introduce dentro de una célula e incluye en su estructura una amina primaria o secundaria capaz de formar un enlace amina mediante acilación. Las substancias que no incluyen una amina primaria o secundaria se pueden derivatizar adecuadamente de manera que puedan conjugarse con compuestos de fórmula general II o III. Por ejemplo, los compuestos que tienen grupos carboxi pueden reaccionar con una diamina adecuada, por ejemplo, una diamina con 2 a 10 átomos de carbono tal como etilendiamina, propilendiamina, 1,4-diaminobutano, espermina o espermidina y similares en presencia de un compuesto de fórmula general II o III y un reactivo de acoplamiento de carbodiimida soluble en agua (por ejemplo, EDC). De esta manera, la diamina sirve como medio para acoplar un compuesto biológicamente activo, que no incluye una amina primaria o secundaria, a un compuesto de fórmula general II o III mediante la formación e un enlace amida.
Los fármacos que contienen amida preferidos incluyen, pero sin limitación, tiramina, arginina, vasopresina, insulina (Czech, M.P., Ann. Rev. Biochem. 46: 359 (1977)), calcitonina (Brown, E.M. y Aurbach, G.D., Vitam. Horm. 38: 236 (1980)), desmopresina (Vavra, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 188: 241 (1974)), interferón \alpha, \beta y \gamma (Stiem, E.R., Ann. Rev. Inter. Med. 96: 80-93 (1982)), interleuquina-2, -3, -4, -6 y -11 (Kluth, D.C. y Rees, A.J., Semin. Nephrol. 16: 576-582 (1996)); Holyoake, T.L., Blood Rev. 10: 169-200 (1996)), G-CSF (Spiekermann, K., et al., Leukemia 11: 466-478 (1997)), GM-CSF (Jonuleit, H., et al., Arch. Dermatol. Res. 289: 1-8 (1996)), hormona del crecimiento humana (Strobl, J.S. y Thomas, M.J., Pharmacol. Rev. 46: 1-34 (1994)), eritropoyetina (Spivak, J.L., Semin. Hematol. 30: 2-11 (1993)), vasopresina (Schroder, E. y Lubke, K., The Peptide 2: 336-350 (1966)), octreotida (Sheppard, M.C. y Stewart, P.M., Metabolism: Clinical and Experimental 45: 63-64 (1996)), aprotinina (Haderland, G. y McConn, R., Fed. Proc. 38: 2760-2767 (1979)), oxitocina (Nachtmann, F., et al., en Anal. Prof. Drug Subst., Vol. 10, Florey, K., ed., Academic Press, New York, NY (1981), pág. 563-600), \beta-TGF (Moses, H.L. y Serra, R., Curr. Opin. Genet. Dev. 6: 581-586 (1996)), BDNF (Apfel, S.C. y Kessler, J.A., Baillieres. Clin. Neurol. 4: 593-606 (1995)), b-FGF (Bikfalvi, A., et al., Endocr. Rev. 18: 26-45 (1997)), PDGF (Hughes, A.D., et al., Gen. Pharmacol. 27: 1079-1089 (1996)), TNF (Majno, P.E., et al., Swiss. Surg. 4: 182-185 (1995)), péptido natriurético auricular (Nakao, K., Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2: 45-50 (1993)), relaxina (Schwabe, C., et al., Recent. Progr. Horm. Res. 34: 123-211 (1978)), amirina (Rink, T.J., et al., Trenes. Pharmacol. Sci. 14: 113-118 (1993)), desoxirribonucleasa (Laskowski, en The Enzymes, Vol. 2, Boyer, P.D., ed., Academic Press, New York, NY (1971), pág. 289-311), EGF (Carpenter, G., Curr. Opin. Cell Biol. 5: 261-264 (1993)), hirudina (Markwardt, Methods. Enzymol. 19: 924 (1970)), neocarzinostatina (Dedon, P.C. y Goldberg, I.H., Chem. Res. Toxicol. 311-332 (1992)), péptido hemorregulador (Paukovits, W.R., et al., Cancer Treat. Rev. 17: 347-354 (1990)) y somatostatina (Moss, R.L., Ann. Rev. Physiol. 41: 617 (1979)).
