ES2242954T3 - Vacuna genetica para el virus de la inmunodeficiencia. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN ACERCAMIENTO A LA METODOLOGIA DE VACUNA QUE SE BASA EN UNA VACUNA GENETICA PARA UN VIRUS. UNA CONSTRUCCION GENETICA QUE CODIFICA DETERMINANTES ANTIGENICOS DEL VIRUS ES TRANSFECTA EN CELULAS DE LOS INDIVIDUOS VACUNADOS DE MANERA A EXPRESAR LOS ANTIGENOS VIRALES EN CELULAS SANAS PARA PRODUCIR UNA RESPUESTA INMUNE A ESTOS ANTIGENOS. EL METODO ES PARTICULARMENTE VENTAJOSO PARA EL VIRUS VIH.

Description

Vacuna genética para el virus de la inmunodeficiencia.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo general de las vacunas genéticas y se relaciona, en particular, con vacunas genéticas para virus de la inmunodeficiencia.

Antecedentes de la invención

La vacunación de individuos para hacer que los individuos vacunados se hagan resistentes al desarrollo de una enfermedad infecciosa es una de las formas más antiguas de cuidado preventivo en medicina. Previamente, las vacunas para patógenos víricos y bacterianos para uso pediátrico, en adultos y veterinario derivaban directamente de los organismos infecciosos y podían categorizarse como dentro de una de tres amplias categorías: vacunas vivas atenuadas, muertas y subunitarias. Aunque las tres categorías de vacunas difieren significativamente en su desarrollo y su modo de acción, la administración de cualquiera de estas tres categorías de estas vacunas pretende dar como resultado la producción de una respuesta inmunológica específica al patógeno después de una o más inoculaciones de la vacuna. La respuesta inmunológica resultante puede o no inmunizar por completo al individuo frente a una posterior infección, pero normalmente prevendrá la manifestación de síntomas de enfermedad y limitará significativamente el grado de cualquier infección posterior.

Las técnicas de la moderna biología molecular han permitido desarrollar una variedad de nuevas estrategias vacunales que están en diversas fases de desarrollo preclínico y clínico. El objetivo de estos esfuerzos es no sólo producir nuevas vacunas para enfermedades antiguas, sino también producir nuevas vacunas para enfermedades infecciosas en las cuales las estrategias clásicas de desarrollo de vacunas no han demostrado tener éxito hasta la fecha. Notablemente, la reciente identificación y propagación de virus de la inmunodeficiencia es un ejemplo de un patógeno para el cual las estrategias clásicas del desarrollo de vacunas no han dado un control efectivo hasta la fecha.

La primera amplia categoría de vacuna clásica son las vacunas vivas atenuadas. Una vacuna viva atenuada representa una cepa específica del virus o bacteria patógena, que ha sido alterada para perder su patogenicidad, pero no su capacidad para infectar y replicarse en humanos. Las vacunas vivas atenuadas son consideradas como la forma más efectiva de vacuna, ya que establecen una verdadera infección en el individuo. El patógeno que se replica y su infección de células humanas estimulan los compartimentos tanto humorales como celulares del sistema inmune, así como la memoria inmunológica de larga duración. Así, las vacunas vivas atenuadas para infecciones víricas y bacterianas intracelulares estimulan la producción de anticuerpos neutralizantes, estimulando así mismo la producción de linfocitos T citotóxicos ("CTL"), normalmente después de tan sólo una única inoculación. Se cree que la capacidad de las vacunas vivas atenuadas para estimular la producción de CTL es una razón importante para la efectividad comparativa de las vacunas atenuadas. Los CTL son reconocidos como el principal componente del sistema inmune responsable del aclaramiento real de las infecciones víricas y bacterianas intracelulares. Los CTL son activados por la producción de proteínas extrañas en células infectadas individuales de los hospedadores, procesando las células infectadas el antígeno y presentando los determinantes antigénicos específicos de la superficie celular para el reconocimiento inmunológico. La inducción de inmunidad CTL por vacunas atenuadas es debida al establecimiento de una infección real, aunque limitada, en las células huésped, incluyendo la producción de antígenos extraños en las células infectadas individuales. El proceso de vacunación resultante de una vacuna viva atenuada da también lugar a la inducción de memoria inmunológica, que se manifiesta en la pronta expansión de clones de CTL específicos y de células plasmáticas productoras de anticuerpos en el caso de una futura exposición a una forma patogénica del agente infeccioso, dando como resultado el rápido aclaramiento de esta infección y la protección práctica frente a la
enfermedad.

Un importante inconveniente de las vacunas vivas atenuadas es que tienen una tendencia inherente a revertir a un nuevo fenotipo virulento a través de mutación genética aleatoria. Aunque estadísticamente dicha reversión es un fenómeno raro para vacunas víricas atenuadas de uso común hoy en día, dichas vacunas son administradas a tan gran escala que son inevitables reversiones ocasionales y existen casos documentados de enfermedades inducidas por vacunas. Además, a veces se observan complicaciones cuando las vacunas atenuadas conducen al establecimiento de infecciones diseminadas debido a un estado reducido de competencia del sistema inmunitario en el receptor de la vacuna. Otras limitaciones sobre el desarrollo de vacunas atenuadas son que puede ser difícil identificar cepas atenuadas apropiadas para algunos patógenos y que la frecuencia de cambios mutagénicos para algunos patógenos puede ser tan grande que el riesgo asociado a la reversión es simplemente inaceptable. Un virus para el que este último punto está particularmente bien ejemplificado es el virus de la inmunodeficiencia humana ("HIV"), en donde la falta de un modelo animal apropiado, así como el conocimiento incompleto de su mecanismo patogénico, hacen que la identificación y el estudio de cepas de virus mutantes atenuadas sea imposible de un modo efectivo. Incluso aunque se pudieran identificar dichos mutantes, la rápida velocidad de cambios genéticos y la tendencia de los retrovirus, tales como el HIV, a recombinarse darían lugar probablemente a un nivel inaceptable de inestabilidad en cualquier fenotipo atenuado del virus. Debido a estas complicaciones, la producción de una vacuna viva atenuada para ciertos virus puede no ser aceptable, incluso aunque esta aproximación produzca eficazmente la inmunidad celular citotóxica y la memoria inmunológica deseadas.

