ES2221961T3 - Diagnostico del sindrome de fatiga cronica. - Google Patents
Diagnostico del sindrome de fatiga cronica.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL SINDROME DE FATIGA CRONICA QUE SE DIAGNOSTICA A TRAVES DE LA DETECCION DE UNA MOLECULA RNASA L DE APROX. 30 KDA, BAJO CONDICIONES NATIVAS, EN EXTRACTOS CELULARES DE CELULAS QUE CONTIENEN RNASA L, TALES COMO CELULAS SANGUINEAS MONONUCLEARES PERIFERICAS. LAS PROTEINAS SE FRACCIONAN SEGUN EL PESO MOLECULAR, BAJO CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES. DICHAS PROTEINAS FRACCIONADAS SON SOMETIDAS A ENSAYO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE DICHA PROTEINA DE APROX. 30 KDA QUE TIENE ACTIVIDAD DE ENZIMA RNASA L DEPENDIENTE 2-5A. LA SEVERIDAD DE LA AFECCION PUEDE DETERMINARSE MEDIANTE UNA PRUEBA PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE MOLECULAS DE RNASA L QUE TIENEN PESOS MOLECULARES APROXIMADOS DE 30 Y 80 KDA. LA PRESENCIA DE DICHA RNASA L DE APROX. 30 KDA Y LA AUSENCIA DE LA MOLECULA RNASA L DE APROX. 80 KDA, SE CORRESPONDE CON UN SINDROME DE FATIGA CRONICA SEVERO. LA PRESENCIA DE AMBAS MOLECULAS, CITADAS ANTERIORMENTE, INDICA UNA MENOR SEVERIDAD DE LA AFECCION DE DICHO SINDROME. BAJO CONDICIONES DESNATURALIZANTES Y EN PRESENCIA DE INHIBIDORES DE PROTEASA, PUEDE DIAGNOSTICARSE DICHO SINDROME A TRAVES DE LA DETECCION DE UNA PROTEINA DE UNION CON EL 2-5A DE APROX. 37 KDA.
Description
Diagnóstico del síndrome de fatiga crónica.
La presente invención se refiere al diagnóstico
del síndrome de fatiga crónica (CFS, en su abreviatura en inglés) a
través de la detección de un marcador molecular único asociado con
la enfermedad.
El síndrome de fatiga crónico (CFS) es una
enfermedad de etiología desconocida, asociada, a menudo, con una
aparición súbita, síntomas semejantes a los de la gripe, fatiga
debilitante, febrícula, mialgia y disfunción neurocognitiva. Los
pacientes con CFS muestran, de manera típica, puntuaciones reducidas
del rendimiento de Karnofsky (KPS). El ensayo de rendimiento de
Karnofsky mide la capacidad del individuo para funcionar y llevar a
cabo actividades normales. Las puntuaciones de Karnofsky van desde
cero para un paciente afuncional o muerto, hasta 100, para una
función completamente normal. El diagnóstico del CFS se realiza
todavía por exclusión.
Una ingente cantidad de pruebas sugiere que el
CFS está asociado a una desregulación de la inmunidad tanto humoral
como celular, incluyendo la respuesta a mitógenos, reactivación de
virus, producción anormal de citoquinas, función disminuida de las
células asesinas naturales y variaciones en los metabolitos
intermedios. Se ha señalado que las anomalías clínicas e
inmunológicas observadas en el CFS podrían incluir defectos en las
vías inducibles por interferón, dependientes del ARN de doble cadena
(dsRNA, ARNdc), es decir, las vías de defensa antiviral de la
2',5'-oligoadenilato
(2-5A)-sintetasa/ARNasa y
p68-quinasa (PKR) (Suhadolnik et al., Clin.
Infect. Dis. 18:896-8104, 1994; Suhadolnik et
al., In Vivo 8:599-604 (1994). La vía de la
2-5A-sintetasa/ARNasa L forma parte
del mecanismo de defensa antiviral en las células de mamíferos; esta
vía interviene, asimismo, en la regulación del crecimiento y
diferenciación celulares (Lengyel, Ann. Review Biochem.
51:251-282, 1982; Sen et al., Adv. Virus Res.
42:57-102, 1993).
Cuando resulta activada por ARNdc, la
2-5A-sintetasa convierte el ATP en
oligoadenilatos enlazados a 2',5' con fosfatos
5'-terminales. La 2-5A
biológicamente activa se une y activa una endorribonucleasa latente,
la ARNasa L, que hidroliza el ARN viral y celular de cadena simple,
principalmente después de secuencias UpNp, inhibiendo de esta forma
la síntesis de proteínas.
Estudios previos de la vía de
2-5A-sintetasa/ARNasa L en el CFS
han revelado una desregulación estadísticamente significativa, en la
que la 2-5A-sintetasa se encuentra
presente, de manera predominante, en su forma activada, los niveles
de 2-5A bioactiva son elevados, y la actividad de
ARNasa L se halla regulada positivamente (Suhadolnik et al.,
Clin.Infect. Dis., véase antes; Suhadolnik et al., In
Vivo, véase antes). La expresión de la
serin-treonina-quinasa, PKR, está
regulada negativamente en el CFS (Suhadolnik et al., In Vivo,
véase antes). La PKR controla la iniciación de la traducción de
proteínas a través de la fosforilación de eIF-2.
En Analytical Biochemistry (192,
268-276, 1991), Floyd-Smith describe
la investigación sobre una endorribonucleasa latente, la ARNasa L,
que se une y resulta activada por
(2'-5')-oligoadenilatos
((2'-5') (A)_{n}, n = 2 a 15). La
caracterización se lleva a cabo por electroforesis sobre gel de
poliacrilamida y ensayos de transferencia de afinidad.
En la publicación Journal of Interferon
Research (vol. 7, nº 6, 1987, página676), Silverman describe el
aislamiento de proteínas de 80 kDa y 33 kDa que se fijan a
2-5A a partir de extractos de hígado de ratón.
En Biochemistry (vol. 27, nº 24, 1988,
páginas 8840-8846), Suhadolnik describe el uso de
fotosondas de 2- y
8-azido-trímero-5'-trifosfato
de 2-5A para investigar la activación y fijación de
ARNasa L y otras proteínas de unión a 2-5A.
A pesar de estos intentos, no se ha logrado
identificar un marcador molecular manifiesto para el CFS. Se
requiere un ensayo bioquímico, basado en un marcador molecular
claramente definido para CFS, que puede constituir la base para un
diagnóstico definitivo del CFS.
En el presente documento, se pueden utilizar las
siguientes abreviaturas:
| AMP | Adenosin-5'-monofosfato; |
| 2-azido-AMP | 2-azido-adenosín-5'-monofosfato; |
| 8-azido-AMP | 8-azido-adenosín-5'-monofosfato; |
| 2,8-azido-AMP | 2,8-azido-adenosín-5'-monofosfato; |
| 2-5A | 2',5'-oligoadenilato, es decir, un oligómero del ácido adenílico con enlaces |
| (2'-5')-fosfodiéster y 5'-trifosfato; |
| CFS | Síndrome de fatiga crónica; |
| dsRNA / ARNdc | ARN de doble cadena; |
| ELISA | Ensayo de inmunosorción unido a enzimas; |
| eteno-AMP | N^{1}N^{6}-etenoadenosín-5'-monofosfato; |
| GST | glutatión S-transferasa; |
| HEPES | Ácido 4-(2-hidroxietil)-piperazin-etanosulfónico; |
| PBMC | Células mononucleares de sangre periférica; |
| PBS | Solución salina tamponada con fosfato; |
| p_{3}A_{3} | Trímero de ácido adenílico con enlaces de (2'-5')-fosfodiéster y 5'-trifosfato; |
| pApAp(8-azidoA) | 5'-O-fosforil\rightarrowadenilil-(2'-5')-adenilil-(2'\rightarrow5')-8-azido-adenosina; |
| poli(U)-3'-pCp | Ácido poliuridílico con un residuo de citosina unido a su extremo 3'; |
| SDS-PAGE | Electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato sódico-poliacrilamida. |
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para diagnosticar el síndrome de
fatiga crónica que comprende analizar una muestra de un paciente
para detectar la presencia de una proteína que se una a un
2'-5'-oligoadenilato, proteína que
tiene un peso molecular de 29 a 31 kDa bajo condiciones nativas,
siendo la presencia de dicha proteína en la muestra del paciente
diagnóstica para el síndrome de fatiga crónica.
