ES2220973T3 - Vehiculos de cocleato para la administracion de moleculas biologicamente relevantes. - Google Patents

Vehiculos de cocleato para la administracion de moleculas biologicamente relevantes.

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ES2220973T3
ES2220973T3 ES96906334T ES96906334T ES2220973T3 ES 2220973 T3 ES2220973 T3 ES 2220973T3 ES 96906334 T ES96906334 T ES 96906334T ES 96906334 T ES96906334 T ES 96906334T ES 2220973 T3 ES2220973 T3 ES 2220973T3
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Raphael James Mannino
Susan Gould-Fogerite
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Rutgers State University of New Jersey
Albany Medical College
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University of Medicine and Dentistry of New Jersey
Rutgers State University of New Jersey
Albany Medical College
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COCLEATOS QUE COMPRENDEN A) UN COMPONENTE CONSISTENTE EN UNA MOLECULA BIOLOGICAMENTE RELEVANTE, B) UN COMPONENTE CONSISTENTE EN UN LIPIDO CARGADO NEGATIVAMENTE, Y C) UN COMPONENTE CONSISTENTE EN UN CATION DIVALENTE. EL COCLEATO PRESENTA PERIODO DE VALIDEZ PROLONGADO, INCLUSO EN ESTADO DESECADO. DE FORMA VENTAJOSA, EL COCLEATO PUEDE SER INGERIDO. LA MOLECULA BIOLOGICAMENTE RELEVANTE PUEDE SER UN POLINUCLEOTIDO O UN POLIPEPTIDO.

Description

Vehículos de cocleato para la administración de moléculas biológicamente relevantes.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a cocleatos y la utilización de éstos para estabilizar moléculas biológicas, tales como hidratos de carbono, vitaminas, minerales, polinucleótidos, polipéptidos, lípidos y similares para la administración a un animal. Los cocleatos son estructuras de lípido estable insoluble - catión divalente en las que se incorpora la molécula biológica. Como los cocleatos pueden ser biológicamente compatibles, los cocleatos pueden administrarse a los huéspedes mediante vías convencionales y pueden servir para administrar la molécula biológica a un lugar elegido como diana en un huésped.
Antecedentes de la invención
Los cocleatos de lípidos puros (figura 1) se han descrito previamente. Los cocleatos de proteínas o cocleatos de péptidos se han descrito previamente y patentado por los presentes inventores, como estructuras intermedias que pueden transformarse en vesículas de proteína-lípido (proteoliposomas) (figura 2) mediante la adición de agentes quelantes de calcio (véase la patente US nº 4.663.161 y la patente US nº 4.871.488). Las micrografías electrónicas de criofractura de cocleatos de proteínas que contienen glicoproteínas de Sendai, preparadas con el método DC, muestran las estructuras de bicapa líquida enrolladas con una superficie "con desniveles". Los cocleatos de fosfolípidos puros son lisos en ese tipo de preparación.
Se ha demostrado que los proteoliposomas resultantes de los cocleatos de polipéptidos son inmunógenos eficaces si se administran a animales por las vías de inmunización intraperitoneal e intramuscular (G. Goodman-Snitkoff, et al., J. Immunol., vol. 147, pág. 410 (1991); M.D. Miller, et al., J. Exp. Med., vol. 176, pág. 1739 (1992)). Además, cuando las glicoproteínas de Sendai o del virus influenza se reconstituyen mediante ese método, los proteoliposomas son vehículos de administración eficaces para proteínas y ADN encapsulados a animales y células en cultivo (R.J. Mannino y S. Gould-Fogerite, Biotechniques, vol. 6, nº 1, págs. 682-690 (1988); S. Gould-Fogerite et al., Gene, vol. 84, pág. 429 (1989); M.D. Miller, et al., J. Exp. Med., vol. 176, pág. 1739 (1992)).
Sería ventajoso proporcionar un medio para estabilizar o proteger moléculas biológicas en una forma que es estable a temperatura ambiente, puede desecarse y es adecuada para la administración oral. Por ejemplo, sería beneficioso tener una formulación para estabilizar polinucleótidos y que pudiera utilizarse para administrar polinucleótidos a una célula.
Sumario de la invención
Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar medios para estabilizar moléculas biológicas para obtener una formulación con una vida útil en almacenamiento prolongada, que puede prepararse en forma de polvo y que posteriormente puede rehidratarse para obtener una molécula biológicamente activa.
También es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación adecuada para su utilización como un vehículo para administrar una molécula biológicamente activa a un huésped. La formulación puede utilizarse para administrar una molécula biológica en el intestino para su absorción o a un órgano, un tejido o una célula diana.
Una molécula biológica adecuada es un polinucleótido.
Otras moléculas biológicas adecuadas son polipéptidos tales como hormonas y citocinas.
Todavía otras moléculas biológicas adecuadas son compuestos bioactivos tales como fármacos.
Estos y otros objetos se han conseguido proporcionando una formulación de cocleato - molécula biológicamente relevante, que puede administrar una molécula biológicamente relevante a un huésped, que comprende
a) al menos un componente de molécula biológicamente relevante;
b) un componente de lípido cargado negativamente, y
c) un componente de catión divalente,
para su utilización en el tratamiento del cuerpo humano o animal, mediante cirugía, terapia o diagnóstico.
La invención proporciona además la utilización de formulaciones novedosas en la fabricación de una composición para el tratamiento de un animal.
Preferiblemente, la molécula biológicamente relevante se selecciona del grupo que consiste en vitaminas, minerales, aminoácidos, toxinas, microbicidas, microbiostáticos, cofactores, enzimas, polipéptidos, agregados de polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, nucleótidos, almidones, pigmentos, ácidos grasos, hormonas, citocinas, virus, organelas, esteroides y otras estructuras con múltiples anillos, sacáridos, metales, tóxicos metabólicos, proteínas y fármacos.
En una realización particular, la molécula biológicamente relevante es un polinucleótido.
El polinucleótido puede ser uno que se expresa para producir un polipéptido o polinucleótido biológicamente activo. Por tanto, el polipéptido puede servir como un inmunógeno o, por ejemplo, tener actividad enzimática. El polinucleótido puede tener actividad catalítica, por ejemplo, ser una ribozima, o puede servir como un inhibidor de la transcripción o traducción, es decir, ser una molécula antisentido. Si se expresara, el polinucleótido incluiría los elementos reguladores necesarios, tales como un promotor, tal como se conoce en la técnica.
En otra realización particular, la molécula biológicamente relevante es un polipéptido. Un ejemplo específico es un cocleato de insulina.