Para los fines de la presente invención, el término "péptido" se refiere a cadenas de aminoácidos naturales o no naturales que comprende de dos a 100 aminoácidos y el término "proteína" a cadenas de aminoácidos naturales o no naturales que comprenden más de 100 aminoácidos. Las proteínas y los péptidos se pueden aislar de fuentes naturales o se pueden preparar por medios bien conocidos en la técnica, tales como tecnología de ADN recombinante o síntesis en estado sólido. Se contempla que los péptidos y proteínas usados de acuerdo con la presente invención pueden comprender sólo L-aminoácidos de origen natural, combinaciones de L-aminoácidos y otros aminoácidos (incluyendo D-aminoácidos y aminoácidos modificados) o solo aminoácidos distintos de L-aminoácidos. Para formar un conjugado de fórmula general I, el péptido o la proteína debe llevar al menos un grupo amina reactivo. El grupo amina reactivo puede ser parte de una cadena lateral de aminoácido, o un grupo amino terminal de la estructura principal del péptido o proteína, o se puede introducir por modificación química de grupos funcionales en moléculas de péptidos o proteínas. Los péptidos pueden ser homo- o hetero-péptidos y pueden incluir aminoácidos naturales, aminoácido sintéticos o cualquier combinación de los mismos.
También se incluyen en el alcance de la presente invención las sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas de los compuestos de la invención. En particular, se contemplan los carboxilatos de metales alcalinos, formados por métodos conocidos tales como la adición de un haluro de metal alcalino al ácido carboxílico correspondiente. Tales sales incluyen las sales de sodio, potasio, litio y amonio.
La expresión "carga negativa" como se usa en este documento se refiere a cualquier par solitario de electrones no solvatado, solvatado o complejado capaz de proporcionar carácter aniónico a un grupo carboxilato.
La expresión "metal alcalino" como se usa en este documento se refiere a cualquier metal del grupo I o del grupo II, por ejemplo, sodio, potasio, litio, calcio y magnesio.
El sujeto animal preferido de la presente invención es un mamífero. El término "mamífero" se refiere a un individuo que pertenece a la clase Mammalia (mamíferos). La invención es particularmente útil en el tratamiento de pacientes humanos.
El término "tratar" se refiere a la administración a los sujetos de un conjugado de lipidización para propósitos que pueden incluir la prevención, mejora o cura de una enfermedad o afección.
Se considera que los medicamentos se proporcionan "en combinación" con otro si se proporcionan al paciente simultáneamente o si el tiempo entre la administración de cada medicamento es tal que permita un solapamiento de la actividad biológica.
En una realización preferida, hay presente al menos un conjugado o se administra como parte de una composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas para administración de acuerdo con la presente invención pueden comprender al menos un conjugado de acuerdo con la presente invención en una forma farmacéuticamente aceptable opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden administrar por cualquier medio que consiga sus propósitos pretendidos. Por ejemplo, la administración puede ser por vía oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-peritoneal, transdérmica, intratecal, intracraneal o intranasal. La dosificación administrada dependerá de la edad, salud y peso del receptor, clase de tratamiento simultáneo, si lo hubiera, frecuencia del tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Los especialistas en la técnica del tratamiento clínico pueden determinar fácilmente las cantidades y regímenes de administración de acuerdo con la presente invención.
La forma de administración también puede incluir emulsiones, nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas sólidas), liposomas, microesferas, microcápsulas, aerosoles, mediante inhalación y formas de dosificación transdérmicas.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos se pueden administrar apropiadamente como suspensiones en aceite para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener substancias que aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, las soluciones y/o suspensiones acuosas pueden contener también estabilizantes y/o tampones, tales como tampón borato y similares.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de una manera ya conocida, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, granulación, preparación de grageas, procesos de disolución o liofilización. De esta forma, las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, añadiendo después los compuestos auxiliares adecuados, si se desea o es necesario, para obtener comprimidos o núcleos de grageas.
