ES2220966T3 - Medios selectivos de cultivo y de aislamiento de las bacterias gram negativas, composicion antibiotica. - Google Patents

Medios selectivos de cultivo y de aislamiento de las bacterias gram negativas, composicion antibiotica.

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Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN MEDIO SELECTIVO PARA EL CULTIVO Y EL AISLAMIENTO DE BACTERIAS GRAM QUE COMPRENDE AL MENOS UN ANTIBIOTICO ESPECIFICAMENTE ACTIVO CONTRA LAS BACTERIAS GRAM+ Y AL MENOS UNA BACTERIOCINA.

Description

Medios selectivos de cultivo y de aislamiento de las bacterias Gram negativas, composición antibiótica.
La presente invención se refiere, por una parte, a medios selectivos para el cultivo y el aislamiento de bacterias Gram negativas (Gram^{-}) y, por otra parte, a composiciones antibióticas útiles para el cultivo y el aislamiento de éstos mismos gérmenes.
Se conocía, por el arte anterior, la patente europea publicada bajo el número EP-A-243 015, que reivindica un medio de cultivo para el aislamiento selectivo de las bacterias Neisseria pathogènes, cuyo medio comprende una composición antibiótica, que incluye la mezcla de vancomicina y de lincomicina. La asociación de éstos dos antibióticos, que tienen una actividad inhibidora con respecto a las bacterias Gram^{+} se utiliza, con otros agentes inhibidores, para aislar de manera selectiva las bacterias Neisseria pathogènes.
Por otra parte, la nisina es conocida por ser una bacteriocina, es decir, un antibiótico de tipo polipeptídico producido por ciertas cepas de Lactococcus lactis o Streptococcus lactis. Este antibiótico presenta un amplio espectro frente a microorganismos Gram^{+}, que incluyen las esporulas. Igualmente se conocía la publicación de Stevens et al. (Nisin Treatment for inactivation of Salmonella Species and Other Gram-negative Bacteria, A.E.M. (1991), Dic., p 3613-3615) que describe la actividad de la nisina. De éste modo, además de su actividad inhibidora conocida contra las bacterias Gram^{+} y utilizada en el campo agro-alimentario para la conservación de géneros sensibles, como los productos lácteos (Delves-Broughtonj., Nisin and its uses as a food preservative, Food Technol., (1990) 4, p. 100-112) o con el fin de controlar un procedimiento de fermentación como la producción de ácido láctico en el vino (Hanlin M.B. et al., Bacteriocins of lactic acid bacteria in combination have greater antibacterial activity, Journal of Food Protection, (1993), 56: p. 252-255), la nisina se ha descrito en combinación con un agente quelante por tener una actividad inhibidora con relación a numerosas especies de Salmonella y también con respecto a otras enterobacterias, siendo todos éstos microorganismos bacterias Gram^{-} aerobias (anaerobias facultativas).
El problema del técnico en la materia, cuando pone a punto medios selectivos para el cultivo y el aislamiento de bacterias, consiste en que debe encontrar un compromiso entre la especificidad y la sensibilidad, estando definida la sensibilidad como la capacidad para detectar las muestras positivas, y la especificidad como la aptitud del ensayo a no generar falsos positivos.
La presente invención aporta una solución a éste problema para la puesta a punto de medios de cultivo específicos para el crecimiento y el aislamiento de bacterias Gram^{-}. En efecto, la solicitante ha puesto a punto medios de cultivo selectivos, comprendiendo dichos medios la combinación de una o varias bacteriocinas activas contra las bacterias Gram^{+} y uno o varios antibióticos específicamente activos contra las bacterias Gram^{+}. Ésta combinación permite aumentar la selectividad de los medios, mejorándose la eficacia y ampliándose el espectro de inhibición de las bacterias Gram^{-}, al mismo tiempo que se preserva una buena sensibilidad de los medios frente a los microorganismos que deben ser aislados.
La presente invención se refiere, por lo tanto, a medios selectivos de cultivo y de aislamiento de bacterias Gram^{-}, comprendiendo dichos medios la combinación de uno o varios antibióticos específicamente activos contra las bacterias Gram^{+} y una o varias bacteriocinas. Los medios de cultivo de la invención pueden ser medios de cultivo líquidos o gelosados.
Una variante preferida del medio selectivo según la invención es un medio que comprende la vancomicina y/o la teicoplanina como antibióticos específicamente activos contra las bacterias Gram^{+}, y nisina como bacteriocina. Los medios según la invención pueden contener, además, antifúngicos.