Las ventajas de los cocleatos son numerosas. Los cocleatos tienen una estructura no acuosa, mientras que no tienen un espacio interno acuoso, y por eso los cocleatos:
a) son más estables que los liposomas porque los lípidos en los cocleatos son menos susceptibles a la oxidación;
b) pueden almacenarse liofilizados, lo que proporciona la posibilidad de ser almacenados durante largos períodos de tiempo a temperaturas ambientales, lo que sería ventajoso para el transporte por todo el mundo y el almacenamiento previos a la administración;
c) mantienen la estructura, incluso después de la liofilización, mientras que las estructuras de los liposomas se destruyen con la liofilización;
d) muestran una incorporación eficaz de moléculas biológicas, particularmente con mitades hidrófobas en la bicapa lipídica de la estructura del cocleato;
e) tienen el potencial para la liberación sostenida o retardada de la molécula biológica in vivo, ya que los cocleatos se desenrollan lentamente o si no, se disocian;
f) tienen una matriz de bicapa lipídica que sirve como un portador y está compuesta por lípidos simples que se encuentran en las membranas celulares de animales y plantas, de manera que los lípidos no son tóxicos, no son inmunogénicos y no son inflamatorios;
(g) contienen una elevada concentración de catión divalente, tal como calcio, un mineral esencial;
(h) son seguros, los cocleatos son formulaciones de subunidades muertas, y como resultado los cocleatos no tienen ninguno de los riesgos asociados con la utilización de vacunas vivas, o con vectores que contienen secuencias de transformación, tales como infecciones potencialmente mortales en individuos inmunocomprometidos o reversión a una infectividad de tipo natural que representa un peligro incluso para las personas sanas;
(i) se producen fácilmente y de manera segura; y
(j) pueden producirse como formulaciones definidas compuestas por cantidades y razones predeterminadas de moléculas biológicamente relevantes, que incluyen polipéptidos, hidratos de carbono y polinucleótidos, tales como ADN.
Las ventajas de la administración oral también son numerosas. La WHO Children's Vaccine Initiative (Iniciativa de Vacunación de Niños de la OMS) ha elegido la vía oral debido a la facilidad de administración. Las vacunas orales son más baratas y más seguras de administrar que las vacunas administradas por vía parenteral (intramuscular o subcutánea). La utilización de agujas se añade al coste y además, desafortunadamente, en la práctica, a menudo las agujas se reutilizan.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de un cocleato de lípido puro.
La figura 2 muestra la estructura de vesículas de polipéptido-lípido con proteínas de membrana integradas.
La figura 3 resume los diferentes procedimientos alternativos para la preparación de los cocleatos.
Las figuras 4(A) y 4(B) muestran los títulos séricos de anticuerpos en ratones tras la administración oral de cocleatos de polipéptido de influenza.
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La figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de la administración oral de cocleatos de polipéptidos cuando se exponen a virus vivos.
La figura 6 es una representación gráfica de los títulos séricos de anticuerpos en ratones tras la administración oral de cocleatos de Sendai.
La figura 7 es un gráfico que representa la inducción de esplenocitos citotóxicos específicos del antígeno tras la administración oral de cocleatos de Sendai.
La figura 8 proporciona una serie de gráficos de barras que representan los niveles séricos de glucosa antes y después de la administración oral de insulina.
Descripción detallada de la invención
Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado ahora y han demostrado que los propios cocleatos pueden utilizarse como medios para estabilizar y administrar moléculas biológicas. Los cocleatos sobreviven al duro entorno ácido del estómago, protegiendo a las moléculas biológicas inmersas en ellos, probablemente en virtud de su estructura de precipitado con múltiples capas única. Es probable que después, células con micropliegues (células epiteliales especializadas del intestino delgado, denominadas células M) atrapen a los cocleatos en el intestino delgado.
Los presentes inventores han demostrado que la administración oral bebiendo los cocleatos que contienen las glicoproteínas y los lípidos víricos de la superficie de los virus influenza o Sendai más fosfatidilserina y colesterol, estimulan tanto la respuesta de los anticuerpos de la mucosa como la de los circulantes. Además, también se generan fuertes respuestas de células cooperadoras (proliferativas) y células citolíticas (citotóxicas). Quizás de la manera más extraordinaria, la administración oral de los cocleatos de influenza protege frente a la exposición intranasal a virus vivos.
Estos resultados son imprevistos por varias razones.
No se sabía y no se esperaba que los cocleatos sobrevivieran al estómago y protegieran a los polipéptidos asociados a ellos del entorno ácido y de las enzimas de degradación. Se sabe que sin la presencia de calcio al menos 3 mM, los cocleatos empiezan a desenrollarse y forman liposomas. Era posible, de hecho probable, que los cocleatos no permanecieran intactos durante el tránsito desde la boca, hacia abajo por el esófago y a través del estómago. Si los cocleatos se hubieran deshecho, habrían sido digeridos como los alimentos.
También era desconocido e imprevisto que, habiendo sobrevivido al estómago, los cocleatos interaccionaran de una manera eficaz con los sistemas inmunológicos mucoso y circulante. Todas las personas ingieren grandes cantidades de proteínas, grasas y azúcares diariamente, que simplemente se digieren y se utilizan como combustible, sin estimular ningún tipo de respuesta inmunológica mucosa o circulante. Por tanto, los cocleatos administran moléculas que conservan actividad biológica en el lugar de administración dentro del huésped.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "respuesta inmunológica" significa bien actividades de anticuerpo, celular, proliferativa o citotóxica, bien la secreción de citocinas.
También, tal como se utiliza en el presente documento, el término "antígeno" pretende indicar el polipéptido al que se dirige una respuesta inmunológica o un polinucleótido que puede expresarse y que codifica para ese polipéptido.
"Polinucleótido" incluye ADN o ARN, así como moléculas antisentido y enzimáticamente activas. Por tanto, la molécula biológicamente relevante puede ser el propio polinucleótido, el transcrito del mismo o el polipéptido traducido para el que codifica de ese modo.
"Polipéptido" es cualquier oligómero o polímero de aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser L-aminoácidos o D-aminoácidos.
Una "molécula biológicamente relevante" es una que desempeña un papel en los procesos vitales de un organismo vivo. La molécula puede ser orgánica o inorgánica, un monómero o un polímero, endógena para un organismo huésped o no, existir naturalmente o sintetizarse in vitro y similares. Por tanto, los ejemplos incluyen vitaminas, minerales, aminoácidos, toxinas, microbicidas, microbiostáticos, cofactores, enzimas, polipéptidos, agregados de polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, nucleótidos, almidones, pigmentos, ácidos grasos, hormonas, citocinas, virus, organelas, esteroides y otras estructuras de múltiples anillos, sacáridos, metales, tóxicos metabólicos, fármacos y similares.
La presente invención también puede practicarse utilizando células completas distintas a las entidades replicativas subcelulares, tales como virus y viroides. Por tanto pueden mezclarse, bacterias, levaduras, líneas celulares, virus y similares con la disolución lipídica pertinente, que se hace precipitar para producir estructuras en las que las células y similares estén fijas dentro de la estructura del cocleato.
Los polipéptidos son moléculas adecuadas para incorporarse a los cocleatos. El procedimiento para preparar los cocleatos se expone con mayor detalle posteriormente en el presente documento. El polipéptido se suspende en un tampón acuoso adecuado. Los lípidos se secan para formar una película delgada. Después, el tampón acuoso se añade a la película lipídica. El recipiente se agita en vórtex y después la muestra se dializa frente a un tampón que contiene cationes.
De esa manera, por ejemplo, pueden obtenerse cocleatos que portan insulina. Los cocleatos de insulina se prepararon con disolución de 1 mg/ml de insulina, pero pueden utilizarse otras concentraciones iniciales diversas de insulina para obtener los cocleatos cargados con concentraciones variables de insulina.
