ES2223039T3

ES2223039T3 - Metodos para la diagnosis y tratamiento de diabetes.

Info

Publication number: ES2223039T3
Application number: ES91918181T
Authority: ES
Inventors: Steinunn Baekkeskov; Henk-Jan Aanstoot; Pietro Decamilli; Franco Folli; Michele Solimena
Original assignee: Yale University; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: Yale University; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 2005-02-16
Anticipated expiration: 2011-09-06
Also published as: EP0547164A1; WO1992004632A1; US20020131963A1; ATE268908T1; DE69133393T2; US7718386B1; EP0547164A4; DK0547164T3; AU8721991A; JP2727377B2; EP0547164B1; JPH06502916A; DE69133393D1

Abstract

ENSAYOS PARA LA DETECCION DE LA DIABETES Y DE UN ESTADO PREDIABETICO QUE CONSISTEN EN EXPONER MUESTRAS DEL SUERO DE UN PACIENTE A UN LIGANDO PURIFICADO CAPAZ DE ENLAZARSE A AUTOANTICUERPOS ESPECIFICOS DE UN AUTOANTIGENO 64KD PRESENTE EN LAS CELULAS (BETA) PANCREATICAS. EL LIGANDO PURIFICADO ES NORMALMENTE DESCARBOXILASA DEL ACIDO GLUTAMICO PURIFICADA (GAD) O UN FRAGMENTO O ANALOGO DE LA MISMA. PREFERENTEMENTE, LOS ENSAYOS DETECTARAN LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS TANTO EN LA GAD CON UN PESO MOLECULAR INFERIOR COMO EN LA GAD CON UN PESO MOLECULAR SUPERIOR PUESTO QUE LOS ESTADOS DIABETICOS Y PREDIABETICOS SOLO PUEDEN ESTAR ASOCIADOS A UNA DE ESTAS DOS FORMAS. LOS ENSAYOS SE PUEDEN LLEVAR A CABO UTILIZANDO LOS PROTOCOLOS CONVENCIONALES, TALES COMO RADIOINMUNOENSAYOS, ENSAYOS DE INMUNOSORBENTES ENLAZADOS A ENZIMAS O ENSAYOS DE ENZIMAS. LOS METODOS PARA TRATAR LA DIABETES CONSISTEN EN ADMINISTRAR COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE INCLUYAN EL LIGANDO PURIFICADO, EN PARTICULAR CUANDO SE ENCUENTRA ACOPLADO A UNA INMUNOGLOBULINA O A UNA CELULA LINFOIDE PARA INDUCIR LA TOLERANCIA. ALTERNATIVAMENTE, LA TOLERANCIA SE PUEDE INDUCIR A BASE DE ADMINISTRAR CELULAS AUXILIARES T ATENUADAS, O RECEPTORES DE CELULAS T AISLADOS, DONDE LAS CELULAS AUXILIARES T SE HAN AISLADO EN BASE A SU REACTIVIDAD CON LA GAD O LIGANDO EQUIVALENTE.

Description

Métodos para la diagnosis y tratamiento de diabetes.

La presente invención se refiere en general a métodos mejorados para identificar y tratar individuos que padecen de diabetes o son susceptibles a la misma. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de ácido glutámico decarboxilasa para detectar autoanticuerpos específicos a células \beta pancreáticas en sueros de individuos diabéticos o prediabéticos, y a una composición para inhibir la respuesta inmunológica que causa la destrucción de células \beta.

La diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) afecta principalmente a la gente joven. Aunque para el tratamiento se dispone de insulina, la morbidez y mortalidad incrementada en varias veces, asociadas con esta enfermedad, urgen el desarrollo de métodos de diagnóstico y preventivos precoces. La destrucción de células \beta pancreáticas, que precede al inicio clínico de IDDM, es mediada por mecanismos autoinmunes. Entre las anormalidades autoinmunes más a fondo estudiadas, asociadas con la enfermedad, se encuentra la alta incidencia de autoanticuerpos en circulación específicos a células \beta, en el momento de la diagnosis. Estudios de familias han demostrado que los autoanticuerpos aparecen varios años antes de ponerse de manifiesto la IDDM, sugiriendo ello un largo periodo prodrómico de autoinmunidad humoral antes de que surjan los síntomas clínicos. Los estudios realizados en familias han documentado también una lenta y progresiva pérdida de respuesta a insulina a glucosa intravenosa en los años que preceden a la diagnosis. La presencia de autoanticuerpos específicos a células \beta en el periodo prediabético es probable que refleje el avance del proceso autoinmune, como el proceso que eventualmente conduce al agotamiento crítico de células \beta y a la dependencia de insulina. Se ha estimado que son el 10% de la masa total de células \beta permanece en el momento del inicio clínico.

Un objetivo principal de la investigación sobre la diabetes ha sido el desarrollo de intervenciones inmunológicas que bloquean o inhiben la destrucción de células \beta y el desarrollo de IDDM. Puesto que las intervenciones inmunológicas conferirán siempre probablemente cierto riesgo de efectos secundarios adversos, se necesitan marcadores altamente sensibles, específicos y fácilmente aplicables para la fase prediabética, en el caso de que dicho tratamiento pueda llegar a convertirse en una alternativa aceptable a la terapia de sustitución con insulina.

