ES2222748T3

ES2222748T3 - Utilizacion de heparinas de bajo peso molecular para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades motoneuronales.

Info

Publication number: ES2222748T3
Application number: ES99958308T
Authority: ES
Inventors: Jean-Marie Stutzmann; Andre Uzan
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-12-13
Publication date: 2005-02-01
Anticipated expiration: 2019-12-13
Also published as: CA2354762A1; EP1140119B1; NO20012849L; JP2002532431A; EP1140119A1; DE69919578T2; NO20012849D0; SI1140119T1; AU1569700A; DE69919578D1; US20060100175A1; IL143279A0; US20030236222A1; CA2354762C; WO2000035462A1; FR2787329A1; US20040038938A1; FR2787329B1; ATE273711T1; DK1140119T3

Abstract

Utilización de una heparina de bajo peso molecular, que tenga un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades de las neuronas motrices.

Description

Utilización de heparinas de bajo peso molecular para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades motoneuronales.

La presente invención se refiere a la utilización de heparinas de bajo peso molecular, que tienen un peso molecular comprendido entre 1000 y 10000 daltones, para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades que afectan a las neuronas motrices.

La heparina estándar es un polisacárido sulfatado de peso molecular medio de 12000-15000 daltones, aislada de las mucosas intestinales de la vaca, del cordero y del cerdo. La heparina se utiliza clínicamente para la prevención y el tratamiento de los trastornos tromboembólicos pero a veces causa hemorragias.

Desde hace una docena de años, la heparina se ha reemplazado progresivamente por heparinas de bajo peso molecular que ya no presentan o en un grado menor el inconveniente de hacer sangrar y no necesitan más de una inyección al día en lugar de 2 a 3 inyecciones como la heparina estándar. Estas heparinas de bajo peso molecular se preparan principalmente por fraccionamiento, despolimerización controlada de la heparina o por síntesis química. Estas, presentan una relación de actividad anti Xa/actividad anti IIa superior a 2. La solicitud internacional WO 9106303 (Univ Case Westwern Reserve; Gliatech Inc (US)) describe la utilización de la heparina o de una parte de la molécula compuesta al menos de una unidad de disacárido para la inhibición del crecimiento o de la regeneración nerviosa.

Ahora se ha descubierto que las heparinas de bajo peso molecular, que tienen un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, aumentan la supervivencia y/o el crecimiento de las neuronas motrices y así pueden utilizarse para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades que afectan a las neuronas motrices.

Las enfermedades que afectan a las neuronas motrices incluyen la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal progresiva, la atrofia muscular infantil, y la esclerosis lateral primaria.

De acuerdo con la invención, se utiliza una heparina de bajo peso molecular que tienen un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, principalmente entre 1500 y 6000 daltones, y en particular, entre 4000 y 5000 daltones.

Estas heparinas se pueden preparar por distintos procedimientos a partir de la heparina:

- fraccionamiento en un medio de disolventes (FR 2440376, US 4692435),

- fraccionamiento sobre resina aniónica (FR 2453875),

- filtración en gel (BARROWCLIFFE, Throm. Res. 12, 27-36 (1977),

- cromatografía de afinidad (US 4401758),

- despolimerización controlada por medio de un agente químico: ácido nitroso (EP 14184, EP 37319, EP 76279, EP 623629, FR 2503714, US 4804652, WO 813276), \beta-eliminación a partir de un éster de la heparina (EP 40144, US 5389618), peryodato (EP 287477), borohidruro de sodio (EP 347588, EP 380943), ácido ascórbico (US 4533549), peróxido de hidrógeno (US 4629699, US 4791195) hidróxido amónico cuaternario a partir de una sal de amonio cuaternario de la heparina (US 4981955)), hidróxido de metal alcalino (EP 380943, EP 347588) o por vía enzimática (EP 64452, US 4396762, EP 244235, EP 244236, US 4826827, US 3766167) o por medio de irradiación (EP 269981).

Algunas, pueden prepararse igualmente por síntesis química (US 4801583, US 4818816, EP 165134, EP 84999, FR 2535306).

Entre estas heparinas de bajo peso molecular que tienen un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, se pueden citar particularmente la enoxaparina (DCI) comercializada por RHONE-POULENC RORER, la nadroparina (DCI) comercializada por SANOFI, la parnaparina (DCI) comercializada por OPOCRIN-ALFA, la reviparina (DCI) comercializada por KNOLL, la dalteparina (DCI) comercializada por KABI PHARMACIA, la tinzaparina (DCI) comercializada por NOVO NORDISK, la danaparoide (DCI) comercializada por ORGANON, la ardeparina (DCI) desarrollada por WYETH AYERST, la certoparina (DCI) comercializada por SANDOZ y los productos en estudio, tales como el CY222 de SANOFI-CHOAY (Thromb. Haemostasis, 58 (1), 553 (1987)), el SR90107/ORG31540 de SANOFI-ORGANON (Trombosis and Haemostasis, 74, 1468-1473 (1995)).