Estudios recientes indican que la inyección directa de plásmidos de ADN puede conllevar la expresión de las proteínas para las que codifican esos plásmidos, lo que tiene como resultado respuestas inmunológicas humoral y mediada por células, véase, por ejemplo, Wang et al., Proc. Natl Acad. Sci. 90: 4156-4160 (1993); Zhu et al., Science 261: 209-211 (1993). Esos estudios indican que las vacunas de ADN podrían proporcionar una alternativa segura y eficaz para la vacunación humana. Esos estudios también sugieren que las vacunas de ADN podrían beneficiarse de sistemas de administración sencillos y más eficaces.
La utilización de lípidos para facilitar la administración, entrada y expresión del ADN en las células animales está bien documentado, véase, por ejemplo, Philip et al., Mol. Cell Biol. 14: 2411-2418 (1994). En efecto, actualmente, los complejos ADN-lípido forman la base de varios protocolos de terapia génica en seres humanos.
Como los cocleatos son estructuras estables que pueden resistir una variedad de condiciones fisiológicas, los cocleatos son medios adecuados para administrar moléculas biológicas, tales como, polipéptidos o polinucleótidos, en un lugar seleccionado en un huésped. El polipéptido o polinucleótido se incorpora a la estructura del cocleato y es integral a ella. Por tanto, el polipéptido o polinucleótido, que puede ser necesario expresar, está protegido de las proteasas y nucleasas de degradación.
Los cocleatos utilizados en la presente invención pueden prepararse mediante métodos conocidos tales como los descritos en la patente US nº 4.663.161, presentada el 22 de abril de 1985, la patente US nº 4.871.488, presentada el 13 de abril de 1987, S. Gould-Fogerite et al., Analytical Biochemistry, vol. 148, págs. 15-25 (1985); S. Gould-Fogerite et al., Advances in Membrane Biochemistry and Bioenergetics, editado por Kim, C.H., Tedeschi, T., Diwan, J.J., y Salerno, J.C., Plenum Press, Nueva York, páginas 569-586 (1988); S. Gould-Fogerite et al., Gene, vol. 84, págs. 429-438 (1989); Liposome Technology, 2ª edición, vol. I, Liposome Preparation and Related Techniques, vol. II, Entrapment of Drugs and Other Materials y vol. III, Interactions of Liposomes with the Biological Milieu, todos editados por Gregory Gregoriadis (CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Londres, Tokio), capítulo 4, págs. 69-80, capítulo 10, págs. 167-184 y capítulo 17, págs. 261-276 (1993); y R. J. Mannino y S. Gould-Fogerite,Liposome Mediated Gene Transfer, Biotechniques, vol. 6, nº 1 (1988), págs. 682-690.
El polinucleótido puede ser uno que exprese un polipéptido, es decir, polipéptidos de membrana de patógenos, polipéptidos de células atípicas o aberrantes, polipéptidos víricos y similares, que se conocen o que son dianas adecuadas para el reconocimiento del sistema inmunológico del huésped en el desarrollo de la inmunidad frente a éste.
El polinucleótido puede expresar un polipéptido que es biológicamente activo, tal como una enzima o una proteína estructural o de mantenimiento.
El polinucleótido también puede ser uno que no se expresa necesariamente como un polipéptido, pero sin embargo ejerce un efecto biológico. Son ejemplos las moléculas y ARN antisentido con actividad catalítica. Por tanto, durante la transcripción, la secuencia expresada puede producir un ARN que es complementario a un mensaje que, si se inactiva, invalidaría un fenotipo no deseado, o producir un ARN que reconoce secuencias específicas de ácidos nucleicos y escinde las mismas en ese lugar o cerca de él, y de nuevo, la no expresión del cual invalidaría un fenotipo no deseado.
El polinucleótido no necesita expresarse, pero puede utilizarse como tal. Por tanto, el polinucleótido puede ser una molécula antisentido o una ribozima. El polinucleótido también puede ser un inmunógeno.
Por tanto, para los polinucleótidos, la secuencia de codificación relevante se subclona corriente abajo a partir de un promotor adecuado, otras secuencias reguladoras pueden incorporarse según se necesite, en un vector que se expande en un huésped apropiado, poniendo en práctica métodos y utilizando materiales conocidos y disponibles en la técnica.
Por ejemplo, dos plásmidos, pDOLHIVenv (AIDS Research and Reference Reagent Program, catálogo de enero de 1991, pág. 113; Freed et al. J. Virol. 63: 4670 (1989)) y pCMVHIVLenv (Dr. Eric Freed, Laboratory of Molecular Immunology, NJAID, NIH) son plásmidos de expresión adecuados para su utilización en los cocleatos de polinucleótidos.
Los plásmidos contienen los marcos de lectura abiertos para las regiones que codifican para env, tat y rev del VIH-1 (cepa LAV).
pDOLHIVenv se construyó introduciendo el fragmento SaII-XhoI del clon molecular infeccioso de longitud completa pNL4-3 en el lugar SaII del vector del retrovirus, pDOL (Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2150 (1987)). La expresión es de las LTR (repeticiones terminales largas) del virus murino Moloney.
pCMVHIVLenv se construyó clonando el mismo fragmento SaII-XhoI en el lugar XhoI del vector de expresión p763 basado en el citomegalovirus (CMV).
El polinucleótido puede configurarse para codificar para múltiples epítopos o epítopos conjugados con un péptido inmunogénico conocido para mejorar el reconocimiento del sistema inmunológico, particularmente si un epítopo tiene un tamaño de sólo unos pocos aminoácidos.
Para formar precipitados de cocleato, una gran parte del lípido presente debe cargarse negativamente. Puede utilizarse un tipo de lípido o puede utilizarse una mezcla de lípidos. Generalmente se han utilizado fosfatidilserina o fosfatidilglicerol. El fosfatidilinositol también forma un precipitado que se transforma en liposomas en contacto con EDTA. Sin embargo, una proporción considerable del lípido puede ser neutra o estar cargada positivamente. Los presentes inventores han incluido hasta el 40% en moles de colesterol basado en el lípido total presente y habitualmente preparan cocleatos de polipéptido-lípido o polinucleótido-lípido que contienen el 10% en moles de colesterol y el 20% de lípidos de membrana vírica. También puede incorporarse en los cocleatos fosfatidiletanolamina, pura o reticulada con polipéptidos.
Mientras pueda utilizarse un lípido cargado negativamente, se prefiere un fosfolípido cargado negativamente y de éstos, los más preferidos son fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico y fosfatidilglicerol.
Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cuánto lípido debe cargarse negativamente al preparar una mezcla con concentraciones conocidas de lípidos negativos y no negativos y mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, determinar si se forman precipitados.
Se conocen varios procedimientos para preparar los cocleatos según la presente invención y éstos se esquematizan en la figura 3.
Un procedimiento adecuado para preparar cocleatos es uno en el que un lípido cargado negativamente tal como fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico o fosfatidilglicerol en ausencia o presencia de colesterol (hasta 3:1, preferiblemente 9:1 en p/p) se utilizan para producir una suspensión de vesículas lipídicas multilamelares que contienen o están rodeadas por una molécula biológicamente relevante (polipéptido, polisacárido o polinucleótido, tal como ADN) que se transforman en pequeñas vesículas lipidoproteicas unilamelares mediante sonicación bajo nitrógeno. Alternativamente, para evitar el daño, la molécula biológicamente relevante puede añadirse a la disolución después de la sonicación. Las vesículas se dializan a temperatura ambiente frente a un catión divalente tamponado, por ejemplo, cloruro de calcio, lo que da como resultado la formación de un precipitado insoluble que puede presentarse en una forma denominada cilindro de cocleato. Después de la centrifugación, el tampón puede atrapar el sedimento resultante para producir la disolución de cocleato utilizada en la presente invención.
