ES2221045T3 - Anticuerpos humanizados anti-cd11a. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS ANTICUERPOS ANTI - CD 11A HUMANIZADOS Y A SUS DIVERSOS USOS. EL ANTICUERPO ANTI - CD 11A HUMANIZADO PUEDE FIJARSE ESPECIFICAMENTE AL CAMPO I DEL CD11A HUMANO, TENER UNA IC50 (NM) INFERIOR O IGUAL A 1 NM APROXIMADAMENTE, DE FORMA QUE IMPIDA LA ADHESION DE LAS CELULAS DE JURKAT SOBRE LOS QUERATINOCITOS EPIDERMICOS HUMANOS NORMALES QUE EXPRESAN EL ICAM - 1, Y/O UNA IC50 (NM) INFERIOR O IGUAL A 1 NM APROXIMADAMENTE EN LA PRUEBA DE REACCION LINFOCITARIA MIXTA.

Description

Anticuerpos humanizados anti-CD11A.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Este invento se refiere de forma general a anticuerpos anti-CD11a humanizados.

Descripción de la técnica relacionada

El antígeno 1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1; CD11a/CD18) está implicado en la adhesión de los leucocitos durante las interacciones celulares esenciales para las respuestas inmunogénicas e inflamación (Larson et al., Immunol. Rev. 114:181-217 (1990)). El LFA-1 es un miembro de la familia de la integrina \beta2, y consiste en una única subunidad \alpha, el CD11a, y una subunidad \beta, el CD18, comunes a otros receptores integrina \beta2, Mac-1 y p150,95. Los ligandos del LFA-1 incluyen la molécula-1 de adhesión intercelular, la ICAM-1, expresada en leucocitos, endotelio y en fibroblastos dérmicos (Dustin et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)), la ICAM-2, expresada en endotelio en reposo y en linfocitos (de Fougerolles et al., J. Exp. Med. 174:253-267 (1991)), y la ICAM-3, expresada en monocitos y linfocitos en reposo (de Fougerolles et al., J. Exp. Med. 179:619-629 (1994)).

Se ha observado in vitro que los anticuerpos monoclonales (MAb) contra el LFA-1 y las ICAM inhiben varias funciones inmunes dependientes de las células T, incluyendo la activación de las células T (Kuypers et al., Res. Immunol. 140:461 (1989)), la proliferación de células B dependiente de células T (Fischer et al., J. Immunol. 136:3198-3203 (1986)), la lisis de células diana (Krensky et al., J. Immunol. 131:611-616 (1983)), y la adhesión de células T al endotelio vascular (Lo et al., J. Immunol. 143:3325-3329 (1989)). En ratones, los MAb anti-CD11a inducen tolerancia a las proteínas antigénicas (Tanaka et al., Eur. J. Immunol. 25:1555-1558 (1995)) y alargan la supervivencia en los aloinjertos cardíacos (Cavazzana-Calvo, et al., Transplantation 59:1576-1582 (1995); Nakakura et al., Transplantation 55:412-417 (1993)), médula ósea (Cavazzana-Calvo et al., Transplantation 59:1576-1582 (1995); van Dijken et al., Transplantation 49:882-886 (1990)), córnea (He et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 35:3218-3225 (1994)), islotes (Nishihara et al., Transplantation Proc. 27:372 (1995)) y tiroides (Talento et al., Transplantation 55:418-422
(1993)).

En humanos, los MAb anti-CD11a impidieron el rechazo del trasplante después de un trasplante de médula ósea (Fischer et al., Blood 77:249-256 (1991); Stoppa et al., Transplant. Intl. 4:3-7 (1991)), y los estudios preliminares de trasplantes renales tratados profilácticamente con MAb anti-CD11a, además de con corticoesteroides y azatioprina, son prometedores (Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)). Las terapias actuales contra el rechazo del trasplante incluyen el uso del OKT3, un MAb de ratón anti-CD3 humano, y la ciclosporina A. La terapia con el OKT3 es efectiva, pero tiene varios efectos secundarios no deseables; su uso resulta en la liberación de numerosas citoquinas, incluyendo el factor-\alpha de necrosis del tumor, el interferón-\gamma, la interleukina-2, y la interleukina-6, lo que resulta en fiebre, escalofríos y alteraciones gastrointestinales (para una revisión consultar Parlevliet et al., Transplant Intl. 5:234-246 (1992); DAntal et al., Curr. Opin. Immunol. 3:740-747 (1991)). La ciclosporina A es efectiva, pero también tiene efectos secundarios graves (para una revisión, consultar Barry, Drugs 44:554-566 (1992)).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD11a humanizados. Los anticuerpos preferidos se unen al dominio I del CD11a humano (por ejemplo, al "epítopo MHM24" tal como se define en ésta), y/o se unen al CD11a con una afinidad de aproximadamente 1 \times 10^{-8} M o más. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo tiene un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 1 nM para prevenir la adhesión de las células Jurkat a los queratinocitos epidérmicos humanos normales que expresan la ICAM-1. Los anticuerpos humanizados preferidos son aquéllos que tienen un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 1 nM en el ensayo de respuesta de linfocitos mezclados (MLR). Este IC50 para un anticuerpo humanizado en el ensayo de MLR se significativamente mejor que el del MAb 25.3 de ratón, el cual ha sido previamente ensayado in vivo (Fischer et al., Blood 7/:249-256 (1991); Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991); Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)).

El anticuerpo anti-CD11a humanizado podría tener una región variable de cadena pesada que comprendiera la secuencia de aminoácidos del CDR1 (GYSFTGHWMN; SEC Nº ID.: 10), y/o del CDR2 (MIHPSDSETRYNQKFKD; SEC Nº ID.: 11), y/p del CDR3 (GIYFYGTTYFDY; SEC Nº ID.: 12) de una anticuerpo humanizado F(ab)-8 MHM24 de la Figura 1, y/o una región variable de cadena ligera que comprendiera la secuencia de aminoácidos del CDR1 (RASKTISKYLA; SEC Nº ID.: 13), y/o del CDR2 (SGSTLQS; SEC Nº ID.: 14), y/p del CDR3 (QQHNEYPLT; SEC Nº ID.: 15) de una anticuerpo humanizado F(ab)-8 MHM24 de la Figura 1. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una variante de la secuencia de aminoácidos de uno o más de los CDR del anticuerpo humanizado F(ab)-8 MHM24, variante que comprende una o más inserciones de aminoácidos dentro o adyacentes a un residuo del CDR, y/o supresión(es) dentro o adyacentes a un residuo del CDR, y/o sustitución(es) de residuo(s) del CDR (siendo la(s) sustitución(es) el tipo preferido de alteración de aminoácidos para generar tales variantes). Tales variantes tendrán normalmente una afinidad de unión por el CD11a humano que no es de más de aproximadamente 1 \times 10^{-8} M.

En las realizaciones preferidas, el anticuerpo humanizado incluye una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC Nº ID.: 2 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC Nº ID.: 5 del anticuerpo humanizado F(ab)-8 MHM24 de la Figura 1, y/o las variantes de la secuencia de aminoácidos de la misma.

Tal como se describe en ésta, ha sido posible rediseñar un anticuerpo humanizado que se une al antígeno CD11a humano, pero no significativamente al antígeno CD11a de rhesus, con objeto de conferir la capacidad de unir el CD11a de rhesus (es decir, una anticuerpo "rhesusizado"). En esta realización, el anticuerpo que se une al CD11a de rhesus podría, por ejemplo, incluir la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la SEC Nº ID.: 23. Los otros CDR podrían ser los mismos que los del anticuerpo F(ab)-8 MHM24 humanizado. Por tanto, el anticuerpo podría comprender la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada "rhesusizada" de la SEC Nº ID.: 24, combinada opcionalmente con una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC Nº ID.: 2.

En ésta se contemplan varias formas del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD11a podría ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tuviera una región constante de una inmunoglobulina humana) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un F(ab')_{2}). Además, el anticuerpo podría estar marcado con una marca detectable, inmovilizado sobre una fase sólida, y/o conjugado con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico).

Se contemplan los usos diagnóstico y terapéutico del anticuerpo. En una aplicación diagnóstica, la invención proporciona un procedimiento para determinar la presencia de una proteína CD11a, el cual comprende exponer una muestra que se sospecha contiene la proteína CD11a al anticuerpo anti-CD11a, y determinar la unión del anticuerpo a la muestra. Para este uso, la invención proporciona un equipo que incluye el anticuerpo e instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la proteína CD11a.

La invención proporciona además: ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo; un vector que comprende ese ácido nucleico, opcionalmente unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una célula huésped que comprende ese vector; un proceso para producir el anticuerpo, el cual comprende cultivar la célula huésped de forma que el ácido nucleico se exprese y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula huésped (por ejemplo, a partir del medio de cultivo de la célula huésped). La invención también proporciona una composición que comprende el anticuerpo anti-CD11a humanizado y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición para uso terapéutico es estéril y podría estar liofilizada. La invención proporciona además un procedimiento para tratar un mamífero que padece una alteración mediada por el LFA-1, el cual comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD11a humanizado al mamífero. Para tales usos terapéuticos, podrían co-administrársele al mamífero otros agentes inmunosupresores o antagonistas de la molécula de adhesión (por ejemplo, otro antagonista del LFA-1 o un antagonista del VLA-4), bien antes, después, o simultáneamente con el anticuerpo anti-CD11a humanizado.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del MHM24 de ratón (SEC Nº ID.: 1), de la cadena ligera del F(ab)-8 MHM24 humanizado (SEC Nº ID.: 2), las secuencias consenso humana del subgrupo \kappa1 de la cadena ligera (hum\kappa1) (SEC Nº ID.: 3). La Figura 1B muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del MHM24 de ratón (SEC Nº ID.: 4), de la cadena pesada del F(ab)-8 MHM24 humanizado (SEC Nº ID.: 5), las secuencias consenso humana del subgrupo III de la cadena pesada (humIII) (SEC Nº ID.: 6), y la cadena pesada mutante del anticuerpo "rhesusizado" del Ejemplo (SEC Nº ID.: 24).

En las Figuras 1A y 1B, las regiones hipervariables basadas en la hipervariabilidad de la secuencia (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) se encierran entre paréntesis, y los bucles hipervariables basados en la estructura de los complejos F(ab)-antígeno (Chothia et al., Nature 342:8767 (1989)) están en cursiva. La numeración de los residuos es acorde a Kabat et al., mostrándose las inserciones como a, b y c.

La Figura 2 muestra las secuencias del dominio-I del CD11a humano (SEC Nº ID.: 7), y del dominio-I del CD11a de rhesus (SECUD 8). Las hojas-\beta y las hélices-\alpha están subrayadas y etiquetadas de acuerdo con Qu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10277-10281 (1995). La secuencia del dominio-I de rhesus (rhCD11a) muestra sólo las cuatro diferencias respecto el dominio-I humano. El epítopo de unió para el MAb MHM24 (SEC Nº ID.: 9) se muestra en negritas (Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)).

La Figura 3 ilustra la inhibición de las células T Jurkat humanas contra queratinocitos humanos normales por parte del MHM24 de ratón (círculos rellenos), del MHM24 quimérico (triángulos vacíos), del MHM24 humanizado (HuIgG1) (cuadrados rellenos), y un control de isotipo IgG humano (+). El porcentaje de unión de se midió mediante la fluorescencia de células Jurkat marcadas.

Las Figuras 4A-4C muestran la inhibición de la unión de linfocitos de rhesus a queratinocitos humanos normales (Figura 4A), de linfocitos de rhesus a la ICAM-1 humana recombinante depositada sobre placas (Figura 4B), y de las células 293 transfectadas con un CD11a quimera de rhesus/humano a queratinocitos humanos normales (Figura 4C). Inhibición por parte del MHM24 unidor de rhesus (RhIgG1) (cuadrados rellenos), del MHM23 anti-CD18 (círculos rellenos), y de un control de isotipo IgG humano (+) (Figuras 4A y 4C), y de un control de isotipo IgG de ratón (+) (Figura 4B). Porcentaje de unión medido mediante la fluorescencia de linfocitos marcados (Figuras 4A y B) o de células 293 marcadas (Figura 4C).

La Figura 5 muestra que el ensayo de respuesta a linfocitos mezclados humanos (MLR) es bloqueado por el MHM24 de ratón (círculos rellenos), el MHM24 humanizado (HuIgG1) (cuadrados rellenos), y un control del isotipo IgG1 humanizado (rombos rellenos). El porcentaje del índice de estimulación (%SI) es la proporción de la respuesta a una concentración de MAb determinada respecto la respuesta máxima sin MAb presente. Los datos son representativos de múltiples ensayos, usando al menos dos pares diferentes de estimulante/respondedor.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

A menos que se indique lo contrario, el término "CD11a" tal como se usa en ésta, se refiere a la subunidad alfa del LFA-1 procedente de cualquier mamífero, pero preferiblemente procedente de un humano. El CD11a podría aislarse a partir de una fuente natural de la molécula, o podría producirse mediante medios sintéticos (por ejemplo, usando la tecnología del ADN recombinante). La secuencia de aminoácidos del CD11a humano se describe, por ejemplo, en la EP-362.526-B1.

El término "dominio-I" del CD11a se refiere a la región de está molécula que se detalla en Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) y/o Qu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10277-10281 (1995). Las secuencias de aminoácidos del dominio-I del CD11a humano (SEC Nº ID.: 7) y del dominio-I del CD11a de rhesus (SEC Nº ID.: 8) se ilustran en la Figura 2 en ésta.

El término "epítopo para el MHM24" cuando se usa en ésta, a menos que se indique lo contrario, se refiere a la región en el dominio-I del CD11a humano a la cual se use el anticuerpo MHM24 (ver el Ejemplo, más abajo). Este epítopo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC Nº ID.: 9, y, opcionalmente, otros residuos aminoácidos del CD11a y/o CD18.