Los excipientes adecuados son, por ejemplo, cargas tales como sacáridos, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa y/o fosfatos cálcicos, tales como fosfato tricálcico o hidrogenofosfato cálcico; así como aglutinantes tales como pasta de almidón, usando, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes tales como los almidones mencionados anteriormente y además carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato sódico. Los compuestos auxiliares son, sobre todo, agentes de regulación del flujo y lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales del mismo, tales como estearato de magnesio o estearato cálcico y/o polietilenglicol. Los núcleos de gragea se proporcionan con los recubrimientos adecuados que, si se desea, son resistentes a los jugos gástricos. Para este fin pueden usarse soluciones concentradas de sacáridos que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Para producir recubrimientos resistentes a los jugos gástricos, se usan soluciones de preparaciones adecuadas de celulosa tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Los recubrimientos también se pueden proporcionar para proteger los conjugados de lipidización de la presente invención de la exposición prematura a un medio suficientemente ácido para hidrolizar el enlace amida formado entre el fármaco activo, el péptido o proteína y el vehículo. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.786.505 y 4.853.230 para los métodos de preparación de unidades de dosificación con núcleos que están protegidos de los ácidos gástricos. Preferiblemente, el núcleo es neutro o básico. Los núcleos básicos contienen uno o más compuestos alcalinos reactivos, tales como los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.786.505 y 4.853.230. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de los comprimidos o grageas, por ejemplo, para la identificación con el fin de caracterizar las combinaciones de dosis de los compuestos activos.
Otras preparaciones farmacéuticas que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, cápsulas enchufables orales hechas de gelatina, supositorios rectales, formulaciones de inhalación para la administración oral y/o nasal, cremas nasales o rectales o ungüentos, opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, un potenciador de la penetración, un excipiente y/o una carga. Los potenciadores de la penetración adecuados para el uso incluyen potenciadores de la penetración catiónicos, aniónicos, anfóteros y neutros, tales como cloruro de benzalconio, clorbutanol, AZONE y otros conocidos en la técnica.
La síntesis de compuestos ejemplares de la fórmula general II se ilustra en los esquemas 1 y 2. En general, se deja reaccionar un derivado de anhídrido bromometilmaleico o su sal maleato con un grupo lipófilo que lleva alcohol o tiol para formar un éter o un tiol éter de fórmula general III. El grupo lipófilo que lleva alcohol o tiol opcionalmente incluye un resto aminoacídico natural o no natural de unión que une el átomo de oxígeno o azufre y el carbonilo unido al grupo lipófilo. El resto aminoacídico de unión natural o no natural se puede conectar al átomo de oxígeno o azufre o el carbonilo unido al grupo lipófilo en el extremo amino, extremo carboxilo o cadena lateral del aminoácido. Con referencia al esquema I, Pal-cisteína incluye eficazmente una unión de glicina unida al carbonilo en el extremo amino y al átomo de azufre mediante la cadena lateral. El uso de hexadecanotiol como en el esquema 2 representa la formación de compuestos de fórmula III sin el aminoácido de unión natural o no natural. Después, el producto de fórmula general III se somete a condiciones de deshidratación para reformar el anhídrido maleico ahora substituido por la unión éter o tioéter con un grupo lipófilo, dando compuestos de fórmula general II. Los especialistas en la técnica apreciarán una diversidad de esquemas de síntesis alternativos que pueden dar lugar a los compuestos deseados.
Esquema 1
Síntesis del reactivo A
8
Esquema 2
Síntesis del reactivo B
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Los esquema 3-5 explican la síntesis de conjugados de lipidización sensibles a pH ejemplares de acuerdo con la presente invención. En general, se permite reaccionar a un fármaco que contiene amina, un aminoácido, un péptido o una proteína con un compuesto de fórmula II para formar una amida de fórmula I. El enlace de amida se forma en condiciones alcalinas, preferiblemente en una solución acuosa tamponada. A menor pH, incluyendo el pH encontrado típicamente in vivo, el enlace de amida se hidroliza liberando la amina libre y un compuesto de fórmula III. La formación del enlace de amida reversible proporciona un mecanismo para la conjugación de una amina hidrófila con un reactivo de lipidización a un pH y liberación de tal amina del reactivo de lipidización a un pH menor.