En una realización alternativa y preferida, para preparar los cocleatos, se utiliza una cantidad de lípido cargado negativamente, por ejemplo fosfatidilserina y colesterol, en las mismas proporciones que anteriormente e iguales a desde aproximadamente 1 hasta 10 veces el peso, preferiblemente iguales a 4 veces el peso de los lípidos víricos u otros adicionales. A la disolución se le añade bien un polipéptido, un mineral, una vitamina, un hidrato de carbono o un polinucleótido, tal como ADN. Esa disolución se dializa después frente a un catión divalente tamponado, por ejemplo cloruro de calcio, para producir un precipitado que puede denominarse un cocleato DC (de diálisis de calcio directa).
Se ha desarrollado un método adicional relacionado para reconstituir cocleatos y se denomina el método LC (liposomas antes que cocleatos). Las etapas iniciales que implican la adición de polipéptido, polisacárido, polinucleótido, tal como ADN, extraídos o combinaciones de éstos, a un lípido cargado negativamente y colesterol secados, son las mismas que para el método de DC. Sin embargo, a continuación se dializa la disolución frente a un tampón (por ejemplo, TES 2 mM, L-histidina 2 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) para formar pequeños liposomas que contienen el polipéptido, polinucleótido, tal como ADN, y/o polisacárido. Un catión divalente, por ejemplo calcio, se añade después bien directamente o bien mediante diálisis para formar un precipitado que puede consistir en cocleatos.
En los procedimientos anteriores para preparar cocleatos según la presente invención, el catión divalente puede ser cualquier catión divalente que puede inducir la formación de un cocleato u otras estructuras lípido insoluble-antígeno. Ejemplos de cationes divalentes adecuados incluyen Ca^{2+}, Mg^{2+}, Ba^{2+} y Zn^{2+} u otros elementos que pueden formar iones divalentes u otras estructuras que tienen múltiples cargas positivas que pueden quelar y puentear lípidos cargados negativamente.
Los cocleatos preparados con diferentes cationes tienen diferentes estructuras y se transforman en liposomas a diferentes velocidades. Debido a esas diferencias estructurales, la velocidad de liberación de las moléculas biológicamente relevantes contenidas con ellas varía. Por consiguiente, combinando cocleatos preparados con diferentes cationes, pueden obtenerse formulaciones que liberarán la molécula biológicamente relevante durante un período de tiempo prolongado.
La cantidad de molécula biológicamente relevante incorporada en los cocleatos varía. Generalmente, debido a las propiedades ventajosas de los cocleatos, pueden utilizarse cantidades menores de molécula biológicamente relevante para conseguir el mismo resultado final comparado con la utilización de medios de administración conocidos.
Un experto puede determinar sin demasiada experimentación la razón óptima de lípido: molécula biológicamente relevante para los fines elegidos como objetivo. Se configuran varias razones y se monitoriza visualmente el progreso de la precipitación de cada muestra mediante microscopio de contraste de fases. La precipitación para formar, por ejemplo, cocleatos, se monitoriza fácilmente. Después, los precipitados pueden administrarse al huésped elegido como diana para establecer la naturaleza y el tenor de la respuesta biológica frente a los cocleatos administrados.
Debería ser evidente que la razón optimizada para cualquier utilización puede oscilar desde una razón elevada, por ejemplo, para minimizar la utilización de una molécula biológicamente relevante poco común, hasta una razón baja para obtener una cantidad máxima de molécula biológicamente relevante en los cocleatos.
Los cocleatos pueden liofilizarse y almacenarse a temperatura ambiente indefinidamente o pueden almacenarse en un tampón que contiene catión divalente a 4ºC durante al menos seis meses.
Las formulaciones de cocleato también pueden prepararse tanto con como sin moléculas fusogénicas, tales como polipéptidos de la cubierta del virus Sendai. Estudios anteriores con proteoliposomas han demostrado que la administración citoplasmática del contenido de los liposomas requiere una bicapa fusogénica de liposomas. El papel exacto de los polipéptidos de la cubierta del virus Sendai para facilitar la respuesta inmunológica frente a los cocleatos de polipéptidos sigue sin estar claro.
Se prefiere usar cocleatos sin moléculas fusogénicas antes que cocleatos con moléculas fusogénicas porque una estructura más sencilla y la facilidad de preparación favorecen el uso en seres humanos.
Como los polinucleótidos son moléculas hidrófilas y los cocleatos son moléculas hidrófobas que no contienen un espacio acuoso interno, sorprende que los polinucleótidos puedan integrarse en los cocleatos. Los polinucleótidos no se exponen sobre la superficie de los cocleatos porque los polinucleótidos son resistentes a las nucleasas.
En el caso de los cocleatos de polinucleótidos, las consideraciones sobre la dosificación son análogas a las metodologías habituales en cuanto a las vacunas, tal como se conoce en la técnica. Además, están disponibles métodos para utilizar polinucleótidos en liposomas y el "ADN desnudo" para servir como nivel inicial para determinar empíricamente un régimen de dosificación adecuado, poniendo en práctica métodos conocidos.
Por ejemplo, un esquema adecuado para determinar la dosificación es tal como sigue.
La dosis inicial de polinucleótidos en cocleatos administrados mediante inyección a animales se selecciona para que sea de aproximadamente 50 \mug, aunque se sabe que tan sólo 2 \mug de plásmidos probados es eficaz. Esta dosis se propone para maximizar la probabilidad de observar una respuesta positiva tras una administración única de un cocleato. Cualquier formulación que no desencadene una respuesta a esa dosis debe considerarse ineficaz, pero mantenerse para su estudio adicional.
Es deseable desarrollar formulaciones que puedan administrarse fácilmente y de manera no invasiva. Por tanto, la administración v.o. (por vía oral) de los cocleatos se elegirá como diana y se probarán inicialmente dosis superiores (100 \mug/animal y 200 \mug/animal). Sin embargo, para las vías parenterales se requieren dosis inferiores.
Después, se utilizarán dosis graduadas para desarrollar una curva de dosis-respuesta para cada formulación. Por tanto, los cocleatos que contienen 50 \mug, 10 \mug, 2 \mug, 0,4 \mug y 0 \mug de polinucleótidos/animal se inocularán con al menos 10 animales por grupo.
La respuesta inmunológica o la actividad enzimática son respuestas que se monitorizan fácilmente cuando se requiere la expresión del polinucleótido. La alteración del fenotipo es otra respuesta para seguir la pista de la eficacia de las moléculas antisentido o tipo ribozima. En el caso de la monitorización del sistema inmunológico, la proliferación de células T, la presencia de CTL (linfocitos T citotóxicos) y anticuerpos en lugares específicos del cuerpo puede evaluarse, utilizando métodos conocidos, para valorar el estado de la respuesta inmunológica específica.
Para determinar la duración de la actividad de las formulaciones de cocleato, se monitorizan periódicamente, durante un máximo de un año o más, los grupos que han respondido a una inmunización única para determinar la vida media de un cocleato al administrarlo.
Los animales que no pueden desarrollar una respuesta detectable con la primera exposición pueden inocularse de nuevo (refuerzo) para poder llegar a comprender la capacidad de las formulaciones de dosis bajas para preparar el sistema inmunológico frente a una estimulación posterior.