Preferentemente, la proteína es ARNasa L.
De manera conveniente, el método comprende,
adicionalmente, analizar la muestra del paciente para detectar la
presencia de una ARNasa L de 79 a 81 kDa en donde (i) la presencia
de una molécula de ARNasa L de 29 a 31 kDa y la ausencia de una
molécula de ARNasa L de 79 a 81 kDa indican la existencia de un
síndrome de fatiga crónica grave, y (ii) la presencia de moléculas
de ARNasa L de ambos pesos moleculares indica síndromes de fatiga
crónica menos graves.
De forma ventajosa, el ensayo de la muestra del
paciente comprende:
(a) fraccionar las proteínas en la muestra del
paciente de acuerdo con el peso molecular, bajo condiciones
nativas;
(b) analizar las proteínas fraccionadas para
detectar la presencia de una proteína de 29 a 31 kDa y,
opcionalmente, de 79 a 81 kDa, con actividad de ARNasa L;
Preferentemente, el ensayo de actividad de ARNasa
L comprende;
(a) detección de la formación de productos de
escisión específicos de la hidrólisis de ARN 28S y/o ARN
18S; o
(b) detectar la hidrólisis de
poli(U)-3'-pCp.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención, se proporciona un método para diagnosticar el
síndrome de fatiga crónica que comprende analizar una muestra de un
paciente para detectar la presencia de una proteína que se fije a
2',5'-oligoadenilato, con un peso molecular aparente
de 36 a 38 kDa en electroforesis sobre gel de
dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, siendo la presencia de dicha
proteína en la muestra del paciente diagnóstica para el síndrome de
fatiga crónica.
De manera conveniente, el método comprende:
(a) poner en contacto una muestra de un paciente
con una sonda que comprende un compuesto según la fórmula I,
portador de un marcador detectable, bajo condiciones suficientes
para formar conjugados covalentes de dicho compuesto de sonda
marcado y proteínas que se fijan a
2',5'-oligoadenilatos en la muestra:
en
donde
m es un número entero de 0 a 3;
n es un número entero de 1 a 3, y
cada R_{1} y cada R_{2} es,
independientemente de cada R_{1} y R_{2}, es hidrógeno o
N_{3}, con la condición de que al menos un R_{1} o R_{2} sea
N_{3},
o una sal hidrosoluble de dicho
compuesto,
(b) poner en contacto la muestra que contiene
dichos conjugados covalentes con un anticuerpo que se une a especies
de ARNasa L en la muestra;
(c) separar las proteínas en dicha muestra por
electroforesis sobre gel; y
(d) examinar dichas proteínas separadas para
detectar la presencia de proteínas marcadoras que
- (i)
- hayan formado un conjugado covalente con el compuesto de sonda marcado, y
- (ii)
- estén unidas a dicho anticuerpo;
siendo la presencia de una proteína
marcadora de peso molecular aparente de 36 a 38 kDa, según la
electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, diagnóstica para el síndrome
de fatiga
crónica.
De manera ventajosa, el método comprende,
adicionalmente, analizar la muestra del paciente para detectar la
presencia de una proteína marcadora de 79 a 81 kDa, en donde la
presencia de una proteína marcadora con un peso molecular aparente
de 36 a 38 kDa, según la electroforesis sobre gel de
dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, y la ausencia de una proteína
marcadora con un peso molecular aparente de 79 a 81 kDa, según la
electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, es diagnóstica para el
síndrome de fatiga crónica grave.
Preferentemente, n es 1, m es 1, y cada R_{2}
es hidrógeno en el compuesto de sonda.
De forma conveniente, el compuesto de sonda es
5'-O-fosforil-adenilil-(2'\rightarrow5')-adenilil-(2'\rightarrow5')-8-azido-adenosina,
o una sal de la misma.
En consecuencia, la muestra se prepara en
presencia de un inhibidor de proteasa agregado.
Preferentemente, la muestra comprende sangre o
una fracción de la misma.
De manera conveniente, la muestra comprende un
extracto citoplásmico de células mononucleares de sangre
periférica.
En el presente documento, se describe un método
para diagnosticar el síndrome de fatiga crónica, que comprende
analizar una muestra de un paciente para detectar la presencia de la
presencia de una ARNasa L de aproximadamente 30 kDa. El método
descrito comprende:
(a) fraccionar la proteína en la muestra del
paciente según su peso molecular bajo condiciones de no
desnaturalización, y (b) analizar las proteínas fraccionadas para
detectar la presencia de una proteína de aproximadamente 30 kDa con
actividad de ARNasa L. El ensayo de actividad de ARNasa L comprende,
por ejemplo, la detección de productos de escisión específicos (SCP)
de la hidrólisis de ARN 28S y/o 18S, o la detección de
la hidrólisis de
poli(U)-3'-pCp.
Asimismo, se describe en este documento otro
método para diagnosticar el síndrome de fatiga crónica, que
comprende:
(a) poner en contacto una muestra de un paciente,
preparada en presencia de un inhibidor de proteasa agregado, con una
sonda que comprende un compuesto según la fórmula I, portador de un
marcador detectable, bajo condiciones suficientes para formar
conjugados covalentes de dicho compuesto de sonda marcado y
proteínas que se unen a 2',5'-oligoadenilatos:
en
donde
m es un número entero de 0 a 3,
n es un número entero de 1 a 3, y
cada R_{1} y R_{2} representan hidrógeno o
N_{3}, con la condición de que al menos un R_{1} o R_{2} sea
N_{3},
o una sal hidrosoluble de dicho
compuesto;
(b) poner en contacto la muestra que contiene
dichos conjugados covalentes con un anticuerpo que se una a especies
de ARNasa L en la muestra;
(c) separar las proteínas en dicha muestra por
electroforesis sobre gel, y
(d) examinar dichas proteínas para detectar la
presencia de proteínas marcadoras, que
- (i)
- hayan formado un conjugado covalente con este compuesto de sonda marcado, y
- (ii)
- estén unidas a dicho anticuerpo;
siendo la presencia de una proteína
marcadora con peso molecular aparente de aproximadamente 37 kDa,
según la electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, diagnóstica para el síndrome
de fatiga
crónica.
Igualmente, se describe en el presente documento
un método adicional para detectar un síndrome de fatiga crónica
grave, que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de un paciente
con una sonda que comprende un compuesto según la fórmula I,
portador de un marcador detectable, bajo condiciones suficientes
para formar conjugados covalentes de dicha
sonda marcada y proteínas que se unen a 2',5'-oligoadenilato en la muestra;
sonda marcada y proteínas que se unen a 2',5'-oligoadenilato en la muestra;
en
donde
m es un número entero de 0 a 3,
n es un número entero de 1 a 3, y
cada R_{1} y cada R_{2} es N_{3},
o una sal hidrosoluble de dicho
compuesto;
(b) poner en contacto la muestra que contiene
dichos conjugados covalentes con un anticuerpo que se une a especies
de ARNasa L en la muestra;
(c)separar las proteínas en dicha muestra
por electroforesis sobre gel;
y
(d) examinar dichas proteínas separadas para
detectar la presencia de proteínas marcadoras que
- (i)
- hayan formado un conjugado covalente con el compuesto de sonda marcado, y
- (ii)
- estén unidas a dicho anticuerpo;
siendo la presencia de una proteína
marcada con un peso molecular aparente de aproximadamente 37 kDa,
según la electroforesis sobre gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida, y la ausencia de una proteína
marcadora con un peso molecular aparente de aproximadamente 80 kDa,
según la electroforesis sobre gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida, diagnóstica para del síndrome
de fatiga crónica
grave.