El término "alteración mediada por el LFA-1" se refiere a un estado patológico causado por interacciones de adherencia celular que implican el receptor del LFA-1 sobre linfocitos. Los ejemplos de tales alteraciones incluyen las respuestas inflamatorias de las células T, tales como las enfermedades inflamatorias de la piel, incluyendo la psoriasis; las respuestas asociadas con las enfermedades del intestino (tales como las enfermedad de Crohn y la colitis ulcerante); el síndrome de la molestia respiratoria adulta; la meningitis; la encefalitis; la uveitis; las condiciones alérgicas tales como el eccema y el asma; las condiciones que implican la infiltración de células T y las respuestas inflamatorias crónicas; las reacciones de hipersensibilidad de la piel (incluyendo la hiedra venenosa y el roble venenoso); la ateroesclerosis; la deficiencia en la adhesión de los leucocitos; las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico (SLE), la diabetes mellitus, la esclerosis múltiple, el síndrome de Reynaud, la tiroiditis autoinmune, la enfecalimielitis autoinmune experimental, el síndrome de Sjorgen, la diabetes de aparición juvenil, y las respuestas inmunes asociadas con la hipersensibilidad retrasada mediada por citoquinas y linfocitos T que se observan típicamente en la tuberculosis, la sarcoidosis, la polimiositis, la granulomatosis y la vasculitis; la anemia perniciosa; la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); la bronquitis; la insulinitis; la rinitis; la urticaria; la glomerulonefritis; las enfermedades que implican la diapedesis de leucocitos; la alteración inflamatoria del CNS; el síndrome de lesión múltiple de órganos secundario a la septicemia o trauma; la anemia hemolítica autoinmune; la mietemia gravis; las enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo; el síndrome nefrótico; los cánceres (por ejemplo, los cánceres de células-B, tales como la leucemia linfocítica crónica o la leucemia de células pilosas); todos los tipos de transplantes, incluyendo las enfermedades de injertos contra huéspedes y huéspedes contra injertos; la infección por VIH y rinovirus; la fibrosis pulmonar; la invasión de células tumorales en órganos secundarios, etc.

El término "agente inmunosupresor", tal como se usa en ésta para la terapia adjunta, se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del huésped en el cual se está trasplantando el injerto. Esto incluiría las sustancias que suprimen la producción de citoquinas, desregulan o suprimen la expresión de auto-antígenos, o enmascaran los antígenos del MHC. Los ejemplos de tales agentes incluyen las pirimidinas 2-amino-6-arilo-5-sustituidas (ver patente estadounidense nº 4.665.077), la azatioprina (o ciclofosfamida, si hay una reacción adversa contra la azatioprina); la bromocriptina; el glutaraldehído (el cual enmascara los antígenos del MHC, tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.120.649); los anticuerpos anti-idiotípicos contra los antígenos del MHC y fragmentos del MHC; la ciclosporina A; los esteroides tales como los glucocorticoesteroides, por ejemplo, la prednisona, la metilprednisolona, y la dexametasona; los antagonistas de citoquinas o del receptor de citoquinas, incluyendo los anticuerpos anti-interferón-\gamma, -\beta, o -\alpha; los anticuerpos contra el factor-\alpha de la necrosis del tumor; los anticuerpos contra el factor-\beta de la necrosis del tumor; los anticuerpos anti-interleukina-2 y los anticuerpos anti-receptor de la interleukina-2; los anticuerpos anti-L3T4; la globulina anti-linfocito heteróloga; los anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; el péptido soluble que contiene un dominio unidor de LFA-4 (WO90/08.187, publicada el 7/26/90); la estreptoquinasa; el TCF-\beta; la estreptodornasa; el ARN o ADN procedente del huésped; el FK506; el RS-61443; la desoxispergualina; la rapamicina; el receptor de la célula-T (patente estadounidense nº 5.114.721); los fragmentos del receptor de la célula T (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO90/11.294; y WO91/01.133); y anticuerpos contra el receptor de la célula T (EP-340.109), tal como el T10B9. Estos agentes se administran en el mismo instante o en momentos separados que el anticuerpo contra el CD11a, y se usan en las mismas dosis o menores que se han establecido en la técnica. El agente inmunosupresor adjunto preferido dependerá de muchos factores, incluyendo el tipo de alteración que se está tratando, incluyendo el tipo de trasplante que se esté realizando, así como el historial del paciente, pero una preferencia conjunta general es que el agente se seleccione de entre ciclosporina A, un glucocorticoesteroide (más preferiblemente la prednisona o metilprednisolona), el anticuerpo monoclonal OKT-3, la azatioprina, la bromocritina, la globulina anti-linfocito heteróloga, o una mezcla de los mismos.

"Tratamiento" se refiere a ambos, el tratamiento terapéutico y profiláctico o a las medidas preventivas. Aquéllos que precisan de tratamiento incluye a aquéllos que ya padecen la alteración, así como aquéllos en los que debe prevenirse la alteración.

"Mamífero", para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológicos, de deporte o de compañía, tales como los perros, los caballos, los gatos, las vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.

El término "injerto", tal como se usa en ésta, se refiere al material biológico derivado de un donante para su trasplante en un receptor. Los injertos incluyen material tan diverso como, por ejemplo, células aisladas, tales como las células del islote y células derivadas de tejido neural (por ejemplo, células de Schwann), tejidos tales como la membrana amniótica de un recién nacido, médula ósea, células precursoras hematopoyéticas, y órganos tales como la piel, corazón, hígado, bazo, páncreas, lóbulo de la tiroides, pulmón, riñón, órganos tubulares (por ejemplo, intestino, vasos sanguíneos, o esófago), etc. Los órganos tubulares pueden usarse para remplazar porciones dañadas del esófago, de los vasos sanguíneos, o del conducto biliar. Los injertos de piel pueden usarse no sólo para quemaduras, sino también como un recubrimiento para intestino lesionado para cerrar ciertos defectos tales como la hernia del diafragma. El injerto se deriva de cualquier fuente de mamífero, incluyendo la humana, tanto de cadáveres como de donantes vivos. Preferiblemente, el injerto es médula ósea o un órgano tal como el corazón, y el donante del injerto y el receptor son compatibles para los antígenos de la clase II del HLA.

El término "donante" tal como se usa en ésta se refiere a especies de mamíferos, vivas o muertas, a partir de las cuales se deriva el injerto. Preferiblemente, el donante es un humano. Los donantes humanos son preferiblemente donantes con sangre compatible, que son normales en un examen físico, y del mismo grupo sanguíneo ABO principal, puesto que cruzar las barreras del grupo sanguíneo principal posiblemente perjudica la supervivencia del aloinjerto. No obstante, es posible trasplantar, por ejemplo, un riñón de un donante del tipo O a un receptor A, B o AB.

El término "trasplante" y variaciones del mismo se refieren a la inserción de un injerto en un huésped, tanto si el trasplante es singénico (en donde el donante y el receptor son genéticamente idénticos), alogénicos (en donde el donante y el receptor son de orígenes genéticos diferentes pero la misma especie), o xenogénico (en donde el donante y el receptor son de especies diferentes). Por tanto, en un escenario típico, el huésped es humano y el injerto es un isoinjerto, derivado de un humano del mismo o diferente origen genético. En otro escenario, el injerto se deriva de una especie diferente de aquélla en la que se trasplanta, tal como un corazón de babuino trasplantado en un huésped receptor humano, e incluye animales procedentes de especies filogenéticamente ampliamente separadas, por ejemplo, una válvula cardíaca de cerdo, o células de islotes beta o células neuronales de animal trasplantadas en un huésped humano.

"Tolerancia creciente de un injerto trasplantado" por parte de un huésped se refiere a la prolongación de la supervivencia de un injerto en un huésped en el cual se ha trasplantado, es decir, la supresión del sistema inmune del huésped de forma que éste tolere mejor un trasplante ajeno.

Dosificación "intermitente" o "periódica" es una dosificación que es continua durante un cierto período de tiempo, y ocurre a intervalos regulares que preferiblemente están separados por más de un día.

"Tolerancia selectiva" de la alteración se refiere a una tolerancia por parte del sistema inmune del huésped para el agente específico que causa el trastorno, pero reteniendo la capacidad del huésped de rechazar un segundo injerto alogénico o xenogénico. Preferiblemente, la tolerancia es tal que el sistema inmune se deja, por otra parte, intacto.

El término "antagonista del LFA-1" se refiere a una molécula que actúa como un inhibidor competitivo de la interacción del LFA-1 con la ICAM-1. Los ejemplos de tales moléculas incluyen los anticuerpos dirigidos contra el CD11a (por ejemplo, los anticuerpos anti-CD11a humanizados descritos en ésta) o el CD18, o ambos, los anticuerpos contra la ICAM-1, y otras moléculas tales como péptidos (por ejemplo, antagonistas imitadores de péptidos).

El término "antagonista del VLA-4" se refiere a una molécula que actúa como inhibidor competitivo de la interacción de la VLA-4 con la VCAM.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio, y específicamente abarca los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y los fragmentos de anticuerpo con tal que presenten la actividad biológica deseada.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión del antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; los diacuerpos; los anticuerpos lineales; las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y los anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en ésta, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que conforman la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural, las cuales podrían estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y están dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales, las cuales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo: que es obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe limitarse en el sentido de requerir la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usarse de acuerdo con la presente invención podrían prepararse mediante el procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o podrían prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" podrían aislarse también a partir de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas por Clackson et al., Nature 352:623-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales en éste incluyen específicamente los anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos", en los cuales una porción de la cadena pesada y/o de la cadena ligera es idéntica a, u homóloga de las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta, o pertenecientes a una determinada clase o subclase de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) a, u homólogas de las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otras especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, con tal que exhiban la actividad biológica deseada (patente estadounidense nº 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

El término "región hipervariable", cuando se usa en ésta, se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno.a región variable comprende los residuos aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, Public Health Services, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)), y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Los residuos "estructurales" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable, tal como se define en ésta.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de ratón), son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de la región hipervariables del receptor se remplazan con los residuos de la región hipervariable procedentes de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón, la rata, el conejo, o un primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) del Fv de la inmunoglobulina humana se remplazan con los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados podrían comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones pueden hacerse para refinar aún más las prestaciones del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos, o al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de la regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, consultar Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un engarce polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L}, lo que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión sobre los sFv consultar Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, editores Rosenburg y Moore, Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un engarce que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma secuencia, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, la EP-404.097; la WO93/11.161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales", cuando se usa a lo largo de esta aplicación, se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1), los cuales forman un par de regiones unidoras de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Un anticuerpo aislado es uno que se ha identificado y separado, y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnóstico o terapéutico del anticuerpo, y podrían incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos y no proteicos. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo, según se determina mediante el procedimiento de Lowry, y más preferiblemente hasta más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un vaso "sequenator", o (3) hasta su homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, usando la tinción con el azul de Coomassie o, preferiblemente, con plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislada se preparará mediante al menos un paso de purificación.

El término "epítopo marcado", cuando se usa en ésta, se refiere al anticuerpos anti-CD11a fusionado con una "marca de epítopo". El polipéptido marca del epítopo tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede prepararse un anticuerpos, aunque es lo bastante corto como para no interferir con la actividad del anticuerpo CD11a. La marca del epítopo preferiblemente es suficientemente única como para el el anticuerpo contra la misma sustancialmente no reaccione de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos de marca apropiados generalmente tienen al menos 6 residuos aminoácidos, y usualmente entre 8-50 residuos aminoácidos (preferiblemente entre 9-30 residuos). Los ejemplos incluyen el polipéptido marca HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165 (1988)); la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra la misma (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); y la marca de la glicoproteína D (gD) del virus Herpes simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). En ciertas realizaciones, la marca del epítopo es un "epítopo unidor del receptor de salvamento".

Tal como se usa en ésta, el término "epítopo unidor del receptor de salvamento" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}) que es responsable del incremento en la vida media en suero de la molécula de IgG.

El término "agente citotóxico", tal como se usa en ésta, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término se pretende que incluya los isótopos radiactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), los agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal, o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, la doxorubicina, el 5-fluorouracilo, la arabinosida de citosina ("Ara-C"), la ciclofosfamida, la tiotepa, el taxotero (docetaxel), el busulfán, la citoxina, el taxol, el metotrexato, el cisplatino, el melfalán, la vinblastina, la bleomicina, el etoposido, la ifosfamida, el mitomicina C, la mitoxantrona, la vincreistina, la vinorelbina, el carboplatino, el teniposido, la daunomicina, la carminomicina, la aminopterina, la dactinomicina, las mitomicinas, las esperamicinas (ver patente estadounidense nº 4.675.187), el melfalán y otras mostazas de nitrógeno relacionadas.

El término "prodroga", tal como se usa en esta solicitud, se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con la droga original, y que es capaz de ser activada o convertida enzimáticamente en la forma original más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy," Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615º Congreso, Belfast (1986), y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, editores Borchardt et al., pp. 247-267, Humana Press (1985). Las prodrogas de esta invención incluyen, pero no se limitan a, las prodrogas que contienen fosfatos, las prodrogas que contienen tiofostatos, las prodrogas que contienen sulfatos, las prodrogas que contienen péptidos, las prodrogas modificadas con D-aminoácidos, las prodrogas glicosiladas, las prodrogas que contienen \beta-lactama, las prodrogas que contienen fenoxiacetamidas opcionalmente sustituidas, o las prodrogas que contienen fenilacetamidas opcionalmente sustituidas, la 5-fluorocitosina y otras prodrogas de 5-fluorouridina, las cuales pueden convertirse en la droga libre citotóxica más activa. Los ejemplos de drogas citotóxicas que pueden derivarse en una forma prodroga para su uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapéuticos descritos más arriba.

La palabra "marca", cuando se usa en ésta, se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugada directa o indirectamente con el anticuerpo. La marca podría ser detectable por sí misma (por ejemplo, marcas con radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, podría catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o composición que es detectable.

Por "fase sólida" se indica una matriz no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas en ésta incluyen las formadas parcial o totalmente por vidrio (por ejemplo, vidrio con poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la patente estadounidense nº 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos, el cual es útil para suministrar una droga (tal como los anticuerpos anti-CD11a descritos en ésta y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación en bicapa, similar a la disposición de lípidos en las membranas biológicas.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente de la forma o disposición en la cual se halla en la naturaleza. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico de como ésta existe en las células naturales. No obstante, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente expresan el anticuerpo, en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación del cromosoma distinta de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante, operativamente unida, en un organismo huésped concreto. Las secuencias de control que son apropiadas para las procariotas, incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operador, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está operativamente unido a un ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está operativamente vinculado a una secuencia codificante si está ubicado para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en pauta de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen porque estar contiguos. La unión se consigue mediante ligación en los sitios de restricción apropiados. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o engarces oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Tal como se usa en ésta, la expresión "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable, y la totalidad de tales denominaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula que es sujeto primario y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. Se entenderá también que toda la progenie podría ser no exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica buscada en las células transformada originales. Cuando se deseen denominaciones distintas, se deducirá claramente del contexto.