Las formulaciones farmacéuticas pueden ser en forma sólida incluyendo comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos y gránulos en dosis unitarias o a granel o en forma líquida incluyendo disoluciones, emulsiones fluidas, suspensiones fluidas, semisólidos y similares. Además del principio activo, la formulación debería comprender diluyentes, portadores, productos de carga, aglutinantes, emulsionantes, tensioactivos, vehículos solubles en agua, tampones, solubilizantes y conservantes adecuados y reconocidos en la técnica.
Una ventaja de los cocleatos es la estabilidad de la composición. Por tanto, los cocleatos pueden administrarse por vía oral, tópica o mediante instilación sin problemas, así como mediante las vías más tradicionales, tales como la subcutánea, intradérmica, intramuscular y similares. La aplicación directa sobre las superficies mucosas es un medio de administración atractivo que se hace posible con los cocleatos.
El experto puede determinar el medio más eficaz y terapéutico para llevar a cabo el tratamiento poniendo en práctica la presente invención. También puede hacerse referencia a cualquiera de las numerosas autoridades y referencias incluyendo, por ejemplo, "Goodman & Gilman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics" (6ª edición, Goodman, et al., editores, MacMillan Publ. Co., Nueva York, 1980).
Los cocleatos de la presente invención pueden utilizarse como un medio para transfectar células con una eficacia mayor que cuando se usan los medios de administración conocidos en la actualidad, tales como los liposomas. Por tanto, los cocleatos de polinucleótidos de la presente invención proporcionan un medio de administración superior para las diferentes vías de terapia génica, Mulligan, Science 260: 926-931 (1993). Tal como indicó Mulligan, las múltiples posibilidades de tratar una enfermedad mediante métodos basados en los genes aumentarán con los métodos mejorados de administración de genes.
Los cocleatos de la presente invención también sirven como medio excelente para administrar otras moléculas biológicamente relevantes a un huésped. Tales moléculas biológicamente relevantes incluyen nutrientes, vitaminas, cofactores, enzimas y similares. Como la molécula biológicamente relevante está contenida dentro del cocleato, en un entorno no acuoso, la molécula biológicamente relevante está esencialmente estabilizada y protegida. Tal como se describió anteriormente en el presente documento, la molécula biológicamente relevante se añade a la disolución lipídica y se trata para formar una estructura precipitada que comprende un lípido y una molécula biológicamente relevante. Tal como se demostró en el presente documento, las moléculas hidrófilas pueden "coclearse", es decir, puede hacerse que formen parte de la estructura del cocleato, con poca dificultad.
Las moléculas biológicamente relevantes lipófilas, adecuadas, tales como fármacos y otros compuestos terapéuticos, también pueden conducirse a cocleación. Por ejemplo, los fármacos lipófilos tales como ciclosporina, ivermectina y anfotericina se coclean fácilmente.
Ahora se describirá la presente invención por medio de ejemplos específicos que no están pensados para limitar la invención.
Ejemplo 1
Se adquirió fosfatidilserina de cerebro bovino en cloroformo de Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, en ampollas de vidrio y se almacenó bajo nitrógeno a - 20ºC. De Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, se obtuvieron colesterol (hígado porcino) de calidad I, \beta-D-octil-glucopiranósido (OCG), isotiocianato de fluoresceína (FITC) - dextrano (peso molecular promedio de 67.000), metrizamida de calidad I y productos químicos para tampones y determinaciones de proteínas y fosfato. Se adquirieron disolventes orgánicos de Fisher Scientific Co., Fairlawn, New Jersey. Los reactivos para la electroforesis en gel de poliacrilamida eran de Bioad Laboratories, Richmond, California. S1000 Sephacryl Superfine se obtuvo de Pharmacia, Piscataway, New Jersey. Los tubos de centrífuga de policarbonato con paredes gruesas (10 ml de capacidad) de Beckman Instruments, Palo Alto, California, se utilizaron para las preparaciones, lavados y gradientes de las vesículas. Un equipo de sonicación ("sonicator") tipo baño, modelo G112SP1G, de Laboratory Supplies Company, Hicksville, Nueva York se usó para las sonicaciones.
El virus se hizo crecer y se purificó esencialmente tal como lo describen M.C. Hsu et al., Virology, vol. 95, pág. 476 (1979). Los virus Sendai (parainfluenza tipo I) e influenza (A/PR8/34) se propagaron en el saco alantoideo de huevos de gallina embrionados de 10 u 11 días. Los huevos se inocularon con 1-100 dosis infecciosas por huevo (10^{3} a 10^{5} partículas víricas determinadas mediante el título HA) en 0,1 ml de suero salino tamponado con fosfato (KCl 0,2 gm/l, KH_{2}PO_{4}0,2 g/l, NaCl 8,0 g/l, Na_{2}H-PO_{4} 1,14 g/l, CaCl_{2} 0,1 g/l, MgCl_{2}6H_{2}O 0,1 g/l (pH 7,2)). Los huevos se incubaron a 37ºC durante de 48 a 72 horas, seguido de una incubación a 4ºC durante de 24 a 48 horas. El líquido alantoideo se recogió y clarificó a 2.000 rpm durante 20 minutos a 5ºC en una centrífuga Damon IEC/PR-J. El sobrenadante se centrifugó después a 13.000 rpm durante 60 minutos. Esta y las todas las centrifugaciones posteriores se realizaron en una centrífuga Sorvall RC2-B a 5ºC utilizando un rotor GG. Los sedimentos se suspendieron de nuevo en suero salino tamponado con fosfato (pH 7,2) mediante agitación en vórtex y sonicación, seguido de centrifugación a 5.000 rpm durante 20 minutos. El sedimento se suspendió de nuevo mediante agitación en vórtex y sonicación, dilución y centrifugación de nuevo a 5.000 rpm durante 20 minutos. Los dos sobrenadantes de 5.000 rpm se combinaron y centrifugaron a 13.000 rpm durante 60 minutos. Los sedimentos resultantes se suspendieron de nuevo en suero salino tamponado con fosfato mediante agitación en vórtex y sonicación, se separaron en alícuotas y se almacenaron a - 70ºC. Se utilizaron una técnica y materiales estériles en toda la inoculación, el aislamiento y la purificación víricas.
El virus almacenado a - 70ºC se descongeló, se transfirió a tubos de policarbonato de paredes gruesas estériles y se diluyeron con tampón A (TES 2 mM, L-histidina 2 mM, NaCl 100 mM (pH 7,4)). Se hizo sedimentar el virus a 30.000 rpm durante 1 hora a 5ºC en un rotor Beckman TY65. El sobrenadante se retiró y el sedimento se suspendió de nuevo hasta una concentración de 2 mg de proteína vírica por ml de tampón de extracción (EB) (NaCl 2 M, tampón fosfato de sodio 0,02 M (pH 7,4)) mediante agitación en vórtex y sonicación. Después se añadió el detergente no iónico \beta-D-octil-glucopiranósido hasta una concentración del 2% (p/v). La suspensión se mezcló, se sonicó durante 5 segundos y se colocó en un baño de agua a 37ºC durante 45 minutos. En los tiempos de incubación de 15, 30 y 45 minutos, la suspensión se retiró brevemente para mezclar y sonicar. Las nucleocápsides sedimentaron mediante centrifugación a 30.000 rpm durante 45 minutos en un rotor TY65. El sobrenadante claro resultante se retiró y se utilizó en la formación de cocleatos que contenían glucoproteína vírica. Puede ser necesario emplear algunas modificaciones del procedimiento anterior con otras proteínas de membrana. Tales modificaciones son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.