En el presente documento, se describe todavía
otro método adicional que se proporciona para evaluar la gravedad
relativa del síndrome de fatiga crónica, que comprende analizar la
muestra del paciente bajo condiciones nativas, para detectar la
presencia de la presencia de moléculas de ARNasa L con pesos
moleculares de aproximadamente 30 y aproximadamente 80 kDa. La
presencia de una molécula de ARNasa L de aproximadamente 30 kDa y la
ausencia de una molécula de ARNasa L de aproximadamente 80 kDa,
indica un síndrome de fatiga crónica grave. La presencia de
moléculas de ARNasa L de ambos pesos moleculares indica un síndrome
de fatiga crónica menos grave. El ensayo se puede llevar a cabo (a)
fraccionando las proteínas en la muestra del paciente de acuerdo con
los pesos moleculares, bajo condiciones de no desnaturalización; y
(b) analizar las proteínas fraccionadas para detectar la presencia
de proteínas de aproximadamente 30 kDa y aproximadamente 80 kDa con
actividad de ARNasa L.
La Fig. 1 muestra el fraccionamiento
(SDS-PAGE al 10%)y autorradiografía de proteínas
unidas a Proteín-A-
Sepharose, recogidas de extractos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), incubadas con la fotosonda 2-5A, [^{32}P]pApAp(8-azidoA), irradiadas con UV e incubadas con anticuerpo policlonal a ARNasa L humana recombinante. P = paciente, C = control. Pistas 1, 4-9; individuos con CFS; pistas 2,3: controles sanos representativos. Actividades de ARNasa L según se han determinado en ensayos de escisión de ARN ribosómico: 79, 54, 37, 73, 59, 253, 127, >500 y 253, desde las pistas 1-9, respectivamente.
Sepharose, recogidas de extractos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), incubadas con la fotosonda 2-5A, [^{32}P]pApAp(8-azidoA), irradiadas con UV e incubadas con anticuerpo policlonal a ARNasa L humana recombinante. P = paciente, C = control. Pistas 1, 4-9; individuos con CFS; pistas 2,3: controles sanos representativos. Actividades de ARNasa L según se han determinado en ensayos de escisión de ARN ribosómico: 79, 54, 37, 73, 59, 253, 127, >500 y 253, desde las pistas 1-9, respectivamente.
La Fig. 2 muestra los resultados del
fraccionamiento analítico sobre gel con HPLC de permeación de
extractos de PBMC de individuos sanos (panel A) y con CFS (paneles B
y C), bajo condiciones nativas (de no desnaturalización). Los
extractos se fotomarcaron con
[^{32}P]pApAp(8-azidoA) antes del
fraccionamiento. Se analizaron partes alícuotas de las fracciones
recogidas de cada extracto de PBMC, para detectar la presencia de
radiactividad por espectroscopia de escintilación. Los paneles D, E
y F muestran los resultados del fraccionamiento analítico sobre gel
por HPLC de permeación de extractos de PBMC de los mismos individuos
sanos (panel D) y con CFS (paneles E y F) que en los paneles A, B y
C, en esta ocasión bajo condiciones nativas (de no
desnaturalización), seguido de ensayo de actividad de ARNasa L de
las fracciones. Se analizaron partes alícuotas de cada fracción,
para detectar la presencia de la presencia de p_{3}A_{3} con
poli(U)-3'-[^{32}P]pCp. En las
fracciones 0-150 no se detectó unión de
2-5A ni actividad enzimática de ARNasa L dependiente
de 2-5A. Los marcadores de peso molecular se indican
mediante flechas. El extracto de PBMC de controles sanos (paneles A
y D)se muestra también en la Figura 1, pista 2. El extracto
de PBMC de CFS de la Fig. 2, paneles B y E, se describe también en
la Figura 1, pista 1. El extracto de PBMC de CFS de la Fig. 2,
paneles D y F, se muestra también en la Figura 1, pista 8.
La Fig. 3 muestra el fraccionamiento
(SDS-PAGE al 10%) de proteínas recolectadas de
extractos de PBMC (100 \mug de proteína), preparados en presencia
(+) o ausencia (-) de inhibidores de proteasas, marcadas por
fotoafinidad con la fotosonda 2-5A,
[^{32}P]pApAp(8-azidoA), e
inmuno-precipitadas con anticuerpo policlonal a
ARNasa L humana y recombinante de 80 kDa. Las proteínas marcadas por
fotoafinidad, inmunorreactivas y unidas a 2-5A se
separaron por SDS-PAGE al 10% y se cuantificaron por
obtención de imágenes de fósforo. Se indican las masas moleculares
de las proteínas que se unen a 2-5A. Pistas 1,2:
extractos de PBMC de CFS; pistas 3,4: extractos de PBMC de controles
sanos.
2-5A biológicamente activo se
fija a y activa la endorribonucleasa latente, ARNasa L. La ARNasa L
activada, a su vez, hidroliza el ARN viral y celular de una sola
cadena, inhibiendo de esta forma la síntesis de proteínas. Se ha
determinado que los extractos celulares de individuos sanos
contienen una proteína que se une a 2-5A de
aproximadamente 80 kDa con actividad de ARNasa L dependiente de
2-5A. Los extractos pueden contener, también, una
proteína que se une a 2-5A de 42 kDa con actividad
de ARNasa L dependiente de 2-5A. Se ha demostrado,
por otra parte, que los pacientes con CFS poseen una proteína que se
une a 2-5A distinta, de 30 kDa, que tiene actividad
de ARNasa L dependiente de 2-5A. Por "actividad de
ARNasa L" se da a entender la actividad enzimática de ARNasa L
sobre la hidrólisis de sus sustratos de ARN.
Las PBMC de un subgrupo de pacientes con CFS
examinados contenían proteínas que se unen a 2-5A
con actividad enzimática de ARNasa L dependiente de
2-5A, con pesos moleculares de aproximadamente 80 y
30 kDa. En ausencia de adición de inhibidor de proteasas en la
preparación de los extractos celulares de pacientes, se observó
también una proteína que se une a 2-5A con actividad
de ARNasa L dependiente de 2-5A con un peso
molecular de aproximadamente 42 kDa. La presencia de la especie de
aproximadamente 80 kDa coincidió con un CFS menos agresivo. Las PBMC
de otro subgrupo de pacientes con CFS contenía actividad de unión a
2-5A y actividad enzimática de ARNasa L, dependiente
de 2-5A, sólo a aproximadamente 30 kDa. Este perfil
coincidió con un CFS más agresivo. Independientemente de la gravedad
del estado patológico, los individuos afectos de CFS se pueden
identificar por la presencia de la especie de ARNasa L de
aproximadamente 30 kDa, que se encuentra siempre ausente en
individuos libres de CFS. La detección de la especie de ARNasa L
única, y hasta ahora desconocida, de aproximadamente 30 kDa bajo
condiciones nativas, permite, por primera vez, obtener un ensayo
bioquímico exacto e inequívoco para el CFS. De manera similar, la
detección de una especie de aproximadamente 37 kDa bajo condiciones
no nativas se correlaciona con el CFS.
De acuerdo con la presente descripción, se toman
muestras de individuos en los que se sospecha la existencia de CFS,
y se las analiza para detectar la presencia de la ARNasa L
dependiente de 2-5A de aproximadamente 30 kDa. La
muestra se puede tomar de cualquier célula adecuada que contenga
ARNasa L. Se puede emplear también sangre o cualquier fracción de la
misma, tal como suero o plasma. La ARNasa L se encuentra presente en
concentraciones sustanciales en células mononucleares. De este modo,
una fuente preferida de células para las muestras comprende PBMC. La
muestra se puede preparar recolectando células por centrifugación,
rompiéndolas y separando los desechos celulares para obtener un
extracto libre de células. Seguidamente, se examina en el extracto
la presencia de ARNasa L de aproximadamente 30 kDa.
Preferentemente, las PBMC se separan de sangre
heparinizada por centrifugación de gradiente de
Ficoll-Hypaque y se preparan extractos citoplásmicos
de acuerdo con los procedimientos de Suhadolnik et al.,
Biochemistry 22:4153-4158 (1983). Para evitar la
pérdida de actividad de ARNasa L, la preparación de los extractos
citoplásmicos debe iniciarse dentro de aproximadamente dos horas de
la recolección de sangre. En pocas palabras, sangre entera
heparinizada se diluye 1:1 con PBS. Se superponen dos volúmenes de
sangre diluida sobre 1 volumen de Ficoll-Hypaque
(Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest.