Ventajosamente, el medio selectivo según la invención, es un medio de cultivo y de aislamiento de bacterias anaerobias Gram^{-} caracterizado porque comprende, además, un antibiótico específicamente activo contra las bacterias aerobias Gram^{-}.
Según otra variante ventajosa, la invención se refiere, igualmente, a un medio específico para el crecimiento y el aislamiento de las bacterias aerobias Gram^{-} parásitas, que son las bacterias Neisseria pathogènes.
Así pues, la invención tiene igualmente por objeto un medio de cultivo selectivo para el crecimiento y el aislamiento de las bacterias Neisseria pathogènes, que comprende, al menos, un antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+} y, al menos, una bacteriocina, caracterizado porque comprende, además, una mezcla compuesta por antibióticos activos contra las bacterias Gram^{-} diferentes de la Neisseria y/o antibióticos activos contra los portadores y/o agentes activos contra las levaduras. Preferentemente, éste medio comprende una mezcla compuesta por colimicina, trimetoprina y anfotericina B.
En la presente invención, se entiende por:
-"bacteriocina", toxinas producidas por ciertas cepas bacterianas, tales como, por ejemplo, la nisina, la pediocina A, la lacticina;
-"antibióticos específicamente activos contra la bacteria Gram^{+}", antibióticos tales como la vancomicina, la teicoplanina, y aquellos de la familia de los MLS (macrolidas, lincosamidas y estreptograminas);
-"antibióticos específicamente activos contra las bacterias aerobias Gram^{-}", antibióticos tales como por ejemplo el ácido nalidíxico, los aminosidos (canamicina...);
-"antifúngico", compuestos activos contra las levaduras tales como por ejemplo la anfotericina B, la nistatina;
-"base nutritiva", un medio que contenga principalmente peptonas, un extracto de levadura, sales;
-"suplemento de enriquecimiento", un medio que comprenda, principalmente, vitaminas, aminoácidos y/o glucosa;
-"suplemento selectivo", una mezcla de uno o varios antibióticos y/o de agentes activos contra ciertos microorganismos que se desea eliminar.
Preferentemente, en los medios selectivos según la invención se utiliza una concentración del o de los antibióticos específicamente activos contra las bacterias Gram^{+}, tal como la vancomicina y/o la teicoplanina o los MLS, comprendida entre 1 y 10 mg/l, y de una forma más preferente, una concentración de 2,5 mg/l.
Las cantidades de bacteriocinas utilizadas están comprendidas entre 10 y 100 mg/l y, preferentemente, entre 50 y 60 mg/l.
El antibiótico específicamente activo contra las bacterias aerobias Gram^{-} es utilizado con una concentración comprendida entre 5 y 50 mg/l y, preferentemente, de 10 mg/l.
La presente invención se refiere, igualmente, a composiciones bactericidas para el cultivo y el aislamiento específico de bacterias Gram^{-}, que comprenden al menos un antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+}, elegido entre la vancomicina, la teicoplamina o una mezcla de ambas, o antibióticos del grupo de los MLS, y al menos una bacteriocina.
Preferentemente, éstas composiciones están destinadas al cultivo y al aislamiento específico de bacterias anaerobias Gram^{-}, caracterizadas porque comprenden, además, un antibiótico específicamente activo contra las bacterias aerobias Gram^{-}, elegido entre el ácido nalidíxico o los aminosidos, tal como la canamicina.
Según otro modo de realización ventajosa, dichas composiciones son composiciones para el aislamiento y cultivo de N. pathogènes que comprenden al menos un antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+} y, al menos, una bacteriocina, caracterizadas porque comprenden, además, la colimicina, la trimetoprina y la anfotericina B.
La invención se refiere, finalmente, a las utilizaciones de dichas composiciones para la fabricación de medios selectivos de cultivo y de aislamiento de bacterias Gram^{-}, de una manera más particular bacterias Gram^{-} anaerobias, o de Neisseria pathogènes.
Los ejemplos siguientes permiten ilustrar la invención.
Ejemplo 1 Medio selectivo para el crecimiento y el aislamiento de las bacterias anaerobias Gram^{-}
Se han realizado ensayos para comparar el medio, objeto de la presente invención, con un medio convencional o un medio que comprende, como único agente que inhibe el crecimiento de las bacterias Gram^{+}, una bacteriocina.
El primer medio, designado a continuación "medio A", contiene todos los elementos de la base nutritiva, un suplemento de enriquecimiento, vancomicina y ácido nalidíxico.