Esquema 3
Lipidización de tiramina (REAL-tiramina)
10
Esquema 4
Lipidización de Arg. vasopresina (REAL-AVP)
11 
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Esquema 5
Lipidización de insulina (REAL-insulina)
12 
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Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de anhídrido 3-S-(N-palmitil cisteinil)metil, 2-metil maleico, Reactivo A (Esquema 1)
El derivado de disulfuro de piridina de N-palmitil-cisteína (Pal-CPD) se obtuvo por métodos conocidos. Pal-CPD se sintetizó de acuerdo con el procedimiento de Ekrami et al., FEBS Letters 371: 283-286 (1995). Se disolvió Pal-CPD (0,7 g, 0,0015 mol) en 10 ml de NaOH pH 11. Se disolvió ditiotreitol (DTT) (0,9 g, 0,006 mol) en 5 ml de agua. La solución de Pal-CPD se añadió gota a gota a la solución de DTT con agitación continua y a temperatura ambiente. La reacción finalizó después de 2 horas. El pH de la mezcla se ajustó a 3 usando HCl 0,01 N, apareciendo un precipitado blanco (Pal-cisteína). El precipitado se lavó 5 veces usando HCl diluido para retirar la cantidad en exceso de DTT.
El material de partida, anhídrido 3-bromometil, 2-metil maleico (Br-DMMA) se obtuvo por la adición de un equivalente de radical bromuro a anhídrido 2,3-dimetil maleico (DMMA). Por consiguiente, se calentaron DMMA (1,5 g, 0,012 mol), NBS (2,3 g, 0,013 mol), peróxido de benzoílo (0,3 g, 0,0012 mol) y óxido de magnesio (0,02 g, 0,0005 mol) en 40 ml de cloroformo a reflujo durante 4 horas. La mezcla se filtró y el cloroformo se evaporó a presión reducida. Al residuo marrón se le añadieron 40 ml de tetracloruro de carbono y se filtró. El filtrado se recogió y el disolvente se retiró a presión reducida. Se obtuvo un aceite transparente con un color verdoso claro, que solidificó después de almacenarlo a 4ºC.
Haciendo referencia al esquema 1, se hace reaccionar Br-DMMA con Pal-cisteína para dar un tiol éter de Pal-cisteína de fórmula III donde R^{1} es hidrógeno, R^{2} es metilo, R^{3} es palmitilo (C_{15}H_{31}), X es azufre, Y es un radical glicina (-NHCH(CO_{2}H)-), n = 1 y m = 1. La reacción se realiza por la adición de Br-DMMA (0,3 g, 0,0014 mol) directamente a una suspensión de Pal-cisteína en 30 ml de HCl diluido a temperatura ambiente. El pH de la mezcla se ajustó gradualmente a 7,9 y finalmente a 11 usando NaOH 1 N. El pH de la mezcla se estabilizó después de 2 horas a pH 11. Después de 16 horas de agitación a 25ºC, la mezcla se filtró y el filtrado se acidificó usando HCl 1 N. Apareció un precipitado blanco que se extrajo con éter. El éter se evaporó a presión reducida. El aceite verdoso restante se secó a alto vacío. Se obtuvo ácido 3-S-(N-palmitil cisteinil)metil, 2-metil maleico (420 mg, 0,84 mmol) con un punto de fusión de 60-63ºC. El rendimiento molar fue del 56%.
El ácido 3-S-(N-palmitil cisteinil)metil, 2-metil maleico (420 mg, 0,84 mmol) se disolvió en 5 ml de THF seco. Se disolvió N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (692 mg, 3,36 mmol) en 1 ml de THF y se añadió a la solución anterior en un baño de hielo. La reacción se agitó en un baño de hielo durante 5 horas y después se filtró. El filtrado se recogió y el THF se retiró a presión reducida. El residuo (sólido pardusco) se disolvió en 1,5 ml de dioxano seco y se filtró. El filtrado se añadió a 30 ml de hexano seco frío y se mantuvo a 4ºC durante 16 horas. El precipitado obtenido se lavó usando hexano seco frío y se aplicó a alto vacío para retirar el disolvente. Se obtuvo un producto pardusco claro (reactivo A) con un punto de fusión de 46-49ºC. El rendimiento molar fue del 54%.