97:1-109, 1968), a una densidad de 1.080 y se
centrífuga a 20ºC durante 30 minutos a 1.000 g. La capa de PBMC se
retira y se lava una vez con 5 volúmenes de PBS. Las PBMC aisladas
se resuspenden en 5 ml de tampón de lisis de eritrocitos (NH_{4}Cl
155 mM, NaHCO_{3} 10 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM), se mantiene sobre
hielo durante 5 min y se lava dos veces con PBS. Las PBMC aisladas
se resuspenden en 0,1 ó 0,2 ml (aproximadamente, 10 veces el volumen
celular) de un tampón (HEPES 20 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 5 mM, KCl 120
mM, glicerol al 10%, ditiotreitol 1 mM), que contiene NONIDET
P-40 al 0,5% y se mantienen sobre hielo durante 10
minutos para lisar las células. Los extractos citoplásmicos se
obtienen por centrifugación durante 6 minutos a 8000 g y 25ºC. Los
extractos libres de células se pueden almacenar de forma indefinida
a -70ºC en partes alícuotas de 25 ó
50 \mul.
50 \mul.
Opcionalmente, se puede agregar un inhibidor de
proteasa al extracto citoplásmico, por ejemplo, comprimidos de un
cóctel de inhibidores de proteasa Mini-Complete®
(Boehringer/Mannheim), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. El inhibidor Mini-Complete® contiene
aprotinina, leupeptina, pefabloc® SC y EDTA. La expresión
"inhibidor de proteasa agregado" como se usa en este documento
en relación con la preparación de extractos celulares para ensayos
diagnósticos, significa inhibidor de proteasa agregado de forma
exógena, más allá del inhibidor de proteasa que puede estar
presente, de manera natural, en el extracto celular. Cuando se
afirma de un extracto que "se prepara en presencia de un inhibidor
de proteasa agregado", se pretende indicar una cantidad de
inhibidor de proteasa que es suficiente para inhibir por completo y
sustancialmente la actividad de las proteasas presentes en el
extracto.
A continuación, se analiza en el extracto
acelular la presencia de la ARNasa L de CFS de aproximadamente 30
kDa. Por "aproximadamente", en relación con el peso molecular
de diversas formas de ARNasa L, se pretende indicar una molécula que
tiene el peso molecular indicado, dentro de un intervalo de más o
menos 1 kDa. Los extractos celulares se fraccionan de acuerdo con el
peso molecular bajo condiciones nativas, de no desnaturalización.
Seguidamente, se analiza en la fracción de aproximadamente 30 kDa la
actividad de ARNasa L dependiente de 2-5A en
presencia de 2-5A, o un análogo del mismo, capaz de
unirse a y activar la ARNasa L en la fracción. Por "condiciones
nativas" se entiende un fraccionamiento mediante un procedimiento
que conserva sustancialmente la actividad de la especie de ARNasa L
en la muestra. Básicamente, condiciones nativas son condiciones que
no desnaturalizan las proteínas y, de forma muy especial,
condiciones que no desnaturalizan enzimas. El experto en la técnica
conoce bien las condiciones de no desnaturalización para fraccionar
proteínas de acuerdo con sus pesos moleculares. El fraccionamiento
no desnaturalizador de proteínas según su peso molecular se lleva a
cabo, de manera muy ventajosa, por cromatografía líquida de alto
rendimiento de filtración sobre gel. Un material cromatográfico
habitual para este objetivo es SUPERDEX 200 de Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, NJ. Este material es eficaz para
fraccionar proteínas que poseen pesos moleculares en el intervalo de
15 kDa a 200 kDa.
La actividad de ARNasa L dependiente de
2-5A de la fracción con un peso molecular de
aproximadamente 30 kDa se puede determinar por medio de una serie de
diferentes ensayos de ARNasa L. El ensayo de actividad de la ARNasa
L puede adoptar la forma de un ensayo de celulosa nuclear (Silverman
et al., Anal. Biochem. 144:450-460, 1985),
que implica inmovilizar y purificar parcialmente las moléculas de
unión a 2-5A sobre celulosa nuclear 2.5A y medir la
actividad de ARNasa L en la muestra por conversión de
poli(U)[^{32}P]pCp en fragmentos solubles en
ácido.
De forma alternativa, la actividad de la ARNasa L
dependiente de 2-5A se puede detectar por un ensayo
de escisión de ARN ribosómico, y detección de los productos de
escisión específicos (SCPs), altamente característicos (Suhadolnik
et al., Clin. Infect. Dis., véase antes). En consecuencia,
las muestras se incuban con extractos citoplásmicos (140 \mug de
proteína por ensayo) de un subclón deficiente en ARNasa L de células
L929 (la fuente de ARN ribosómicos 28S y 18S intacto),
a 30ºC durante 60 minutos. Se extrae el ARN total, se desnaturaliza
y se analiza por electroforesis sobre geles de agarosa al 1,8%. Tras
teñir con bromuro de etidio, se visualizan bandas de ARN bajo luz
ultravioleta. La formación de SPCs debida a la actividad de ARNasa L
se puede cuantificar por trazados densitométricos de fotografías
sobre gel, expresándola como la relación de los productos de
reacción (SPCs) con respecto al sustrato (ARNr de 28S y
18S) que permanece al final del período de incubación. Para
una discusión de SCPs, véase Wreschner et al., Nature
289:414-417 (1981)).
De acuerdo con todavía otro método, la actividad
de la ARNasa L dependiente de 2-5A de la fracción
con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa se puede determinar
analizando la hidrólisis de un sustrato de ARNasa L adecuadamente
marcado tal como un sustrato radiomarcado. Por ejemplo, la actividad
de ARNasa L en una fracción proteica se puede determinar poniendo en
contacto la fracción con el sustrato
poli(U)-3'-[^{32}P]pCp en presencia
de p_{3}A_{3}, seguido de un ensayo de radiactividad por
espectrometría de escintilación.
Además de la detección de la ARNasa L de
aproximadamente 30 kDa, se puede utilizar la misma metodología para
ensayar la presencia de la especie de aproximadamente 80 kDa que se
encuentra presente en las células de individuos normales. La
presencia de la molécula de ARNasa L de aproximadamente 30 kDa, y la
ausencia de la molécula de ARNasa L de aproximadamente 80 kDa,
indica que el paciente está afectado por un CFS grave o avanzado. La
presencia de moléculas de ARNasa L de ambos pesos moleculares en la
muestra del paciente indica una afectación por un CFS menos grave o
avanzado. Los pacientes gravemente incapacitados por CFS, cuyos
extractos celulares contienen sólo ARNasa L de aproximadamente 30
kDa, y no la molécula de 2-5A de 80 kDa, se
caracterizan, por lo general, por puntuaciones de rendimiento de
Karnofsky (KPS) de 60 o menores. Estos pacientes carecen también de
la especie de ARNasa L de aproximadamente 42 kDa, que se puede
observar en controles sanos y en pacientes con CFS con una
enfermedad menos grave. Los pacientes de CFS cuyos extractos
celulares contienen las especies de ARNasa L tanto de
aproximadamente 30 kDa como de aproximadamente 80 kDa, se
caracterizan, en general, por una KPS de 60.
Como alternativa al fraccionamiento según el peso
molecular, las proteínas de la muestra del paciente se pueden
purificar parcialmente por métodos convencionales, utilizando sales
tales como sulfato de amonio y disolventes tales como acetona y
alcohol butílico, seguido de cromatografía con
dietilaminoetil-celulosa. Esta metodología da como
resultado la separación de proteínas sobre la base de la carga. Las
formas de 30 y 80 kDa de la ARNasa L se pueden separar por este
método basado en las diferencias de carga total.