El segundo medio, designado como "medio B", contiene todos los elementos de la base nutritiva, un suplemento de enriquecimiento, ácido nalidíxico y nisina.
El tercer medio, designado como "medio C", corresponde al medio según la invención y contiene todos los elementos presentes en el medio A y en el medio B.
Las concentraciones indicadas son las concentraciones finales para un litro de preparación.
TABLA I
1
La base para anaerobias comprende compuestos que favorecen el crecimiento de las bacterias anaerobias Gram^{-}. Se utiliza el medio Schaedler comercializado por la sociedad Sanofi Diagnostics Pasteur como base para anaerobias. La nisina utilizada procede del suministrador Sigma (código N5764).
El suplemento de enriquecimiento comprende hemina (5 mg/l), vitamina K3 (0,5 mg/l) y succinato de sodio (2,5 mg/l).
El pH ha sido ajustado a 7,6 \pm 0,2.
Las cepas ensayadas en cultivo proceden bien de cepas depositadas en la ATCC o en la colección del Institut Pasteur (CIP), o bien proceden de hospitales (denominadas "SDP"). Estas son las siguientes: Clostridium perfringens ATCC 3124, Clostridium sporogenes ATCC 11437, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Clostridium oedematiens SDP, Clostridium sphenoides SDP, Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroides fragilis SDP 385, Bacteroides fragilis SDP 1396, Bacteroides distasomis SDP 419, Bacteroides ATCC 130, Bacteroides vulgatus ATCC 8482, Bacteroides vulgatus CIP 103714, et Fusobacterium nucleatum CIP 101130.
Protocolo
Se introduce en una solución de un litro de agua destilada la base de Schaedler y agar en proporciones tales como las que se han indicado en la tabla 1. La mezcla se lleva a ebullición y a continuación se trata en el autoclave. A continuación se añaden los otros elementos según los medios descritos anteriormente, A, B y C utilizando sus soluciones estériles. Las preparaciones obtenidas se cuelan entonces en cápsulas de Pétri (cápsula redonda de 90 mm) con un 5 % de sangre de caballo desfibrinada. Las cápsulas se siembran con el anillo a partir de una suspensión bacteriana. Entonces se incuban las cápsulas sembradas con anaerobias, a 37ºC, durante 48 horas.
En la tabla 2 siguiente, las abreviaturas de las cepas "Bact", "Fuso" y "Clost" significan, respectivamente, cepas Bacteroides sp, Fusobacterium nucleatum y Clostridium sp.
En la tabla 2 siguiente, los símbolos + y -, al nivel de los diferentes medios, significan:
- -:
crecimiento nulo
- +:
crecimiento pequeño (algunas colonias que tienen un diámetro pequeño)
- + +:
buen crecimiento (numerosas colonias que tienen un diámetro importante)
- + + +:
crecimiento muy bueno (ya no se pueden contar las colonias)
TABLA II
2
Se señalará que el crecimiento de las bacterias Gram^{-} no está modificado por el medio utilizado, mientras que el crecimiento de las cepas bacterianas Gram^{+}está inhibido de forma mucho más importante en el medio C que en los medios A y B. Éstos resultados demuestran que la nisina refuerza la selectividad del medio (especificidad para las bacterias Gram^{-}) conferida por la vancomicina y el ácido nalidíxico. Sin afectar a la sensibilidad de dicho medio. En efecto, la combinación de la nisina y de la vancomicina (medio C de la invención) presenta una actividad mayor que la simple adición de los efectos individuales de los antibióticos (medio A y B). Por lo tanto se observa un efecto ventajoso inesperado de los antibióticos utilizados según la invención.
Ejemplo 2 Medio selectivo para el aislamiento de Neisseria pathogènes.
1. Se han realizado ensayos para comparar el medio según la invención con un medio convencional y con un medio que comprende, como único inhibidor de las bacterias Gram^{+}, una bacteriocina.
El primer medio se designa a continuación como "medio A" y contiene todos los elementos de la base nutritiva enriquecida en hemoglobina, un suplemento de enriquecimiento, un suplemento selectivo, cuya composición está dada más abajo, y vancomicina y teicoplanina como antibióticos activos contra las bacterias Gram^{+}.
El segundo medio, designado como "medio B" contiene todos los elementos de la base nutritiva enriquecida con hemoglobina, un suplemento de enriquecimiento, el mismo suplemento selectivo que el del medio A, y una bacteriocina.
El tercer medio, designado como "medio C", corresponde al medio según la invención y contiene todos los elementos presentes en el medio A y en el medio B.