Además del tratamiento preventivo, se necesitan métodos para la identificación de individuos susceptibles de manera precoz y precisa. Resultan particularmente convenientes los ensayos que pueden detectar autoanticuerpos asociados con la autoinmunidad humoral inicial que acompaña a la destrucción de células \beta. El método clásico para detectar autoanticuerpos de células de islotes es mediante inmunohistología utilizando secciones pancreáticas congeladas. Sin embargo, los estudios realizados en familias han demostrado que los anticuerpos citoplásmicos de células \beta (ICCA) medidos por este método son de una especificidad insuficiente para que sirvan como un único marcador de susceptibilidad. Además, los ICCA son muy difíciles de normalizar y la interpretación de la sección tenida queda sujeta a desviaciones por parte del observador. De este modo, no existe forma alguna de definir lo que se considera una muestra "positiva". Se pueden conseguir ensayos más precisos mediante la utilización de marcadores más específicos, bien solos o bien en combinación con ICCA. Marcadores alternativos incluyen autoanticuerpos de 64 k, autoanticuerpos de insulina y haplotipo DR/DQ\beta MHC clase II.

Los ensayos para la detección precoz de respuestas humorales en IDDM deberán proporcionar una medición rápida y cuantitativa del marcador particular, preferentemente mediante protocolos convencionales de ensayos en sueros, tal como un inmunoensayo unido a una enzima (ELISA) y/o un radioinmunoensayo (RIA). Dichos ensayos deberán detectar un anticuerpo diana primario de células \beta característico de la autoinmunidad humoral y deberán proporcionar una sensibilidad y una especificidad mejoradas con respecto al ensayo de ICCA a la hora de pronosticar IDDM. La insulina y el autoantígeno de 64 k de células \beta son actualmente los únicos antígenos diana primarios potenciales conocidos de autoinmunidad humoral en IDDM, en el caso de que la expresión y especificidad de células \beta se apliquen como criterios para dicho antígeno. Los autoanticuerpos de insulina tienen una incidencia de solo 30-40% en chicos jóvenes y mucho menor en chicos mayores y en adultos, que desarrollan IDDM. Los autoanticuerpos de 64 k tienen una incidencia de alrededor del 80% tanto en el momento del inicio clínico como en el periodo prediabético y se ha demostrado que preceden a la IDDM manifiesta en varios años en estudios realizados con familias y han de ser detectados simultáneamente con y a veces antes, pero nunca más tarde que ICCA e IAA. De este modo, la detección de autoanticuerpos de 64 k promete ser una medida útil para la detección precoz de IDDM.

Sin embargo, la detección del autoanticuerpo de 64 k ha sido problemática. El autoantígeno de 64 kD solo ha sido identificado hasta ahora en la célula \beta pancreática y no se ha purificado en cantidades suficientes para permitir la secuenciación, clonación u otra identificación que hubiese permitido la preparación a gran escala de reactivos necesarios para la detección o terapia. Por estos motivos, la detección del autoanticuerpo de 64 k se ha realizado por inmunoprecipitación con lisados detergentes de islotes de rata y humanos. Dichos ensayos son costosos, de larga duración y no se adaptan fácilmente a las instalaciones de los laboratorios clínicos. Por tanto, los mismos no serán adecuados para realizar un estudio amplio de poblaciones humanas con el fin de identificar individuos en riesgo de desarrollar IDDM.

Por estas razones, sería conveniente identificar la naturaleza del autoantígeno de 64 kD, de manera que pudieran obtenerse grandes cantidades del autoantígeno o de análogos del mismo, para utilizarse como reactivos en la detección y terapia de IDDM.

El autoantígeno de 64 kD en células \beta pancreáticas fue identificado originalmente como una diana de autoanticuerpos en IDDM mediante experimentos de inmunoprecipitación utilizando lisados detergentes de islotes humanos (Baekkeskov et al. (1982) Nature 298:167-169). Los anticuerpos al autoantígeno de 64 kD preceden al inicio clínico de IDDM y se ha demostrado que tienen una incidencia de alrededor del 80%en el inicio clínico y durante el periodo prediabético (Baekkeskov et al. (1987) J. Clin. Invest. 79:926-934; Atkinson et al. (1990) Lancet 335:1357-1360; y Christie et al. (1988) Diabetologia 31:597-602). Las proteínas de 64 kD tanto de rata como humana son altamente homólogas con respecto a epitopos autoantigénicos (Christie et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:376-381). El autoantígeno de 64 kD en islotes de Langerhans se detecta de tres formas diferentes con respecto a la hidrofobicidad y compartimentación: una forma hidrófila soluble de 65 kD y pI de aproximadamente 7,1; una forma hidrófoba de 64 kD, que es soluble o de una baja avidez por la membrana y que tiene un pI de aproximadamente 6,7; y una forma hidrófoba firmemente anclada en la membrana de la misma movilidad electroforética y del mismo pI. Ambas formas hidrófobas de 64 kD, la unida a la membrana y la soluble, existen como dos isoformas, \alpha y \beta, que tienen idéntico pI e idénticas propiedades hidrófobas, pero que difieren en aproximadamente 1 kD (Baekkeskov et al. (1989) Diabetes 38:1133:1141). Se comprobó que el autoantígeno de 64 kD era específico a células \beta en un análisis de un número de tejidos, que no incluían el cerebro (Christie et al., supra.).