De acuerdo con otro método, que se puede utilizar
para identificar pacientes con CFS grave, los extractos celulares se
marcan por fotoafinidad con una fotosonda que comprende un análogo
de 2-5A-azido, seguido de
inmunoprecipitación con un anticuerpo contra ARNasa L y
fraccionamiento según el peso molecular. Esta metodología
identifica, de manera específica, las proteínas inmunorreactivas de
ARNasa L, que se unen a 2-5A, y elimina las
proteínas que inmuno-reaccionan con el anticuerpo
contra la ARNasa L, pero que no son proteínas que se unen a
2-5A. La metodología elimina también las proteínas
que se unen a 2-5A que no reaccionan de manera
inmunológica con el anticuerpo.
El
foto-marcado/inmunoprecipitación/fraccionamiento de
extractos celulares de individuos sanos, preparados en ausencia de
un inhibidor de proteasas añadido, y el
foto-marcado/inmunoprecipitación/fraccionamiento de
extractos celulares de pacientes con CFS con síntomas menos graves,
detecta las proteínas que se unen a 2-5A con masas
moleculares aproximadas de 80 y 37 kDa en SDS-PAGE.
En ausencia de un inhibidor de proteasas añadido, se detecta,
igualmente, una proteína que se une a 2-5A con una
masa molecular aproximada de aproximadamente 42 kDa. En pacientes
con síntomas graves de CFS, la metodología detecta la proteína de
unión a 2-5A de aproximadamente 37 kDa. No se
observa la proteína de unión a 2-5A de
aproximadamente 80 kDa. Tampoco se observa la proteína de
aproximadamente 42 kDa, incluso en ausencia del inhibidor de
proteasas añadido. Cuando se preparan extractos celulares de
individuos sanos en presencia de un inhibidor de proteasas añadido,
no se observan las proteínas que se unen a 2-5A de
aproximadamente 37 kDa y de aproximadamente 42 kDa tras el
foto-marcado/inmunoprecipitación/ fraccionamiento de
los extractos celulares.
En consecuencia, la metodología de
foto-marcado/inmunoprecipitación/fraccionamiento se
puede utilizar para detectar la ausencia de la proteína de unión a
2-5A de aproximadamente 80 kDa, para identificar, de
esta forma, pacientes con CFS grave, teniendo en consideración que
el ensayo no se puede usar para distinguir entre individuos sanos y
pacientes con CFS con síntomas menos graves del síndrome, en donde
los extractos celulares se preparan sin adición de inhibidores de
proteasas. Cuando se preparan extractos celulares de individuos
sanos en presencia de un inhibidor de proteasas añadido, no se
observa la proteína que se une a 2-5A de
aproximadamente 37 kDa. Por otra parte, la molécula de 37 kDa se
observa en extractos de pacientes con CFS preparados en presencia de
un inhibidor de proteasas. La presente metodología de
foto-marcado/inmunoprecipitación/ fraccionamiento se
puede utilizar, por lo tanto, para distinguir los extractos de
pacientes con CFS de los extractos celulares normales, con la
condición de que los extractos se preparen en presencia de un
inhibidor de proteasas añadido.
Es preciso destacar que, mientras que el anterior
método de
foto-marcado/inmunoprecipitación/fraccionamiento es
capaz de detectar una proteína de unión a 2-5A de
aproximadamente 37 kDa en extractos celulares de individuos sanos,
preparados en ausencia de un inhibidor de proteasas añadido, la
molécula detectada carece de actividad de ARNasa L dependiente de
2-5A en individuos sanos.
La fotosonda utilizada en el ensayo de
foto-marcado/inmunoprecipitación/ fraccionamiento
comprende un análogo de 2-5A según la fórmula I
anterior, en el que uno o los dos 2- ú 8-hidrógenos
de uno o más de los residuos de adenina de la molécula de
2-5A están sustituidos con un grupo azido. El
foto-marcado de las proteínas que se unen a
2-5A en extractos celulares comprende poner en
contacto el extracto con una fotosonda marcada (por ejemplo,
radiomarcada), bajo condiciones suficientes para formar conjugados
covalentes de la fotosonda y de las proteínas que se unen a
2-5A. En general, esto se consigue mediante la
incubación de una mezcla del extracto y la fotosonda, bajo luz
ultravioleta de baja intensidad. La preparación de los análogos
azido de 2.5A para utilizarlos como fotosondas es describe en la
Patente de EE.UU. 4.990.498 (síntesis enzimática) y en Charubala
et al., Helv. Chim. Acta 72:1354-1361 (1989)
(síntesis química). Los análogos azido de 2-5A se
unen eficazmente y activan la ARNasa L. En virtud del grupo azido
fotosensible, los análogos azido de 2-5A forman
fácilmente intermedios reactivos del radical nitreno
(C-N) tras su exposición a luz ultravioleta de baja
intensidad. El intermedio del radical nitreno reacciona con, y
foto-marca de manera covalente, las moléculas
biológicas. La fotoactivación in situ de los análogos azido
de 2-5A, tras la unión a ARNasa L, no interfiere con
la actividad de ARNasa L (véase la Patente de EE.UU. 4.990.498, Fig.
2).
El análogo azido de 2-5A según la
fórmula I puede comprender un oligómero de una única especie de
azido-AMP (por ejemplo,
2-azido-AMP), como en el caso de
2-azido-adenilil-(2'\rightarrow5')-2-azido-adenilil-(2'\rightarrow5')-2-azido-adenosina;
un oligómero tanto de 2-azido-AMP
como de 8-azido-AMP, como en el caso
de
2-azido-adenilil-(2'\rightarrow5')-8-azido-adenilil-(2'\rightarrow5')-azido-adenosina;
un oligómero de AMP y 2-azido-AMP u
8-azido-AMP, como en el caso de
2-azido-adenilil-(2'\rightarrow5')-2-azido-adenilil-(2'\rightarrow5')-2-azido-adenosina;
o un oligómero resultante de cualquier combinación de cualesquiera
de los monómeros AMP, 2-azido-AMP,
8-azido-AMP o
2,8-azido-AMP, con la condición de
que al menos uno de estos monómeros sea una especie de
azido-AMP.
El análogo azido de 2-5A de la
fórmula I, para utilizar en la práctica de la presente invención,
es, preferentemente, un trímero (n=1). El grado preferido de
5'-fosforilación es la monofosforilación (m=1). Se
prefieren especialmente los oligómeros que contienen uno o más
residuos 8-azido-adenililo, en
particular análogos azido de 2-5A en los que el
nucleótido del extremo 2' es
8-azido-adenosina, por ejemplo,
5'-O-fosforil-adenilil-(2'\rightarrow5')-adenilil-(2'\rightarrow5')-8-azido-adenosina.
El análogo azido de 2-5A porta,
preferentemente, una marca detectable, que permite su
identificación. La marca puede comprender, por ejemplo, una marca
radiactiva tal como ^{32}P, ^{3}H, ^{14}C o ^{15}N. ^{32}P
es el emisor de partículas \beta más potente y, por lo tanto, se
le prefiere. De forma alternativa, la marca puede comprender uno o
más grupos eteno incorporados, de fuerte fluorescencia. El grupo
amino sobre el carbono 6 de uno o más de los núcleos de adenina se
puede convertir en grupos eteno para formar
N^{1}N^{6}-etenoadenina, o el oligómero
fluorescente se puede sintetizar de novo a partir de
eteno-AMP, o a partir de una combinación de
eteno-AMP, monómero azido-AMP y
monómeros AMP, con la condición de que al menos un monómero
comprenda eteno-AMP. Véase Suhadolnik et al., J.
Biol.. Chem. 252:4125-4133 (1977). Los expertos
en la técnica conocen otras marcas para detectar moléculas
biológicas.
Tras el foto-marcado con el
análogo azido de 2-5A, el extracto celular se
combina, entonces, con un anticuerpo policlonal contra ARNasa L. El
anticuerpo para la etapa de inmunoprecipitación puede comprender
antisueros policlonales generados contra 80 kDa humana recombinante,
reconociendo estos antisueros la ARNasa L de CFS de aproximadamente
30 kDa. La ARNasa L humana recombinante de 80 kDa se puede expresar
por técnicas recombinantes convencionales a partir del ADNc conocido
de longitud completa (Zhou et al., Cell
72:753-765, 1993; Secuencia de GenBank, número de
acceso L10381). Antisueros policlonales contra la ARNasa L humana
recombinante de 80 kDa se obtienen inmunizando animales con la
proteína recombinante y cosechando los anticuerpos por técnicas
conocidas.