II. Modos para llevar a cabo la invención A. Preparación del anticuerpo

En el Ejemplo de más adelante se describe un procedimiento para humanizar un anticuerpo no humano contra el CD11a. Con objeto de humanizar un anticuerpo anti-CD11a, se prepara el material de partida del anticuerpo no humano. En las siguientes secciones se describirán técnicas de ejemplo para generar tales anticuerpos.

(i) Preparación del antígeno

El antígeno CD11a a usarse en la producción de anticuerpos podría ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular del CD11a o un fragmento del CD11a (por ejemplo, un fragmento de CD11a que incluyera el "epítopo MHM24", tal como el fragmento del dominio-I del CD11a). Alternativamente, pueden usarse células que expresan el CD11a sobre la superficie celular para generar anticuerpos. Tales células pueden transformarse para expresar el CD11a y, opcionalmente, el CD18, o podian ser otras células que ocurren de forma natural (por ejemplo, células linfoblastoides humanas, ver Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983)) o células Jurkat (ver el Ejemplo, más abajo). Otras formas de CD11a útiles para generar anticuerpos serán evidentes a los especialistas en la técnica.

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales preferiblemente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y de un adyuvante. Podría ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina del haba de soja, usando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, el éster maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados, mediante la combinación, por ejemplo, de 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente), con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund, e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, se impulsan los animales con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado, en el adyuvante completo de Freund, mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se sangran los animales y se ensaya el título del anticuerpo en el suero. Los animales se impulsan hasta que el título se estabiliza. Preferiblemente, el animal se impulsa con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. Los agentes de agregación, tales como el alum, se usan también de forma conveniente para potenciar la respuesta inmune.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales podrían prepararse usando el procedimiento del hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o podrían prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (patente estadounidense nº 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, un ratón, u otro animal apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se ha descrito más arriba en ésta para elicitar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in vitro. Los linfocitos pueden fusionarse a continuación con células de mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo apropiado, que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras no carecen del enzima transferasa de fosforibosil de hipoxantina a guanina (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas típicamente incluirá la hipoxantina, la aminopterina, y la timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan niveles elevados y estables de producción de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son la líneas de mieloma de ratón, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11, disponibles del Salk Institute Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 y X63-Ag8-653, disponibles del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor et al., J. Immunol. 133:3001 (1984)); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987).

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de mieloma se ensaya en busca de la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación, o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

La afinidad de unión el anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Una vez se ha identificado que las células de hibridoma producen anticuerpos con la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones podrían subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante, y cultivarse mediante procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma podrían hacerse crecer in vivo como tumores ascites en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separar convenientemente del medio de cultivo, del fluido de ascites, o del suero, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, la proteína-A-Sepharose, la cromatografía con hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, los cuales de transfectan a continuación en células huéspedes, tales como células de E. coli, células COS de mono, células ováricas de hámster chino (CHO), o células de mieloma que, de otro modo, no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá más adelante con más detalle.

(iv) Humanización y variantes de la secuencia de aminoácidos

El Ejemplo de más abajo describe un procedimiento para la humanización de un anticuerpo anti-CD11a. En ciertas realizaciones, podría ser deseable generar variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado, particularmente cuando éstas mejoren la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado.

Las variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo anti-CD11a humanizado se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo anti-CD11a humanizado, o mediante la síntesis de péptidos. Tales variantes incluyen, por ejemplo, la supresiones de, y/o las inserciones en, y/o lal sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos mostradas para el F(ab)-8 anti-CD11a humanizado (por ejemplo, como en las SEC Nº ID.: 2 y 5). Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, con tal que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también podrían alterar los procesos posteriores a la traducción del anticuerpo anti-CD11a humanizado, tales como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido del anticuerpo anti-CD11a humanizado que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis, es la denominada "mutagénesis de barrido con alanina", tal como describieron Cunningham y Well, Science 244:1081-1085 (1989). En ésta, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se remplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno CD11a. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que muestren una sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que el sitio para introducir una variación de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene porque estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar las prestaciones de una mutación en un sitio determinado, se realiza el barrido con ala o la mutagénesis aleatoria en el codón o región diana, y las variantes de anticuerpo anti-CD11a humanizado se examinan en busca de la actividad deseada.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen las fusiones amino y/o carboxi terminales que oscilan en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones terminales incluyen el anticuerpo anti-CD11a humanizado con un residuo metionil N-terminal, o el anticuerpo fusionado a una marca de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-CD11a humanizado incluyen la fusión al extremo N- o C-terminal del anticuerpo anti-CD11a humanizado de un enzima o un polipéptido que incrementan la vida media en suero del anticuerpo (ver más abajo).

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen suprimido al menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-CD11a humanizado, y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de máximo interés para la mutagénesis de sustitución incluyen los bucles hipervariables, aunque también se contemplan las alteraciones de FR. La Tabla IV en el Ejemplo de más abajo proporciona una guía sobre que residuos de la región hipervariable pueden alterarse. Los residuos de la región hipervariable o residuos FR implicados en las unión del antígeno generalmente se sustituyen de una forma relativamente conservadora. Tales sustituciones conservadores se muestran en la Tabla I, bajo la cabecera "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en la Tabla I, o tal como se describen más adelante en referencia a las clases de aminoácidos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I

1

Se consiguen modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre (a) el mantenimiento de la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que existen de forma natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1)

hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3)

ácidos: asp, glu;

(4)

básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que incluyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conversadoras implicarán el intercambio de un miembro de uno de estas clases por otra clase. También podría sustituirse cualquier residuo cisteína no implicado en mantener la conformación correcta del anticuerpo anti-CD11a humanizado, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir la formación de entrecruzamientos aberrantes. A la inversa, podrían añadirse enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alteración se quiere indicar suprimir uno o más grupos carbohidratos hallados en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de los anticuerpos típicamente está unida a N o unida a O. Unida a N se refiere al anclaje del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el anclaje enzimático del grupo carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere al anclaje de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente a la serina o treonina, aunque también podrían usarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, de tal forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptido descritas más arriba (para los sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también podría hacerse mediante la adición de, o sustitución con, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo anti-CD11a humanizados se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de aminoácidos que ocurren de forma natural), o a la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida contra un sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de cassette, de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo anti-CD11a humanizado.

Ordinariamente, las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD11a humanizado tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencias de aminoácidos del anticuerpo humanizado original de una de las cadenas pesada o ligera (como en las SEC Nº ID.: 2 ó 5), más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y lo más preferiblemente al menos el 95%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en ésta como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos del anti-CD11a humanizado, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar las sustituciones conservadoras (tal como se definieron más arriba en la Tabla I) como parte de la identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, supresión o inserciones N-terminales, C-terminales o internas en la secuencia del anticuerpo debería considerarse que afecta la identidad u homología de secuencia.

(v) Examen en busca de propiedades biológicas

Los anticuerpos que tienen las características identificadas en ésta como deseables en un anticuerpo anti-CD11a humanizado se examinan.

Para examinar en busca de anticuerpos que se unen al epítopo sobre el CD11a unido por un anticuerpo de interés (por ejemplo, los que bloquean la unión del anticuerpo MHM24 al CD11a), puede realizarse un ensayo de entrecruzamiento rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1998). Alternativamente, puede realizarse el mapado del epítopo, por ejemplo, tal como se describe en Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

Las afinidades del anticuerpo (por ejemplo, por el CD11a humano o CD11a de rhesus) podrían determinarse mediante unión de saturación usando, bien células mononucleares de sangre periférica o leucocitos de rhesus, tal como se describe en el Ejemplo de más abajo. De acuerdo con este procedimiento para determinar la afinidad del anticuerpo, se añaden linfocitos o leucocitos de rhesus a las placas, en un volumen de 170 \mul por pocillo, y se incuban las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, se recolectan las células y se lavan 10 veces. A continuación se cuentan las muestras. Los datos se transforman de cuentas por minuto a nanomolaridad, y a continuación se realiza el ajuste de una curva de cuatro parámetros a los gráficas de saturación (unido respecto total) para determinar los valores de K_{d} (app). Los anticuerpos humanizados preferidos son aquéllos que unen el CD11a humano con un valor de K_{d} de no más de aproximadamente 1 \times 10^{-7}; preferiblemente de no más de aproximadamente 1 \times 10^{-8}; más preferiblemente de no más de aproximadamente 1 \times 10^{-9}; y lo más preferiblemente de no más de aproximadamente 2 \times 10^{-10}.

Es también deseable seleccionar anticuerpos humanizados que tengan propiedades anti-adhesión beneficiosas en el "ensayo de adhesión a una monocapa de queratinocitos". Los anticuerpos preferidos son aquéllos que tienen un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 250 nM; preferiblemente de no más de aproximadamente 100 nM; más preferiblemente de no más de aproximadamente 1 nM; y los más preferiblemente de no más de aproximadamente 0,5 nM, para impedir la adhesión de células Jurkat a queratinocitos epidérmicos humanos normales que expresan la ICAM-1. De acuerdo con este ensayo, los queratinocitos epidérmicos humanos normales se retiran del frasco de cultivo y se resuspenden en medio de ensayo de linfocitos a una concentración de 5 \times 10^{5} células viables/ml. A continuación, se cultivan durante toda la noche alícuotas de 0,1 ml/pocillo en placas de 96 pocillos con fondo plano, se lavan, se resuspenden hasta 1 \times 106 células/ml, y se incuban con diluciones en serie a la mitad, empezando a 500 ng/ml de anticuerpo, a 4ºC, durante 30 minutos. Después de retirar el medio de la monocapa de queratinocitos, se añaden 0,1 ml/pocillo de células marcadas, y se incuban a 37ºdegC, durante 1 hora. Los pocillos se lavan para suprimir las células no unidas, y se mide la fluorescencia.

Los anticuerpos anti-CD11a humanizados son aquéllos que tienen valor de IC50 (nm) de no más de aproximadamente 100 nM; preferiblemente de no más de aproximadamente 50 nM, más preferiblemente de no más de aproximadamente 5 nM, y los más preferiblemente de no más de aproximadamente 1 nM en el ensayo de respuesta de linfocitos mezclados (MLR), usando linfocitos humanos. Tanto para MLR humano y de rhesus, se aislaron linfocitos de sangre periférica de dos donantes no relacionados a partir de sangre entera, heparinizada, y se resuspendieron hasta una concentración de 3 \times 10^{6} células/ml en RPMI 1640 (GIBCO) con aditivos, tal como se describe en el Ejemplo siguiente. Las células estimulantes se convierten en inertes mediante irradiación. Las células respondedoras a una concentración de 1,5 \times 10^{5} células por pocillo se co-diluyen con una cantidad igual de células estimulantes en placas de fondo plano de 96 pocillos. Se añaden a los cultivos diluciones en serie a la mitad del anticuerpo, empezando a una concentración de 10 nM, para obtener un volumen final de 200 \mul/pocillo. Los cultivos se incuban a 37ºC en 5% CO_{2} durante 5 días, y a continuación se pulsan con 1 \muCi/pocillo de [^{3}H]timidina durante 16 horas, y se mide la incorporación de [^{3}H]timidina.

(vi) Fragmentos de anticuerpo

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD11a humanizado es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente estos fragmentos se derivaban a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biphysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:891 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otra estrategia, los fragmentos F(ab')_{2} pueden aislarse directamente a partir de cultivos de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes a los practicantes especialistas.

(vii) Anticuerpos multiespecíficos

En algunas realizaciones, podría ser deseable generar anticuerpos contra el CD11a humanizados multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), que tengan especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo podrían unirse a dos epítopos diferentes de la proteína CD11a. Alternativamente, un brazo anti-CD11a podría combinarse con un brazo que se une a una molécula que activadora sobre un leucocito, tal como una molécula receptora de las células T (por ejemplo, la CD2 o CD3), o a receptores Fc para la IgG (Fc\gammaR), tlaes como el Fc\gammaR1 (CD64), el Fc\gammaRII (CD32), y el Fc\gammaRIII (CD16), con objeto de concentrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el CD11a. Los anticuerpos biespecíficos podrían usarse también para dirigir agentes citotóxicos hacia células que expresen el CD11a. Estos anticuerpos poseen un brazo unidor de CD11a y un brazo que une el agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-\alpha, alcaloide vinca, la cadena A de ricina, el metotrexato, o un hapteno de isótopo radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).

De acuerdo con otra estrategia para preparar anticuerpos biespecíficos, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se remplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias, de tamaño idéntico o similar al de la(s) cadena(s) más larga(s), sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo remplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no deseados, tales como los homodímeros. Consultar WO96/27.011, publicada el 6 de septiembre de 1996.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen los anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, un de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, y el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualesquier procedimientos de entrecruzamiento apropiados. Los agentes entrecruzadores apropiados son bien conocidos en la técnica, y se descubren en la patente estadounidense nº 4.676.980, junto con un cierto número de técnicas de entrecruzamiento.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también han sido descritas en la literatura. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlaces químicos. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se cortan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuación a Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetanolamina, y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, los cuales pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo F(ab')_{2} biespecífica humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y a células T humanas de pulmón, así como de activar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.