Los pacientes con una enfermedad neurológica rara pero severa, Stiff Man Syndrome (SMS), tienen autoanticuerpos a neuronas GABA-érgicas. Se comprobó que la ácido glutámico decarboxilasa (GAD), la enzima que sintetiza GABA a partir de ácido glutámico, era el autoantígeno predominante (Solimena et al. (1988) N. Engl. J. Med. 318:1012-1020 y Solimena et al. (1990) N. Engl. J. Med. 322:1555-1560). La casi totalidad de los pacientes positivos a anticuerpos a neuronas GABA-érgicas fueron también positivos para anticuerpos citoplásmicos de células de islotes, como quedó demostrado por inmunofluorescencia de secciones pancreáticas, y un tercio de los mismos presentaban IDDM. Además, se detectaron autoanticuerpos a neuronas GABA-érgicas, detectables por inmunocitoquímica, en 3 de 74 pacientes de IDDM sin SMS (Solimena et al. (1988) supra. y Solimena et al. (1990) supra.). Otros estudios han registrado también una alta incidencia de IDDM en pacientes de SMS (Lorish et al. (1989) Mayo Clin. Proc. 64:629-636). Se ha encontrado GAD en altos niveles en islotes de Langerhans (Okada et al. (1976) Science 194:620-622). Dentro del islote, la GAD está localizada selectivamente en células \beta y ausente en los otros tres tipos de células endocrinas, las células \alpha, \delta y PP (Garry et al. (1988) J. Histochem. & Citochem. 36:573-580 y Vincent (1983) Neuroendocrinol. 36:197-204). Si bien se sabe poco acerca de las propiedades bioquímicas de la GAD pancreática, la proteína del cerebro ha sido caracterizada parcialmente. En el cerebro de la rata, se encontró que el 60% de la proteína estaba unida a la membrana y el 40% era soluble después de la homogenización (Chang y Gottlieb (1988) J. Neurosci. 8:2123-2130). La GAD del cerebro consiste en al menos dos isómeros resueltos por diferencias en movilidad electroforética en SDS-PAGE. Sus pesos moleculares han sido descritos como de 59-66 kD (Chang y Gottlieb, supra.). Los epitopos inmunogénicos de ambas isoformas se conservan en gran medida desde roedores a humanos (Legay et al. (1986) J. Neurochem. 46:1478-1486). El mRNA de la forma más grande ha sido clonado y secuenciado (Kaufman et al. (1986) Science 232:1138-1140 y Julien et al. (1990) J. Neurochem. 54:703-705). La proteína se detecta en una forma dímera bajo condiciones no reductoras (Legay (1987) J. Neurochem. 48:1022-1026). Erlander et al. (1991) Neuron 7:91-100 describen la clonación y secuenciación de ambas formas de mayor y menor peso molecular de GAD del SNC de la rata. Cram et al. (1991) describen la secuenciación parcial de las formas de cerebro y pancreática de GAD humana y han registrado siete sustituciones de aminoácidos en una secuencia de 180 aminoácidos. La secuencia del gen codificador de la forma de mayor peso molecular de GAD del SNC de la rata se ofrece en Julien et al. (1990) J. Neurochem. 34:703-705. Partes del trabajo experimental que subyace en la presente invención fueron informadas por Baekkeskov et al. (1990) Nature 347:151-156.

La EP-A-0543945 (publicada después de la fecha de prioridad aquí reivindicada) expone el uso de GAD en la detección de diabetes relacionada con autoanticuerpos.

Se proporciona ahora un método para detectar, en sueros, autoanticuerpos a un autoantígeno de células \beta pancreáticas de aproximadamente 64 kD, comprendiendo dicho método exponer una muestra de suero a un ligando purificado para los autoanticuerpos que tiene una pureza de al menos 50% p/p y detectar la interacción específica entre el ligando purificado y los autoanticuerpos, en donde el ligando purificado es ácido glutámico decarboxilasa del SNC y de peso molecular más bajo o un fragmento de la misma que contiene un epitopo capaz de unir autoanticuerpos contra ácido glutámico decarboxilasa. Esto constituye un método mejorado para diagnosticar y controlar individuos diabéticos y prediabéticos. Los autoanticuerpos son reactivos con uno o más autoantígenos de células \beta pancreáticas de aproximadamente 64 kD (referidos generalmente como el autoantígeno de 64 kD, pero que de hecho comprenden dos formas de distinto peso molecular, como más adelante se describe). Preferentemente, los métodos detectarán la presencia de autoanticuerpos tanto a una forma de peso molecular más bajo de GAD como a una forma de peso molecular más alto de GAD, distinguiendo más preferentemente entre la presencia de anticuerpos reactivos con cada una de las formas.