Ejemplo 2 A. Cocleatos DC
Se mezcló una cantidad de fosfatidilserina y colesterol (razón en peso 9:1) en tampón de extracción y detergente no iónico, tal como se describió anteriormente en el presente documento, con una concentración preseleccionada de polinucleótido y se agitó la disolución en vórtex durante 5 minutos. La disolución clara, incolora que resultó se dializó a temperatura ambiente frente a tres cambios (mínimo 4 horas por cambio) de tampón A (TES ácido N-tris[hidroximetil]-metil-2-aminoetanosulfónico 2 mM, L-histidina 2 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4, también identificado como tampón TES) que contenía CaCl_{2} 3 mM. La diálisis final habitualmente utilizada es Ca^{2+} 6 mM, aunque Ca^{2+} 3 mM es suficiente y otras concentraciones pueden ser compatibles con la formación de cocleatos. La razón entre el dializado y el tampón para cada cambio fue como mínimo de 1:100. Los precipitados resultantes de calcio - fosfolípido, blancos se han denominado cocleatos DC. Cuando se examinan mediante microscopio óptico (x 1000, contraste de fases, aceite), la suspensión contiene numerosas estructuras particuladas de hasta varias micras de diámetro, así como estructuras de tipo aguja.
B. Cocleatos LC
Se mezcló una cantidad de fosfatidilserina y colesterol (razón en peso 9:1) en tampón de extracción y detergente no iónico, tal como se describió anteriormente en el presente documento, con una concentración preseleccionada de polinucleótido y se agitó la disolución en vórtex durante 5 minutos. Primero se dializó la disolución durante la noche utilizando una razón máxima de 1:200 (v/v) entre dializado y tampón A sin cationes divalentes, seguido de tres cambios adicionales de tampón que llevan a la formación de pequeñas vesículas lipidoproteicas. Las vesículas se transformaron en un precipitado de cocleato, bien mediante la adición directa de iones de Ca^{2+}, bien mediante diálisis frente a dos cambios de tampón A que contenía iones Ca^{2+} 3 mM, seguido de uno que contenía tampón A con Ca^{2+} 6 mM.
Ejemplo 3 Respuestas inmunológicas a vacunas de cocleato de proteínas administradas por vía oral
Para preparar la vacuna, se hizo crecer y se purificó virus influenza, y se extrajeron y aislaron las glucoproteínas y los lípidos tal como se describe en el ejemplo 1. Los cocleatos de proteínas se prepararon según el procedimiento de "cocleato LC" descrito anteriormente.
Las vacunas de cocleato que contenían las glucoproteínas y los lípidos de la cubierta del virus influenza y fosfatidilserina y colesterol se dieron a ratones administrando gradualmente 0,1 ml de líquido en la boca y dejando que los tragaran cómodamente. Las figuras 4(A) (del experimento A) y 4(B) (del experimento B) muestran los niveles totales resultantes de anticuerpo circulante específico para las glucoproteínas de influenza, determinados mediante ELISA. El título de anticuerpos se define como la mayor dilución que sigue dando la densidad óptima del control negativo.
En el experimento A, que generó los datos mostrados en la figura 4(A), las dosis iniciales de vacuna de 50, 25, 12,5 ó 6,25 \mug de glucoproteínas (grupos 1 a 4, respectivamente) se administraron en las semanas 0 y 3. La tercera y la cuarta inmunizaciones (semanas 6 y 19) fueron con una cuarta parte de la dosis utilizada para las dos inmunizaciones iniciales. Las sangría 1 - sangría 6 tuvieron lugar en las semanas 0, 3, 6, 19 y 21. Los datos demuestran que pueden conseguirse títulos elevados de anticuerpo circulante bebiendo simplemente vacunas de cocleato que contienen glucoproteínas víricas. La respuesta puede reforzarse, aumentando con la administración repetida, y está relacionada directamente con la cantidad de glucoproteína de la vacuna.
Estas observaciones se confirmaron y ampliaron en el experimento B, que generó los datos mostrados en la figura 4(B). El intervalo de dosis se amplió para incluir dosis iniciales de 100 \mug y 3,1 \mug. La vacuna se administró en las semanas 0, 3 y 15, siendo la tercera inmunización una cuarta parte de las dosis de las dos iniciales. De la sangría 1 a la sangría 6 tuvieron lugar en las semanas 0, 3, 6, 15 y 16. Las respuestas específicas a la glucoproteína de influenza circulante pudieron detectarse después de una administración única para las cinco dosis superiores, y para todos los grupos después de dos cargas. Los datos mostrados son para los sueros reunidos de cada grupo, pero habiendo administrado a todos los ratones las cuatro dosis más altas, y cuatro de cinco ratones en los grupos cinco y seis respondieron a la vacuna con títulos de anticuerpo circulante que oscilaron desde 100 hasta 102.400. El grupo siete, que no recibió ninguna vacuna, tuvo títulos inferiores a 50 para todos los ratones en todos los puntos de tiempo.
La respuesta de anticuerpos tiene una vida larga. Los títulos a las 13 semanas después de la tercera inmunización (figura 4(A), sangría 5) y a las 12 semanas después de la segunda inmunización (figura 4(B), sangría 4) permanecieron iguales o en el intervalo de una dilución más o menos que los observados a las 3 semanas después del refuerzo anterior.
Para determinar si la administración oral de la vacuna subunitaria descrita en el ejemplo 2 podría conducir a la inmunidad protectora en las vías respiratorias, se inmunizaron los ratones descritos en el experimento B del ejemplo 2 con cocleatos en las semanas 0, 3 y 15. Los ratones inmunizados se expusieron mediante aplicación intranasal de 2,5 x 10^{9} partículas de virus influenza a las 16 semanas. Tres días después de la exposición vírica, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron los pulmones y la tráquea. Todo el pulmón o la tráquea se trituraron y sonicaron, y se inyectaron alícuotas en huevos de gallina embrionados para que se produjera la amplificación de cualquier virus presente. Después de tres días a 37ºC, se obtuvo el líquido alantoideo de los huevos individuales y se realizaron los títulos de hemaglutinación (HA).
En el experimento A del ejemplo 2, los ratones también se expusieron a influenza vivo por vía intranasal, después de la administración oral de cocleato. Se obtuvieron los pulmones tres días después y se cultivaron para detectar la presencia de virus.
Los datos combinados de los dos experimentos se ofrecen en la tabla 1. Los resultados también se muestran gráficamente en la figura 5.
