ES2200569T3

ES2200569T3 - Nueva aplicacion terapeutica de la nicergolina.

Info

Publication number: ES2200569T3
Application number: ES99956109T
Authority: ES
Inventors: Michel Dib
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1998-11-24
Filing date: 1999-11-22
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2019-11-22
Also published as: US20030134869A1; DK1133296T3; FR2786100B1; US6469019B2; AU1278600A; PT1133296E; JP2002530336A; EP1133296A1; US20010044448A1; ATE246924T1; DE69910425T2; EP1133296B1; FR2786100A1; JP4637359B2; DE69910425D1; WO2000030643A1

Abstract

Utilización de nicergolina para la preparación de un medicamento destinado a la prevención y el tratamiento de enfermedades motoneuronales.

Description

Nueva aplicación terapéutica de la nicergolina.

La presente invención se refiere a la utilización de la nicergolina para la preparación de un medicamento destinado a la prevención y/o tratamiento de las enfermedades motoneuronales.

La nicergolina o 1,6-dimetil-8\beta-(5-bromonicotinoil)-oximetil-10a-metoxi ergolina (Sermion®) presenta especialmente propiedades \alpha-bloqueantes, \alpha2-adrenolíticas (CARPENE C. et al., J. Pharmacol., 14, 57-66 (1983)), antiisquémicas (CAHN R. et al., Chem. Abstracts, 107, 228784x (1987); UEDAT et al., Chem. Abstracts, 118, 225224f (1993)), antagonistas del calcio (TAKAHASHI K. et al., Br. J. Pharmacol., 100, 705-710 (1990), antioxidantes (TANAKA M. et al., Neurosci. Let., 248, 67-72 (1998)), antitrombóticas, (Chem. Abstracts, 105, 54314k (1986)). Mejora la capacidad de aprendizaje y la memoria (Chem. Abstracts, 113, 52358u (1990); Chem. Abstracts, 111, 108396h (1989); Chem. Abstracts, 109, 86208c (1988); Chem. Abstracts, 106, 12788e (1987); Chem. Abstracts, 115, 198237s (1991)).

Actualmente, se ha descubierto que la nicergolina aumenta la supervivencia de las motoneuronas y puede así ser utilizada en la prevención y/o tratamiento de las enfermedades motoneuronales.

Las enfermedades motoneuronales incluyen la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal progresiva, la atrofia muscular infantil y la esclerosis lateral primaria.

En presencia de soporte trófico aportado por los factores neurotróficos BDNF o GDNF, los cultivos de motoneuronas están compuestos de neuronas grandes y homogéneas con largas neuritas ramificadas. Sin embargo, las motoneuronas mueren por apoptosis si el cultivo se efectúa en ausencia de soporte trófico.

El efecto de la nicergolina ha sido pues determinado en un modelo de degeneración inducido por privación de factor neurotrófico de motoneuronas en cultivo.

Por otra parte, los astrocitos desempeñan un papel de gran importancia en el control y mantenimiento de un ambiente adecuado para la supervivencia motoneuronal.

La nicergolina ha sido igualmente ensayada en un co-cultivo de motoneuronas y astrocitos.

Los protocolos utilizados son los siguientes:

Cultivos enriquecidos en motoneuronas

Los cultivos enriquecidos en motoneuronas se prepararon utilizando el método de centrifugación descrito por R.L. SCHNAAR y A.E. SCHAFFNER, J. Neurosci., 1, 204-217 (1981) y modificado por W. CAMU y C.E. HENDERSON, J. Neurosci. Methods, 44, 59-70 (1992). En placas de cultivo previamente recubiertas con laminina/ornitina según el método de A.G. ESTEVEZ et al., J. Neurosci., 18 (3), 923-931 (1998), se sembraron las motoneuronas con una densidad de 2550 células por placa de 35 mm. Los cultivos se mantuvieron seguidamente en el medio L15 (GIBCO BRL) que contenía bicarbonato sódico (22 mM), conalbúmina 0,1 mg/mL), putrescina (0,1 mM), insulina (5 \mug/mL), selenito sódico (31 nM), glucosa (20 mM), progesterona (21 nM),penicilina (100 UI/mL) y estreptomicina (100 \mug/mL).