Ejemplo 2 Síntesis de anhídrido 3-S-(hexadecanil)metil, 2-metil maleico, Reactivo B (Esquema 2)
Haciendo referencia al esquema 2, se hace reaccionar Br-DMMA con hexadecanotiol para dar un tiol éter de fórmula III donde R^{2} es metilo, R^{3} es hexadecano (C_{16}H_{33}), n = 0 y m = 0. En condiciones de deshidratación, se obtiene el anhídrido reactivo B de fórmula II, donde R^{2}, R^{3}, n y m son como se han definido anteriormente.
Por consiguiente, como se indica en el esquema 2, se hidrolizó Br-DMMA (0,5 g, 0,0025 mol) en 10 ml de agua a pH 8 y se añadió a 0,63 g de hexadecanotiol (0,0025 mol) disuelto en 50 ml de THF. Se añadió trietilamina (1 ml) a la mezcla y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo obtenido se disolvió en una solución diluida de NaOH (pH 11) y se lavó con éter (3 x 20 ml). El filtrado se ajustó a pH 2 usando HCl 1 N y apareció un precipitado blanco. El precipitado se extrajo en éter y el éter se retiró a presión reducida. El producto final, ácido 3-(hexadecaniltio)metil, 2-metil maleico, se secó a alto vacío.
El ácido 3-(hexadecaniltio)metil, 2-metil maleico se deshidrató para dar el reactivo B usando el mismo procedimiento descrito anteriormente para el reactivo A. El reactivo B se disolvió en DMF caliente y se mantuvo a 4ºC durante 16 horas. Apareció un precipitado blanco que se lavó usando DMF fría. El disolvente se retiró a alto vacío. Se obtuvo un polvo blanco (73 mg) con un rendimiento molar del 16%.
Ejemplo 3 Preparación de tiramina lipidizada reversiblemente (REAL-tiramina) usando el Reactivo A (Esquema 3)
Se disolvió el reactivo A (2 mg, 0,00426 mmol) en 60 \mul de DMF seca y se añadió a 0,2 mg (0,00146 mmol) de tiramina en 200 \mul de tampón borato USP (pH 10, 0,1 M) en un baño de hielo. La reacción se realizó durante 4 horas en un baño de hielo y durante 16 horas a 4ºC.
Ejemplo 4 Determinación de la sensibilidad al PH de REAL-tiramina
Se determinó la dependencia al pH de la formación del enlace amida controlando la concentración de la tiramina libre. Se prepararon tampones fosfato 1 M a pH 6, 7 y 8. Se diluyó REAL-tiramina 1:2 usando estos tampones. La solución madre de tiramina también se diluyó para tener la misma concentración de REAL-tiramina y se usó como control. Las muestras se incubaron a 37ºC. La fluorescencia de la tiramina libre liberada de REAL-tiramina se determinó en diferentes momentos usando una reacción de fluorescamina.
Después de la lipidización de tiramina, la concentración de tiramina libre disminuyó hasta el 15% de la concentración original. La incubación de REAL-tiramina a bajo pH dio como resultado un aumento en la concentración de tiramina libre indicando la escisión del enlace amida. La velocidad de hidrólisis del enlace amida era dependiente del pH (pH 6 > pH 7 > pH 8). Después de 1 hora de incubación de REAL-tiramina a pH 6, el enlace amida se había hidrolizado casi totalmente, sin embargo, a pH 7 se hidrolizó aproximadamente el 45% y a pH 8 sólo el 7% del enlace amida de REAL-tiramina (Fig. 1).