También se han descrito otras técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucinas procedentes de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante la fusión de genes. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región gozne para formar monómeros, y a continuación se re-oxidaron para forma los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para construir fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado con un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un engarce, el cual es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. En consecuencia, se fuerza a los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formándose de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Alternativamente, el anticuerpo biespecífico podría ser un "anticuerpo lineal" producido según se describe en Zapata et al., Proteing Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

(viii) Otras modificaciones

Se contemplan otras modificaciones del anticuerpos anti-CD11a humanizado. Por ejemplo, podría ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con relación a la función efectora, por ejemplo, para potenciar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, podrían introducirse residuos cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de puentes disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así formado podría tener una capacidad de internalización mejorada, y/o una capacidad mediada por el complemento de matar células aumentada, y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B., J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). También podrían prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada usando entrecruzadores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede diseñarse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales, y podría por tanto tener capacidades de lisis por complemento y ADCC potenciadas. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito en ésta conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina de origen animal (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito más arriba. Las toxinas enzimáticamente activas, y los fragmentos de las mismas, que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no unidores de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor de momordica charantia, la curcina, la crotina, el inhibidor de sapaonaria officinalis, la gelonina, la mitgelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina, y la tricotecenes, Una diversidad de radionúcleos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-CD11a radioconjugados. Los ejemplos incluyen el ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Los conjugados del anticuerpo y del agente citotóxico se preparan usando una diversidad agentes acoplantes bifuncionales de proteína, tales como el N-succinimidil-3-(-2-piridilditiol) propionato (SPDP), el iminotiolano (IT), los derivados bifuncionales de los imidoésteres (tales como el dimetil adipimidato HCl), los ésteres activos (tales como el disuccinimidil suberato), los aldehídos (tales como el glutaraldehído), los compuestos bis-azido (tales como el bis(p-azidobenzoil)hexanediamina), los derivados de bis-diazonio (tales como el bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamino), los diisocianatos (tales como el tolieno-2,6-diisocianato), y los compuestos bis-activos de fluor (tales como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triamino-pentaacético (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionúcleos al anticuerpo. Ver WO94/11.026.

En otra realización, el anticuerpo podría estar conjugado a un "receptor" (tal como la estreptoavidina) para su utilización en el pre-apuntamiento hacia tumor, ne donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la retirada del conjugado no unido de la circulación usando un agente de eliminación, y administrando a continuación un "ligando2" (por ejemplo, avidina), el cual se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un núcleo radiactivo).

Los anticuerpos anti-CD11a descubiertos en ésta también podrían formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen anticuerpos pueden prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos por Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y las patentes estadounidenses nº 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se descubren en la patente estadounidense nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa, con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros con tamaño de poro definido para rendir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con liposomas tal como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como al doxorubicina) está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizo et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).

El anticuerpo de la presente invención podían usarse también en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo con un enzima activador de la prodroga, el cual convierte una prodroga (por ejemplo, un peptidil-agente quimioterapéutico, ver WO81/01.145) en una droga anti-cáncer activa. Ver, por ejemplo, la WO88/07.378 y la patente estadounidense nº 4.975.278.

El componente enzimático del inmunoconjugado útil para la ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre una prodroga de tal forma que la convierte en su forma más activa, citotóxica.

Los enzimas que son útiles en el procedimiento de esta invención incluyen, pero no se limitan a, la fosfatasa alcalina, útil para convertir prodrogas que contiene fosfatos en drogas libres; la arilsulfatasa, útil para convertir prodrogas que contienen sulfatos en drogas libres; la desaminasa de citosina, útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en la droga anticáncer 5-fluorouracilo; las proteasas, tales como la proteasa de serratia, la termolisina, la subtilisina, las carboxipeptidasas y la catepsinas (tales como la catepsinas B y L), que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptidos en drogas libres; las D-alanilcarobxipeptidasas, útiles para convertir las prodrogas que contienen sustituyentes D-aminoácidos; los enzimas que cortan carbohidratos, tales como la \beta-galactosidasa y la neuraminidasa, útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; la \beta-lactamasa, útil para convertir las drogas derivatizadas con \beta-lactamas en drogas libres; y las amidasas de penicilina, tales como la amidasa de penicilina V o la amidasa de penicilina G, útiles para convertir las drogas derivatizadas en sus nitrógenos de amina respectivamente con grupos fenoxiacetilo y fenilacetilo en drogas libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", pueden usarse para convertir las prodrogas de la invención en drogas activas libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse tal como se describe en ésta para el suministro del abzima a una población de células tumorales.

Los enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos anti-CD11a mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como el uso de los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales discutidos más arriba. Alternativamente, usándose técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden al menos la región unidora de antígeno de un anticuerpo de la invención, unida a al menos una porción funcionalmente activa de un enzima de la invención (ver, por ejemplo, Neuberger, et al., Nature 312:604-608 (1984)).

En ciertas realizaciones de la invención, podría ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en vez de un anticuerpo intacto, con objeto, por ejemplo, de incrementar la penetración en el tumor. En este caso, podría ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con objeto de incrementar su vida media en suero. Esto podría conseguirse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo unidor de un receptor de salvamento en el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, mediante mutación de la región apropiada en el fragmento del anticuerpo, o incorporando el epítopo en una marca peptídica que se fusiona a continuación al fragmento de anticuerpo en uno de los extremos o en el medio, por ejemplo, mediante síntesis del ADN o del péptido). Ver la WO96/32.478, publicada el 17 de octubre de
1996.

El epítopo unidor del receptor de salvamento generalmente constituye una región en la que cualquiera de uno o más residuos aminoácidos procedentes de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Aún más preferiblemente, se transfieren tres o más residuos procedentes de uno o dos bucles del dominio Fc. Todavía más preferiblemente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región FC (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere al CH1, CH3 o región V_{H}, o a más de una de tales regiones, del anticuerpo. Alternativamente, el epítopo se obtiene del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región C_{L} o V_{L}, o a ambas, del fragmento de anticuerpo.

En una realización de las más preferidas, el epítopo unidor del receptor de salvamento comprende la secuencia (5' a 3'): PKNSSMISNTP (SEC Nº ID.: 16), y opcionalmente comprende además una secuencia seleccionada de entre el grupo formado por HQSLGTQ (SEC Nº ID.: 17), HQNLSDGK (SEC Nº ID.: 18), HQNISDGK (SEC Nº ID.: 19), o VISSHLGQ (SEC Nº ID.: 20), particularmente cuando el fragmento de anticuerpo es un Fab o F(ab')_{2}. En otra realización de las más preferidas, el epítopo unidor del receptor de salvamento es un polipéptido que contiene la(s) secuencia(s) (5' a 3'): HQNLSDGK (SEC Nº ID.: 18), HQNISDGK (SEC Nº ID.: 19), o VISSHLGQ (SEC Nº ID.: 20), y la secuencia PKNSSMISNTP (SEC Nº ID.: 16).

Las modificaciones covalentes del anticuerpo anti-CD11a también se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Éstas pueden hacerse mediante síntesis química o mediante corte enzimático o químico del anticuerpo, si son aplicables. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos aminoácidos diana del anticuerpo con un agente derivatizador orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales.

Los residuos cisteinilo más comúnmente se hacen reaccionar con \alpha-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para rendir derivados carboximetilos o carboxiamidometilos. Los residuos cisteinilo también se derivatizan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, acido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)propiónico, cloroacetilfosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil-2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidil se derivatizan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 puesto que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidina. También es útil el bromuro de para-bromofancilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinilo y amino-terminales se hacen reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilos. Otros reactivos apropiados para derivatizar residuos que contienen \alpha-aminos incluyen los imidoésteres, tales como el metil-picolinimidato, el piridoxal fosfato, el piridoxal, el cloroborohidruro, el ácido trinitrobencenosulfónico, la O-metilisourea, la 2,4-pentanediona, y la reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.

Los residuos arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos, el fenilglioxal, la 2,3-butanodiona, la 1,2-ciclohexanodiona, y la ninhidrina. La derivatización de residuos arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas a causa del pK_{a} elevado del grupo funcional guanidino. Además, estos reactivos podrían reaccionar con los grupos de la lisina así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos tirosilo podría realizarse, con interés concreto en la introducción de marcas espectrales en los residuos tirosilo, mediante la reacción con compuestos diazonios aromáticos o con tretranitrometano. Más comúnmente, se usan el N-acetilimidazolio y en tetranitrometano paar formar respectivamente especies O-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro. Los residuos tirosilo se yodan usando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayos.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), en donde R y R' son grupos alquilos diferentes, tales como la 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o la 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos aspartilo o glutamilo se convierten a residuos asparaginilo y glutaminilo mediante su reacción con iones amonio.

Los residuos glutamininilo y asparaginilo frecuentemente se desamidan a respectivamente los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo. La forma desamidada de estos residuos se halla dentro del ámbito de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de grupos hidroxilos de residuos serilos o treonilos, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificaciones covalentes implica el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos en el sentido de que no requieren la producción del anticuerpo en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para la glicosilación unida a N- u O-. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, los azúcares podrían unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilos libres, (c) grupos sulhidrilo libres, tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina. (e) residuos aromáticos, tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en WO97/05.330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La supresión de cualquier grupo carbohidrato presente en el anticuerpo podría conseguirse química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en el corte de la mayoría de los azúcares, excepto el azúcar de engarce (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el anticuerpo intacto. La desglicosilación química fue descrita por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981). El corte enzimático de grupos carbohidratos sobre anticuerpos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicósidasas, tal como describieron Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la forma detallada en las patentes estadounidenses nº 4.640.835, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ó 4.179.337.

B. Vectores, células huéspedes, y procedimientos recombinantes

La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo anti-CD11a humanizado, vectores y células huéspedes que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para su ulterior clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente de la secuencia señal

El anticuerpo anti-CD11a de esta invención podría producirse de forma recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido. La secuencia señal heteróloga preferiblemente seleccionada es una que es reconocida y procesada por la célula huésped (es decir, es cortada por una peptidasa señal). Para las células procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal nativa del anticuerpo anti-CD11a, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, la lpp, o las líderes termoestables de la enterotoxina II. Para la secreción en levadura, la secuencia señal nativa podría sustituirse por, por ejemplo, la líder de la invertasa de levadura, un factor líder (incluyendo los factores-\alpha líderes de Saccharomyces y Kluyveromyces), o la líder de la fosfatasa ácida, la líder de la glucoamilasa de Candida albicans, o la señal descrita en WO90/13.646. En la expresión en células de mamífero, están disponibles las secuencias señal de mamífero así como las líderes secretoras virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simplex.

El ADN para la región precursora se liga en pauta de lectura con el ADN que codifica el anticuerpo anti-CD11a.

(ii) Componente del origen de replicación

Ambos, los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencia que se replican autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es apropiado para levaduras, y varios orígenes virales (de SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son apropiados para los vectores de clonación en mamíferos. Generalmente, el componente del origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (el origen de replicación del SV40 podría usarse típicamente tan sólo porque contiene el promotor temprano).

(iii) Componente de selección del gen

Los vectores de clonación y expresión podrían contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia frente a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, la ampicilina, la neomicina, el metotrexato, o la tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles a partir de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina en Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a la droga y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan las drogas neomicina, el ácido micofenólico y la higromicina.

Otro ejemplo de marcadores de selección apropiados para las células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo anti-CD11a, tales como el de la DHFR, el de la quinasa de timidina, los de las metalotioneínas-1 y -11, preferiblemente de genes de metalotioneínas de primates, el de la desaminasa de adenosina, el de la descarboxilasa de ornitina, etc.

Por ejemplo, primero se identifican las células transformadas con el gen de selección de la DHFR cultivando la totalidad de los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula huésped apropiada, cuando se emplea la DHFR del tipo salvaje, es la línea celular ovárica de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR.

Alternativamente, pueden seleccionarse células huéspedes (particularmente huéspedes del tipo salvaje que contienen DHFR endógena) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-CD11a, la proteína DHFR del tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como la fosfotransferasa de aminoglicósido-3' (APH), mediante el cultivo de las células en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicósido, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Consultar la patente estadounidense nº 4.965.199.

Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, la ATCC nº 44.076 o la PEP4-1. Jones, Genetics 85:12 (1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos que incorporan el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular pKD1 de 1,6 \mum pueden usarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se describió un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante en K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology 8:135 (1990). También se han descrito vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúmina de suero humana recombinante madura por parte de cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology 9:968-975 (1991).

(iv) Componente del promotor

Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente unido al ácido nucleico del anticuerpo anti-CD11a. Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y lactosa, la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp), y promotores híbridos tales como el promotor tac. No obstante, son apropiados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores a usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el anticuerpo anti-CD11a.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases cadena arriba respecto el sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada de 70 a 80 bases cadena arriba respecto el inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, en donde N podría ser cualquier nucleótido. En el extremo 30 de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la adición de la cola poli-A al extremo 3' de la secuencia codificante. La totalidad de estas secuencias se insertan convenientemente en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la quinasa de 3-fosfoglicerato u otros enzimas glicolíticos, tales como la enolasa, la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, la hexoquinasa, la descarboxilada de piruvato, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de la glucosa-6-fosfato, la mutasa del 3-fosfoglicerato, la quinasa de piruvato, la isomerasa de la triosafosfato, la isomerasa de la fosfoglucosa, y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de tener su transcripción por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de la deshidrogenasa de alcohol 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradadores asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y glucosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en levadura se describen aún más en la EP-73.657. Los potenciadores de levadura también se usan ventajosamente con promotores de levaduras.

La transcripción del anticuerpo anti-CD11a a partir de vectores en células huéspedes de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela de los pollos, los adenovirus (tales como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma de las aves, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, y más preferiblemente del Virus 40 de los Simios (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores del choque térmico, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

(v) Componente del elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-CD11a de esta invención por parte de eucariotas superiores se incrementa a menudo insertando en el vector una secuencia potenciadora. Se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). No obstante, típicamente, se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (p.b. 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. Ver también, Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador podría empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto la secuencia que codifica el anticuerpo anti-CD11a, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' respecto el promotor.

(vi) Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huéspedes eucariotas (de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesaria para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mARN. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones 5' y, ocasionalmente, 3' no traducidas de los ADN o cADN eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica el anticuerpo anti-CD11a. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. Consultar la WO94/11.026 y el vector de expresión descubierto en ella.

(vii) Selección y transformación de células huéspedes

Las células apropiadas para la clonación y expresión del ADN en los vectores de ésta son las células procariotas, de levadura, o de eucariotas superiores descritas más arriba. Los procariotas apropiados para este caso incluyen las eubacterias, tales como, los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceas como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Kleibsella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli, tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P, descubierta en DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es la E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son apropiadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de clonación o expresión apropiados para los vectores que codifican el anticuerpo anti-CD11a. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es el más comúnmente usado entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. No obstante, un cierto número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en ésta, tales como Schizosaccharomyces pombe, huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 126.045),K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226), Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como
Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypoclaudium, y huéspedes de Aspergillus, tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped apropiadas para la expresión del anticuerpo anti-CD11a glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes, y las correspondientes células huéspedes permisivas de insecto, a partir de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca del vinagre), y Bombyx mori. Una diversidad de cepas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 del NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori, y tales virus podrían usarse como los virus en ésta de acuerdo con la presente invención.