Las motoneuronas así obtenidas están compuestas de neuronas grandes (25-30 \mum) y homogéneas con largas neuritas ramificadas. Más del 70% de las células son inmuno-reactivas para el receptor neurotrofina p75 y los marcadores Islet ½ para las motoneuronas espinales. Alrededor del 70% de las motoneuronas mueren por apoptosis 24 horas después de la siembra si el cultivo se efectúa en ausencia de factor trópico.

Cultivo de astrocitos de médula espinal

Los astrocitos se obtuvieron de ratas jóvenes de un día de edad según el método de R.P. SANETO y J. DE VELLIS, en Neurochemistry a practical approach (A.J. TURNER y H.S. St. JOHN) IRL Press, Oxford-DC, pp. 27-63 ligeramente modificado. Las médulas espinales se diseccionaron estérilmente, se liberaron de meninges y ganglios dorsales. Se transfirieron de cinco a diez médulas espinales a PBS (tampón fosfato salino) y cortaron antes de la incubación a 37ºC durante 25 minutos en PBS al que se le había añadido 0,25% de tripsina. El tratamiento enzimático se detuvo por adición de 10 mL de medio Dubelcco-Eagle modificado (DMEM) al que se había añadido suero fetal bovino (FCS) y las células se recuperaron por centrifugación. Otra etapa de disociación mecánica se efectuó utilizando la extremidad de una pipeta de 1 mL. Las células se sembraron con una densidad de 1,5x10^{6} células por 25 cm^{2} de medio de cultivo en el DMEM al 10% de FCS. Después de 2 días in vitro los cultivos se alimentaron diariamente. Cuando se completó una monocapa visible de células, los cultivos se agitaron 48 horas a 250 rpm y, al día siguiente, las monocapas se trataron con arabinósido de citosina (10^{-5} M) durante 48 horas. Las monocapas de astrocitos fueron seguidamente amplificadas con una densidad de cinco en placas de cultivo de 35 mm para los frascos de cultivo de 25 cm^{2} iniciales.

Los cultivos de astrocitos espinales se componen de más del 98% de células poligonales, planas e inmuno-reactivas para la proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Las monocapas se expusieron al producto a ensayar y seguidamente se incubaron con el medio motoneuronal para obtener un medio de cultivo acondicionado. Este medio se transfirió y ensayó a diferentes diluciones para determinar sus efectos sobre la supervivencia neuronal.

Inmunoquímica

Las células se fijaron en paraformaldehido al 4% y glutaraldehido al 0,1%, en el PBS (pH 7,4 a 4ºC durante 15 minutos) y en una solución metanólica fría. Los cultivos se lavaron seguidamente y los sitios no específicos se bloquearon con suero de cabra al 10% y albúmina de suero bovina (BSA) al 2% en PBS y se trataron para inmunoquímica utilizando anticuerpos contra el receptor de neurotrofina de baja afinidad p75 o una proteína de neurofilamentos de 200 kD (Amersham) utilizando las instrucciones del fabricante y aplicando la reacción de amplificación avidina-biotina DAB/peróxido de hidrógeno.

Tratamiento de los astrocitos con nicergolina

El tratamiento de los astrocitos con nicergolina se efectuó de la siguiente manera: el producto se disolvió en metanol, se esterilizó por filtración e utilizó inmediatamente después de la preparación. El tratamiento aplicado a los cultivos de motoneuronas enriquecidos se efectuó por adición de partes alícuotas de los productos a ensayar en disolución en el medio L15 por siembra. Las monocapas de astrocitos se expusieron al vehículo o a las disoluciones del compuesto a ensayar durante 24 horas y a diferentes concentraciones. Las monocapas de astrocitos se lavaron 3 veces con DMEM y se incubaron con el medio L15 completo. El medio acondicionado de astrocitos se recogió 24 horas más tarde y se centrifugó a 1800 g durante 15 minutos y se utilizó inmediatamente o se conservó a -70ºC como máximo 2 semanas sin pérdida de actividad trófica.

Recuento de células y análisis estadístico

Las células inmuno-reactivas para los neurofilamentos y que exhibían neuritas más largas que los diámetros de las células fueron consideradas motoneuronas viables. El número de motoneuronas se evaluó por recuento de células marcadas en una superficie de 0,4-1 cm^{2} en microscopio con 200 aumentos. En todos los casos, los valores se expresaron como un porcentaje del número de motoneuronas presentes en los cultivos mantenidos con factores tróficos. Las experiencias se realizaron al menos 3 veces.