El anticuerpo ARNasa L puede comprender un
anticuerpo intacto, o fragmentos del mismo capaces de fijar un
antígeno, incluidos, pero no necesariamente limitados a, los
fragmentos Fab y F(ab')_{2}. Por consiguiente, como se usa
en este documento, el término "anticuerpo"incluye moléculas
intactas de anticuerpo y sus fragmentos, que conservan actividad de
fijación de antígenos. Opcionalmente, se puede utilizar un
anticuerpo secundario marcado para ayudar en la identificación de
complejos antígeno-anticuerpo formados por el
anticuerpo de ARNasa L. El anticuerpo secundario es capaz de unirse
a ARNasa L, o al anticuerpo de ARNasa L primario. El anticuerpo
secundario marcado puede comprender, por ejemplo, IgG
anti-conejo de oveja, cabra o ratón, en el caso en
que el anticuerpo de ARNasa L primario sea un anticuerpo de
conejo.
La marca en el anticuerpo secundario se detecta
por medios físicos o químicos. Estas marcas incluyen marcas
radiactivas; marcas cromóforas tales como marcas fluorescentes,
absorbentes de ultravioletas o absorbentes de luz; y marcas
enzimáticas. Como marca se puede utilizar cualquier radioisótopo
apropiado, por ejemplo, ^{125}I, ^{131}I, ^{3}H y ^{14}C.
En un ELISA, la marca es una enzima, por ejemplo, fosfatasa
alcalina, que escinde un sustrato cromóforo para liberar un producto
de escisión cromóforo. En el caso de fosfatasa alcalina, el sustrato
puede comprender, por ejemplo, monofosfato de fenolftaleína o
fosfato de p-nitrofenilo.
Tras la inmunoprecipitación, los complejos que
comprenden anticuerpo, fotosonda y proteína que se une a
2-5A, formados en el extracto, se purifican,
entonces, mediante absorción por resina de Proteína A (por ejemplo,
agarosa de Proteína A), seguido de lavado y elución de las proteínas
desde la resina. La mezcla de proteínas eluidas se fracciona por
electroforesis sobre gel y las proteínas que se unen a
2-5A
foto-marcadas/inmunoprecipitadas se visualizan por
detección de la marca portada en la fotosonda o anticuerpo. Los
pesos moleculares de las bandas marcadas se determinan por
referencia a estándares conocidos de peso molecular.
La práctica de la invención se ilustra mediante
los siguientes Ejemplos no limitantes. Todos los extractos de PBMC
de pacientes con CFS, analizados bajo condiciones de no
desnaturalización, se caracterizaron por la presencia de la ARNasa L
de aproximadamente 30 kDa, y todos los controles sanos carecieron de
esta ARNasa L de bajo peso molecular. De esta forma, la ARNasa L de
aproximadamente 30 kDa es una marca molecular para la afectación de
CFS. Los datos presentados en este documento indican también que,
además de distinguirse por la presencia de la marca de ARNasa L de
aproximadamente 30 kDa, los casos más graves de CFS se caracterizan
por la ausencia de la especie de ARNasa L de aproximadamente 80 kDa.
Los pacientes de CFS con síntomas menos graves conservaron la
especie de ARNasa L de aproximadamente 80 kDa, así como la especie
de 30 kDa. Por lo tanto, basándose en los datos obtenidos, el patrón
de aparición de las moléculas de ARNasa L de 80 y 30 kDa se
correlaciona con la gravedad de la presentación clínica de CFS.
Se obtuvieron resultados similares con
foto-marcado con azido, inmunoprecipitación y
fraccionamiento sobre SDS-PAGE de las proteínas que
se unen a 2-5A bajo condiciones de
desnaturalización. La detección de una proteína que se une a
2-5A con un peso molecular aparente de
aproximadamente 37 kDa, pero no de 80 kDa, coincidió con el CFS
grave, en tanto que la presencia de ambas bandas se correspondió con
síntomas menos graves de CFS.
Los sujetos del estudio fueron individuos a los
que se había diagnosticado previamente que satisfacían los criterios
para CFS según las directrices del Centro de Control y Prevención
de Enfermedades (CDC) de 1988 (Holmes et al., Ann. Intern.
Med. 108:387-389, 1988), y controles sanos. Los
pacientes y los controles se seleccionaron de consultas médicas de
Nevada y Carolina del Norte. Los criterios para la selección de
pacientes y controles y las variables clínicas al comienzo del
estudio fueron acordes a los descritos por Suhadolnik et al.,
Clin. Infect. Dis. 18:S96-S104 (1994). En el
momento de la recogida de muestras de sangre, se evaluaron síntomas
seleccionados sobre una lista de comprobación de síntomas
auto-clasificada. El nivel de fatiga se evaluó
usando la Puntuación de Rendimiento de Karnofsky (KPS media = 56).
Se reclutaron 10 sujetos de control de edad y sexo comparables. Cada
paciente con CFS y su control sano se sometieron a una anamnesis
médica y a una exploración física. La distribución de edades de los
controles no fue significativamente diferente de la de los
individuos con CFS (edad media de CFS = 46 años; edad media de
controles = 41,7 años). Se llevaron a cabo entrevistas con todos los
controles y negaron específicamente sufrir fatiga crónica o
cualquier otro síntoma significativo; los resultados de las
exploraciones físicas fueron normales. Se obtuvo la aprobación del
estudio por parte de las Juntas de Revisión Institucionales locales.
Se logró el consentimiento informado de cada paciente y control. Se
separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la
sangre heparinizada (50 ml) por centrifugación sobre un gradiente de
densidad de Ficoll-Hypaque y se prepararon extractos
citoplásmicos de la forma anteriormente descrita por Suhadolnik
et al., Biochemistry 22:4153-4158 (1983). Los
extractos citoplásmicos se prepararon sin adición de inhibidores de
proteasas.
Zhou et al., Cell
72:753-765 (1993) describen el ADNc de ARNasa L de
longitud completa, que está contenido como número de acceso de
GenBank L10381. Se utilizó la estrategia proteica de fusión con
glutatión-S-transferasa (GST) para
obtener la ARNasa L humana, recombinante y purificada de 80 kDa
necesaria para la producción del anticuerpo policlonal de ARNasa L.
Se obtuvo la proteína de fusión de GST-ARNasa L por
expresión en E. coli, de acuerdo con el procedimiento
descrito por Sobol et al., J. Biol. Chem.
270:5963-5978 (1995). Se generó un anticuerpo
policlonal contra ARNasa L humana y recombinante de 80 kDa en
conejos blancos de Nueva Zelanda por inmunización con la proteína de
fusión de GST-ARNasa L humana y recombinante,
altamente purificada. Se preparó suero antes de la inmunización y se
conservó como control (suero pre-inmune). La
inoculación inicial se llevó a cabo el día 1 con 100 \mug de
GST-ARNasa L mezclada con un volumen igual de
adyuvante completo de Freund. Se repitieron las administraciones de
50 \mug de GST-ARNasa L (50% proteína nativa y 50%
proteína desnaturalizada por calor), mezclada con adyuvante
incompleto de Freund los días 14, 21, 49 y 84. Se extrajeron
muestras de sangre para determinar la producción de anticuerpos a
los 120, 150 y 180 días, precedidos por
re-inmunizaciones adicionales. Tras la hidrólisis de
la proteína de fusión de GST-ARNasa L con trombina
humana, la ARNasa L se acopló de forma covalente con el cartucho
activado de glutaraldehído (Whatman), según las especificaciones del
fabricante. Se hizo circular boro-hidruro sódico a
través de la columna para reducir el glutaraldehído que no se había
acoplado con la ARNasa L. Se hizo circular el antisuero de conejo
que contenía los anticuerpos policlonales contra la ARNasa L a
través de la columna de glutaraldehído durante 1 hora a temperatura
ambiente y se eluyó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El anticuerpo policlonal de ARNasa L se caracterizó por
transferencia de Western, usando extractos de células 293 humanas
(ATCC CRL 1573) y una proteína de fusión GST-ARNasa
L recombinante expresada en E. coli, según la descripción de
Sobol et al., véase antes.