TABLA 1
Dosis de vacuna \mug Tráquea^{1} nº de Pulmones^{2}nº de Pulmones^{3}nº de
de proteína infectados / total infectados / total infectados / total
100 0/5 0/5 0/5
50 2/5 0/5 2/10
25 0/5 0/5 1/10
125 1/5 0/5 1/10
6,25 0/5 5/5 6/10
3,12 4/5 5/5 5/5
0 5/5 5/5 9/10
1. Ratones del experimento B.
2. Ratones del experimento B.
3. Ratones de los experimentos A y B.
Los datos de la tabla 1 muestran que los cinco ratones no vacunados tenían suficiente virus en la tráquea para infectar los huevos de gallina embrionados (más de 10^{3} partículas por tráquea o al menos una dosis infecciosa por huevo (EID) por 0,1 ml de suspensión). En contraposición, la vacuna oral proporcionó un alto grado de protección frente a la replicación vírica en la tráquea. Todos los ratones de los grupos 1, 3 y 5 del experimento B fueron negativos para el virus. Dos ratones en el grupo 2, 1 en el grupo 4 y 4 en el grupo 6 (la dosis de vacuna más baja) del experimento B tenían suficiente virus para dar positivo en este ensayo muy sensible utilizado para detectar la presencia de virus.
La vacuna oral de cocleato de proteínas también proporcionó protección frente a la replicación vírica en los pulmones. Los veinte ratones que recibieron las cuatro dosis más elevadas de vacuna fueron negativos para el virus cuando se cultivaron suspensiones de los pulmones en huevos de gallina embrionados (tabla 1). Todos los ratones de los grupos inmunizados con 6,25 \mug y 3,1 \mug de glucoproteínas y todos los ratones en el control no vacunado fueron positivos para el virus.
Incluso en las dosis de vacuna más bajas, hubo cierta inhibición de la replicación vírica. Cuando se diluyeron a 1/10 las suspensiones de los pulmones y se inocularon en los huevos, sólo un animal en los grupos inmunizados con 6,25 \mug fue positivo, comparado con tres en los grupos inmunizados con 3,12 \mug y tres en el control no vacunado. El cultivo de diluciones 1/100 dio como resultado un animal positivo en cada uno de los grupos inmunizados con 6,25 y 3,12 \mug, pero 3 de 5 permanecieron positivos en el grupo no vacunado. Además, para los dos animales del grupo que fue inmunizado con 3,12 \mug, pero que eran negativos a 1/100, sólo el 50% de los huevos se infectaron a 1/10 y tenían títulos HA bajos. En contraposición, para el grupo no vacunado, todos los huevos se infectaron y produjeron cantidades máximas de virus con diluciones 1/10 y 1/100.
A ratones C57BL/6 se les administró cocleatos que contenían glucoproteínas del virus Sendai, por vía oral, en las semanas 0 y 3. Se les hizo una sangría en las semanas 0 (sangría 1), 3 (sangría 2) y 6 (sangría 3). El grupo 1 recibió aproximadamente 50 \mug de proteínas, el grupo 2 aproximadamente 25 \mug, el grupo 3 aproximadamente 12,5 \mug, el grupo 4 aproximadamente 6,25 \mug y el grupo 5 (control negativo) recibió 0 \mug de proteínas. Los niveles de anticuerpos específicos para Sendai en el suero reunido de 5 ratones en cada grupo de dosis se determinaron mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 6. Puede observarse que se generaron fuertes respuestas de anticuerpos, que la magnitud de la respuesta estaba relacionada directamente con la dosis de inmunización y que la magnitud de la respuesta aumentó (se reforzó) después de una segunda inmunización.
La respuesta tuvo una vida extremadamente larga. La respuesta es predominantemente de IgG, lo que indica la implicación en la ayuda a las células T y el establecimiento de células de memoria a largo plazo asociadas con una respuesta inmunológica secundaria. Sorprendentemente, la dosis más baja que inicialmente tenía la respuesta más baja, ahora tenía los niveles más elevados de anticuerpos circulantes. Esto puede deberse a la regulación por disminución del sistema inmunológico de respuestas muy altas originalmente pero dejando que las respuestas bajas vayan aumentando lentamente. Esto también puede indicar una persistencia y una liberación retardada del antígeno. También es interesante y coherente con el uso de la vía oral de inmunización que se generen y mantengan títulos significativos de IgA.
Se administró por vía oral una dosis de 50 \mug de proteína de cocleatos que contenían glucoproteínas de Sendai. Dos semanas más tarde, se sacrificó el animal (ratón BALB/c) y se obtuvieron células del bazo. La actividad citolítica de las células del bazo se midió mediante su capacidad para provocar la liberación de cromo-51 de células diana presentadoras de antígenos Sendai. El ratón no inmunizado no mató las células pulsadas con virus Sendai (SV) con una nueva estimulación en cultivo (N/SV/SV) ni las células presentadoras no pulsadas con Sendai (N/N/N) (figura 7). En contraposición, los ratones inmunizados con cocleatos de Sendai mataron las dianas pulsadas con SV hasta un grado muy elevado y las dianas no pulsadas hasta un grado menor. La actividad citolítica es crucial para la eliminación de las células infectadas con virus, o parásitos intracelulares o para las células cancerosas. Es altamente deseable inducir esta actividad a una vacuna, pero clásicamente no se ha observado con la mayoría de las vacunas muertas. Es una característica importante de las vacunas de cocleato de proteínas.
Ejemplo 4
Se inmunizaron por vía i.m. (intramuscular) ratones hembra BALB/c de ocho semanas con varias formulaciones de cocleato de polinucleótidos, polinucleótido solo y controles y después, se probó la capacidad de los esplenocitos de los ratones para proliferar en respuesta a una proteína para la que codifica el polinucleótido.
Los cocleatos con o sin proteínas fusogénicas de virus Sendai se prepararon tal como se describió anteriormente en el presente documento. El polinucleótido utilizado fue el plásmido pCMVHIVLenv. La disolución que contenía lípido y proteínas de la cubierta del virus Sendai extraídas, tal como se describió anteriormente en el presente documento, y el polinucleótido se mezclaron en una razón de 10:1 (p/p) y una razón de 50:1 (p/p). Ese protocolo dio como resultado cuatro grupos, cocleato / ADN, 10:1; cocleato / ADN, 50:1; cocleato de SV / ADN, 10:1; y cocleato de SV / ADN, 50:1. Se utilizó ADN desnudo en una tasa de 10 \mug/ratón y 50 \mug/ratón. El control era tampón solo. Se inmunizó dos veces a los ratones, con 15 días de separación con 50 \mul/ratón.
Se obtuvieron los esplenocitos y se probaron en un ensayo de proliferación de células T utilizando timidina tritiada, tan como se conoce en la técnica. Los cultivos control no contenían antígeno ni con A. El antígeno utilizado fue péptido p18, a 1 \muM, 3 \muM y 6 \muM. Las células se recogieron en los días 2, 4 y 6 después de la preparación de los cultivos de esplenocitos.
El ADN desnudo proporcionó una respuesta marginal por encima del nivel de fondo. Las cuatro preparaciones de cocleatos produjeron una respuesta específica para p18 que aumentó con el tiempo. A los seis días, la respuesta era aproximadamente cuatro veces el nivel de fondo.
El intervalo de la concentración de ADN en la razón 10:1 fue de aproximadamente 120-170 \mug/ml. En la razón 50:1 (p/p), la concentración de ADN fue de aproximadamente 25-35 \mug/ml.
Los cocleatos de polinucleótidos se expusieron a nucleasa microcócica y no se observó degradación de los ácidos nucleicos o poca.
Se encontró que la eficacia de encapsulación de polinucleótidos era aproximadamente del 50% basado en la cuantificación del ADN libre del lípido, que está presente en el sobrenadante después de una reacción de precipitación. Después de lavar el precipitado y abrir las estructuras eliminando el catión, se recuperó aproximadamente el 35% del ADN.