Preferiblemente, las heparinas de bajo peso molecular que tienen un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, están constituidas por oligosacáridos que tienen un ácido 2-O-sulfo-4-enopiranosurónico en uno de sus extremos.

Se obtiene una heparina de bajo peso molecular particularmente ventajosa por despolimerización de un éster de la heparina, y principalmente un éster bencílico, por medio de una base tal como la sosa.

En presencia de un soporte trófico proporcionado por los factores neurotróficos BDNF o NT5, los cultivos de neuronas motrices se componen de neuronas grandes y homogéneas con largas neuritas ramificadas. Sin embargo, las neuronas motrices mueren por apoptosis si el cultivo se lleva a cabo en ausencia de un soporte trófico.

El efecto de las heparinas de bajo peso molecular, que tienen un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, ha sido determinado en un modelo de degeneración inducida por la privación del factor neurotrófico de neuronas motrices en el cultivo.

Además, los astrocitos juegan un importante papel en el control y el mantenimiento de un ambiente adecuado para la sobrevivencia de las neuronas motrices.

El efecto de las heparinas de bajo peso molecular, que tienen un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, también se ha ensayado sobre un co-cultivo de neuronas motrices y de astrocitos.

Los protocolos utilizados son los siguientes:

Cultivos enriquecidos en neuronas motrices

Los cultivos enriquecidos en neuronas motrices se preparan utilizando el método de centrifugación descrito por R.L.SCHNAAR y A.E. ACHAFFNER, J. Neurosci., l, 204-217 (1981) y modificado por W. CAMU y C.E. HENDERSON, J. Neurosci. Methods, 44, 59-70 (1992). Las médulas espinales de embriones de rata E15 se disecaron estérilmente se les quitaron los cordones espinales dorsales. A continuación se cortaron y se incubaron 15 minutos a 37ºC en PBS (tampón de fosfato salino: NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Na_{2}HPO_{4} 6,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM) al que se ha añadido 0,05% de tripsina. La disociación de las células se completa por trituración con la extremidad de una pipeta en 1 ml en el medio de cultivo al que se ha añadido albúmina de suero bovino (BSA) y ADNasa. La suspensión de células se expone sobre una banda de metrizamida 6,5% peso/volumen en un medio L15 (comercializado por Gibco BRL) y se centrifugan a 500 g durante 15 minutos. La banda de la interfaz que contiene las neuronas motrices se recupera. Las neuronas motrices se distribuyen a una densidad de 5000 células por 35 mm en cajas de cultivos prerevestidas con poliornitina-laminina en un medio L15 al que se ha añadido bicarbonato de sodio (22 mM), coalbúmina (0.1 mg/ml), putrescina (0.1 mM), insulina (5 \mug/ml), selenito de sodio (31 nM), glucosa (20 mM), progesterona (21 nM), penicilina (100 Ul/ml) y estreptomicina (100ug/ml). Los cultivos se mantienen a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2}.

Cultivo de astrocitos de médula espinal

Los astrocitos se obtienen a partir de embriones de ratas según el método de R.P. SANETO Y J. DE VELLIS, en Neurochemistry, a practical approach (A.J. TURNER y H.S. St JOHN). IRL Press, Oxford-Washington DC, p. 27-63 (1987) ligeramente modificado. Las médulas espinales se disecan estérilmente, se les quitan las meninges y los ganglios dorsales. Se transfieren de cinco a diez médulas espinales al PBS (tampón de fosfato salino : NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Na_{2}HPO_{4} 6,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM) y se cortan antes de la incubación a 37ºC durante 25 minutos en PBS al que se ha añadido 0,25% de tripsina. El tratamiento enzimático se detiene por adicción de 10 ml del medio de Dubelcco-Eagle modificado (DMEM) al que se ha añadido 10 % de suero fetal de vaca (FCS) y las células se recogen por centrifugación. Se efectúa otra etapa de disociación mecánica utilizando la extremidad de una pipeta de 1 ml. Las células se extienden con una densidad de 1.5-2x10^{6} células por 25 cm^{2} de medio de cultivo en DMEM al 10% de FCS. Después de 2 días in vitro los cultivos se alimentan cada día hasta el final de la duración del estudio. Cuando se obtiene una monocapa visible de células, los cultivos se agitan 48 horas a 250 rpm, y al día siguiente, las monocapas se tratan con arabinosido de citosina (10^{-5}M) durante 48 horas. Las monocapas de astrocitos se amplifican a continuación a una densidad de cinco por 35 mm sobre las placas de cultivo para los frascos de cultivo de 25 cm^{2} al principio del estudio.