En contraste con los métodos anteriores para la detección de autoanticuerpo al antígeno pancreático, que en general han requerido el uso de células lisadas de islotes pancreáticos, el uso del ligando purificado capaz de unirse específicamente a los autoanticuerpos permite la realización de una amplia variedad de protocolos de ensayos convenientes capaces de detectar los autoanticuerpos incluso a concentraciones muy bajas. Ejemplos de protocolos de ensayos incluyen los ensayos en fase sólida que utilizan ligando inmovilizado capaz de capturar el autoanticuerpo, en donde la cantidad de anticuerpo capturado puede medirse de manera competitiva o no competitiva. Ejemplos de ensayos competitivos incluyen radioinmunoensayos (RIA) e inmunoensayos unidos a una enzima (ELISA), mientras que ejemplos de ensayos no competitivos incluyen los ensayos "sandwich". Alternativamente, se pueden emplear protocolos de ensayos homogéneos en donde la unión del autoanticuerpo a un complejo de ligando marcado se traduce en la modulación de una señal procedente del complejo, por ejemplo, modulación de la actividad de un marcador enzimático. Igualmente útiles serán los ensayos con enzimas en donde se emplea la determinación de la actividad de GAD como una medida directa del autoanticuerpo presente en sueros.

En otro aspecto, la presente invención comprende ácido glutámico decarboxilasa del SNC y de peso molecular más bajo o un fragmento de la misma que contiene un epitopo capaz de unir autoanticuerpos contra ácido glutámico decarboxilasa para utilizarse en un método para inhibir el desarrollo de diabetes mellitus dependiente de insulina, comprendiendo dicho método administrar a un paciente una dosis preseleccionada de ácido glutámico decarboxilasa.

Además, la invención incluye una composición que comprende ácido glutámico decarboxilasa del SNC y de peso molecular más bajo o un fragmento de la misma que contiene un epitopo capaz de unir autoanticuerpos contra ácido glutámico decarboxilasa en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha composición se puede emplear en métodos para el tratamiento y prevención de diabetes por administración de una dosis preseleccionada de GAD de SNC de peso molecular más bajo o un fragmento de la misma como una cantidad protectora de ligando purificado capaz de imitar inmunológicamente al menos una porción del autoantígeno de 64 kD de células \beta pancreáticas. Con el fin de inducir una respuesta inmunitaria protectora (es decir, tolerancia del autoantígeno de 64 kD) puede ser conveniente acoplar el ligando a inmunoglobulinas o células linfoides antes de administrarlo al paciente.

Según otro aspecto más de la presente invención, la GAD del SNC y de peso molecular más bajo se puede emplear para estimular y aislar las células T colaboradoras implicadas en la respuesta humoral que produce los autoanticuerpos de 64 k. Los receptores aislados de células T en dichas células pueden a su vez administrarse a un paciente como una terapia inmunopreventiva.

La invención se describe ahora adicionalmente con referencia a los dibujos adjuntos en donde:

La figura 1 incluye un par de fluorogramas que demuestran que anticuerpos promovidos contra ácido glutámico decarboxilasa y el autoanticuerpo de 64 k obtenido a partir de sueros diabéticos, reconocen la misma proteína en islotes de rata.

La figura 2 es una transferencia Western de inmunoprecipitados de células de cerebro de rata y de islotes de rata, obtenidos por reacción con sueros positivos a anticuerpo de 64 k y sueros positivos a anticuerpo a ácido glutámico decarboxilasa.

La figura 3 incluye dos gráficos que demuestran que la actividad de la enzima ácido glutámico decarboxilasa es inhibida en células de islotes y lisados de células de cerebro por la inmunoprecipitación con sueros positivos a anticuerpo de 64 k.

La figura 4 es una micrografía de inmunofluorescencia que demuestra la presencia de ácido glutámico decarboxilasa en islotes de células \beta pancreáticas de la rata.

La figura 5 incluye una electrofóresis en gel bi-dimensional del autoantígeno de 64 kD de células del cerebro de la rata y células de islotes de la rata y una transferencia Western de ácido glutámico decarboxilasa soluble y en partículas a partir de cerebro e islotes de la rata, antes y después de la digestión con tripsina.

La figura 6 incluye una transferencia Western de células neonatales de cerebro de la rata y de islotes de la rata, sondadas con sueros positivos a anticuerpo a ácido glutámico decarboxilasa y sueros diabéticos.

La figura 7 incluye micrografías que muestran terminales nerviosos manchados con los mismos sueros, para demostrar la identidad de una ácido glutámico decarboxilasa y del autoantígeno de 64 kD.

La figura 8 es una gráfica que ilustra el modelo de reactividad del autoanticuerpo con las formas de mayor y menor peso molecular de GAD en pacientes diabéticos, pacientes prediabéticos, pacientes que padecen del Síndrome del Hombre Rígido y controles.

La presente invención se deriva del descubrimiento, realizado por la entidad solicitante, de que el autoantígeno de 64 kD de células \beta pancreáticas (que son las células que segregan insulina de los islotes de Langerhan es ácido glutámico decarboxilasa (GAD) (E.C. 4.1.1.15) que es una proteína abundante de neuronas secretoras de GABA en el sistema nervioso central (SNC). En particular, se ha descubierto que las formas pancreáticas de GAD son sustancialmente idénticas a las formas de GAD del SNC y reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con dichas formas de GAD del SNC (como se describe con mayor detalle a continuación), permitiendo ello el uso de reactivos que incorporan GAD del SNC, o porciones de la misma, para la detección de autoanticuerpos al autoantígeno de 64 kD (referidos aquí como autoanticuerpos de 64 k) que han sido asociados con diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), como se ha expuesto anteriormente con mayor detalle. De este modo, y por primera vez, se dispone de reactivos purificados adecuados para realizar ensayos convencionales para el estudio de sueros, de manera que pueden evaluarse grandes poblaciones respecto a la diabetes y estados prediabéticos de un modo eficiente y económico.