Los cultivos de células de plantas de algodón, trigo, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden usarse también como huéspedes.

No obstante, el interés ha sido máximo en las células de vertebrados, y la propagación de líneas de células huéspedes de mamíferos útiles en cultivo (cultivo de tejidos) ha devenido un procedimiento rutinario. Son ejemplo de líneas de células huéspedes de mamíferos la línea CV1 de riñón de mono transformadas por el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humana (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); las células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); las células sertoli del ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); las células renales de mono (CV1, ATCC CCL 70); la células renales del mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); la células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); las células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); las células MRC 5; las células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos más arriba para la producción del anticuerpo anti-CD11a, y se cultivan en medio nutritivo convencional, modificado según sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de las células huéspedes

Las células huésped usadas para producir el anticuerpos anti-CD11a de esta invención podrían cultivarse en una diversidad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como el F10 de Ham (Sigma), el Medio Esencial Medio (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son apropiados para cultivar las células huéspedes. Ademas, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Bioche. 102:255 (1980), las patentes estadounidenses nº 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ó 5.122.469; WO87/00.195; o la patente estadounidense Re. 30.985, podrían usarse como medios de cultivo de las células huéspedes. Cualquiera de estos medios podría suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como la insulina, la transferrina o el factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, cálcico, magnésico, y fosfatos), tampones (tales como el HEPES), nucleótidos (tales como la adenosina y la timidina), los antibióticos (tales como la droga Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También podría incluirse cualesquier otros suplementos necesarios en las concentraciones apropiadas, que serán conocidas por los especialistas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, y similares, son las previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes al especialista con la formación ordinaria.

(ix) Purificación del anticuerpo anti-CD11a

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso se retiran los restos en forma de partículas, bien células huéspedes o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Biol. Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, la pasta de células se descongela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), a lo largo de aproximadamente 30 minutos. Los restos celulares pueden retirarse mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta hacia el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Pellicon de Millipore. Podría incluirse un inhibidor de proteasas tal como el PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteolisis, y podrían añadirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, la cromatografía con hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, y la cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2 o \gamma4 humanas (Lindmark et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad más frecuentemente es agarosa, pero hay otras matrices disponibles. La matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirendivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos de los que pueden conseguirse con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Philipsburg, NJ) es útil para la purificación. Hay también disponibles otras técnicas para la purificación de la proteína, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía sobre sílice, la cromatografía con heparina Sepharose™, la cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, la SDS-PAGE, y la precipitación con sulfato amónico, dependiendo del anticuerpo a recuperarse.

A continuación de cualquier paso(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes podría someterse a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo, usando un tampón de elución con un pH de entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente realizada a concentraciones bajas de sal (por ejemplo, desde aproximadamente 0-0,25 M de sal).

C. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, editor A. Osol (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, el citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio; el cloruro de bencetonio; el alcohol fenolbutilo o bencilo; los alquilparabenos tales como el metil o propil parabén; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol; y el m-cresol); los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); las proteínas, tales como la albúmina de suero, la gelatina, o la inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como el sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como el TWEEN™, PLURONICS™, o polietilenglicol (PEG).

La formulación en ésta también podría contener mas de un compuesto activo según sea necesario para la indicación concreta que se esté tratando, preferiblemente aquéllos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre ellas. Por ejemplo, podría ser deseable proporcionar además un agente inmunosupresor. Tales moléculas se presentan convenientemente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también podrían atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se descubren en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, editor A. Osol (1980).

Las formulaciones a usarse en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración.

Podrían prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos idóneos de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato), o el poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y el \gamma etil-L-glutamato, el etilenvinilacetato no degradable, los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el etilenvinilacetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpo encapsulados permanecen en el cuerpo durante un período largo, podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de la exposición a la humedad a una temperatura de 37ºC, lo que resulta en un pérdida de actividad biológica y posibles cambios en su inmunogenicidad. Dependiendo del mecanismo implicado, pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, podría conseguirse la estabilización mediante la modificación de los residuos sulhidrilo, liofilizando a partir de soluciones acuosas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando matrices de polímero específicas.

D. Usos no terapéuticos del anticuerpo

Los anticuerpos de la invención podrían usarse como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan sobre una fase sólida, tal como una resina Sephadex o un papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína CD11a (o un fragmento de la misma) a ser purificada, y a continuación se lava el soporte con un solvente apropiado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína CD11a, la cual está unida por el anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otro solvente apropiado, tal como un tampón glicina, pH 5,5, que liberará la proteína CD11a del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-CD11a también podrían ser útiles en ensayo de diagnóstico de la proteína CD11a, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos, o suero.

Para las aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente se marcará con un grupo detectable. Hay numerosas marcas disponibles que pueden agruparse de forma general en las siguientes categorías:

(a)

Radioisótopos, tales como el ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H y ^{131}I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, editores Coligen et al., Wiley-Interscience, Nueva York, Pubs (1991), y la radiactividad puede medirse usando el recuento del centelleo.

(b)

Están disponibles marcas fluorescentes tales como los quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, el dansilo, la Lissamina, la ficoeritrina, y el Rojo de Texas. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, ver más arriba. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.

(c)

Hay disponibles varias marcas enzima-sustrato y la patente estadounidense nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunas de éstas. El enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico, la cual puede medirse usando técnicas diversas. Por ejemplo, el enzima podría catalizar un cambio de color en un sustrato, el cual puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, el enzima podría alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen más arriba. El sustrato quimioluminiscente pasa a estar químicamente excitado por una reacción química, y podría emitir a continuación luz, la cual puede medirse (usando, por ejemplo, un quimioluminómetro), o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcas enzimáticas incluyen las luciferasas (por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga o luciferasa bacteriana; patente estadounidense nº 4.737.456), la luciferina, las 2,3-dihidroftalazinedionas, la deshidrogenasa del malato, la ureasa, las peroxidasas, tales como la peroxidasa de rábano silvestre (HRPO), la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la lisozima, las oxidasas de sacáridos (por ejemplo, la oxidasa de glucosa, la oxidasa de galactosa y la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato), los oxidasas heterocíclicas (tales como la uricasa y la oxidasa de xantina), la lactoperoxidasa, la microperoxidasa, y similares. Las técnicas para la conjugación de enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," en Methods in Enzymol. (Ed. J. Langone y H. Van Vunakis), Academic Press, Nueva York, 73:147-166 (1981).

Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:

(i)

la peroxidasa de rábano silvestre (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o hidrocloruro de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB));

(ii)

la fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y

(iii)

la \beta-D-galactosidasa (\beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, la p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (4-metilumbeliferil-\beta-D-galactosidasa).

Hay otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato disponibles para los especialistas en la técnica. Para una revisión general de éstas consultar las patentes estadounidenses nº 4.275.149 y 4.318.980.

A veces, la marca está indirectamente conjugada con el anticuerpo. El especialista capacitado estará al caso de las diferentes técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina, y cualquiera de las tres amplias categorías de marcas mencionadas más arriba pueden conjugarse con la avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina, y, de ese modo, la marca puede conjugarse con el anticuerpo de manera indirecta. Alternativamente, para conseguir la conjugación indirecta de la marca al anticuerpo, se conjuga el anticuerpo con un pequeño hapteno (por ejemplo, digoxina) y uno de los cuatro tipos diferentes de marcas mencionados más arriba se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). De este modo, puede conseguirse la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo.

En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-CD11a no necesita estar marcado, y la presencia del mismo puede detectarse usando un anticuerpo marcado, el cual se une al anticuerpo anti-CD11a.

Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como un ensayo de unión competitivo, ensayos en sandwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la muestra de ensayo por la unión a una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína CD11a en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de forma que el estándar y el analito que están unidos al anticuerpo podrían separarse convenientemente del estándar y del analito que permanecen sin unir.

Los ensayos en sandwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica, o epítopo, diferente de la proteína a detectarse. En un ensayo en sandwich, el analito de la muestra de ensayo se une a un primer anticuerpo, el cual está inmovilizado sobre un soporte sólido, y a continuación un segundo anticuerpo se une al analito, formando de este modo un complejo a tres bandas insoluble. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.376.110. El propio segundo anticuerpo podría estar marcado con un grupo detectable (ensayos en sandwich directos) o podría medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un grupo detectable (ensayo en sandwich indirecto). Por ejemplo, el ensayo ELISA es un tipo de ensayo en sandwich, en cuyo caso el grupo detectable es un enzima.

Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor podría ser fresca o congelada, o podría estar empapada en parafina y fijada con un conservante tal como, por ejemplo, la formalina.

Los anticuerpos también podrían usarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo está marcado con un núcleo radiactivo (tal como ^{111}In, ^{99}Tc, ^{14}C, ^{131}I, ^{125}I, ^{3}H, ^{32}P y ^{35}S) de forma que el tumor puede localizarse usando inmunocentelleografía.

E. Equipos de diagnóstico

Por una cuestión de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en forma de equipo, es decir, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayos de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con un enzima, el equipo incluye los sustratos y cofactores requeridos por el enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, podrían incluirse otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos podrían variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos podrían proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes, los cuales, en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

F. Usos terapéuticos del anticuerpo

Se contempla que el anticuerpo anti-CD11a de la presente invención podría usarse para tratar los diversos trastornos asociados con el LFA-1, tal como se describe en ésta.

El anticuerpo anti-CD11a se administra mediante cualquier medio apropiado, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, la administración intralesional (incluyendo la perfusión o, alternativamente, la puesta en contacto del injerto con el anticuerpo antes del trasplante). Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-CD11a se administra convenientemente mediante infusión en pulsos, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, las dosis se administran mediante inyecciones, más preferiblemente mediante inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, tal como se ha definido más arriba, la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, del historial clínico del paciente y de la respuesta al anticuerpo, y de la opinión del médico que atiende. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es la dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No obstante, podrían ser útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. En WO94/04.188 se describe un régimen de dosis de ejemplo.

La composición del anticuerpo se formulará, dosificará, y administrará de forma consistente con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno concreto que se está tratando, el mamífero concreto que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el procedimiento de administración, el plan de administración, y otros factores conocidos por los practicantes médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo a administrarse estará gobernada por tales consideraciones, y es la mínima cantidad necesaria para prevenir, mejorar, o tratar el trastorno mediado por el LFA-1, incluyendo el tratamiento de la artritis reumatoide, la reducción de las respuestas inflamatorias, la inducción de la tolerancia a inmunoestimulantes, la prevención de una respuesta inmune que resultaría en el rechazo de un injerto por parte de un huésped o viceversa, o la prolongación de la supervivencia de un injerto trasplantado. Tal cantidad está preferiblemente por debajo de la cantidad que es tóxica para el huésped o que hace al huésped significativamente más susceptible a infecciones.

No es necesario, pero el anticuerpo opcionalmente se formula con uno o más agentes actualmente usados para impedir o tratar el trastorno en cuestión. Por ejemplo, en la artritis reumatoide, el anticuerpo podría suministrarse conjuntamente con un glucocorticosteroide. Además, la terapia con el péptido receptor de las células T es idóneamente una terapia adjunta para prevenir las señales clínicas de encefalomielitis autoinmune. Para los trasplantes, el anticuerpo podría administrarse concurrentemente con, o por separado de un agente inmunosupresor tal como se ha definido más arriba, por ejemplo, la ciclosporina A, para modular el efecto inmunosupresor. Alternativamente, o en adición, podrían administrarse antagonistas del VLA-4 u otros antagonistas del LFA-1 al mamífero que padece un trastorno mediado por el LFA-1. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo anti-CD11a presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos más arriba. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y por las rutas de administración usadas hasta la fecha, o aproximadamente desde el 1 hasta el 99% de las dosis empleadas hasta la fecha.

G. Artículos manufacturados

En otra realización de esta invención, se proporciona un artículo manufacturado que contiene los materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos más arriba. El artículo manufacturado comprende un contenedor y una marca. Los contenedores apropiados incluyen por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los contenedores podrían estar formados por una variedad de materiales tales como el vidrio y plásticos. El contenedor contiene una composición que es efectiva para tratar la condición y podría tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor podría ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tuviera un tapón perforable por medio de una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-CD11a. La marca sobre el contenedor, o asociada a él, indica que la composición se usa para tratar la condición escogida. El artículo manufacturado podría comprender además un segundo contenedor comprendiendo un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. Además, podría incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaquetado con instrucciones de uso.

Ejemplo Producción de anticuerpos anti-CD11A humanizados

Este ejemplo describe la humanización y eficacia biológica in vitro de un anticuerpo monoclonal anti-CD11a humano de ratón, MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983)). Los estudios previos sobre el MHM24 de ratón han mostrado que, al igual que otros anticuerpos anti-CD11a, puede inhibir la función de las células T (Hildreth et al., J. Immunol. 134:3272-3280 (1985); Dougherty et al., Eur. J. Immunol. 17:943-947 (1987)). Ambos, los MAb de ratón y humanizado impiden efectivamente la adhesión de células T humanas a los queratinocitos humanos, y la proliferación de las células T en respuesta a leucocitos no autólogos en el ensayo de respuesta de linfocitos mezclados (MLR), un modelo para la respuesta a los antígenos de la clase II del MHC (McCabe et al., Cellular Immunol. 150:364-375 (1993)). No obstante, ambos, los MAb de ratón (Reimann et al., Cytometry 17:102-108 (1994)) y los MAb humanizados no reaccionan de forma cruzada con los CD11a de primates no humanos distintos del CD11a de chimpancé. Con objeto de tener un MAb humanizado disponible para estudios pre-clínicos en rhesus, se rediseñó el MAb para que se uniera al CD11a de rhesus cambiando cuatro residuos en una de las regiones determinantes de la complementariedad, CHR-H2, en el dominio pesado variable. La clonación y modelado molecular del dominio-I del CD11a de rhesus sugieren que un cambio, de un residuo lisina en el dominio-I del CD11a humano a un ácido glutámico en el dominio-I del CD11a de rhesus es la razón de que los MAb de ratón y humanizados no se unan al CD11a de rhesus.