Los cultivos de astrocitos espinales están compuestos a lo sumo de 98% de células inmunorreactivas para la proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Las monocapas de astrocitos se exponen al producto que se quiere ensayar, en solución acuosa durante 24 horas a la concentración indicada. Las monocapas de astrocitos se lavan a continuación con DMEM y se mantienen 2 horas en un medio de cultivo al que se añaden las neuronas motrices. Dos horas después de la alimentación y durante 2 ó 3 días, el vehículo o el producto que va a ensayar se añade al medio de
cultivo.

Inmunoquímica

Las células se fijan en 4% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído en el PBS (pH 7.4 a 4ºC durante 15 minutos). A continuación se lavan los cultivos y los sitios no específicos bloqueados con el 10% de suero de cabra y 2% de albúmina de suero bovino (BSA) en el PBS. Estos cultivos se incuban sucesivamente con anticuerpos de factor de transcripción Islet ½ una noche a 4ºC y con estreptavidinperoxidasa (1/200, Gibco) durante 60 minutos. Los anticuerpos se visualizan utilizando la reacción DAB/peróxido de hidrógeno. Los anticuerpos de antineurofilamentos (LC Amersham) se utilizan para la identificación de neuritas.

Recuento de células y análisis estadístico

Las células inmunorreactivas para la homoproteína Islet ½ o por los neurofilamentos y que muestran neuritas más largas que los diámetros de 10 células se consideran como neuronas motrices adecuadas. Se evalúa el número de neuronas motrices por recuento de células marcadas en una superficie de 1,44 cm^{2} bajo microscopio con 200 aumentos. Los valores se expresan como un número de neuronas motrices por cm^{2} o un porcentaje del número de neuronas motrices presentes en los cultivos mantenidos con factores tróficos (BDNF/NT5 1ng/mg). Los experimentos se llevaban a cabo como mínimo 3 veces.

Los análisis estadísticos se llevan a cabo utilizando el ensayo de Student (ensayo-t).

Los ensayos se han hecho utilizando la enoxaparina como heparina de bajo peso molecular.

Los resultados obtenidos son los siguientes:

1 Efecto de diferentes concentraciones de enoxaparina sobre el número de neuronas motrices en los co-cultivos de astrocitos-neuronas motrices

	Número de neuronas motrices % en comparación
	con el control \pm desviación típica
Vehículo	100 \pm 21
Enoxaparina
1 ng	118 \pm 33
10 ng	\hskip1,2cm 196 \pm 47 (P<0,05)
50 ng	149 \pm 22

Estos resultados demuestran que el pretratamiento de los astrocitos con la enoxaparina aumenta el número de neuronas motrices que se depositan sobre la monocapa de los astrocitos.

En este ensayo, la enoxaparina no induce ningún efecto morfológico aparente.

2 Efecto sobre la supervivencia de las neuronas motrices en cultivos de astrocitos-neuronas motrices

	Supervivencia de neuronas motrices % en comparación
	con el control \pm desviación típica
Vehículo	99,5 \pm 5,1
Enoxaparina
1 ng	109,3 \pm 16,9
10 ng	\hskip1,5cm 120,7 \pm 3,2 (P= 0,0066)

Estos resultados demuestran que la enoxaparina aumenta la supervivencia de las neuronas motrices.

3 Efecto sobre el número de neuronas motrices muy gruesas

	Número de neuronas motrices Gruesas (500 \mum)
	por cm^{3}
Vehículo	38
Enoxaparina
1 ng/ml	48
10 ng/ml	66

Estos resultados demuestran que la enoxaparina aumenta el número de neuronas motrices gruesas en comparación con el control.

4 Efecto de potenciación sobre la estimulación de la actividad trófica de las neuronas motrices

Las monocapas de astrocitos responden al esfuerzo inducido por la exposición a concentraciones, sub-letales, de radicales libres y aumento de la producción de la actividad trófica de las neuronas motrices. En particular, el flujo de concentraciones débiles de peroxinitrito formado por SIN-1 (200 umol/mn) estimulan de manera importante la capacidad trófica de las monocapas de astrocitos después del final de los estímulos. El efecto de la enoxaparina ha sido por tanto estudiado sobre este efecto.

Las monocapas de astrocitos se tratan 24 horas con el vehículo o la enoxaparina (10 ng/ml) y se tratan 1 hora con 2 mM de SIN-1 (medio nitrogenado). Después del lavado, las neuronas motrices se exponen a un medio L15. Después de 2 horas, se añade de nuevo vehículo o enoxaparina.