Ejemplo 5 Preparación de AVP lipidizada reversiblemente (REAL-AVP) usando el Reactivo A (Esquema 4)
Se disolvió arginina vasopresina (AVP) (0,5 mg) en 1 ml de tampón borato (pH 10, 0,1 M). Se hizo reaccionar una alícuota de 0,5 ml (0,25 mg, 0,207 \mumol) de esta solución en un baño de hielo con 1 mg (2,1 \mumol) del reactivo A disuelto en 50 \mul de dimetilformamida (DMF) seca. La mezcla se agitó durante 16 horas a 4ºC. La concentración final de REAL-AVP fue de 0,455 mg/ml.
Ejemplo 6 Efecto in vivo de REAL-AVP en ratas brattleboro deficientes en vasopresina
Se inyectó REAL-AVP por vía subcutánea en animales (5 \mug/kg) y se recogió la orina a diferentes puntos de tiempo. La figura 2 muestra el volumen acumulativo de orina durante las primeras 8 horas después de la inyección. AVP y Pal-AVP tienen efectos similares con un retraso en la excreción de orina de 4 horas. Se observó un retraso mayor en la excreción de orina, de hasta 6 horas, después de la inyección de REAL-AVP. La lipidización directa de AVP a ácido palmítico, Pal-AVP, no fue tan eficaz como REAL-AVP. La cantidad de excreción de orina volvió a la original 24 horas después de la inyección de Pal-AVP y AVP. Sin embargo, el efecto de REAL-AVP duró 3 días (Fig. 3).
Se puede concluir que la lipidización sensible al pH de AVP prolonga la actividad biológica de AVP.
Ejemplo 7 Preparación de insulina lipidizada reversiblemente (REAL-insulina) usando el Reactivo A (Esquema 5)
Se disolvió insulina (2 mg) en 2 ml de tampón borato (pH 10, 0,1 M). El reactivo A (1 mg, 2,1 \mumol) se disolvió en 100 \mul de DMF y se hizo reaccionar con 1 ml (1 mg, aproximadamente 0,14 \mumol) de solución de insulina en un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a 4ºC y después se dializó contra 500 ml de tampón borato (pH 10, 0,01 M) durante 24 horas a 4ºC. El volumen de REAL-insulina dializada se ajustó a 2 ml usando tampón borato (pH 10, 0,1 M) para dar una concentración de 0,5 mg/ml de REAL-insulina. El volumen de solución madre de insulina (1 ml) también se ajustó a 2 ml para dar una concentración de 0,5 mg/ml.
Ejemplo 8 El efecto de REAL-insulina en ratas hiperglucémicas
Se indujo diabetes en ratas Sprague Dawley usando inyección i.v. de 60 mg/kg de estreptozotocina. Se prepararon soluciones de 0,5 unidades/ml de insulina o REAL-insulina en tampón borato (pH 10, 0,1 M). Las ratas se dejaron en ayunas durante las 16 horas previas al experimento y se les inyectaron por vía subcutánea 0,5 unidades/kg de insulina o REAL-insulina. Se controló el nivel de glucosa en sangre de las ratas en diferentes puntos de tiempo durante 9 horas. Después de este periodo de tiempo, se administró alimento a las ratas y se midió el nivel de glucosa en sangre después de 15 horas de alimentación. Las ratas se dejaron en ayunas de nuevo y se midió el nivel de glucosa en sangre después de 16 horas. El periodo de ayuno y alimentación continuó durante 3 días.