Materiales y procedimientos (a) Construcción de F(ab')s humanizados

Se clonó y secuenció el MAb anti-CD11a humano de ratón, MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983); Hildreth et al., J. Immunol. 134:3272-3280 (1985)). Con objeto de tener un plásmido útil para la mutagénesis así como para la expresión de F(ab) en E. coli, se construyó el fagémido pEMX1. Basado en el fagémido pb0720, un derivado del pH0475 (Cunningham et al., Science 243:1330-1336 (1989)), el pEMX1 contiene un fragmento de ADN que codifica una cadena ligera I del subgrupo-\kappa humanizada y una cadena pesada del subgrupo III humanizada (VH-CH1), y un promotor de la fosfatasa alcalina y una secuencia Shine-Dalgamo, derivada ambas de otro plásmido previamente descrito y basado en el pUC119, el pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)). También se introdujo un único sitio de restricción SpeI entre el ADN que codificaba las cadenas ligeras y pesada del F(ab).

Para construir la primera variante de F(ab) del MHM24 humanizado, F(ab)-1, se realizó la mutagénesis dirigida a un sitio (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)) con una plantilla de pEMX1 que contenía deoxiuridina; se cambiaron la totalidad de los seis CDR de la secuencia MHM24. TOdas las otras variantes de F(ab) se construyeron a partir de un plantilla de F(ab)-1. Los plásmidos se transformaron en la cepa XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, San Diego, CA) para la preparación de un ADN de hebra doble y sencilla. Para cada variante, se secuenciaron completamente ambas las cadenas ligera y pesada usando el procedimiento del didesoxinucleótido (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Los plásmidos de transformaron en la cepa 16C9 de E. coli. derivada de la MM294, sembrada sobre placas LB que contenían 5 \mug/ml de carbenicilina, y se seleccionó una única colonia para la expresión de la proteína. La única colonia se cultivó en 5 ml LB-100 \mug/ml de carbenicilina durante 5-8 horas a 37ºC. Los 5 ml de cultivo se añadieron a 500 ml de AP5-100 \mug/ml de carbenicilina y se dejó crecer durante 16 horas en un frasco de agitación atenuada de 4 l, a 37ºC. El medio APS consiste en: 1,5 g de glucosa, 11,0 Hycase SF, 0,6 g de extracto de levadura (certificado), 0,19 g de MgSO_{4} (anhidro), 1,07 g de NH_{4}Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 de NaCl, 120 ml de trietanolamina 1 M, pH 7,4, hasta 1 litro de agua, a continuación esterilizado mediante filtración a través de un filtro Sealkeen de 0,1 \mum.

Las células se recolectaron mediante centrifugación en una botella de centrífuga de 1 litro (Nalgene) a 3000 \timesg, y se retiró el sobrenadante. Después de congelarlo durante 1 hora, se resuspendió el precipitado en 25 ml de MES 10 mM-EDTA 10 mM frío, pH 5,0 (tampón A). Se añadieron 250 \mul de PMSF 0,1 M (Sigma) para inhibir la proteolisis, y 3,5 ml de una solución de reserva 10 mg/ml de lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma) para ayudar en la lisis de la pared celular bacteriana. Después de una agitación suave sobre hielo durante 1 hora, se centrifugó la muestra a 40.000 \timesg durante 15 minutos. Se llevó el sobrenadante hasta 50 ml con tampón A, y se cargó sobre una columna de 2 ml de DEAE equilibrada con tampón A. A continuación, el flujo a través se aplicó sobre una columna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) (0,5 ml de volumen de lecho) equilibrada con tampón A. Se lavó la columna con 10 ml de tampón A y se eluyó con 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, en 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. El F(ab) se cambió entonces de tampón en PBS, usando un Centricon-30 (Amicon) y se concentró hasta un volumen final de 0,5 ml. Se corrieron geles de SDS-PAGE de todos los F(ab) para comprobar su pureza y el peso molecular de cada variante se verificó mediante espectrometría de masas por electrospray.

(b) Construcción de una IgG quimérica y humanizada

Para la generación de las variantes de IgG1 humanas de los MHM24 quiméricos (chIgG1) y humanizados
(HuIgG1), los dominios apropiados (F(ab)-8, Tabla II) de las cadenas variable ligera y variable pesada humanizadas o de ratón se subclonaron en vectores pRK separados, previamente descritos (Gorman et al., DNA Protein Eng. Tech. 2:3 (1990)). Las variantes de barrido de alanina se construyeron mediante mutagénesis dirigida a un sitio (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)) de los plásmidos de la cadena ligera y pesada de la HuIgG1. La secuencia de ADN de cada variante se verificó mediante secuenciación con didesoxinucleótido.

Los plásmidos de la cadena pesada y ligera se cotransfectaron en una línea celular de riñón embrionario humano transformada con adenovirus, la 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), usando un procedimiento de elevada eficiencia (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977); Gorman et al., Science 221:551 (1983)). Se cambió el medio a medio sin suero y se recolectó diariamente durante hasta 5 días. Los anticuerpos se purificaron a partir de los sobrenadantes juntados usando proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). El anticuerpo eluido se cambió a tampón PBS usando un Centricon-30 (Amicon), se concentró a 0,5 ml, se esterilizó mediante filtración usando un Millex-GV (Millipore), y se guardó a 4ºC.

La concentración de anticuerpo se determinó usando un ELISA de unión de Ig total. La concentración de la IgG1 anti-p185^{HER} humanizada de referencia (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) se determinó mediante el análisis de la composición de aminoácidos. Cada pocillo de la placa de 96 pocillos de recubrió con 1 \mug/ml de F(ab')_{2} de anti-IgG humana de cabra (Cappel Laboratories, Westchester, PA) durante 24 horas a 4ºC. Los anticuerpos purificados se diluyeron y añadieron por duplicado a las placas recubiertas. Después de 1,5 horas de incubación, se lavaron las placas con PBS-0,02% Tween 20, y se añadieron 0,1 ml de un dilución 1:2000 de F(ab')_{2} de anti-IgG humana (Cappel) de cabra conjugada con peroxidasa de rábano silvestre. Después de 1,5 horas de incubación se lavaron las placas y se añadieron 0,1 ml de 0,2 mg/ml de hidrocloruro de o-fenilendiamina-0,01% de peróxido de hidrógeno-PBS. Transcurridos 10 minutos, se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 2 M y se leyó la O.D. a 490 nm.

(c) Clonación del dominio-I del CD11a de rhesus

La secuencia del dominio-I de rhesus se obtuvo usando RT-PCR y cebadores derivados de la secuencia de ADN del CD11a humano. En resumen, se aisló el mARN a partir de \sim10^{7} leucocitos de rhesus usando el equipo de purificación de mARN Fast Track (Invitrogen). Se transcribieron de forma inversa 10 \mug de mARN usando la transcriptasa inversa de MuLV. A continuación, se amplificó la primera hebra de cADN mediante 40 ciclos de PCR usando los cebadores:

5'-CACTTTGGATACCGCGTCCTGCAGGT-3'

(hacia adelante) (SEC Nº ID.: 21)

y

5'-CATCCTGCAGGTCTGCCTTCAGGTCA-3'

(hacia atrás) (SEC Nº ID.: 22)

Se purificó una única banda con el tamaño predicho a partir de la PCR usando la electroforesis en gel de agarosa. El producto de la PCR se digirió con el enzima de restricción Sse8387I (Takara) y se ligó a un plásmido que contenía el CD11a humano digerido con el mismo enzima de restricción. Hay dos sitios Sse8387I en la secuencia del CD11a humano, uno a cada lado del dominio-I. El plásmido resultante codificó una quimera consistente en el CD11a humano con un dominio-I de rhesus sustituyendo el dominio-I humano. El análisis de la secuencia de ADN reveló cinco diferencias de aminoácidos entre el humano y el de rhesus. Una diferencia estaba en la región N-terminal del dominio-I (Thr59Ser), y las otras cuatro diferencias estaban en el propio dominio-I: Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu y Val308Ala (Figura 2).

(d) Análisis FACScan de la unión del F(ab) y la IgG a células Jurkat

Se incubaron alícuotas de 10^{6} células T Jurkat con diluciones en serie de anticuerpos humanizados y control en PBS-0,1% de BSA-azida sódica 10 mM, durante 45 minutos a 4ºC. Las células se lavaron y a continuación se incubaron en F(ab')_{2} anti-humano de cabra conjugado con fluoresceína (Organon Teknika, Westchester, PA), durante 45 minutos a 4ºC. Las células se lavaron y a continuación se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se adquirieron 8 \times 10^{3} células mediante el modo en lista y se seleccionaron mediante dispersión de la luz hacia adelante respecto la dispersión lateral de la luz, excluyéndose de ese modo las células muertas y los desechos.

(e) Saturación de la unión para determinar las K_{d} aparentes

Se prepararon anticuerpos marcados radiactivamente usando Iodo-Gen (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadieron 50 \mug de anticuerpo y 1 mCi de ^{125}I (DuPont, Wilmington, DE) a cada tubo, y se incubaron durante 15 minutos a 25ºC. Las proteínas marcadas radiactivamente se purificaron del resto de ^{125}I libre usando columnas PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equilibradas en Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS, Life Technologies, Grand Island, NY) conteniendo un 0,2% de gelatina.

Se purificaron células mononucleares a partir de sangre periférica humana heparinizada, obtenida de dos donantes, usando el Medio de Separación de Linfocitos (LSM, Organon Teknika, Durham, NC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La sangre se centrifugó a 400 \timesg durante 40 minutos a 25ºC sin freno. Se recolectaron las células en la interficie entre el LSM y el plasma se resuspendieron a continuación en HBSS-0,2% de gelatina.

Se purificaron leucocitos a partir de sangre periférica de monos rhesus, obtenida de dos individuos, mediante sedimentación en Dextrano. Se diluyó la sangre con un volumen igual de Dextrano T500 al 3% (Pharmacia) en PBS, y se dejó sedimentar en reposo a 25ºC durante 30 minutos. Después de la sedimentación, las células que permanecían en suspensión se recolectaron y precipitaron mediante centrifugación a 400 \timesg durante 5 minutos. Los eritrocitos residuales se retiraron mediante dos ciclos de lisis hipotónica usando agua destilada y 2\times HBSS. Después de la lisis de los eritrocitos, las células se lavaron en PBS y a continuación se resuspendieron en HBSS-gelatina al 0,2%.

Las afinidades de los anticuerpos se determinaron mediante unión de saturación usando o células mononucleares de sangre periférica (MHM24 de ratón y HuIgG1) o leucocitos de rhesus (MHM23, RhIgG1). En cada ensayo, un anticuerpo marcado radiactivamente se diluyó en serie en HBSS-gelatina al 0,2% por cuadruplicado. La unión no específica se determinó mediante la adición por duplicado de anticuerpo sin marcar homólogo en una concentración final de 500 nM, a lo largo de la dilución en serie. Los linfocitos humanos o los leucocitos de rhesus se añadieron a la placas en un volumen de 170 \mul por pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital de placas. Después de la incubación, se recolectaron las células usando un recolector de células SKATRON™ (Lier, Norway) y se lavaron 10 veces con PBS que contenía gelatina al 0,25% y azida sódica al 0,1%. Las muestras se contaron a continuación durante 1 minuto en un contador gamma Wallac GammaMaster de LKB (Gaithersburg, MD). Los datos se transformaron de cuentas por minuto en nanomolaridad, y a continuación se hizo un ajuste de las gráficas de saturación (unido frente a total) con una curva de cuatro parámetros para determinar los valores de K_{d} (app).

(f) Ensayo de adhesión a la monocapa de queratinocitos

Los queratinocitos epidérmicos humanos normales (Clonetics, San Diego, CA) se retiraron de los frascos de cultivo con tripsina-EDTA, se centrifugaron, y resuspendieron en medio de ensayo de linfocitos (RPMI 1640 (GIBCO)-10% de suero fetal bovino-1% de penicilina/estreptomicina) a una concentración de 5 \times 10^{5} células viables/ml. A continuación se cultivaron alícuotas de 0,1 ml/pocillo durante la noche en placas de 96 pocillos de fondo plano; los pocillos apropiados se estimularon mediante la adición de interferón-gamma (Genentech, South San Francisco, CA) con 100 unidades/pocillo.

Se marcaron células Jurkat del clon E6-1 (ATCC, Rockville, MD) o linfocitos de rhesus purificados (ver procedimientos de MLR) con 20 \mug/ml de Calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR) a 37ºC durante 45 minutos. Después de lavar tres veces con medio de ensayo de linfocitos, las células Jurkat o linfocitos de rhesus se resuspendieron hasta 1 \times 10^{6} células/ml y se incubaron con anticuerpo diluido en serie, a 4ºC durante 30 minutos. Después de retirar el medio de la monocapa de queratinocitos, se añadieron 0,1 ml/pocillo de células marcadas y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Los pocillos se lavaron cinco veces con 0,2 ml/pocillo/lavado de medio de linfocitos a 37ºC para retirar las células no unidas. La fluorescencia se midió usando un Cytofluor 2300 (Millipore, Bedford, MA).

Se construyó un CD11a quimérico de rhesus-humano (Rh/HuCD11a), que comprendía un CD11a humano con un dominio-I de rhesus, mediante mutagénesis dirigida a un sitio (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (19859) sobre un un plásmido plantilla que contenía desoxiuridina y que codificaba el CD11a humano. Se alteraron cuatro residuos: Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu, y Val308Ala (Figura 2). Los plásmidos que codificaban el Rh/HuCD11a y el CD11b humano (EP-364.690) se cotransfectaron en una línea celular de riñón embrionaria humana transformada con adenovirus, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), usando un procedimiento de elevada eficiencia (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977); German et al., Science 221:551 (1983)). Las células 293 transfectadas con Rh/HuCD11a se marcaron con 20 \mug/ml de Calceína AM a 37ºC durante 45 minutos. Después de lavar tres veces con medio de ensayo de linfocitos, las células 293 transfectadas con Rh/HuCD11a se resuspendieron hasta 1 \times 10^{6} células/ml y se incubaron con anticuerpo diluido en serie a 4ºC durante 30 minutos. Después de retirar el medio de la monocapa de queratinocitos, se añadieron 0,1 ml/pocillo de células 293 marcadas y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Los pocillos se lavaron cinco veces con 0,2 ml/pocillo/lavado de medio de linfocitos a 37ºC para retirar las células no unidas. La fluorescencia se midió usando un Cytofluor 2300.