La segunda categoría de vacunas consiste en vacunas muertas y subunitarias. Estas vacunas consisten en bacterias o virus completos inactivados o en sus componentes purificados. Estas vacunas derivan de virus o bacterias patógenos que han sido inactivados por un procesamiento físico o químico y se formula como vacuna o bien el patógeno microbiano completo o un componente purificado del patógeno. Se puede hacer que vacunas de esta categoría sean relativamente seguras por el proceso de inactivación, pero existe una relación entre el grado de inactivación y el grado de reacción del sistema inmune inducida en el paciente vacunado. Una inactivación excesiva puede dar lugar a cambios extensos en la conformación de determinantes inmunológicos, de tal forma que las respuestas inmunes posteriores al producto no sean protectoras. Esto resulta mejor ejemplificado por evaluación clínica de las vacunas de virus del sarampión y del virus sincitial respiratorio inactivadas del pasado, que dieron lugar a fuertes respuestas de anticuerpos que no sólo no consiguieron neutralizar los viriones infecciosos, sino que exacerbaron la enfermedad por exposición al virus infeccioso. En el otro extremo, si se mantienen los procedimientos inactivados en un mínimo para conservar la inmunogenicidad, existe un riesgo significativo de incorporación de material infeccioso en la formulación vacunal.

La principal ventaja de las vacunas muertas o subunitarias es que pueden inducir un título significativo de anticuerpos neutralizantes en el individuo vacunado. Las vacunas muertas son generalmente más inmunogénicas que las vacunas subunitarias, en el sentido de que provocan respuestas a múltiples sitios antigénicos sobre el patógeno. Las vacunas de virus muertos o subunitarias requieren de forma rutinaria múltiples inoculaciones para conseguir las respuestas de imprimación y de refuerzo apropiadas, pero la inmunidad resultante puede ser de larga duración. Estas vacunas son particularmente efectivas en la prevención de la enfermedad causada por bacterias productoras de toxinas, donde el modo de protección es un título significativo de anticuerpo neutralizante de la toxina. La respuesta de anticuerpos puede durar durante un período significativo o producir un rápido efecto de rebote con una infección posterior, debido a una respuesta anamnésica o secundaria. Por otra parte, estas vacunas generalmente no consiguen producir una respuesta inmune celular citotóxica, lo que hace que sean menos que ideales para prevenir la enfermedad vírica. Dado que los linfocitos citotóxicos son el vehículo primario para la eliminación de las infecciones víricas, cualquier estrategia vacunal que no pueda estimular la inmunidad celular citotóxica es normalmente la metodología menos preferida para una enfermedad vírica, dando así lugar a que un virus atenuado sea la metodología habitual de elección.

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha hecho ahora posible usar la producción heteróloga de cualquier proteína, de un patógeno microbiano o vírico o de una parte del mismo, como vacuna. Los constituyentes de la vacuna, por lo tanto, no necesitan derivar del propio organismo patógeno real. En teoría, por ejemplo, se pueden producir glicoproteínas de la superficie vírica en sistemas de expresión eucarióticos en su conformación nativa para una inmunogenicidad apropiada. Sin embargo, en la práctica, los constituyentes proteicos víricos recombinantes no provocan respuestas de anticuerpos protectoras de una manera universal. Además, como con las vacunas muertas, generalmente no se observan respuestas inmunes citotóxicas celulares tras inoculación con una proteína subunitaria recombinante. Por lo tanto, mientras que esta estrategia vacunal ofrece un modo efectivo de producción de grandes cantidades de una proteína vírica o bacteriana segura y potencialmente inmunogénica, dichas vacunas son capaces de producir sólo respuestas de anticuerpos en suero y por ello pueden no ser la mejor elección para proporcionar protección contra la enfermedad vírica.

La disponibilidad de la tecnología del ADN recombinante y los desarrollos en inmunología han llevado al mapa fino inmunológico de los determinantes antigénicos de diversos antígenos microbianos. Es ahora teóricamente posible, por lo tanto, desarrollar vacunas químicamente sintetizables basadas en péptidos cortos en donde cada péptido representa un epitopo o determinante distinto. Se han realizado progresos en la identificación de determinantes de células T "helper", que son instrumentales en dirigir las respuestas inmunes de células B o de anticuerpos. La unión covalente de un péptido de célula helper a un péptido que representa un epitopo de célula B, o sitio de unión a anticuerpo, puede aumentar dramáticamente la inmunogenicidad del epitopo de la célula B. Desafortunadamente, muchos sitios de unión a anticuerpos naturales sobre virus son conformacionalmente dependientes, o están compuestos por más de una cadena peptídica, de tal forma que la estructura del epitopo sobre el virus intacto se hace difícil de imitar con un péptido sintético. Así, las vacunas peptídicas no parecen ser el mejor vehículo para la estimulación de anticuerpos neutralizantes para patógenos víricos. Por otra parte, existe alguna evidencia preliminar de que péptidos que representan los determinantes reconocidos por linfocitos T citotóxicos pueden inducir CTL si se dirigen a las membranas de células portadoras de antígenos de histocompatibilidad mayor ("MHC") de clase I mediante copulación a un resto lipofílico. Estas vacunas peptídicas experimentales parecen seguras y baratas, pero tienen alguna dificultad en imitar las estructuras tridimensionales complejas de las proteínas, aunque existe alguna evidencia de que se puede conseguir que provoquen inmunidad citotóxica en animales experimentales.

Otra nueva técnica recombinante que se ha propuesto para vacunas es crear vacunas recombinantes vivas que representan virus no patógenos, tales como el virus de la vaccinia o el adenovirus, en donde se ha substituido un segmento del genoma vírico por un gen codificante de un antígeno vírico de un virus patógeno heterólogo. La investigación ha indicado que la infección de animales experimentales con dicho virus recombinante conduce a la producción de una variedad de proteínas víricas, incluyendo la proteína heteróloga. El resultado final es normalmente una respuesta inmune celular citotóxica a la proteína heteróloga causada por su producción tras la inoculación. Con frecuencia, también se observa una respuesta de anticuerpos detectable. Los virus recombinantes vivos son, por lo tanto, similares a los virus atenuados en su modo de acción y dan lugar a respuestas inmunes, pero no exhiben la tendencia a revertir a un fenotipo más virulento. Por otra parte, la estrategia no está libre del inconveniente de que el virus de la vaccinia y el adenovirus, aun no siendo patógenos, pueden aún inducir infecciones patógenas con una baja frecuencia. Por lo tanto, no estaría indicada para uso en individuos inmunocomprometidos, debido a la posibilidad de una infección
diseminada catastrófica. Además, la capacidad de estas vacunas para inducir inmunidad a una proteína heteróloga puede verse comprometida por una inmunidad pre-existente al vehículo vírico, impidiendo así una infección eficaz con el virus recombinante e impidiendo de este modo la producción de la proteína heteróloga.

Resumiendo, todas las estrategias vacunales antes descritas poseen ventajas únicas y desventajas que limitan su utilidad frente a diversos agentes infecciosos. Varias estrategias emplean antígenos no replicantes. Aunque se pueden usar estas estrategias para la inducción de anticuerpos séricos que pueden ser neutralizantes, dichas vacunas requieren múltiples inoculaciones y no producen inmunidad citotóxica. Para la enfermedad vírica, se considera a los virus atenuados como los más efectivos, debido a su capacidad para producir una potente inmunidad citotóxica y memoria inmunológica duradera. Sin embargo, no se pueden desarrollar vacunas atenuadas seguras para todos los patógenos víricos.