Ejemplo 5
De una forma similar, se probó la actividad citotóxica específica de antígeno de esplenocitos de animales, inmunizados tal como se describe en el ejemplo 4, utilizando un ensayo de liberación de cromo utilizando células diana compatibles conocidas por expresar una proteína del VIH, tal como gp160, marcadas con H-2. Las células respondedoras pueden estimularse mediante una exposición breve a péptidos de VIH purificados.
En la preestimulación, los animales expuestos a los cocleatos de polinucleótidos demostraron esplenocitos citotóxicos específicos dirigidos contra gp160, con cerca del 100% de la citotoxicidad observada en una razón de efector:diana de 100.
Ejemplo 6
Se añadieron quince mg de insulina a 15 ml de tampón de extracción (EB) en un tubo de plástico de 50 ml. Después, se añadieron 300 mg de OCG a la mezcla. La suspensión resultante era coloidal y no era clara a un pH de 7,4. La disolución se ajustó con NaOH 1 N a un pH de 8,5, resultando una disolución clara.
En un recipiente separado, se mezclaron 6,8 ml de una disolución de 10 mg/ml de fosfatidilserina y 1,5 ml de una disolución de 5 mg/ml de colesterol y después se secaron hasta producirse una película delgada. La disolución de insulina se añadió al recipiente dando una suspensión coloidal. La suspensión se agitó en vórtex durante siete minutos y después se puso sobre hielo durante una hora. Se ajustó el pH de la disolución a 9-9,5 con NaOH 1 N, la muestra se esterilizó mediante filtración y se colocó en tubos de diálisis con aproximadamente 2 ml por bolsa.
Se utilizaron dos programas diferentes de diálisis.
1
2
Tras la diálisis, se encontró que el precipitado resultante comprendía numerosos cocleatos.
Ejemplo 7
Se administró por vía oral muestras de cocleatos de insulina a ratones. Los niveles séricos de glucosa se midieron a tiempo 0 (antes de la administración de cocleatos), a los 30 minutos y a los 60 minutos después de la administración utilizando métodos habituales. Se utilizaron las formulaciones de cocleato del ejemplo 6 con una concentración inicial de 1 mg de insulina/ml de disolución. A cada ratón se le administraron 100 ul o 200 ul de las preparaciones designadas tal como se ha indicado. Para comparar, se administró a un ratón la insulina humana comercial habitual, Humulin R, mediante administración intraperitoneal.
3
La administración oral de insulina afectó los niveles séricos de glucosa.
Ejemplo 8
Se administraron por vía oral cocleatos de insulina, producidos tal como en el ejemplo 6, a ratones hembra BALB/c de tres meses que se habían hecho diabéticos mediante la inyección intraperitoneal de estreptozotocina, poniendo en práctica métodos conocidos. Dos días después de la exposición a estreptozotocina, los ratones se asignaron a grupos de cinco y se les administró cocleatos orales de insulina a 200 \rhol por ratón. A otros ratones se les inyectaron 2 U.I. de Humulin R.
Se obtuvieron muestras séricas a tiempo 0, antes de la dosificación de insulina, y dos horas después de la administración de insulina. Se midieron los niveles de glucosa utilizando un kit de Sigma (St. Louis). Los animales control no se trataron, es decir, no recibieron ni estreptozotocina ni insulina. Los datos representativos se exponen en la figura 8. La insulina administrada por vía oral simplemente bebiendo, fue eficaz para reducir la glucemia. No se observó ninguna disminución de la glucemia en los animales control.
Aunque la invención se ha descrito en detalle y con referencia a realizaciones específicas de la misma, para un experto en la técnica será evidente que pueden realizarse varios cambios y modificaciones en ella sin alejarse del alcance de la misma.

Claims (19)

  1. \global\parskip0.900000\baselineskip
    1. Formulación de cocleato de molécula biológicamente relevante, que puede administrar una molécula biológicamente relevante a un huésped, que comprende:
    a)
    por lo menos un componente de molécula biológicamente relevante;
    b)
    un componente de lípido cargado negativamente, y
    c)
    un componente de catión divalente,
    para su utilización en el tratamiento del cuerpo humano o animal, mediante cirugía, terapia o diagnóstico.
  2. 2. Formulación de cocleato según la reivindicación 1, en la que dicho componente de molécula biológicamente relevante se selecciona de entre el grupo que consiste en vitaminas, minerales, aminoácidos, toxinas, microbicidas, microbiostáticos, cofactores, enzimas, polipéptidos, agregados de polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, nucleótidos, almidones, pigmentos, ácidos grasos, hormonas, citocinas, virus, organelas, esteroides y otras estructuras con múltiples anillos, sacáridos, metales, tóxicos metabólicos, proteínas y fármacos.
  3. 3. Formulación de cocleato según la reivindicación 2, en la que dicho componente de molécula biológicamente relevante es un polinucleótido, que es preferiblemente un ácido desoxirribonucleico.
  4. 4. Formulación de cocleato según la reivindicación 3, en la que dicho polinucleótido es ácido desoxirribonucleico que se transcribe para producir un ácido ribonucleico.
  5. 5. Formulación de cocleato según la reivindicación 4, en la que dicho ácido ribonucleico se traduce para producir un polipéptido.
  6. 6. Formulación de cocleato según la reivindicación 3, en la que dicho polinucleótido es un ácido ribonucleico catalítico.
  7. 7. Formulación de cocleato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho componente de lípido cargado negativamente es un fosfolípido, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol y ácido fosfatídico.
  8. 8. Formulación de cocleato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el componente de catión divalente es un compuesto catiónico que puede quelar y complejar lípidos cargados negativamente.
  9. 9. Formulación de cocleato según la reivindicación 8, en la que el componente de catión divalente se selecciona del grupo que consiste en Ca++, Mg++, Ba++ y Zn++, preferentemente Ca++.
  10. 10. Formulación de cocleato según la reivindicación 2, en la que dicho componente de molécula biológicamente relevante es un componente de polinucleótido y es una molécula antisentido.
  11. 11. Formulación de cocleato según la reivindicación 3, en la que el ácido desoxirribonucleico es un plásmido.
  12. 12. Formulación de cocleato según la reivindicación 2, en la que dicho componente de molécula biológicamente relevante es una hormona, preferiblemente insulina.
  13. 13. Formulación de cocleato según la reivindicación 2, en la que dicho componente de molécula biológicamente relevante es un mineral.
  14. 14. Formulación de cocleato según la reivindicación 2, en la que dicho componente de molécula biológicamente relevante es un fármaco lipófilo.
  15. 15. Formulación de cocleato según la reivindicación 14, en la que el fármaco lipófilo se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina, ivermectina y amfotericina.
  16. 16. Utilización de una formulación de cocleato, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la fabricación de una composición para el tratamiento del cuerpo humano o animal, mediante cirugía, terapia o diagnóstico.
  17. 17. Utilización según la reivindicación 16, en la que la composición va a administrarse en el ser humano o animal por vía tópica.
  18. 18. Utilización según la reivindicación 16, en la que la composición va a administrarse en el ser humano o animal en las superficies mucosas, preferentemente por vía oral.
  19. 19. Utilización según la reivindicación 16, en la que la composición va a administrarse en el ser humano o animal por vía subcutánea, intramuscular e intradérmica.
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