La síntesis química de la fotosonda de azido de
2-5A, ApAp(8-azidoA),
5'-monofosforilación con
[\gamma-^{32}P]ATP y
polinucleótido-quinasa para producir
[^{32}P]-pApAp(8-azidoA) y
el foto-marcado de las proteínas que se unen a
2-5A en los extractos de PBMC, se llevaron a cabo de
la forma descrita por Charubala et al., Helv. Chim. Acta
72:1354-1361 (1989). De esta forma, el
foto-marcado de las proteínas que se unen a
2-5A se logró por incubación de extractos de PBMC
(100 \mug de proteína), preparado en ausencia de inhibidores de
proteasas añadidos, con la fotosonda de 2-5A
[^{32}P]-pApAp(8-azidoA)
(60 \muCi/nmol, 5 \muCi) (30 min, 4ºC), seguido de irradiación
UV (8000 vatios/cm^{2}, 30 segundos, 0ºC). La mezcla de
foto-marcado se combinó con anticuerpo policlonal de
ARNasa L purificado por afinidad (24 \mug de proteína), Proteína
A-Sepharose (30 \mul) y 100 \mul de solución
salina tamponada con fosfato (PBS), y la mezcla se hizo rotar
durante 1 h a 4ºC. Después de tres lavados con PBS, la resina se
mezcló con 40 \mul de solución de solubilización de proteínas, se
llevó a ebullición durante 5 minutos y se centrifugó (10.600 x g, 5
min, temperatura ambiente). El sobrenadante se fraccionó por
SDS-PAGE al 10%. Las proteínas que se unen a
2-5A foto-marcadas con azido e
inmunoprecipitadas se visualizaron por autorradiografía del gel
seco. La metodología combinada de foto-marcado con
azido e inmunoprecipitación elimina las proteínas que
inmuno-reaccionan con el anticuerpo policlonal de
ARNasa L, pero que no son proteínas que se unen a
2-5A, eliminando, asimismo, las proteínas que se
unen a 2-5A que no son inmunorreactivas con el
anticuerpo policlonal de ARNasa L.
Bajo las condiciones de desnaturalización de este
experimento, se observaron tres proteínas que se unen a
2-5A con masas moleculares de 80, 42 y 37 kDa en las
PBMC de controles sanos (Figura 1, pistas 2,3) y en un subgrupo de
PBMC de CFS (Figura 1, pistas 1,4,5). Sin embargo, el
foto-marcado de fotoafinidad y la
inmunoprecipitación revelaron un segundo subgrupo de PBMC de CFS, en
el que se observó sólo una proteína que se une a
2-5A, con una masa molecular estimada de 37 kDa; no
se observaron proteínas que se unen a 2-5A de 80 ni
de 42 kDa (Figura 1, pistas 6,7,8,9). Los pacientes representados
por las pitas 1, 4 y 5 se distinguieron por síntomas de CFS menos
graves. Los pacientes representados por las pitas 6, 7, 8 y 9 se
distinguieron por síntomas de CFS más graves. De este modo, los
resultados del ensayo se correlacionan con la gravedad de la
presentación del CFS en los pacientes estudiados.
La proteína que se une a 2-5A de
aproximadamente 37 kDa no surge de la degradación mediada por
proteasa de la ARNasa L de aproximadamente 80 kDa en el momento de
la preparación y procesamiento del extracto de PBMC. La
cuantificación por análisis de imágenes de fósforo demostró que las
bandas de proteínas observadas a 37 kDa en los extractos de PBMC de
CFS tuvieron la misma intensidad en presencia y en ausencia de
inhibidores de proteasas, lo que indica que la proteína de
aproximadamente 37 kDa es estable.
Se incubaron extractos de PBMC (200 \mug de
proteína) de individuos con CFS o de controles sanos, durante 30
minutos a 4ºC, en presencia de
[^{32}P]-pApAp(8-azidoA)
(109 \muCi/nmol, 10 \muCi), se les irradió con UV (8000
vatios/cm^{2}), 30 seg, 0ºC), se cargaron en una columna de
filtración sobre gel Superdex 200 (Hiload 16/60) (Pharmacia Biotech
Inc.) y se eluyeron a temperatura ambiente con
Tris-Cl 25 mM (pH 7,4), KCl 80 mM, EDTA 1 mM,
MgCl_{2} 5 mM, ATP 0,1 mM y \beta-mercaptoetanol
14 mM, a un caudal de 0,5 ml/min; se recolectaron fracciones de 0,5
ml. La fotosonda de
[^{32}P]azido-2-5A que se
enlazó covalentemente con la(s) proteína(s) que se
une(n) a 2-5A en cada fracción se cuantificó
por espectrometría de escintilación con radiación de Cerenkov
(eficiencia de 50%) en el espectrómetro de escintilación modelo 6895
de Tm Analytics. La columna Superdex 200 se calibró con miosina,
\beta-galactosidasa, fosforilasa b, albúmina
sérica bovina, ovalbúmina, anhidrasa carbónica e inhibidor de
tripsina de soja (220, 116, 97,4, 68, 44, 31 y 21,5 kDa,
respectivamente).
Se fraccionaron bajo condiciones nativas
extractos de PBMC (200 \mug de proteína) procedentes de controles
sanos y de individuos con CFS, en una columna de filtración sobre
gel Superdex 200, de la forma descrita en el párrafo anterior. La
actividad de ARNasa L se determinó en una parte alícuota
(5-20 \mul) de cada fracción por la hidrólisis de
poli(U)-3'-[^{32}P]pCp (20.000 dpm)
en mezclas de reacción (15-30 \mul) que contenían
p_{3}A_{3} (1 x 10^{-8} M a 1 x 10^{-7} M) (Sobol et
al., véase antes). La determinación de actividad de ARNasa L no
específica se midió por hidrólisis de
poli(C)-3'-[^{32}P]pCp (14.000 dpm)
en mezclas de reacción (15-30 \mul) en ausencia de
p_{3}A_{3}. Las mediciones radiactivas se llevaron a cabo usando
Scintiverse I (Fisher) (eficiencia >99%).
En los extractos de PBMC de controles sanos,
analizados bajo condiciones nativas, se observó actividad enzimática
de ARNasa L de unión a 2-5A y dependiente de
2-5A a 80 y 42 kDa (Figura 2, paneles A y D). En un
subgrupo de extractos de PBMC de CFS, se observaron tres proteínas
que se unen a 2-5A con actividad enzimática de
ARNasa L dependiente de 2-5A. En este subgrupo, se
observaron proteínas que se unen a 2-5A con
actividad enzimática de ARNasa L dependiente de 2-5A
a 80, 42 y 30 kDa (Figura 2, paneles B y E), o a 80, 42 y 30 kDa. En
un segundo subgrupo de extractos de PBMC de CFS (como se muestra en
la Figura 1, pistas 6,7,8,9), no se observó actividad enzimática de
ARNasa L de unión a 2-5A ni dependiente de
2-5A a 80 ni 42 kDa; sin embargo, se observó
actividad enzimática de ARNasa L de unión a 2-5A y
dependiente de 2-5A a 30 kDa (Figura 2, paneles C y
F). Se utilizó
poli(C)-3'-[^{32}P]pCp en los
ensayos de control para demostrar que la actividad enzimática de
ARNasa L dependiente de 2-5A observada en extractos
de PBMC no se debió a actividad de ARNasa no específica. No se
observó hidrólisis de
poli(C)-3'-[^{32}P]pCp en ninguna
fracción, lo que se considera prueba adicional de la presencia de
ARNasa L dependiente de 2-5A. La especificidad de la
fotosonda de [^{32}P]pApAp-(8-azidoA) se
confirmó por experimentos de competición con p_{3}A_{3}
auténtico (datos no mostrados). Adicionalmente, tampoco se observó
hidrólisis de poli(U)-3'-[^{32}P]pCp
en ausencia de 2-5A, el activador alostérico de
ARNasa L.