	Número de neuronas motrices % en
	comparación con el control
Vehículo	100
SIN-1 (2mM)	125
Enoxaparina (10 ng/ml)	115
Enoxaparina (10 ng/ml) * SIN-1 (2 mM)	160

Estos resultados demuestran que la enoxaparina y el SIN-1 aumentan la capacidad trófica de los astrocitos. Además, la enoxaparina potencia el efecto trófico del SIN-1.

La presente invención se refiere a la utilización de una heparina de bajo peso molecular, que tiene un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, para la preparación de un medicamento útil para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades de las neuronas motrices y principalmente la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal progresiva, la atrofia muscular infantil, y la esclerosis lateral primaria.

Los medicamentos están constituidos por una sal (preferentemente con sodio o calcio) de una heparina de bajo peso molecular, bajo la forma de una composición en que está asociada a cualquier otro producto farmacéuticamente compatible, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. Los medicamentos de acuerdo con la invención pueden emplearse por vía intravenosa, subcutánea, oral, rectal, tópica o pulmonar (inhalación).

Las composiciones estériles para administración intravenosa o subcutánea son generalmente soluciones acuosas. Estas composiciones pueden contener también adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonificantes, emulsificantes, dispersantes y estabilizantes. La esterilización se puede hacer de diversas formas, por ejemplo, por filtración aséptica, incorporando a la composición agentes esterilizantes, por irradiación. También se pueden preparar bajo la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento de su utilización en agua estéril u otro medio cualquiera inyectable estéril.

Como composiciones sólidas para la administración oral, se pueden utilizar comprimidos, píldoras, polvos (cápsulas de gelatina, sellos) o gránulos. En estas composiciones, el principio activo está mezclado con uno o más diluyentes inertes, tal como el almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo atmósfera de argón. Estas composiciones también pueden comprender otras sustancias además de los diluyentes, por ejemplo, uno o más lubrificantes tal como estearato de magnesio o talco, un agente que favorezca la absorción oral, un colorante, un revestimiento (grageas) o un barniz.

Como composiciones líquidas para administración oral, se pueden utilizar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contengan diluyentes inertes, tal como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender otras sustancias además de las diluyentes, por ejemplo, productos humidificadores, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizantes.

Las composiciones para administración rectal son supositorios o cápsulas rectales que contienen, además del producto activo, excipientes tales como manteca de caco, glicéridos semi-sintéticos o polietilenglicoles.

Las composiciones para administración tópica pueden ser, por ejemplo, cremas lociones, colirios, colutorios, gotas nasales o aerosoles.

Las dosis dependen del efecto que se busca, de la duración del tratamiento y de la vía de administración utilizada; generalmente están comprendidas entre 0,2 mg y 4 mg por kg por día por vía subcutánea, o sea 14 a 280 mg por día para un adulto.

De una manera general, el médico determinará la posología apropiada en función de la edad, del peso y de todos los otros factores propios del sujeto a tratar.

La invención se refiere igualmente al procedimiento de preparación de medicamentos útiles para la supervivencia y/o el crecimiento de neuronas motrices y, en particular, en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades de las neuronas motrices, y particularmente la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal progresivas, la atrofia muscular infantil, la esclerosis lateral primaria, que consiste en mezclar una heparina de bajo peso molecular, que tenga un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, con uno o más diluyentes y/o adyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables.

Claims

1. Utilización de una heparina de bajo peso molecular, que tenga un peso molecular medio comprendido entre 1000 y 10000 daltones, para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades de las neuronas motrices.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, para la prevención y/o el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal progresiva, la atrofia muscular infantil, o la esclerosis lateral.

3. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2, para la que la heparina de bajo peso molecular tiene un peso molecular medio comprendido entre 1500 y 6000 daltones.

4. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2, para la que la heparina de bajo peso molecular tiene un peso molecular medio comprendido entre 4000 y 5000 daltones.

5. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular está constituida por oligosacáridos que tienen un ácido 2-O-sulfo-4-enopiranosurónico en uno de sus extremos.

6. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, para la que la heparina de bajo peso molecular se obtiene por despolimerización de un éster de heparina por medio de una base.

7. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, para la que la heparina de bajo peso molecular es la enoxaparina.

8. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la nadroparina.

9. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la parnaparina.

10. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la reviparina.

11. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, para la que la heparina de bajo peso molecular es la dalteparina.

12. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la tinzaparina.

13. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la danaparoide.

14. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la ardeparina.

15. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la certoparina.

16. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es la CY222.

17. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, para la que la heparina de bajo peso molecular es el SR90107/ORG31540.