Es, por lo tanto, deseable desarrollar vacunas que sean capaces de producir inmunidad citotóxica y memoria inmunológica, así como la producción de anticuerpos circulantes, sin presentar ningún riesgo inaceptable de patogenicidad o mutación o recombinación del virus en el individuo vacunado.

Resumen de la invención

La presente invención se resume en que se usa una construcción vacunal genética derivada del virus de la inmunodeficiencia humana ("HIV") para fabricar un medicamento para la vacunación de un animal contra el HIV por un método de vacunación genética, que incluye las etapas de preparación de copias de una construcción genética extraña que incluye un promotor operativo en células del animal y una región codificante de proteína que codifica para un determinante producido por el virus, depositar las copias de la construcción genética extraña sobre partículas de soporte de pequeño tamaño en relación al tamaño de las células del animal y acelerar las partículas de soporte revestidas hacia el interior de las células del animal in vivo.

La presente invención se resume también en que se crea una vacuna genética para HIV uniendo una secuencia de ADN codificante de todos los marcos abiertos de lectura del genoma vírico, pero no las largas repeticiones terminales o el sitio de unión a cebadores, a un promotor efectivo en células humanas para hacer una vacuna genética y transducir luego la vacuna genética a células de un individuo por un proceso de transfección mediada por partículas.

Es una característica de la presente invención el ser adoptada igualmente para administración epidérmica o mucosal de la vacuna genética o administración a células de sangre periférica y, por lo tanto, puede ser usada para inducir una respuesta de anticuerpos en suero, así como mucosal, en el individuo tratado.

Es una ventaja del método de vacunación genética de la presente invención el ser inherentemente segura, no ser dolorosa de administrar y no deber dar lugar a consecuencias adversas para los individuos vacunados.

Otros objetos, ventajas y características de la presente invención serán evidentes gracias a la siguiente descripción.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un mapa de plásmidos, que muestra genes y sitios de restricción, del plásmido pWRG1602.

La Fig. 2 es un mapa de plásmidos del plásmido de vacuna genética pCHIVpAL.

La Fig. 3 es una ilustración gráfica de algunos de los resultados de uno de los ejemplos que se darán a continuación.

La Fig. 4 es una ilustración gráfica de los resultados de otro de los ejemplos que se darán a continuación.

Descripción de la realización preferida

La presente invención pretende crear vacunas genéticas para los virus de la inmunodeficiencia por transfección de células somáticas en el animal que ha de ser inmunizado con una secuencia génica capaz de provocar la expresión en las células del animal de las proteínas antigénicamente correctas del virus patógeno, no incluyendo la secuencia génica elementos del genoma vírico necesarios para la replicación vírica o la patogénesis. La introducción de dicha construcción de vacuna genética en células somáticas animales pretende imitar las acciones de virus atenuados o vivos recombinantes sin riesgos de infección patógena en individuos sanos o inmunocomprometidos. La introducción de la vacuna genética hará que se expresen en esas células los determinantes proteicos estructurales asociados a la partícula vírica. Las proteínas estructurales procesadas se exhibirán sobre la superficie celular de las células transfectadas conjuntamente con los antígenos del complejo de histocompatibilidad mayor ("MHC") de la célula normal. La exhibición de estos determinantes víricos antigénicos en asociación con los antígenos del MHC pretende provocar la proliferación de clones de células T citotóxicas específicas para los determinantes víricos. Más aún, las proteínas estructurales liberadas por las células transfectadas expresantes pueden ser también recogidas por células presentadoras de antígeno para disparar respuestas de anticuerpos. La construcción de vacuna genética capaz de provocar esta respuesta inmune es preferiblemente administrada a las células transfectadas por medio de un sistema de transformación de partículas aceleradas.

Por diversas razones, la aproximación de la vacuna genética de la presente invención es utilizada de una forma particularmente ventajosa para la vacunación contra virus de la inmunodeficiencia, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana ("HIV") y virus animales relacionados, virus de la inmunodeficiencia de simios ("SIV") y virus de la inmunodeficiencia felina ("FIV"). El virus HIV no se presta a aproximaciones de vacunas atenuadas debido a la inherente posibilidad de reversión de formas mutadas de este virus. Aunque se están desarrollando vacunas subunitarias proteicas víricas para estos virus, dichas vacunas subunitarias no pueden producir una respuesta citotóxica, que puede ser necesaria para prevenir el establecimiento de la infección por HIV o de la enfermedad relacionada con el HIV. El uso de una estrategia de transfección de vacunas genéticas como se describe aquí activaría una respuesta citotóxica. Esta aproximación vacunal también permite la administración a tejidos mucosales que pueden ayudar a conferir resistencia a la introducción del virus, que, con el HIV, se cree que a veces se produce a través de membranas mucosales.

Con objeto de conseguir la respuesta inmune celular buscada en el proceso de vacunación de la presente invención, se debe crear una construcción de vacuna genética que sea capaz de hacer que las células transfectadas del individuo vacunado expresen los determinantes antigénicos mayores del virus. Se puede hacer esto identificando las regiones codificantes para las diversas proteínas codificadas por el genoma del virus, creando una secuencia codificante sintética para cada una de dichas proteínas y uniendo cada una de dichas secuencias codificantes a promotores capaces de expresar las secuencias en células de mamífero. Alternativamente, se puede utilizar el propio genoma vírico. Para un retrovirus, se puede preparar la secuencia codificante a partir de la forma de ADN del genoma vírico, el provirus, siempre que el clon del provirus haya sido alterado para eliminar de él las secuencias necesarias para la replicación vírica en los procesos infecciosos, tales como las repeticiones terminales largas y el sitio de unión a cebadores. Dicho clon provírico tendría de forma inherente las secuencias procesadoras de ARNm necesarias para causar la expresión de todas las proteínas estructurales víricas en células transfectadas.

Se debe alterar el material genético vírico para evitar que comience el proceso patogénico. El método de alteración del virus variará de un virus a otro. El virus de la inmunodeficiencia es un retrovirus portador del material genético en forma de ARN. Durante el proceso de infección normal, el ARN es procesado por una enzima, a la que se hace referencia como transcriptasa inversa, que convierte la secuencia de ARN del virus en una forma de ADN, conocida como provirus. El provirus para el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) tiene hasta una docena de marcos abiertos de lectura, todos los cuales son traducidos para producir proteínas durante el proceso infeccioso. Algunas de las proteínas son estructurales y otras son reguladoras para etapas del proceso infeccioso. Cuando esto sucede, todas las proteínas producidas a partir del provirus son realmente producidas a partir de un solo precursor de ARNm, que se ayusta de forma diferencial para producir una variedad de productos de ARN diferentemente ayustados, los cuales son traducidos a las diversas proteínas expresadas por el virus. Ventajosamente, sería útil si la célula transfectada utilizada en el proceso de vacunación de la presente invención expresara todas las proteínas estructurales víricas posibles. Por consiguiente, sería deseable usar tanto provirus como fuera posible como secuencia codificante de la vacuna genética para esta vacuna genética, suponiendo sólo que se eliminan suficientes porciones del provirus como para hacerlo incapaz de iniciar una fase de replicación vírica en un individuo vacunado.