La GAD del SNC y la GAD pancreática se encuentran en al menos dos formas de distinto peso molecular, incluyendo una forma más pequeña descrita en la bibliografía (para GAD del SNC) como teniendo un peso molecular comprendido entre 59 y 65 kD aproximadamente y una forma más grande descrita como teniendo un peso molecular comprendido entre 63 y 67 kD aproximadamente. Véase, Kaufman et al. (1986) Science 232:1138-1140 y Chang y Gottlieb (1988) J. Neurosci. 8:2123-2130. La forma de peso molecular más bajo de la GAD pancreática y GAD del SNC puede ser reconocida por el anticuerpo a GAD-6, en la forma descrita por Chang y Gottlieb (1988), supra. La GAD pancreática, es decir, el antígeno pancreático de 64 kD, está presente como un doblete proteico con una movilidad electroforética similar a la de las isoformas de GAD del cerebro (figura 6). Véase Baekkeskov et al. (1989) Diabetes 38:1133-1141. Las composiciones purificadas útiles en la presente invención se pueden obtener o derivar de la forma de peso molecular más bajo o de las formas de ambos pesos moleculares de SNC. Además, las formas de GAD se conservan en gran medida entre las especies y el ligando purificado utilizado en la presente invención puede estar basado en formas de GAD no humanas y también humanas, tales como formas de ratas, felinas y otras formas que han sido previamente caracterizadas.

En la sección experimental indicada más adelante se ofrecen características más detalladas de las formas de peso molecular más bajo y peso molecular más alto de la GAD pancreática. La GAD natural aislada de fuentes animales puede disponerse en una cantidad suficiente solo a partir de células del SNC.

Los datos ofrecidos en la sección experimental demuestran además que la GAD de rata producida por técnicas recombinantes es adecuada para detectar los autoanticuerpos de 64 k en humanos. De este modo, la fuente animal de la GAD utilizada en los ensayos no parece constituir un factor crítico. Sin embargo, la forma de peso molecular de la GAD utilizada para detectar los autoanticuerpos, constituye un aspecto importante de la presente invención, como se describirá a continuación con mayor detalle.

Los métodos de la presente invención utilizan ligando purificado para los autoanticuerpos de 64 k para la detección de dichos autoanticuerpos en muestras de suero. El ligando purificado será normalmente una forma aislada de GAD de SNC o una forma producida por técnicas recombinantes de GAD de SNC, pero también puede ser un fragmento de GAD u otro péptido que define un sitio de unión epitópica capaz de unir específicamente los autoanticuerpos de 64 k. Podrá apreciarse que el conocimiento de la secuencia de DNA del gen de GAD, así como de la secuencia de aminoácidos de la GAD, permiten la identificación y preparación de una variedad de composiciones péptidas sintéticas que pueden utilizarse como el ligando purificado de la presente invención.

El ligando purificado de la presente invención puede ser natural, es decir, GAD intacta del SNC o fragmentos de la misma, aislado a partir de fuentes adecuadas, tales como células del SNC tanto humanas como no humanas. Métodos para dicho aislamiento son descritos en Oertel et al. (1980) Brain Res: Bull. Vol. 5, Suppl. 2, pp 713-719; Oertel et al. (1981) J. Neurosci. 6:2689-2700; y Chang y Gottlieb (1988) J. Neurosci. 8:2123-2130.

Los polipéptidos naturales pueden ser aislados por técnicas convencionales tal como cromatografía de afinidad. Convenientemente, se pueden promover anticuerpos policlonales o monoclonales contra GAD previamente purificada y se pueden emplear para preparar una columna de afinidad adecuada por técnicas bien conocidas. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Hudson y Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, United Kingdom, 1980, capítulo 8. Normalmente, mediante dichas técnicas de aislamiento se obtendrá una forma intacta de GAD. Si se desean fragmentos de péptidos, los mismos se pueden obtener mediante disociación química o enzimática de la molécula intacta.

Como alternativa al aislamiento de GAD intacta a partir de fuentes naturales, será posible preparar proteínas sintéticas y polipéptidos a base de las secuencias de al menos la forma de peso molecular más bajo y opcionalmente también de la forma de peso molecular más alto de GAD de SNC. Secuencias de péptidos a partir de la forma de peso molecular más bajo de GAD de SNC son ofrecidas en Chang y Gottlieb (1988), supra. Las secuencias de ácidos nucleicos de la forma de peso molecular más bajo de GAD de SNC se pueden obtener por técnicas convencionales empleando una sonda de ácidos nucleicos basada en la secuencia de DNA de la forma de peso molecular más alto de GAD de SNC, la cual se indica en Julien et al. (1990) J. Neurochem. 54:703-705. Alternativamente, pueden examinarse bibliotecas de expresión de cDNA para encontrar una forma deseada de GAD empleando anticuerpos a \alpha-GAD que son disponibles o que pueden ser preparados en la forma que más adelante se describirá.

La clonación y expresión de las dos formas de peso molecular de GAD del SNC de la rata se describen en Erlander et al. (1991) Neuron 7:91-100, en donde se indica que las dos formas son codificadas por distintos genes. La clonación y expresión de las formas de mayor peso molecular de GAD pancreática de la rata se describen en la sección experimental ofrecida más adelante.