El nivel de glucosa en sangre de las ratas aumentó una semana después de inducir la diabetes desde una media de 100 mg/dl a 420 mg/dl (ratas sin ayuno). En las ratas tratadas con insulina, se observó una caída significativa en el nivel de glucosa en sangre en la primera hora. Sin embargo, en ratas tratadas con REAL-insulina no hubo cambios en el nivel de glucosa en sangre en la primera hora y se observó una caída significativa de la glucosa en sangre en las primeras 2 horas después de la inyección (fig. 4). Esto se debe posiblemente al tiempo necesario para que la REAL-insulina se hidrolice y libere la insulina libre. Después de la inyección de insulina, el nivel de glucosa en sangre en ayunas de las ratas volvió al original en 24 horas. Sin embargo, en el caso de ratas tratadas con REAL-insulina, el efecto del fármaco sobre el nivel de glucosa en sangre duró 3 días (fig. 5). A las ratas diabéticas en ayunas también se les administraron por vía oral 10 U/kg de insulina, REAL-insulina y placebo. Las ratas se dejaron en ayunas durante las 16 horas previas a la administración oral. Se usó una microemulsión de agua/aceite como vehículo del fármaco. La figura 6 no muestra ninguna reducción significativa en el nivel de glucosa en sangre observado después de la administración oral de insulina o placebo. Sin embargo, en ratas tratadas con REAL-insulina, se observó una reducción del 28% del nivel de glucosa en sangre en 9 horas.
Puede concluirse que usando REAL-insulina, se puede prolongar la actividad biológica de la insulina. Usando una formulación apropiada, REAL-insulina se puede administrar por vía oral para reducir los niveles de glucosa en sangre.

Claims (17)

1. Un compuesto de fórmula general I
13
en la que R^{2} se selecciona del grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde el alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, aciloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
uno de R^{4} y R^{5} es una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionada entre el grupo compuesto por un fármaco que contiene amina, un aminoácido natural o no natural, un péptido y una proteína y el otro de R^{4} y R^{5} es OR^{6}, donde R^{6} se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno, un metal alcalino o una carga negativa;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fármaco que contiene amina es tiramina.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho péptido se selecciona entre el grupo compuesto por Arg. Vasopresina e insulina.
4. Un compuesto de fórmula general II
14
en la que R^{2} se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde el alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, aciloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un lípido de origen natural, un hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que comprende de 4 a 26 átomos de carbono, un ácido graso o un éster del mismo, o un tensioactivo;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
5. Un compuesto de fórmula general III
15 
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la que R^{2} se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde el alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, aciloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
6. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1, 4 y 5 en el que R^{2} es metilo y X es azufre.
7. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1, 4 y 5 en el que n=0, m=0 y R^{3} es un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de 4 a 26 átomos de carbono.
8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho hidrocarburo de cadena lineal o ramificada tiene de 5 a 19 átomos de carbono.
9. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 7 y 8, en el que dicho hidrocarburo de cadena lineal o ramificado junto con el grupo carbonilo próximo se selecciona entre el grupo compuesto por palmitilo, oleílo, estearilo, miristilo, laurilo, colato y desoxicolato.
10. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1, 4 y 5, en el que dicho aminoácido natural o no natural es un aminoácido de origen natural.
11. Un método in-vitro para aumentar la absorción celular de una substancia que contiene amina seleccionada entre el grupo compuesto por un fármaco que contiene amina, un péptido y una proteína, que comprende administrar un compuesto de la reivindicación 1 a dichas células.
12. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para aumentar la absorción celular de una substancia que contiene amina seleccionada entre un fármaco, un péptido y una proteína que contiene amina.
13. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para prolongar la retención en sangre y en tejidos de un mamífero de un compuesto que contiene una amina biológicamente activa seleccionado entre el grupo compuesto por fármacos, péptidos y proteínas que contienen amina.
14. Un método para formar un compuesto de la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionado entre el grupo compuesto por un fármaco, un péptido y una proteína que contiene amina, con un compuesto de la reivindicación 4, en condiciones en las que se obtenga el compuesto de la reivindicación 1.
15. Un método in-vitro para liberar una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo en el interior de una célula, que comprende exponer dicha célula al compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto se absorbe por dicha célula y se expone a un pH dentro de dicha célula suficientemente bajo para hidrolizar un enlace amida y liberar dicha substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo.
16. Una composición farmacéutica que comprende:
(A) una cantidad eficaz de un compuesto de la reivindicación 1; y
(B) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16, en la que dicha composición comprende un recubrimiento entérico que protege dicho compuesto de la hidrólisis del enlace amida, previniendo así la liberación de dicha substancia que contiene el grupo amino biológicamente activo hasta que dicho recubrimiento se retire o se disuelva.
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