(g) Ensayo de adhesión de la ICAM

Se recubrieron placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) con 0,1 ml/pocillo de 1 \mug/ml de Fc de IgG anti-humana de cabra (Caltag) durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar las placas tres veces con PBS, se bloquearon las placas con BSA al 1%-PBS durante 1 hora a 25ºC. A continuación se lavaron las placas tres veces con PBS y se añadieron 0,1 ml/pocillo de 50 ng/ml de IgG-ICAM humana recombinante, y se incubaron durante la noche.

La ICAM-IgG consistía en los cinco dominios extracelulares de la ICAM humana fusionados sobre un Fc de IgG humana. Se construyó un plásmido para la expresión de una inmunoadhesina ICAM-1 humana (Simmons et al., Cell 331:624-627 (1988) y Staunton et al., Cell 52:925-933 (1988)), denominado pRK.5dICAMGalg. Éste contiene los cinco dominios similares a Ig de la ICAM-1, un sitio de corte de seis aminoácidos reconocido por una variante H64A se la subtilisina BPN', Genenasa I (Carter et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 6:240-248 (1989)), y la región Fc de una IgG1 humana (Ellison et al., Nucleic Acids Research 10:4071-4079 (1982)) en el vector pRK5 (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)). Las células 293 renales embrionarias humanas (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)) se transfectaron establemente con el pRK.5dICAMGalg y el plásmido RSV-neo (Gorman et al., Science 221:551-553 (1983)) para generar una línea celular que expresa los cinco dominios de la Ig de ICAM-1 (5dICAMIg). Se seleccionó un clon expresaba 20 \mug/ml de 5dICAMIg mediante ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA), usando anticuerpos contra el Fc de la IgG humana (Caltag, Burlingame, CA) e ICAM-1 (BBIG-11; R & D Systems, Minneapolis, MN). El sobrenadante del cultivo celular procedente de esta línea celular se cargó sobre una columna de Proteína A (ProsepA, Bioprocessing, Ltd., Durham, England) equilibrada con tampón Hepes 0,01 M (pH 7,0), NaCl 0,5 M, TMAC 0,5 M (cloruro de tetrametilamonio) para suprimir el material no unido específicamente. El tampón TMAC se lavó cuidadosamente de la columna con HBS, y la 5dICAMIg eluyó con tampón Hepes 0,01 M (pH 7,0), MgCl_{2} 3,5 M, y 10% (p/v) de glicerol. El conjunto de la proteína A se dializó extensivamente frente HBS y se concentró.

Los linfocitos de rhesus purificados (ver procedimientos del MLR) se marcaron con 20 \mug de Calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR) a 37ºC durante 45 minutos. Después de lavar tres veces con medio de ensayo de linfocitos, las células de linfocitos de rhesus se resuspendieron hasta 1 \times 10^{6} células/ml y se incubaron con anticuerpo diluido en serie, a 4ºC durante 30 minutos. Después de retirar el medio de las placas recubiertas con ICAM-IgG, se añadieron 0,1 ml/pocillo de células marcadas y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Los pocillos se lavaron cinco veces con 0,2 ml/pocillo/lavado de medio de linfocitos a 37ºC para retirar las células no unidas. La fluorescencia se midió usando un Cytofluor 2300 (Millipore, Bedford, MA).

(h) Respuesta de linfocitos mezclados (MLR) en una dirección

Para ambas, las MLR de humanos y de rhesus, se aislaron los linfocitos de sangre periférica procedentes de dos donantes no relacionados a partir de sangre completa heparinizada, usando Medio de Separación de Linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC). Los linfocitos se resuspendieron hasta una concentración de 3 \times 10^{5} células/ml en RPMI 1649 (GIBCO)-1% de suero AB humano al 10%-1% de glutamina-1% de penicilina/estreptomicina-1% de aminoácidos no esenciales-1% de piruvato-5 \times 10^{-5} M 2-\beta-mercaptoetanol-50 \mug/ml de gentamicina-5 \mug/ml de polimixina B. Las células estimulantes se hicieron inertes mediante irradiación con 3000 rads en un irradiadior de cesio. Las células respondedoras a una concentración de 1,5 \times 10^{5} células por pocillo se co-cultivaron con un número igual de células estimulantes en placas de 96 pocillo de fondo plano. Se añadieron diluciones en serie, a la mitad, de cada anticuerpo a los cultivos para rendir un volumen total de 200 \mul/pocillo. Los cultivos se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 5 días, y a continuación se pulsaron con 1 \muCi/pocillo de [^{3}H]timidina durante 16 horas. La incorporación de [^{3}H]timidina se midió con un contador de centelleo Beckman. Los ensayos se realizaron por triplicado. Como control del isotipo se usó un MAb humanizado anti-p185^{HER2} humano (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) para la HuIgG1 y la RhIgG1. Un Mab de ratón anti-tPa de hámster (Genentech) se usó como control del isotipo (IgG1 de ratón) para el MAb MHM23. El MAb 253 se compró a Immunotech, Inc. (Westbrook, ME).

(i) Modelos gráficos por ordenador del MHM24 de ratón y humanizado

Las secuencias de los dominios VL y VH (Figuras 1A y 1B) se usaron para construir un modelo gráfico por ordenador de los dominios VH-VL del MHM24 de ratón. Este modelo se usó para determinar que residuos estructurales debían incorporarse en el anticuerpo humanizado. También se construyó un modelo de F(ab)-8 para verificar la selección correcta de los residuos estructurales de ratón. La construcción de los modelos se realizó según se ha descrito previamente (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Eigenbrot et al., J. Mol. Biol. 229:969 (1993)).

Resultados (a) Humanización

Las secuencias consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana y del subgrupo \kappa I de la cadena ligera se usaron como la estructura para la humanización (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) (Figuras 1A y 1B). Esta estructura ha sido usada exitosamente en la humanización de otros anticuerpos de ratón (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); Eigenbrot et al., Proteins 18:49-62 (1994)). Todas las variantes humanizadas se prepararon y examinaron inicialmente por su unión como F(ab) expresados en E. coli. Los rendimientos típicos a partir de frascos de agitación de 500 ml fueron de 0,2-0,5 mg F(ab). La espectrometría de masas verificó la masa de cada F(ab) con un error inferior a las 5 unidas de masa.

El CDR-H1 incluía los residuos H28-H35, lo que incluye todos los residuos expuestos tanto de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologica Interest, 5ª edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) y Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989). Los otros bucles hipervariables se definieron de acuerdo con Chothia et al. (1989). Los números de los residuos de la cadena ligera se prefijan con "L"; los números de los residuos de la cadena pesada se prefijan con "H".

TABLA II Unión de variantes del MHM24 humanizado al CD11a humano sobre células Jurkat

2

En la variante inicial F(ab)-1 los residuos del CDR se transfirieron desde el anticuerpo de ratón hasta la estructura humana. Además, el residuo H71 se cambió de la Arg humana a la Val de ratón, puesto que se ha observado previamente que este residuo afecta a las conformaciones de los CDR-H1 y CDR-H2 (Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989); Tramontano, J. Mol. Biol. 215:175 (1990)). Este F(ab) no mostró unión detectable. En el F(ab)-2, el CDR-H2 se extendió para incluir la definición basada en secuencia (es decir, incluir los residuos H60-H65). El EC50 para la unión del F(ab)-2 al CD11a humano fue de 771 \pm 320 ng/ml, lo que es 148 veces más débil que el EC50 de la IgG1 quimérica (5,2 \pm 3,0 ng/ml).

En las humanizaciones previas se ha hallado que los residuos en un bucle estructural (FR-3) adyacente al CDR-H1 y CDR-H2 pueden afectar la unión (Eigenbrot et al., Proteins 18:49-62 (1994)). En el F(ab)-5 se cambiaron 3 residuos en este bucle a su contrapartida de ratón, y esta variante mostró una mejora de 23 veces en la unión (Tabla II). La alteración de los residuos humanos en las posiciones L53 y L55 a los del ratón (es decir, SerL53Thr y GluL55Gln) mejoraron aún más la unión en otras 4 veces (F(ab)-6, Tabla II); esto convirtió efectivamente el CDR-L2 desde la definición basada en la estructura (residuos L50-L52) a la definición basada en la secuencia (residuos L50-L56). La alteración subsiguiente de la PheH27 a la Tyr de ratón en el CDR-H1 resultó en una mejora adicional de 3 veces (F(ab)-7, Tabla II). Finalmente, en base a los modelos de MHM24 de ratón y humanizado, dos de los tres residuos de ratón (H75 y H76) en el FR-3 se cambiaron de nuevo a humanos, y se halló que estos dos residuos no tenían efecto alguno sobre la unión (F(ab)-7 y F(ab)-8, Tabla II). El EC50 promedio para el F(ab)-8 fue ligeramente mejor que el de la IgG1 quimérica (Tabla II). No todos los cambios de humano a ratón resultaron en una unión mejorada. La PheH67 se cambió a la Ala de ratón porque previamente se había hallado que esta posición afectaba la unión (Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)) pero no hubo un efecto evidente (F(ab)-3, Tabla II). Cambiando la ValH71 de nuevo a la Arg humana causó una reducción de 3 veces en la unión (F(ab)-4, Tabla II), apoyando la inclusión de la ValH71 en el fab-1.

Los dominios VL y VH del F(ab)-8 se transfirieron a los dominios constantes de una IgG1 humana. El anticuerpo intacto de longitud completa, HuIgG1, mostró un EC50 equivalente al del F(ab)-8 y mejorado en comparación con la IgG1 quimérica de longitud completa (Tabla II). Cuando se consideran los datos de todos los ensayos de la HuIgG1, incluyendo su uso como un estándar para los ensayos de barrido de alanina y de MLR (ver más abajo), el EC50 para la HuIgG1 contra el CD11a humano fue de 0,042 \pm 0,072 nM (N=15). También se realizó el análisis de unión de saturación para determinar las constantes de disociación aparentes, K_{d}(app): 0,15 \pm 0,02 nM para el MHM24 de ratón y 0,15 \pm 0,04 nM para la HuIgG1 (Tabla III).

TABLA III K_{d} aparente mediante unión de saturación a linfocitos humanos y leucocitos de rhesus

3

(b) Barrido de alanina de los residuos del CDR

Para determinar que residuos del CDR estaban implicados en la unión al CD11a humano se realizó un barrido de alanina (Cunningham et al., Science 244:1081 (1989)) sobre los residuos del CDR de la HuIgG1. Cada variante se ensayó por la unión al CD11a sobre células Jurkat. En la cadena ligera sólo el CDR-L3 contribuye a la unión. La HisL91 tenía un gran efecto (Tabla IV) y es probablemente conformacional puesto que esta cadena lateral debería estar parcialmente enterrada. Los residuos AsnL92 y TyrL94 tenían un efecto más modesto, reduciendo la unión respectivamente en 3-veces y 12-veces. No obstante, hay que destacar que cambiando simultáneamente estos dos residuos a alanina (así como el GluL93Ala) no tenía un efecto aditivo sobre la unión (variante L3, Tabla IV).

TABLA IV Barrido de alanina de los residuos del CDR de MHM24

4

TABLA IV (continuación)

5

TABLA IV (continuación)

6

En la cadena pesada, el CDR-H2 y CDR-H3 son los contribuidores prominentes a la unión. El residuo ThpH33Ala del CDR-H1 tuvo un gran efecto pero este los más probablemente se debe a un cambio conformacional, puesto que el TrpH33 debería estar parcialmente enterrado. El residuo único más importante que contribuía a la unión es el AspH54 en el CDR-H2; el cambio de este residuo a alanina efectuó una reducción de 147-veces en la unión (Tabla IV). Otros residuos en el CDR-H2 implicados en la unión incluyen el GluH56, la GlnH61 y la LysH64 (Tabla IV). En el CDR-H3, la TyrH97Ala redujo la unión en 11-veces y la TyrH100cAla en 8-veces. Como en el CDR-L3, la alteración simultánea de varios residuos CDR-H3 a alanina causó una gran reducción, no aditiva, en la unión (variante H3 respecto TyrH97Ala y TyrH100cAla, Tabla IV). Además, el residuo FR-3 incluido en la humanización, LysH73, también mostró una reducción de 5 veces en la unión cuando cambiaba de alanina a arginina (Tabla IV).

(c) Rediseño de la HuIgG1 para unirse al CD11a de rhesus

Ambos, el MHM24 de ratón y la HuIgG1 mostraron aproximadamente una reducción de 1000-veces en la unión al CD11a de rhesus: la HuIgG1 tenía un EC50 contra el CD11a de rhesus de 45,6 \pm 40,4 nM (N=16) en comparación con un EC50 de 0,042 \pm 0,072 nM contra el CD11a humano. Puesto que el modelo en primates es importante para evaluar la biología, toxicidad, y eficacia del MHM24, se consideró que era ventajoso mejorar la unión de la HuIgG1 al CD11a de rhesus. Inicialmente, se determinaron los residuos de la región hipervariables del MAb que eran importantes para la unión al CD11a humano y CD11a de rhesus, de forma que pudieran alterarse aquéllos importantes para el rhesus pero no para el humano. En consecuencia, las variantes de barrido de alanina también se ensayaron frente el CD11a de rhesus sobre linfocitos de sangre periférica. El hallazgo más importante fue que uno de las variantes de mutación de alanina múltiple, variante H2, se unía 18-veces mejor al CD11a de rhesus que la HuIgG1 (Tabla IV). No obstante, las mutaciones individuales de los tres residuos incluidos en la variante H2 mostraron una mejora mínima en la unión: HisH52Ala, 0,7-veces mejor, SerH53Ala, 0,7-veces mejor, y SerH55Ala, 1,3-veces peor (Tabla IV). Una serie de mutaciones dobles en estos tres residuos mostró que la combinación HisH52Ala-SerH53Ala era la mejor, proporcionando una mejora de 77-veces en la unión en comparación con la HuIgG1 (variantes H2A1, H2A2 y H2A3, Tabla IV). Además, las variantes AspH54Ala y GluH56Ala también causaban una mejora de 3-veces respecto la HuIgG1 (Tabla IV), aunque la Asp54 es el residuo unidor más importante en la HuIgG1 con respecto al CD11a humano.