Una estrategia conveniente para conseguir este objetivo con los virus HIV o SIV se basa en el hecho de que los virus infecciosos tienen importantes elementos genéticos necesarios para la replicación del genoma vírico, conocidos como los elementos de las repeticiones terminales largas ("LTR") y el sitio de unión a cebadores y que se localizan en los extremos de la secuencia nativa del provirus. El sitio de unión a cebadores es el sitio sobre el ARN vírico en donde un ARNt reconoce el ARN vírico y se une a él para servir como cebador para la iniciación del proceso de transcripción inversa. Tanto los elementos LTR como el sitio de unión a cebadores son necesarios para permitir que se produzca la transcripción inversa. La eliminación de los LTR o del sitio de unión a cebadores impediría la replicación vírica. La eliminación tanto de los LTR como del sitio de unión a cebadores del provirus de ADN asegura que la secuencia genética así creada sea incapaz de provocar replicación vírica o codificación de partículas víricas patógenas.

Así, se prefiere el uso de regiones codificantes víricas intactas para proteínas estructurales y reguladoras para la presente invención, tanto por razones de un montaje de vacunas genéticas conveniente como para asegurar la correcta producción de tantas proteínas víricas como sea posible para imitar con efectividad una infección natural. Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable y suficiente expresar sólo una o unas cuantas proteínas víricas sin producir el conjunto completo de proteínas víricas. Se puede hacer esto montando un vector de expresión individual para cada proteína vírica deseada usando técnicas recombinantes estándar.

Para expresar apropiadamente la secuencia genética vírica en células transfectadas, se necesita una secuencia promotora operable en las células diana. Se conocen varios de tales promotores para sistemas de mamíferos que pueden unirse 5' o secuencia arriba de la secuencia codificante para la proteína que se ha de expresar. También se puede añadir un finalizador de la transcripción secuencia abajo, o secuencia de poliadenilación, 3' a la secuencia codificante de la proteína.

Con objeto de ser efectiva como vacuna genética, se requiere un método para administrar la secuencia genética codificante de las proteínas víricas a las células del individuo que se quiere inmunizar. Existen varias técnicas mediante las cuales se pueden administrar genes a las células somáticas de mamíferos que padecen de enfermedad vírica de inmunodeficiencia. Como técnicas conocidas, se incluyen la inyección directa de ADN, el uso de vectores retrovíricos para administrar secuencias genéticas a células somáticas o la administración de ADN en liposomas u otros agentes de encapsulación que puedan dirigir la administración del ADN encapsulado hacia uno o más tipos celulares de un individuo susceptible. Sin embargo, se prefiere para la presente invención transferir el ADN al individuo susceptible por medio de un dispositivo de transferencia de genes por partículas aceleradas. Esta técnica de administración de genes por partículas aceleradas se basa en la deposición de construcciones genéticas que han de ser administradas a células sobre partículas de soporte extremadamente pequeñas, que están diseñadas para ser pequeñas en relación a las células que quiere transformar, de tal forma que las partículas de soporte se alojan en el interior de las células diana. Esta técnica puede ser empleada con células in vitro o in vivo. Con alguna frecuencia, el ADN que ha sido previamente depositado sobre las partículas de soporte se expresa en las células diana. Esta técnica de expresión génica ha demostrado funcionar en procariontes y eucariontes, desde bacterias y levaduras hasta plantas y animales superiores. Así, el método de partículas aceleradas proporciona una metodología conveniente para administrar genes a las células de una amplia variedad de tipos de tejidos y ofrece la capacidad de administrar esos genes a células in situ e in vivo sin ningún impacto o efecto adverso sobre el individuo tratado.

La aproximación general de la tecnología de transformación génica por partículas aceleradas está descrita en la Patente EE.UU. Nº 4.945.050 de Sanford. Se puede obtener comercialmente un instrumento basado en una variante mejorada de esa aproximación de Biorad Laboratories. Se describe una aproximación alternativa a un aparato de transformación de partículas aceleradas en la Patente EE.UU. Nº 5.015.580, que, aun estando dirigida a la transformación de plantas de soja, describe un aparato que es igualmente adaptable para uso con células de mamífero y mamíferos enteros intactos.

También se contempla específicamente que se pueden administrar gotitas acuosas que contengan ADN desnudo, incluyendo ahí la vacuna genética vírica, por técnicas de aceleración adecuadas a los tejidos del individuo que se quiere vacunar. Con alguna frecuencia, dicho ADN "desnudo" será captado en los tejidos tratados.

El término transfectadas es aquí usado para hacer referencia a células que han incorporado la construcción de vacuna genética extraña administrada, cualquiera que sea la técnica de administración empleada. El término transfección es usado con preferencia al término transformación para evitar la ambigüedad inherente a este último término, que también se usa para referirse a cambios celulares en el proceso de la oncogénesis.

Con el dispositivo de partículas aceleradas, se puede administrar una vacuna genética de un modo no invasivo a una variedad de tipos tisulares susceptibles para conseguir la respuesta antigénica deseada en el individuo. Más convenientemente, la vacuna genética puede ser introducida en la epidermis. Dicha administración, según se ha visto, producirá una respuesta inmune humoral sistémica y probablemente también estimulará una respuesta inmune citotóxica. Para obtener una efectividad adicional de esta técnica, puede ser también deseable administrar los genes a una superficie de tejido mucosal para asegurarse de que se produzca una respuesta antigénica mucosal, así como sistémica en el individuo vacunado. Se contempla que hay una variedad de sitios de administración adecuados disponibles, incluyendo cualquier número de sitios sobre la epidermis, las células de sangre periférica, es decir, los linfocitos, que podrían ser tratadas in vitro y devueltas al individuo, y una variedad de superficies de la mucosa oral, del tracto respiratorio superior y genital.

La adecuación de los vectores de expresión de la vacuna para el virus de la inmunodeficiencia que se han de transfectar a células por procesos de transfección de partículas aceleradas puede ser valorada estudiando la producción antigénica vírica en células de mamífero in vitro. Se pueden transfectar células de mamífero susceptibles de un tipo celular que pueda mantenerse en cultivo, tales como células COS de mono, in vitro por cualquiera de una serie de técnicas de transfección celular, incluyendo la transfección mediada por fosfato de calcio, así como la transfección por partículas aceleradas. Una vez se introduce el vector de expresión de la vacuna genética en las células susceptibles, se puede entonces monitorizar la expresión de los antígenos víricos en sobrenadantes de medio del cultivo de dichas células por una variedad de técnicas, incluyendo el ELISA, el Western blotting o el ensayo de la transcriptasa
inversa.