Se pueden producir proteínas y polipéptidos sintéticas mediante cualquiera de dos técnicas generales. En primer lugar, se pueden sintetizar polipéptidos que tienen hasta 150 aminoácidos aproximadamente, teniendo normalmente menos de alrededor de 100 aminoácidos y más generalmente teniendo menos de alrededor de 75 aminoácidos, mediante el método de síntesis en fase sólida de Merrifield ya bien conocido, en donde se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena en crecimiento. Véase Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156. Numerosos proveedores, tal como Applied Biosystems, Foster City, California, suministran en la actualidad aparatos para sintetizar automáticamente dichos polipéptidos empleando la metodología en fase sólida.

El segundo método, preferido, para sintetizar las proteínas y polipéptidos de la presente invención implica la expresión, en células cultivadas de mamíferos, de moléculas de DNA recombinado que codifican el gen deseado de GAD o una porción del mismo. El uso de sistemas de expresión mamíferos, tales como células del ovario del hámster chino (CHO), puede proporcionar la modificación posterior a la traducción de las proteínas y polipéptidos, lo cual aumenta la similitud inmunológica de los productos sintéticos con las formas naturales de GAD. El propio gen de GAD puede ser natural o sintético, pudiéndose obtener el gen natural a partir de cDNA o bibliotecas genómicas, empleando sondas degenerativas basadas en la secuencia conocida de aminoácidos indicada en Julien et al., supra. Alternativamente, se pueden sintetizar polinucleótidos tomando como base la secuencia de DNA ya registrada, mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de DNA de una sola hebra mediante el método del fosforamidito descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tett. Letters 22:1859-1862. Se puede obtener entonces un fragmento de doble hebra sintetizando la hebra complementaria y calentando y luego enfriando las hebras entre sí bajo condiciones adecuadas, o bien añadiendo la hebra complementaria empleando DNA polimerasa con una secuencia cebadora adecuada.

Los fragmentos de DNA naturales o sintéticos, codificadores de la proteína o fragmento de GAD deseada, se incorporaran entonces en constructos de DNA capaces de introducirse y expresarse en un cultivo de células de mamífero in vitro. Normalmente, los constructos DNA serán capaces de replicarse en hospedantes procariotos con el fin de facilitar la manipulación y multiplicación iniciales del constructo. Una vez obtenida una cantidad suficiente del constructo, este se introducirá y se integrará normalmente en el genoma de las líneas de células de mamífero cultivadas o de otras líneas de células eucariotas.

Los constructos de DNA adecuados para introducirse en bacterias o levadura incluirán un sistema de replica reconocido por el hospedante, el fragmento de DNA de GAD que codifica el producto proteico o polipéptido deseado, las secuencias de iniciación y regulación de la transcripción y traducción unidas al extremo 5' de la secuencia de DNA estructural, y las secuencias de regulación de la terminación de la transcripción y traducción unidas al extremo 3' de la secuencia estructural. Las secuencias reguladoras de la transcripción incluirán un promotor heterólogo que es reconocido por el hospedante.

Convenientemente, pueden emplearse vectores de clonación disponibles que incluyen el sistema de réplica y las secuencias reguladoras de la transcripción y traducción junto con un sitio de inserción para la secuencia de DNA de GAD. Para la transformación de líneas celulares de mamíferos y de otras células eucariotas, se puede emplear la co-transfección de las líneas celulares en presencia de un marcador adecuado, tal como el gen de DHFR. La transfección puede ser realizada también empleando técnicas químicas o de electroporación.

Los ligandos de la presente invención se utilizarán en una forma sustancialmente pura, es decir, con una pureza de al menos 50% p/p (peso/peso) aproximadamente, así como en general sustancialmente libres de proteínas y contaminantes interferentes. Preferentemente, los ligandos serán aislados o sintetizados en una pureza de al menos 80% p/p aproximadamente y, más preferentemente, en una pureza de al menos 95% p/p aproximadamente. Empleando técnicas convencionales de purificación de proteínas, se pueden obtener péptidos homogéneos con una pureza de al menos 99% p/p. Por ejemplo, las proteínas pueden ser purificadas mediante el uso de anticuerpos específicos para los polipéptidos de GAD, empleando cromatografía de afinidad con inmunoadsorbente. Dicha cromatografía de afinidad se efectúa uniendo primeramente los anticuerpos a un soporte de fase sólida y poniendo en contacto entonces los anticuerpos unidos con la fuente de los polipéptidos del ligando, por ejemplo, lisados de células del SNC o células que han sido modificadas por técnicas recombinantes para producir GAD, o de sobrenadantes de células que han sido modificadas por técnicas recombinantes para segregar GAD cuando son cultivadas.

Para utilizarse en la purificación, los anticuerpos a GAD pueden obtenerse inyectando GAD o fragmentos de GAD en una amplia variedad de vertebrados, según técnicas convencionales. Vertebrados adecuados incluyen ratones, ratas, ovejas y cabras. Normalmente, los animales son sangrados periódicamente con sangrías sucesivas que tienen un mejor título y especificidad. Los antígenos pueden ser inyectados intramuscular, interperitoneal, subcutáneamente. Normalmente, se emplean vehículos tal como un adyuvante completo o un completo de Freund. Preferentemente, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por técnicas bien conocidas. En particular, se pueden producir fragmentos monoclonales de Fab en E. coli por el método de Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281.