En un intento de hallar una única sustitución en la posición H54 que mejorara la unión al CD11a de rhesus, pero que no redujera la unión al CD11a humano, la posición H54 se sustituyó con una variedad de aminoácidos. Todas las sustituciones redujeron la unión en más de un orden de magnitud, mientras que la sustitución AspH54Asn mejoraba la unión a rhesus en 10-veces (Tabla V).

TABLA V Sustitución de aminoácidos en AspH54

7

Puesto que no se notaron efectos aditivos para los cambios en las posiciones H52-H53, estas se combinaron con una variedad de cambios en las posiciones H54 y H56 (Tabla VI). Para todas las variantes, H52 y H53 fueron alanina. En una serie, la posición de H54 fue Asn y la posición de H56 fue GLu (original), Ala, Asn o Gln. Ninguna de estas variaciones mejoró la unión al CD11a de rhesus respecto la variante H2A1 (Tabla VI). En otra serie, la posición H54 fue Ala y la posición H56 fue Glu (original), Ala, Ser o Asn, y, de nuevo, todas fueron peores que la variante H2A1. En la tercera serie, la posición H54 fue Ser y la posición H56 fue Glu (original), Ala, Ser o Asn. Dos de estas variantes presentaron una unión mejorada al CD11a de rhesus en comparación con la variante H2A1 (H2C11 y H2C12, Tabla VI). El EC50 para el CD11a de rhesus de estas dos variantes fue de 0,11 \pm 0,11 nM (N=9) para la H2C11 y 0,19 \pm 0,08 nM (N=7) para la H2C12. Estos valores eran 3- a 5-veces más débiles que la EC50 de la HuIgG1 para el CD11a humano (0,042 nM), pero son una mejora de 240- a 415-veces respecto el EC50 de la HuIgG1 por el CD11a de rhesus (45,6 nM). La H2C12 se denominará de ahora en adelante como RhIgG1. Los valores de K_{d} aparente a partir de experimentos de unión de saturación mostraron que la RhIgG1 se unía al CD11a de rhesus, así como que el MHM23 de ratón se unía al CD18 de ratón (Tabla III).

TABLA VI Unión de las variantes del CDR-H2 al CD11a humano y de rhesus

8

En la interacción HuIgG1-CD11a humano, AspH54 fue el residuo más importante (Tabla IV); el cambio de este residuo a otros aminoácidos reducía significativamente la unión, ocurriendo la menor reducción con los cambios a Glu, As, y Gln. No obstante, en la interacción HuIgG1-CD11 a de rhesus, AspH54 fue perjudicial, puesto que el cambio de este residuo a Ala o Asn mejoraba la unión (Tabla V). Con objeto de comprender esta diferencia entre la unión a los CD11a humano y de rhesus, éste último se clonó a partir de una biblioteca de PLB de rhesus. La Figura 2 muestra que el dominio-I de del CD11a de rhesus difiere del dominio-I del CD11a humano en tan sólo cuatro posiciones: 133, 189, 197 y 308. Previamente, se había mapado el epítopo para el CD11a humano del MHM24 en los residuos 197-203 (Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)), lo que incluye el cambio de la Lys197 humana al Glu197 de rhesus en rhesus.

d) Ensayos de adhesión de células de queratinocitos

Se compararon el MHM24 de ratón, la IgG1 quimérica, y la HuIgG1 por su capacidad para impedir la adhesión de células Jurkat (células T humanas que expresan el LFA-1) a queratinocitos epidérmicos humanos normales que expresan la ICAM-1. Los tres anticuerpos se comportaron de forma similar (Figura 3) con valores de IC50 similares (Tabla VII).

TABLA VII Bloqueo de la adhesión celular por parte de variantes del MHM24

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Ni el MHM24 de ratón, ni el humanizado bloquearon la adhesión de linfocitos de cinomolgus o rhesus a queratinocitos humanos. Cuando se comparó la RhIgG1 con el anticuerpo MHM23 anti-CD18 humano (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983); Hildreth et al., J. Immunol. 134:3272-3280 (1985)) en el bloque de la adherencia de linfocitos de rhesus a queratinocitos humanos, la RhIgG1 fue 74-veces menos eficaz que el MHM23 (Figura 4A, Tabla VII). Sin embargo, cuando se recubrieron las placas con ICAM-1 humana recombinante (en vez de queratinocitos humanos), la RhIgG1 fue tan sólo 4-veces menos eficaz que el MHM23 (Figura 4B, Tabla VII). Se transfectó un CD11a quimérico, formado por el CD11a humano en el cual el dominio-I se había mutado a rhesus (Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu, Val308Ala), en células 293 renales embrionarias humanas. De nuevo, la RhIgG1 fue tan sólo 4-veces inferior respecto el MHM23 en el bloqueo de estas células Rh/HuCD11a-293 para impedir su adhesión a los queratinocitos humanos (Figura 4C, Tabla VII).

Los anticuerpos de isotipo de control para la RhIgG1 (anticuerpo anti-p185HER2 humanizado; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) y MHM23 (MAb 354 de ratón, una IgG1 de ratón anti-tPA de hámster) no bloquearon la unión de los linfocitos de rhesus a los queratinocitos humanos o a la ICAM-1 recombinante (Figuras 4A, 4B), o la del Rh/HuCD11a a los queratinocitos humanos (Figura 4C). Esto implica que las prestaciones reducidas de la RhIgG1 en comparación con el MHM23 de ratón en el ensayo de linfocitos de rhesus:queratinocitos humanos no se debía a alguna interacción no esperada del Fc humano de la HuInG1 (en comparación con el Fc del MHM23 de ratón) con los linfocitos de rhesus, la cual podría reducir la concentración de RhIgG1 disponible para la unión al CD11a de rhesus. Los datos de ICAM-1 humana recombinante muestran que la RhIgG1 se está uniendo a los linfocitos de rhesus e impidiendo su adhesión casi tan bien como el MHM23 de ratón (Figura 4B, Tabla VII). Los datos de Rh/HuCD11a-293 (Figura 4C, Tabla VII) muestran que la RhIgG1 no se está uniendo a dianas sobre los queratinocitos humanos (en comparación con la HuIgG1), lo cual podría reducir la concentración de RhIgG1 disponible para unirse al CD11a de rhesus. Además, la K_{d}(app) de la RhIgG1 por los leucocitos de rhesus fue similar con (donante rhesus 3) y sin (donante rhesus 1) la adición de 1 mg/ml de IgG1 humana (Tabla III). Esto muestra que la unión de la RhIgG1 es específica del CD11a de rhesus.

(e) Ensayos de respuesta de linfocitos mezclados

En los MLR, la HuIgG1 presentó un valor de IC50 2-veces más débil que el MHM24 de ratón (Tabla VIII, Figura 5).

TABLA VIII Resultados del ensayo de respuesta de linfocitos mezclados

10

Ambos, los MAb de ratón y humanizado lo hicieron de 10- a 20-veces mejor que el MAb 25.3, el cual se había ensayado previamente in vivo (Fischer et al., Blood 77:249-256 (1991); Stoppa et al., Transplant. Int. 4:3-7 (1991); Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)). La variante RhIgG1 unidora a rhesus presentó un valor de IC50 ligeramente mejor que el MHM23 de ratón (Tabla VIII). Se usaron diferentes donantes de sangre respondedores:estimulantes en ensayos independientes y los resultados no variaron significativamente. La K_{d} de la RhIgG1 para el CD11a de rhesus es aproximadamente 26-veces inferior a la K_{d} de la HuIgG1 por el CD11a humano (Tabla III), y esto se refleja en los valores de IC50 derivados de los ensayos de MLR (Tabla VIII).

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuepos Anti-CD11a Humanizados

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 24

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

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(B)

DIRECCIÓN: 1 DNA Way

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAIS: Estados Unidos de América

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(F)

(ZIP): 94080

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(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: WinPatIn (Genentech)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE REGISTRO:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Lee, Wendy M.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 40.378

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: P1014PCT

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(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 650/225-1994

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(B)

TELEFAX: 650/952-9881

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 1:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 2:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 3:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 6:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 184 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 184 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 8:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His Trp Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 12:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 13

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTTTGGAT ACCGCGTCCT GCAGT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCCTGCAG GTCTGCCTTC AGGTCA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

19

Claims (31)

1. Anticuerpo anti-CD11a humanizado que contiene un dominio variable que tiene, incorporado en un dominio variable de anticuerpo humano, aminoácidos procedentes de un anticuerpo donante no es humano, los cuales se unen al epítopo del dominio-I de un CD11a humano, que comprende la secuencia KHVKHML; y que comprende un residuo aminoácido del anticuerpo donante en uno o más sitios seleccionados de entre el 27, 28, 30, 49, 71 y 73 del dominio variable de la cadena pesada, y/o un residuo humano en la posición 59 en el dominio variable de la cadena pesada (numeración de residuos según Kabat).

2. Anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, que comprende un residuo aminoácido de anticuerpo donante en una o más de las posiciones 49, 71 y 73 en el dominio variable de la cadena pesada.

3. Anticuerpo humanizado de la reivindicación 2, que comprende residuos del anticuerpo donante en la totalidad de dichas tres posiciones, 49, 71 y 73.

4. Anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende residuos del anticuerpo donante en una o más de las posiciones 27, 28 y 30 del dominio variable de la cadena pesada.

5. Anticuerpo humanizado de la reivindicación 4, que comprende residuos del anticuerpo donante en la totalidad de las tres posiciones 27, 28 y 30 del dominio variable de la cadena pesada.

6. Anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un residuo humano en dicha posición 59 del dominio variable de la cadena pesada.

7. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos residuos que no son humanos se derivan de la SEC Nº ID.: 1 y SEC Nº ID.: 4.

8. Anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 7, que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende al menos los siguientes residuos procedentes de la secuencia de aminoácidos del CDR1 (SEC Nº ID.: 10), del CDR2 (SEC Nº ID.: 11), y del CDR3 (SEC Nº ID.: 12) del anticuerpo humanizado identificado en ésta, y en la Figura 1B, como F(ab)-8, a saber, Trp33 en el CDR1, Asp54, Glu56, Gln61 y Lys64 en el CDR2, y Tyr97 y Tyr199c en el CDR3.

9. Anticuerpo humanización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los residuos de la cadena pesada humana se derivan de la secuencia consenso de un subgrupo III V_{H}.

10. Anticuerpo anti-CD11a humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de,

(a)

CDR2 (SEC Nº ID.: 11), o

(b)

CDR1 (SEC Nº ID.: 10), CDR2 (SEC Nº ID.: 11), y CDR3 (SEC Nº ID.: 12), o

(c)

SEC Nº ID.: 5,

del anticuerpo humanizado identificado en ésta como F(ab)-8 en la Figura 1B;

o una variante del mismo por medio de la inserción y/o supresión dentro de o adyacente a un residuo de CDR, y/o la sustitución de un residuo del CDR, o por medio de la supresión y/o inserción y/o sustitución de residuos dentro de la secuencias de aminoácidos mostradas para la regiones variables del F(ab)-8 (SEC Nº ID.: 2 y 5).

11. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los residuos de la cadena ligera humana se derivan de una secuencia consenso kappa 1 humana.

12. Anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 11, que tiene todos los residuos estructurales de la cadena ligera consenso kappa 1 humana.

13. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene una región variable de cadena ligera que comprende al menos los siguientes residuos a partir de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado identificado en ésta, y en la Figura 1A, como F(ab)-8, a saber, His91, Asn92 y Tyr94 en el CDR3 (SEC Nº ID.: 15).

14. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del CDR1 (SEC Nº ID.: 13), del CDR2 (SEC Nº ID.: 14), y del CDR3 (SEC Nº ID.: 15) del anticuerpo humanizado identificado en ésta, y en la Figura 1A, como F(ab)-8.

\newpage

15. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC Nº ID.: 2 para la región variable de la cadena ligera.

16. Anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC Nº ID.: 5 para la región variable de la cadena pesada.

17. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual es un anticuerpo de longitud completa.

18. Anticuerpo humanizado de acuerdo con de las reivindicaciones 1 a 16, el cual es un fragmento de anticuerpo.

19. Anticuerpo anti-CD11a humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene al menos una de las siguientes propiedades:

(a)

se une con un valor de K_{d} de no más de aproximadamente 1 \times 10^{-8} M,

(b)

tiene un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 1 nM para prevenir la adhesión de células Jurkat a queratinocitos epidérmicos humanos normales que expresan la ICAM-1,

(c)

tiene un valor de IC50 (nM) de no más de aproximadamente 1 nM en un ensayo de respuesta de linfocitos mezclados.

20. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, unido a una marca detectable.

21. Anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, inmovilizado sobre una fase sólida.

22. Conjugado que comprende el anticuerpo anti-CD11a humanizado de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, unido a un agente citotóxico.

23. Procedimiento para determinar la presencia de una proteína CD11a, el cual comprende exponer una muestra, sospechosa de contener la proteína CD11a, al anticuerpo anti-CD11a humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, y determinar la unión de dicho anticuerpo a la muestra.

24. Equipo que comprende el anticuerpo anti-CD11a humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, e instrucciones para el uso del anticuerpo anti-CD11a humanizado para detectar la proteína CD11a.

25. Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-CD11a humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

26. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 25.

27. Célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 25, o el vector de acuerdo con la reivindicación 26.

28. Procedimiento de producción de un anticuerpo anti-CD11a humanizado que comprende cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 27, de manera que se exprese el ácido nucleico; y recuperar el anticuerpo anti-CD11a humanizado a partir de la célula hospedadora.

29. Utilización de un anticuerpo anti-CD11a humanizado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno mediado por el LFA-1 en un paciente.

30. Utilización del anticuerpo anti-CD11a humanizado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la preparación de un medicamento destinado a la inhibición de la función inmune dependiente de células T.

31. Utilización de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho trastorno se selecciona de entre el asma, la artritis reumatoide, el rechazo del injerto respecto el hospedador en los trasplantes, la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico, la dermatitis, la enfermedad de Crohn, y la colitis ulcerante.