Tras confirmar que un determinado vector de expresión es efectivo en la inducción de la producción de las proteínas víricas apropiadas en células cultivadas in vitro, se puede demostrar entonces que dicho vector sirve para inducir una producción proteica similar en un modelo de pequeños animales, tales como el ratón. La medición de las respuestas inmunes de anticuerpos y celulares citotóxicas en ratones en respuesta a dicha vacuna genética sería una importante demostración del concepto y justificaría el inicio de pruebas más rigurosas en un modelo de inoculación animal apropiado.

Una vez se ha determinado que la vacuna genética es capaz de inducir la producción de proteínas víricas y de respuestas inmunes en pequeños animales de laboratorio, resulta entonces necesario determinar la dosificación y el calendario adecuados para producir respuestas inmunes significativas en un modelo animal para la enfermedad de la inmunodeficiencia humana. Se puede hacer esto de un modo más efectivo usando el SIV y el modelo del macaco rhesus. Los animales recibirían varias dosis de las construcciones de expresión por técnicas de transfección de partículas aceleradas en una variedad de sitios tisulares. Los sitios tisulares tratados incluirían, aunque sin limitación, la epidermis, la dermis (a través de la epidermis), la cavidad oral y la mucosa del tracto respiratorio superior y las células de sangre periférica. Se utilizarían varias técnicas de inoculación y el número y el calendario de dosis de una vacuna genética variarían sistemáticamente para optimizar cualquier respuesta inmunogénica resultante y determinar qué rutinas de dosificación darían lugar a una respuesta máxima. Las respuestas de anticuerpos en los individuos tratados serían detectadas por cualquiera de las técnicas conocidas para reconocer anticuerpos para antígenos víricos específicos, de nuevo usando técnicas estándar de Western blot y ELISA. Es también posible detectar la respuesta citotóxica mediada por células usando metodologías estándar conocidas para quienes tienen conocimientos ordinarios en biología inmunológica. Específicamente, la presencia de células T citotóxicas en el bazo o en la sangre periférica puede venir indicada por la presencia de actividad lítica, que reconoce células diana histocompatibles que expresan los antígenos víricos del virus de la inmunodeficiencia.

Aunque los mejores sitios para la administración de una vacuna genética para la enfermedad de la inmunodeficiencia humana y el número y el calendario de dosis deben ser determinados empíricamente en un modelo animal y después confirmados en estudios clínicos, es difícil en este punto predecir el modo preciso en el cual dicha vacuna sería usada en un marco de cuidados para la salud humana real. Como dicha vacuna pretende imitar los efectos de una vacuna vírica viva atenuada o recombinante sin riesgos de patogenicidad, es concebible que dicha vacuna no sólo sería útil en la inducción de inmunidad protectora en individuos "naïve", sino que también estaría indicada para uso en individuos inmunocomprometidos infectados por el HIV con el fin de reforzar artificialmente su estado inmune para prevenir o impedir la progresión de la enfermedad. Es también importante considerar que ninguna estrategia vacunal única puede ser capaz por sí sola de inducir la variedad de respuestas inmunológicas necesarias para conseguir la profilaxis en individuos sanos o para prevenir la progresión de la enfermedad en individuos infectados. Más bien, una combinación de aproximaciones puede demostrar una verdadera sinergia en alcanzar estos objetivos. Así, es concebible que una aproximación de vacuna combinada que incorporara una vacuna genética, que imita una verdadera infección, y una vacuna muerta o subunitaria sería una forma atractiva para conseguir de manera eficiente inmunidad citotóxica y memoria inmunológica, así como altos niveles de anticuerpos protectores. Las vacunas genéticas servirían como alternativa segura al uso de vacunas vivas y podrían ser usadas en una variedad de protocolos de inmunización y en combinación con otras vacunas para conseguir los resultados deseados.

Ejemplos 1. Construcción de vectores

Las secuencias genéticas para el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y el virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) han sido determinadas en su totalidad, publicadas y tienen una disponibilidad general. Por ejemplo, la secuencia de ADN para la cepa de HIV denominada LAV-1/BRU se encuentra en el GenBank, con el Número de Acceso K02013, y las posiciones nucleotídicas a las que se hace referencia más adelante proceden de dicha secuencia. Los experimentadores cualificados pueden adquirir fácilmente muestras tanto de HIV como de SIV a través de los depositarios apropiados en las instalaciones de investigación de la salud.

Se construyó el vector de expresión de la vacuna genética para el HIV de forma que incluyera un fragmento de 8.266 pares de bases derivado del genoma provírico de la cepa de HIV LAV-1/BRU. El fragmento era la porción de la secuencia provírica de ADN del HIV que comienza en el sitio Sac I en la posición nucleotídica 678 y que acaba en el sitio Xho I en el nucleótido número 8.944 (la convención de numeración de nucleótidos aquí empleada supone que el nucleótido número 1 corresponde al primer nucleótido de la región U3 de LTR 5'). Este fragmento designado del genoma de HIV contiene todos los marcos abiertos de lectura víricos, a excepción sólo de una porción que codifica para el extremo carboxilo de la proteína nef. Este fragmento, una vez transcrito, da lugar a un ARNm que contiene todos los sitios donantes y aceptores de ayustamiento necesarios para efectuar las rutas de ayustamiento del ARN que tienen lugar en una célula infectada durante el proceso patogénico iniciado por el virus HIV.

Este fragmento de la secuencia codificante debe copularse a un promotor capaz de expresión en células de mamíferos para conseguir la expresión de las proteínas antigénicas víricas en una célula susceptible. Una vez copulada a un promotor, este fragmento de la secuencia codificante da lugar a la expresión de los marcos abiertos de lectura mayores del virus (incluyendo gag, pol y env) y hace uso del cambio de marco ribosomal nativo y de las rutas de procesamiento del ARNm, del mismo modo que como serían utilizados por el propio virus. Sin embargo, este fragmento sí carece de ciertos elementos genéticos víricos necesarios para la replicación del genoma vírico, incluyendo específicamente los elementos de las repeticiones terminales largas (LTR) y el sitio de unión a cebadores. Por lo tanto, el fragmento es incapaz de transcripción inversa, inhibiendo así que se produzca cualquier proceso patogénico potencial con esta secuencia genética.

Para copular la secuencia codificante que codifica para los antígenos de HIV a un promotor capaz de expresión en células de mamífero, se usó el promotor precoz inmediato del citomegalovirus humano ("HCMV"). Se había construido un cassette de expresión, denominado pWRG1602, que se ilustra mediante el mapa de plásmidos de la Figura 1. El plásmido pWRG1602 da un fragmento de restricción Eco R1 y Bam H1 de 660 pares de bases que contiene varios sitios de restricción sintéticos que habían sido añadidos al extremo de la región de 619 pares de bases que contenía el promotor precoz inmediato de HCMV.