Los ensayos de la presente invención detectarán la presencia de autoanticuerpos a por lo menos una de las dos formas de peso molecular de GAD en sueros de pacientes y preferentemente detectarán ambas formas. Se ha comprobado (como se describe en la sección experimental ofrecida más adelante) que los pacientes diabéticos y prediabéticos tendrán normalmente autoanticuerpos a ambas formas de peso molecular de GAD, pero en algunos casos solo tendrán anticuerpos bien a la forma de mayor peso molecular o bien a la forma de menor peso molecular. De este modo, el ensayo preferido de la presente invención será capaz de detectar la presencia de anticuerpos reactivos con cualquiera de las formas de peso molecular de GAD, incluso en ausencia de anticuerpos a la otra forma de peso molecular.

Incluso más preferentemente, los ensayos de la presente invención serán capaces de detectar por separado la presencia de autoanticuerpos a cada una de las dos formas de peso molecular de GAD. Se cree que el modelo de anticuerpos presentes (es decir, únicamente a la GAD de mayor peso molecular, únicamente a la GAD de menor peso molecular o a ambas formas de peso molecular de GAD) constituirá un indicador de diagnóstico importante del estado de enfermedad.

Los ensayos para detectar por separado anticuerpos a la GAD de mayor peso molecular y a la GAD de menor peso molecular, pueden realizarse convenientemente haciendo reaccionar los sueros de los pacientes por separado con cada una de las formas de GAD, en donde la otra forma está sustancialmente ausente. El uso de GAD producida por técnicas recombinantes (o fragmentos o análogos de GAD) resultará particularmente útil para llevar a cabo detecciones por separado, puesto que la GAD así producida estará libre de la otra forma de peso molecular.

Sin embargo, en muchos casos, será todavía conveniente examinar los sueros de los pacientes respecto a la presencia simultánea de ambas formas de peso molecular de GAD. Un resultado negativo (es decir, sin reacción) indicará que el paciente no es diabético ni prediabético. Un resultado positivo indicará que el paciente es diabético o prediabético. Los sueros de los pacientes pueden ser entonces examinados adicionalmente respecto a la presencia cada autoanticuerpo por separado, si así se desea. La evaluación simultánea se puede realizar convenientemente bien con combinaciones de las dos formas de peso molecular de GAD que son aisladas de forma conjunta a partir de la fuente animal, o bien combinando GAD recombinante producida por separado de cada forma de peso molecular.

Los ensayos de acuerdo con la presente invención confían habitualmente en la exposición del ligando o ligandos purificados a una muestra de suero y en la detección de la unión específica entre el ligando y los autoanticuerpos para el autoantígeno de 64 kD de células \beta pancreáticas que puede estar presente en el suero. La unión entre los autoanticuerpos y el ligando purificado indica que los autoanticuerpos están presentes y constituye un diagnóstico de un estado diabético o prediabético del paciente. Alternativamente, dichos ensayos se pueden emplear para controlar el estado de un paciente que ha experimentado un transplante de células del islote pancreático, en donde la presencia de los autoanticuerpos de 64 k indica una respuesta inmunitaria adversa a las células transplantadas. El protocolo de ensayo particular elegido no es crítico y solo es necesario que el ensayo sea lo suficientemente sensible para detectar un nivel de umbral del autoantígeno que es considerado como positivo.

Los ensayos de acuerdo con la presente invención serán útiles para identificar pacientes que son prediabéticos, es decir, que tienen autoanticuerpos en circulación al autoantígeno de 64 kD, pero que no han padecido todavía de un daño suficiente en las células \beta productoras de insulina para ser identificados clínicamente como teniendo IDDM, o que padecen de IDDM clínica. Los ensayos serán también útiles para controlar el efecto de la inmunoterapia (como se describe más adelante) para bloquear o prevenir reacciones autoinmunitarias a las células \beta y para controlar el progreso de la enfermedad desde la pre-diabetes a la diabetes clínica, y resultarán particularmente útiles para controlar el estado de células \beta pancreáticas transplantadas en pacientes diabéticos que han sido objeto de un injerto de células de islote.

Los ensayos adecuados incluyen tanto protocolos en fase sólidas (heterogéneos) como en fase no sólida (homogéneos). Los ensayos pueden ser realizados empleando formatos competitivos o no competitivos y utilizando una amplia variedad de marcadores, tales como radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quemiluminiscentes, marcadores centrífugos y similares. Una mayoría de ensayos adecuados confían en protocolos heterogéneos en donde el ligando se une a una fase sólida que se emplea para separar el complejo de ligando-autoanticuerpo que se forma cuando está presente autoanticuerpo en la muestra de suero. Una ventaja particular derivada del uso de un ligando purificado es que ello facilita la preparación de una fase sólida para utilizarse en el ensayo. Es decir, el ligando puede ser inmovilizado convenientemente sobre diversas fases sólidas, tales como varillas de nivel, macropartículas, microesferas, partículas magnéticas, tubos de ensayo, pocillos de microvaloración.