Los análisis estadísticos se efectuaron utilizando el ensayo t de Student (ensayo t).

Los resultados obtenidos son los siguientes:

1.- Efecto de la nicergolina en la supervivencia motoneuronal en co-cultivos astrocitos/motoneuronas:

	% de motoneuronas marcadas
Vehículo solo	100 \pm 9,4
Nicergolina
0,1 \muM	115,7 \pm 16
1 \muM	145,5 \pm 24*
10 \muM	163,7 \pm 22,5**
*significativamente diferente del vehículo (p<0,05)
** significativamente diferente del vehículo (p<0,01)
ND no determinado

Estos resultados demuestran que la nicergolina a la concentración 10 \muM aumenta la supervivencia motoneuronal en 63,7% en comparación con los cultivos tratados solo con el vehículo.

2.- Efecto neurotrófico de la nicergolina sobre la muerte neuronal en cultivos enriquecidos en motoneuronas y en ausencia de factor trófico:

En este ensayo, la nicergolina aumenta la supervivencia de las motoneuronas en 13% (p<0,05).

La presente invención se refiere igualmente a la utilización de la nicergolina para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades motoneuronales y especialmente esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal progresiva, atrofia muscular infantil, y esclerosis lateral primaria.

La nicergolina puede prepararse según la patente EE.UU. 3.228.943.

\newpage

Los medicamentos están constituidos por al menos nicergolina, en estado puro o bajo forma de una composición en la que se ha asociado a otro producto farmacéuticamente compatible, pudiendo ser inerte o fisiológicamente activo. Los medicamentos según la invención pueden emplearse especialmente por vía oral o parenteral.

Como composiciones sólidas para la administración oral, pueden utilizarse comprimidos, píldoras, polvos, (cápsulas de gelatina, sellos), liofilizados orales (Lyoc®) o granulados. En estas composiciones, el principio activo se mezcla con uno o varios diluyentes inertes, tales como almidón, ácido tartárico, goma arábiga, sacarina sódica, vainillina, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo corriente de argón. Estas composiciones pueden contener igualmente otras sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo uno o varios lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, un colorante, un recubrimiento (grageas) o un barniz.

Como composiciones líquidas para la administración oral, se puede utilizar disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables que contengan diluyente inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden contener otras sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizantes.

Las composiciones estériles para administración parenteral, pueden ser preferentemente soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones o emulsiones. Como disolvente o vehículo, se puede emplear agua, propilenglicol, un polietilenglicol, aceites vegetales, particularmente aceite de oliva, ésteres orgánicos inyectables, por ejemplo oleato de etilo u otros disolventes orgánicos adecuados. Estas composiciones pueden contener igualmente coadyuvantes, particularmente agentes humectantes, isotonificantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. La esterilización puede realizarse de varias formas, por ejemplo por filtración aseptizante, incorporando a la composición agentes esterilizantes, por irradiación o por calentamiento. Pueden prepararse igualmente bajo forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento del empleo en agua estéril o en otro medio estéril inyectable.

Ejemplos de formulación

Cápsulas de gelatina: 5 mg de nicergolina y como excipientes talco, lactosa y estearato de magnesio

Liofilizado oral: 5 mg de nicergolina y como excipientes ácido tartárico, lactosa, goma arábiga, sacarina sódica y vainillina

Polvo para uso parenteral: 5 mg de nicergolina y como excipientes ácido tartárico y lactosa.

Las dosis dependen del efecto buscado, la duración del tratamiento y de la vía de administración utilizada; generalmente están comprendidas entre 30 y 100 mg por día por via oral para un adulto con dosis unitarias que van de 5 a 20 mg de sustancia activa.

De forma general, el médico determinará la posología apropiada en función del peso y de otros factores propios del sujeto a tratar.

Claims

1. Utilización de nicergolina para la preparación de un medicamento destinado a la prevención y el tratamiento de enfermedades motoneuronales.

2. Utilización según la reivindicación 1 para el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal progresiva, atrofia muscular infantil y esclerosis lateral primaria.

3. Utilización según una de la reivindicaciones 1 ó 2, para la preparación de un medicamento que contiene de 5 a 20 mg de nicergolina.