El segmento de finalización de la transcripción utilizado era una secuencia de poliadenilación del virus SV40. El fragmento de poliadenilación de SV40 es un fragmento de aproximadamente 800 pares de bases (obtenido por digestión con Bgl II y Bam HI) derivado del plásmido psv2dhfr, que podía ser antes adquirido comercialmente de los Bethesda Research Labs., número de catálogo 5369SS. El mismo fragmento de poliadenilación está también descrito en Subramani y col., Mol. Cell. Biol., 1: 854-864 (1981). Este fragmento contiene también una pequeña secuencia intermedia de SV40 próxima al extremo Bgl II, estando la región de poliadenilación de SV40 hacia el extremo Bam HI del fragmento.

Se construyó un plásmido de expresión de vacuna genética de HIV, denominado pCHIVpAL, de la forma siguiente. Se trató el fragmento de SV40 de 800 pares de bases de psv2dhfr con ADN polimerasa de Klenow para "rellenar" los extremos colgantes. Paralelamente, se escindió una cantidad de ADN Bluescript M13+SK con Xho I (Número de Acceso X52325, con el sitio Xho I en la posición 668) y se trató de forma similar con ADN polimerasa de Klenow. Se ligaron los dos fragmentos, obteniéndose como resultado un plásmido denominado pBSpAL. La orientación del fragmento SV40 en el vector Bluescript era tal que el extremo Bam HI, o el extremo que contenía el sitio de poliadenilación, estaba orientado hacia el cuerpo principal del poliligante contenido en el plásmido.

Se digirieron entonces cantidades del plásmido pBSpAL con las enzimas de restricción Sac I y Sal I para crear un plásmido que tuviera extremos compatibles para la ligación a un fragmento creado por digestión con Xho I y Sac I. A este plásmido, se le ligó el fragmento de 8.266 pares de bases del provirus HIV, obteniéndose como resultado un plásmido llamado pHIVpAL, que ahora contiene la región codificante de los determinantes antigénicos de HIV seguida de la señal de poliadenilación de SV40.

Se escindió entonces el plásmido pHIVpAL con la enzima de restricción Sac I y se suprimieron los extremos colgantes 3' usando ADN polimerasa de Klenow. En la abertura así creada, se insertó el fragmento de 660 pares de bases que contenía el promotor HCMV (cuyos extremos habían sido rellenados con ADN polimerasa de Klenow).

El resultado es el plásmido designado en la Figura 2, que contiene, orientado de 5' a 3', el promotor precoz inmediato de HCMV, el fragmento de 8.266 pares de bases del genoma de HIV codificante de todos los marcos abiertos de lectura importantes sobre el virus y el fragmento de poliadenilación de SV40. Esta construcción sirvió como construcción de vacuna genética para el método de la presente invención.

Se construyó el vector de expresión de SIV de una forma análoga al vector de expresión de HIV, excepto por utilizar, en lugar de la secuencia génica de HIV, un fragmento de 8.404 pares de bases del genoma provírico de SIVmac239 (que se encuentra en el GenBank bajo el Nº de Acceso M33262), que comienza en el sitio Nar I en la posición nucleotídica 823 y finaliza en el sitio Sac I en la posición nucleotídica 9.226 (siguiendo la misma convención de numeración de nucleótidos que con el HIV). El fragmento de expresión del genoma de SIV puede ser substituido por el plásmido del fragmento de HIV pCHIVpAl anterior.

2. Introducción de la vacuna genética en células en cultivo

Para verificar la capacidad de la construcción genética para expresar las proteínas antigénicas apropiadas en células de mamífero, se realizó una prueba in vitro.

Se reprodujeron in vitro cantidades del plásmido pCHIVpAL. Se depositaron entonces copias del ADN de este plásmido sobre partículas de soporte de oro antes de la transfección a células en cultivo. Se hizo esto mezclando 10 milígramos de polvo de oro precipitado (1,5 micras de diámetro medio) con 50 microlitros de espermidina 0,1 M y 25 microgramos de ADN del plásmido pCHIVpAL. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron entonces 50 microlitros de CaCl_{2} 2,5 M a la mezcla, agitando mientras tanto de forma continua, después de lo cual se incubó la mezcla durante 3 minutos más a temperatura ambiente para permitir la precipitación del ADN sobre las partículas de soporte. Se centrifugó la mezcla durante 30 segundos en una microcentrífuga para concentrar las partículas de soporte con el ADN sobre las mismas, después de lo cual se lavaron suavemente las partículas de soporte con etanol y se resuspendieron en 10 mililitros de etanol en un vial de vidrio tapado. Se ayudó a la resuspensión de las partículas de soporte en el etanol por inmersión del vial en un baño de agua sonicante durante varios segundos.

Se depositaron entonces las partículas de soporte revestidas de ADN sobre láminas mylar de 35 milímetros cuadrados (1,7 cm en cada lado) en una proporción de 170 microlitros de partículas de soporte de oro revestidas de ADN por lámina mylar. Se hizo esto aplicando la suspensión etanólica de las partículas de soporte sobre la lámina de soporte y dejando luego que se evaporara el etanol. Se pusieron entonces las partículas de oro revestidas de ADN en cada lámina mylar en un aparato de transformación en partículas aceleradas del tipo descrito en la Patente EE.UU. Nº 5.015.580, que utiliza una descarga disruptiva eléctrica ajustable para acelerar la partícula de soporte en las células diana que se han de transfectar con el ADN transportado.

Mientras tanto, se había preparado un cultivo de células COS-7 de mono en una placa de cultivo de 3,5 cm. Se eliminó temporalmente el medio de cultivo de células COS y se invirtió la placa de cultivo para que sirviera como superficie diana para el proceso de transfección de partículas aceleradas. Se utilizó una descarga disruptiva de 8 kilovoltios en el proceso descrito con más detalle en la Patente EE.UU. 5.015.580 antes identificada. Después de la inyección de partículas en las células, se añadieron dos mililitros de medio fresco a la placa de cultivo para facilitar la viabilidad continuada de las células.

A las 24 horas de la administración de partículas aceleradas, se recogió el medio de 35 placas de cultivo de las células y se concentró para estudiar los antígenos de HIV de alto peso molecular. Se concentró el medio por centrifugación a alta velocidad, se apartaron 0,5 mililitros del medio sin concentrar para futura determinación del contenido en p24 de HIV usando un kit de ELISA comercial. Se añadió medio de crecimiento fresco a la placa para permitir la monitorización continuada de la producción de antígenos de HIV. Se limpió el medio recogido de restos celulares centrifugándolo primeramente a 1.500 RPM en una centrífuga de laboratorio estándar y filtrándolo luego a través de una membrana de 0,45 micras. Se depositó el filtrado limpio suavemente sobre amortiguadores de 1 mililitro de glicerol al 20%, KCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, en cada uno de 6 tubos de ultracentrífuga (rotor Beckman SW41). Se centrifugaron las muestras a 35.000 RPM durante 70 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación, se desechó el medio y se resuspendieron las pellas en un total de 20 microlitros como NaCl 0,15 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM.