Protocolo
La base gelosada nutritiva es una base para gelosa chocolate enriquecida con hemoglobina, comercializada por la sociedad Sanofi Diagnostics Pasteur, cuya composición es la siguiente:
Peptona de carne 20 g/l
Extracto de levadura 3 g/l
Extracto de carne 3 g/l
Almidón 2 g/l
Cloruro de sodio 5 g/l
L-cisteína 0,01 g/l
Agar 15 g/l
Ésta base se ha preparado y se ha tratado en el autoclave separadamente de las otras soluciones y compuestos.
La solución de hemoglobina se ha preparado a partir de hemoglobina en polvo y está presente en el medio a una concentración final de 10 g/l. Ésta se ha preparado y se ha tratado en el autoclave separadamente de las otras soluciones y compuestos para ser añadida a continuación de manera estéril a la base.
El suplemento de enriquecimiento es un suplemento polivitamínico (SPV) comercializado por la sociedad Sanofi Diagnostics Pasteur bajo la marca SPV ®. Ésta solución se ha añadido al medio con un volumen final de 10 ml. La composición siguiente está dada para la realización de un litro de medio según la invención:
Clorhidrato de cisteína 25,9 g
Clorhidrato de guanina 0,03 g
Clorhidrato de tiamina 0,003 g
Cloruro de co-carboxilasa 0,1 g
NAD 0,25 g
Nitrato férrico 0,02 g
Ácido para-amino-benzoico 0,013 g
Adenina 1 g
L-glutamina 10 g
Vitaminas B12 0,01 g
Glucosa 200 g
El suplemento selectivo es una mezcla compuesta por un antibiótico activo contra las bacterias Gram^{-} diferentes de Neisseria (colimicina), por un antibiótico activo contra los Proteus (trimetoprima) y un agente activo contra las levaduras (anfotericina B).
Cada antibiótico se ha preparado en forma de solución estéril, bien a partir de viales inyectables rehidratados con una solución apropiada, o bien por pesada seguido de una rehidratación y de una filtración sobre filtro de 0,22 \mum. Para preparar 200 ml de cada solución de antibiótico, se rehidrata cada antibiótico en una solución de rehidratación y agua estéril en cantidad suficiente para obtener la solución final de 200 ml. Se utilizan 500 mg de trimetoprina recogidos con 500 \mul de ácido láctico, 300 mg de anfotericina y 15.10^{6} U.I. de colimicina.
Se han preparado soluciones de vancomicina, de teicoplanina y de nisina de la misma manera, disolviéndose, respectivamente, 400 mg de teicoplanina, 400 mg de vancomicina y 5 g de nisina recogidos con algunas gotas de ácido clorhídrico con el fin de obtener 200 ml de solución.
En la tabla III siguiente se da una composición de los medios obtenidos para un litro.
TABLA III
3
Los diferentes medios realizados se han distribuido en cápsulas de Petri (diámetro 90 mm, volumen 18 ml) según las prácticas corrientes en bacteriología. Estos medios pueden ser conservados durante doce semanas entre 2 y 8ºC.
Las cepas ensayadas en cultivo proceden de cepas, bien depositadas en la ATCC, o en la colección del Institut Pasteur (CIP), o bien proceden de hospitales (denominados "SDP"). Algunas cepas de estafilococos y de enterococos ensayadas tienen perfiles de resistencia particulares a los antibióticos clásicos contra las bacterias Gram^{+} (éstas cepas son las más representativas dentro de lo posible en el caso presente en medio hospitalario, la concentración mínima inhibidora (CMI) es frecuentemente elevada frente a la vancomicina, teicoplanina y otros antibióticos clásicos). Las cepas son las siguientes: Neisseria meningitidis SDP 2161, Neisseria meningitidis SDP 7612, Neisseria meningitidis ATCC 13077, Neisseria meningitidis Tiron SDP, Neisseria meningitidis ATCC 1913, Neisseria gonorrheae ATCC 1924, Neisseria lactamica SDP186, Neisseria gonorrheae Adelaïde SDP, Neisseria gonorrheae Hauch SDP, Neisseria gonorrheae SDP 345, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus SDP 13/93, Staphylococcus SDP 17/93, Staphylococcus SDP 18/93, Enterococcus SDP 21/93, Enterococcus faecalis ATCC 33186.
Los cultivos bacterianos se siembran según los métodos corrientes en bacteriología. El crecimiento y la inhibición se observan al cabo de 48 horas de incubación bajo atmósfera de CO_{2} a 37ºC.