La proteína que se une a 2-5A
observada a 37 kDa bajo condiciones de desnaturalización con el
análisis de SDS-PAGE concuerda, de manera razonable,
con la proteína de 30 kDa observada bajo condiciones nativas, sobre
la base de precedentes de la bibliografía que explican las
diferencias de masa molecular observada bajo condiciones de
desnaturalización y nativas (Sommerville et al., J.
Bacteriol. 117:3837-3842, 1995).
Se prepararon extractos de PBMC en presencia y en
ausencia de inhibidores de proteasas para evaluar el posible efecto
de la degradación proteolítica durante la preparación y el
procesamiento de los extractos. La preparación de extractos
citoplásmicos en presencia de inhibidor de proteasas se llevó a cabo
de acuerdo con las instrucciones del fabricante (comprimidos de
cóctel de inhibidor de proteasas Mini-Complete®,
Boehringer/Mannheim, que contienen aprotinina, leupeptina,
pefabloc®SC y EDTA). Suhadolnik et al., Clin. Infect. Dis.,
véase antes). La fotosonda de azido
[^{32}P]pApAp(8-azidoA), se unió
covalentemente a sus proteínas de unión a 2-5A y se
purificó adicionalmente por inmunoprecipitación con anticuerpo
policlonal de ARNasa L humana y recombinante de 80 kDa. Las
proteínas inmunorreactivas de unión a 2-5A marcadas
por fotoafinidad se cuantificaron por análisis de imágenes de
fósforo tras SDS-PAGE. El extracto de PBMC de CFS
preparado en presencia de inhibidores de proteasas contuvo una
proteína inmunorreactiva de unión a 2-5A de bajo
peso molecular de 37 kDa, además de la ARNasa L dependiente de
2-5A de 80 kDa (Figura 3, pista 1). El marcado por
fotoafinidad y la inmunoprecipitación del mismo extracto de PBMC de
CFS, preparado en ausencia de inhibidores de proteasas, reveló
proteínas inmunorreactivas de unión a 2-5A a 37 kDa
y 42 kDa, además de la ARNasa L de 80 kDa (Figura 3, pista 2). La
cuantificación por análisis de imágenes de fósforo demostró que las
bandas de proteínas a 37 kDa en extractos de PBMC de CFS tuvieron la
misma intensidad en presencia y en ausencia de inhibidores de
proteasas, lo que indica que la proteína de 37 kDa es estable
(Figura 3, pistas 1 y 2). En extractos de PBMC de controles sanos,
preparados en presencia de inhibidores de proteasas, sólo se detectó
la ARNasa L de 80 kDa (Figura 3, pista 3). En el mismo extracto,
preparado en ausencia de inhibidores de proteasas, hubo una
disminución de 70% de la ARNasa L de 80 kDa (Figura 3, compárense
las pistas 3 y 4). Sin embargo, no se detectó ninguna proteína
inmunorreactiva de unión a 2-5A de 37 kDa en este
extracto de PBMC de controles sanos, preparado en presencia o en
ausencia de inhibidores de proteasas (Figura 3, pistas 3 y 4). En
algunos pocos extractos de PBMC de controles sanos analizados, se
observó una proteína inmunorreactiva de unión a 2-5A
a 50 kDa, pero no a 37 kDa (Figura 3, pista 4). No obstante, la
proteína que se une a 2-5A de 50 kDa no exhibió
actividad de ARNasa L dependiente de 2-5A en la
medición de la hidrólisis de
poli(U)-3'-[^{32}P]pCp (datos no
mostrados).
Claims (13)
1. Un método para diagnosticar el síndrome de
fatiga crónica, que comprende analizar una muestra de un paciente
para detectar la presencia de una proteína que se una a
2',5'-oligoadenilato, proteína que posee un peso
molecular de 29 a 31 kDa, en condiciones nativas, en el que la
presencia de esta proteína en la muestra del paciente es diagnóstica
para el síndrome de fatiga crónica.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
la proteína es ARNasa L.
3. Un método según la reivindicación 2 que
comprende, adicionalmente, analizar en la muestra del paciente la
presencia de una ARNasa L de 79 a 81 kDa, en el que (i) la presencia
de una molécula de ARNasa L de 29 a 31 kDa y la ausencia de una
molécula de ARNasa L de 79 a 81 kDa, indican un síndrome de fatiga
crónica grave, y (ii) la presencia de moléculas de ARNasa L de ambos
pesos moleculares indica un síndrome de fatiga crónica menos
grave.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 y 3, en el que el ensayo de la muestra del
paciente comprende:
- (a)
- fraccionar las proteínas de la muestra del paciente, de acuerdo con su peso molecular, bajo condiciones nativas;
- (b)
- analizar las proteínas fraccionadas para detectar la presencia de una proteína de 29 a 31 kDa y, opcionalmente, de una proteína de 79 a 81 kDa, con actividad de ARNasa L;
5. Un método según la reivindicación 4, en el que
el ensayo de actividad de ARNasa L comprende:
- (a)
- detectar la formación de productos de escisión específicos de la hidrólisis de ARN 28S y/o 18S; o
- (b)
- detectar la hidrólisis de poli(U)-3'-pCp.
6. Un método para diagnosticar el síndrome de
fatiga crónica, que comprende analizar una muestra de un paciente
para detectar la presencia de una proteína que se una a
2',5'-oligoadenilato, con un peso molecular aparente
de 36 a 38 kDa, en electroforesis sobre gel de
dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, en el que la presencia de
esta proteína en la muestra del paciente es diagnóstica para el
síndrome de fatiga crónica.
7. Un método según la reivindicación 6, que
comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra del paciente con una sonda que comprende un compuesto según la fórmula I, portador de un marcador detectable, bajo condiciones suficientes para formar conjugados covalentes de dicho compuesto de sonda marcada y proteínas que se unen a 2',5'-oligoadenilato en la muestra:
en
donde
m es un número entero de 0 a 3,
n es un número entero de 1 a 3, y
cada R_{1} y cada R_{2} es,
independientemente de cada R_{1} y R_{2}, hidrógeno o N_{3},
con la condición de que al menos un R_{1} o R_{2} sea
N_{3},
o una sal hidrosoluble de dicho
compuesto;
- (b)
- poner en contacto la muestra que contiene dichos conjugados covalentes con un anticuerpo que se une a especies de ARNasa L en la muestra;
- (c)
- separar las proteínas en dicha muestra por electroforesis sobre gel; y
- (d)
- examinar dichas proteínas separadas para detectar la presencia de proteínas marcadoras que
- (i)
- hayan formado un conjugado covalente con el compuesto de sonda marcada, y
- (ii)
- estén unidas por dicho anticuerpo;
siendo la presencia de una proteína
marcadora con un peso molecular aparente de 36 a 38 kDa, según la
electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, diagnóstica para el síndrome
de fatiga
crónica.
8. Un método según la reivindicación 7 para
detectar el síndrome de fatiga crónica grave, que comprende,
adicionalmente, analizar la muestra del paciente para detectar la
presencia de una proteína marcadora de 79 a 81 kDa, en el que la
presencia de una proteína marcadora con un peso molecular aparente
de 36 a 38 kDa, según la electroforesis sobre gel de
dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, y la ausencia de una proteína
marcadora con un peso molecular aparente de 79 a 81 kDa, según la
electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida, son diagnósticas para un
síndrome de fatiga crónica grave.
9. Un método según la reivindicación 7 ú 8, en el
que n es 1, m es 1, y cada R_{2} es hidrógeno en el compuesto de
sonda.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que el compuesto de sonda es
5'-O-fosforil-adenilil-(2'\rightarrow5')-adenilil-(2'\rightarrow5')-8-azido-adenosina,
o una sal de la misma.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra se prepara en
presencia de un inhibidor de proteasas añadido.
12. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra comprende sangre o
una fracción de la misma.
13. Un método según la reivindicación 12, en el
que la muestra comprende un extracto citoplásmico de células
mononucleares de sangre periférica.
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