Se sometió la muestra concentrada a un proceso de electroforesis en un gel prevaciado de SDS 12%-poliacrilamida (Bio-Rad). Se sometió el gel a electrotransferencia sobre una hoja de nitrocelulosa usando un "blotter" semi-seco Buchler (Modelo Número 433-2900) según las directrices del fabricante. Se realizaron entonces ensayos para detectar los antígenos víricos HIV inmovilizados sobre la hoja de nitrocelulosa. Se detectaron los antígenos HIV p24 y gp120 usando un kit de ensayo de inmunotransferencia Bio-Rad (número de Catálogo 170-6451). Para utilizar el kit de ensayo de inmunotransferencia, se requieren anticuerpos específicos para los antígenos que se busca detectar. Para uso en el ensayo específico del HIV, se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales, que son de adquisición comercial. Para gp120, los anticuerpos monoclonales 1001 de American Bio-Technologies y NEA 9305 de DuPont. Para el antígeno p24, se utilizaron el anticuerpo monoclonal número 4001 de American Bio-Technologies y el anticuerpo NEA 9283 de DuPont. Se realizó el ensayo de inmunotransferencia según las directrices del fabricante, excepto por la substitución directa con leche desecada desnatada Carnation de la gelatina en todas las soluciones que requerían gelatina. El ensayo de inmunotransferencia desarrollado reveló bandas correspondientes a los dos antígenos gp120 y p24 producidos en la muestra de las células COS tratadas. Un control negativo no produjo dichas bandas y controles positivos consistentes en las propias proteínas antigénicas produjeron bandas similares a las de las muestras de las células tratadas. Esto confirmó la actividad, y la expresión, del plásmido pCHIVpAL en las células COS y confirmó también que las formas de peso molecular de los antígenos eran similares a las producidas en las células huésped normales para el virus. Una muestra paralela derivada de células COS no tratadas no mostró evidencia alguna de reactividad. Hubo una ligera diferencia en la movilidad entre la banda gp120 derivada de las células COS y la banda gp120 en el control positivo, lo que se pensaba era debido a diferencias en la glicosilación.

Para demostrar aún más la producción de determinantes de HIV en células COS de mono, se analizó medio de crecimiento de células tratadas usando un kit de ensayo de antígeno HIVp24 de Coulter (número de Catálogo 6603698). Se estudiaron muestras de medio de crecimiento de los tres primeros períodos de 24 horas después de la administración génica en cuanto a contenido en antígeno p24 y mostraron contener 42, 30 y 12 nanogramos por mililitro, respectivamente, del antígeno p24. Estos valores reflejan la cantidad de antígeno p24 liberada al medio durante cada período de 24 horas, ya que se cambió completamente el medio de crecimiento para las células cada día después del tratamiento. Muestras paralelas de células COS no tratadas no exhibieron reactividad.

3. Detección de antígeno vírico en la piel de ratones infectados

Se usó entonces un protocolo de transfección por partículas aceleradas para administrar el plásmido pCHIVpAL a la piel de ratones enteros intactos. Se había demostrado previamente que se pueden utilizar partículas aceleradas para administrar genes a la epidermis o a la capa dérmica de animales intactos y que los genes se expresan una vez administrados. Se depositaron copias del plásmido pCHIVpAL sobre partículas de soporte de oro, como se ha descrito en el ejemplo anterior, excepto por usar cinco microgramos del plásmido por milígramo de las partículas de soporte de oro, y se suspendió la preparación en etanol a una concentración de 5 mg de partícula de soporte por ml de etanol. Se cargaron 163 microlitros de la suspensión en cada una de dos láminas de soporte para uso en el protocolo de aceleración de partículas en ratones enteros intactos. Se prepararon dos suspensiones adicionales de partículas de soporte como controles. La primera preparación de control utilizaba un plásmido que contenía el gen de la hormona del crecimiento humana y se preparó la segunda sin adición de ningún ADN sobre las partículas de soporte de oro. Se anestesiaron seis ratones Balb/C con 50 microlitros de una mezcla 10:2 de Ketamina/Rompún y se afeitó el pelo abdominal de los ratones con maquinilla. Se extrajeron los folículos pilosos con una crema depilatoria (Nair). Se suspendieron los ratones anestesiados 15 milímetros por encima del tamiz de retención sobre una cámara de administración de partículas usando una placa de Petri de plástico como espaciador, usando el método descrito en la solicitud PCT publicada Nº WO 91/19781. Se cortó un orificio cuadrado en el fondo de la placa de Petri para permitir el acceso de las partículas de soporte a la capa cutánea abdominal de los ratones anestesiados. Se dividió a los seis ratones en tres grupos de dos ratones cada uno. Los ratones de cada uno de los tres grupos recibieron una sola "ráfaga" de partículas de soporte, que fueron aceleradas utilizando un voltaje de descarga disruptiva de 25 kV. Los ratones de cada uno de los tres grupos recibieron tratamientos que representaban el pCHIVpAL, el plásmido de la hormona de crecimiento o las partículas de soporte de oro libres de ADN, respectivamente. Tres días después del tratamiento, se cortaron las áreas de la piel de interés de los ratones tratados, así como de los dos ratones control que no habían sido sometidos a ningún protocolo de transfección mediado por partículas. Se cortaron las muestras de tejido con tijeras de disección en 600 microlitros de solución salina tamponada con fosfatos que contenía un 0,5% de Triton X-100. Se centrifugaron entonces las suspensiones de tejido a 5.000 RPM durante cinco minutos y se recogieron los sobrenadantes resultantes. Se diluyeron las muestras de sobrenadante diez veces y se analizaron en cuanto al contenido en antígeno p24 de HIV usando el kit de ELISA para el antígeno p24 de HIV de Coulter (número de catálogo 6603698) utilizando las directrices del fabricante. La Figura 3 ilustra los resultados de este protocolo. Las muestras de tejido de los ratones tratados con pCHIVpAL exhibían 3 veces más reactividad que las muestras control, lo que indica que los tejidos tratados estaban sintetizando antígeno p24 de HIV como resultado del protocolo de la administración génica. Después de restar el fondo, este nivel de reactividad es consistente con la liberación de 0,6 nanogramos de antígeno p24 de HIV del tejido cortado cuando se compara con una curva estándar generada con reactivos de control positivo en el kit de ELISA.