TABLA IV
4
En la tabla IV anterior los signos - y + al nivel de los diferentes medios, tienen los mismos significados que los que se han dado en el ejemplo 1.
Se señalará que el crecimiento de las bacterias Neisseria no varia en función del medio utilizado. Por el contrario, las bacterias Gram^{+} están poco inhibidas en los medios A y B, mientras que en el medio C, su crecimiento está muy inhibido. Los resultados demuestran que la combinación de los antibióticos según la invención, en el medio C, permite obtener una selectividad mayor que la que se podía esperar por la simple adición de los efectos individuales de los antibióticos. En efecto, las cepas Staphylococcus y Enterococcus que no son totalmente inhibidas por los medios A y B, lo son en su mayor parte sobre el medio C.

Claims (17)

1. Medio selectivo para el cultivo y el aislamiento de bacterias Gram^{-}, que comprende al menos un antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+} y al menos una bacteriocina.
2. Medio según la reivindicación precedente, caracterizado porque el antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+} se elige entre la vancomicina, la teicoplanina o una mezcla de ambas, o antibióticos del grupo de los MLS, y la bacteriocina se elige entre la nisina, la pediocina A o la lacticina.
3. Medio según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la concentración en antibióticos específicamente activos contra las bacterias Gram^{-} está comprendida entre 1 y 10 mg/l y preferentemente es de 2,5 mg/l, y la de la bacteriocina está comprendida entre 10 y 100 mg/l y, preferentemente, entre 50 y 60 mg/l.
4. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende vancomicina y/o teicoplanina y nisina.
5. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende, además, antifúngicos.
6. Medio selectivo para el cultivo y el aislamiento de las bacterias Gram^{-} anaerobias, que comprende al menos un antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+} y al menos una bacteriocina, caracterizado porque comprende, además, un antibiótico específicamente activo contra las bacterias aerobias Gram^{-}.
7. Medio según la reivindicación 6, caracterizado porque el antibiótico específicamente activo contra las bacterias aerobias Gram^{-} se elige entre el ácido nalidíxico o los aminosidos, tales como la canamicina.
8. Medio según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el antibiótico específicamente activo contra las bacterias aerobias Gram^{-} tiene una concentración comprendida entre 5 y 50 mg/l y, preferentemente, de 10 mg/l.
9. Medio selectivo para el cultivo y el aislamiento de Neisseria pathogènes, que comprende al menos un antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+} y al menos una bacteriocina, caracterizado porque comprende, además, una mezcla compuesta por antibióticos activos contra las bacterias Gram^{-} diferentes de la Neisseria y/o antibióticos activos contra los Proteus y/o agentes activos contra las levaduras.
10. Medio según la reivindicación precedente, caracterizado porque contiene colimicina, trimetoprina y anfotericina B.
11. Medio selectivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se trata de un medio líquido a base de agar o de un medio a base de gelosa.
12. Composición bactericida para el cultivo y el aislamiento de bacterias Gram^{-}, que comprende al menos un antibiótico específico contra las bacterias Gram^{+} elegido entre la vancomicina, teicoplanina o una mezcla de ambas, o antibióticos del grupo de los MLS, y al menos una bacteriocina, elegida entre la nisina, la pediocina A o la lacticina.
13. Composición bactericida para el cultivo y el aislamiento de bacterias Gram^{-} anaerobias, que comprende al menos un antibiótico específicamente activo contra las bacterias Gram^{+} elegido entre la vancomicina, la teicoplanina o una mezcla de ambas, o antibióticos del grupo de los MLS, y al menos una bacteriocina, elegida entre la nisina, la pediocina A o la lacticina, caracterizada porque comprende, además, un antibiótico específicamente activo contra las bacterias aerobias Gram^{+}, elegido entre el ácido nalidíxico o los aminosidos, tal como la canamicina.
14. Composición según la reivindicación 12 para el cultivo y el aislamiento de Neisseria pathogènes, caracterizado porque comprende, además, colimicida, trimetoprima y anfotericina.
15. Utilización de una composición según la reivindicación 12 para la fabricación de un medio selectivo de cultivo y de aislamiento de bacterias Gram^{-}.
16. Utilización de la composición según la reivindicación 13 para la fabricación de un medio selectivo de cultivo y de aislamiento de bacterias Gram^{-} anaerobias.
17. Utilización de la composición según la reivindicación 14 para la fabricación de un medio selectivo de cultivo y de aislamiento de Neisseria pathogènes.
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