4. Detección de anticuerpos IgG en suero específicos para el p24 de HIV en ratones vacunados

Se llevó a cabo el siguiente experimento para estudiar la capacidad de ratones para exhibir una respuesta inmune sistémica a proteínas extrañas expresadas como resultado de la administración génica a células epidérmicas de los ratones. Se crearon copias del plásmido pCHIVpAL y se depositaron sobre partículas de soporte de oro como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, excepto por la utilización de 10 microgramos de ADN plasmídico por milígramo de las partículas de soporte de oro. Como control, se usó también un plásmido heterólogo que contenía el gen de la hormona del crecimiento humana para preparar partículas de soporte de oro revestidas de plásmido para administración génica in vivo. Para este ejemplo, se usaron 5,0 microgramos de ADN por milígramo de partículas de soporte de oro, debido al menor tamaño del plásmido de la hormona del crecimiento humana y para tener aproximadamente el mismo número de copias del plásmido administradas a las células in vivo.

Se dividió a 10 ratones Balb/C (5 a 7 semanas de edad) en tres grupos de cuatro, tres y tres ratones, respectivamente. Se realizó una primera etapa de inmunización imprimadora sobre los cuatro ratones del grupo 1, en donde cada uno recibió un solo tratamiento de partículas aceleradas revestidas sólo con el plásmido de la hormona de crecimiento. Se condujo la aceleración a 25 kV por el método descrito en el Ejemplo 3 anterior. Los tres ratones del grupo 2 recibieron cada uno un solo tratamiento de partículas de soporte de oro revestidas con el plásmido pCHIVpAL. Los ratones del grupo 3 recibieron cada uno tres tratamientos abdominales de partículas aceleradas que habían sido revestidas con pCHIVpAL. En el caso del grupo 3, se organizaron las áreas de ráfagas de forma que no fueran solapantes. Se repitió la rutina de ráfagas para los tres grupos cuatro y siete semanas después para reforzar las respuestas inmunes. A los ocho a diez días del último tratamiento, se tomaron muestras de sangre retroorbitarias de cada ratón y se dejó que coagularan a 4ºC en tubos microtainer. Después de centrifugar a 5.000 RPM, se recogió el suero.

Se llevó a cabo a continuación un ensayo para detectar anticuerpos específicos para el p24 del HIV en el suero de los ratones por un enzimoinmunoensayo. Se realizó este ensayo adsorbiendo 0,4 microgramos de antígeno p24 de HIV recombinante (American Bio-Technologies, Inc.) en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos en 50 microlitros de solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (D-PBS) incubando durante la noche a 4ºC. Después de la adsorción del antígeno, se bloquearon los sitios restantes de unión a proteínas por adición de D-PBS que contenía un 2% de leche desecada descremada Carnation (200 microlitros por pocillo) durante dos horas. Se lavaron entonces los pocillos tres veces con 300 microlitros de D-PBS que contenía un 0,025% de Tween-20. Se diluyeron muestras de suero de 5 microlitros cada una 1:10 con D-PBS (45 microlitros) y se añadieron a un solo pocillo, después de lo cual se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar con D-PBS Tween-20 como se ha descrito antes, se detectó la presencia de anticuerpo de ratón unido usando un segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina de cabra anti-ratón (Bio-Rad, número de catálogo 172-1015) diluido 1:1.500 en D-PBS-Tween-20 (50 microlitros por pocillo). Después de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo los pocillos y se detectó el anticuerpo conjugado usando un kit de substrato de fosfatasa alcalina de Bio-Rad (Nº de Catálogo 172-1063) según las instrucciones del fabricante. Se analizó la placa ELISA en un lector de microplacas usando un filtro de 405 nm.

Los resultados de este ensayo están ilustrados en la Figura 4. Uno de los ratones del grupo que recibió ráfagas únicas de las partículas de oro revestidas con pCHIVpAL y dos ratones del grupo que recibió tres ráfagas de las mismas partículas exhibían respuestas de anticuerpos específicos para p24 significativas (5 a 10 veces por encima del fondo). Todos los sueros de los animales control exhibían una reactividad ELISA de fondo típica. Este ejemplo demuestra la viabilidad de inducir respuestas de anticuerpos específicos de antígenos tras administración epidérmica de genes codificados por antígeno depositados sobre partículas de soporte a células en un animal intacto in vivo.

Se demuestra, por lo tanto, que se pueden crear niveles circulantes de anticuerpos para antígenos de un virus de inmunodeficiencia in vivo administrando al paciente no cantidades de las proteínas antigénicas del virus, o el propio virus, sino más bien administrando en lugar de ello al paciente que ha de ser tratado secuencias génicas que provocan la expresión de las proteínas antigénicas en células del individuo vacunado. Este método permite, por lo tanto, la creación de una respuesta de anticuerpos en suero en individuos vacunados sin necesidad de administrar al individuo ninguna porción del virus vivo o ninguna porción del material genético que sea capaz de efectuar la replicación del virus en los individuos.

Claims (14)

1. Uso de una construcción de vacuna genética para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunológica a un virus de inmunodeficiencia en un primate, donde:

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la construcción de vacuna genética incluye un promotor operativo en células del primate y una región codificante de proteína que codifica para determinantes antigénicos de dicho virus, pero no incluye secuencias esenciales para la replicación del virus;

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la construcción de vacuna genética es depositada sobre partículas de soporte pequeñas en cuanto a tamaño en relación al tamaño de las células del primate, para fabricar así dicho medicamento, y

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dicha respuesta inmunológica es inducida por aceleración de las partículas de soporte revestidas hacia el interior de la piel del primate.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el virus es el virus de la inmunodeficiencia humana.

3. Uso según la reivindicación 2, donde el promotor es el promotor precoz inmediato del citomegalovirus humano.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la región codificante de proteína codifica para los determinantes antigénicos mayores del virus.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la región codificante de proteína incluye ADN suficiente para codificar para todos los determinantes codificados por el genoma vírico.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las secuencias esenciales para la replicación son los elementos de las repeticiones terminales largas y el sitio de unión a cebadores.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las partículas de soporte son partículas de oro.

8. Un dispositivo de transferencia génica de partículas aceleradas para inducir una respuesta inmunológica a un virus de inmunodeficiencia en un primate, siendo cargado dicho dispositivo con partículas de soporte que son de pequeño tamaño en relación al tamaño de las células del primate y que están revestidas con una construcción de vacuna genética que incluye un promotor operativo en dichas células y una región codificante de proteína que codifica para determinantes antigénicos de dicho virus, pero no incluye secuencias esenciales para la replicación del virus.

9. Un dispositivo según la reivindicación 8, donde el virus es el virus de la inmunodeficiencia humana.

10. Un dispositivo según la reivindicación 9, donde el promotor es el promotor precoz inmediato del citomegalovirus humano.

11. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la región codificante de proteína codifica para los determinantes antigénicos mayores del virus.

12. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la región codificante de proteína incluye ADN suficiente para codificar para todos los determinantes codificados por el genoma vírico.

13. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde las secuencias esenciales para la replicación son los elementos de las repeticiones terminales largas y el sitio de unión a cebadores.

14. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde las partículas de soporte son partículas de oro.