La fase sólida se expone a la muestra de suero de manera que el autoanticuerpo, si existe, es capturado por el ligando. Separando entonces la fase sólida de la muestra de suero, los autoanticuerpos capturados pueden ser separados de los autoanticuerpos no unidos y de otros contaminantes de la muestra de suero. El autoanticuerpo capturado puede ser detectado entonces empleando la técnica no competitiva del "sandwich", en donde el ligando marcado para el autoanticuerpo se expone a la fase sólida lavada. Alternativamente, los formatos competitivos confían en la introducción previa de autoanticuerpo marcado, soluble, en la muestra de suero, de manera que las formas marcada y sin marcar pueden competir respecto a la unión a la fase sólida. Dichas técnicas de ensayo son bien conocidas y han sido descritas ampliamente tanto en patentes como en revistas científicas. Ejemplos de inmunoensayos adecuados para detectar los autoanticuerpos en suero incluyen aquellos descritos en las Patentes US Nos. 3.791.932; 3.817.837; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; y 4.098.876.

Particularmente preferidos son los métodos de ensayo con inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) que se describen detalladamente en las Patentes US Nos. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.879.262; y 4.034.074. Dichos ensayos ELISA pueden proporcionar la medición de títulos muy bajos de los autoanticuerpos.

De acuerdo con la técnica ELISA preferida, el ligando purificado se une covalente o no covalentemente a una superficie sólida. La superficie sólida se expone a la muestra de suero con lo que el autoanticuerpo presente en la muestra es capturado y unido. Habitualmente, el ligando sobre la fase sólida estará presente en exceso, de manera que puede unirse toda la cantidad de autoanticuerpo. Después de separar la fase sólida y lavar su superficie, la fase sólida se puede exponer a reactivo marcado capaz de unir específicamente el autoanticuerpo capturado. El reactivo marcado puede ser ligando purificado marcado, o bien puede ser otro ligando capaz de unirse al autoanticuerpo, por ejemplo, anticuerpo anti-humano marcado. De este modo, el marcador se une a la fase sólida solo si está presente autoanticuerpo en la muestra de suero. Los marcadores enzimáticos pueden ser detectados por técnicas de visualización convencionales, por ejemplo, producción de una tinción coloreada, quemiluminiscencia, fluorescencia.

Una segunda modalidad preferida comprende los radioinmunoensayos (RIA) los cuales se efectúan empleando una fase sólida que ha sido preparada en la forma anteriormente descrita. La fase sólida se expone a la muestra de suero en presencia de autoanticuerpos radiomarcados que pueden competir respecto a la unión al ligando inmovilizado. De este modo, la cantidad de radiomarcador unido a la fase sólida será inversamente proporcional a la cantidad de autoanticuerpos inicialmente presentes en la muestra de suero. Una vez separada la fase sólida, el radiomarcador no unido específicamente puede ser separado mediante lavado y se determina la cantidad de radiomarcador unido a la fase sólida. La cantidad de radiomarcador unido puede relacionarse a su vez con la cantidad de autoanticuerpos inicialmente presentes en la muestra.

Además de los protocolos de ensayos inmunológicos convencionales como los descritos anteriormente, la presencia del autoanticuerpo de 64 k en sueros se puede detectar midiendo el efecto del autoanticuerpo sobre la actividad enzimática de GAD de SNC o de GAD pancreática de peso molecular más bajo introducida en una muestra del suero. Tales ensayos directos con enzimas pueden estar basados en el método descrito por Albers y Brady (1959) J. Biol. Chem. 234:926-928. Una descripción detallada de una técnica adecuada se ofrece más adelante con referencia a la figura 3 en la sección experimental, en donde la interacción entre los autoanticuerpos y la GAD es detectada en base a la pérdida de actividad enzimática.

El ligando purificado de la presente invención se puede incorporar como componentes de composiciones farmacéuticas útiles para atenuar, inhibir o prevenir la destrucción de células \beta pancreáticas, asociada con el inicio de diabetes mellitus dependiente de insulina. Las composiciones deberán contener una cantidad terapéutica o profiláctica de al menos un ligando purificado según la presente invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia compatible, no tóxica, adecuada para suministrar los polipéptidos al paciente. Como vehículo se pueden emplear agua estéril, alcohol, gasas, ceras y sólidos inertes. En las composiciones farmacéuticas se pueden incorporar también adyuvantes, agentes tampón, agentes dispersantes y similares, farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones pueden contener un solo polipéptido o bien pueden contener dos o más polipéptidos de acuerdo con la presente invención, en forma de un "cocktail".

Los inventores creen en la actualidad que la destrucción de células \beta pancreáticas en IDDM es una respuesta autoinmunitaria celular. De este modo, las composiciones farmacéuticas deberán ser adecuadas para inhibir dicha respuesta. En particular, puede ser conveniente acoplar los ligandos purificados de la presente invención a inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG, o a células linfoides del paciente que está siendo tratado, con el fin de promover la tolerancia. Dicha técnica es descrita en Bradley-Mullen, Activation of Distinct Subsets of T Suppressor Cells with Type III Pneumococcal Polysaccharide Coupled to Syngeneic Spleen Cells, en: IMMUNOGICAL TOLERANCE TO SELF AND NO-SELF, Buttisto et al., eds., Annals N.Y. Acad. Sci., Vol. 392, pp. 156-166, 1982. Alternativamente, los péptidos pueden ser modificados para mantener o mejorar la unión a MHC, reduciéndose o eliminándose al mismo tiempo la unión al receptor de células T asociado. De este modo, los péptidos de GAD modificados pueden competir con la GAD natural para inhibir la activación de células T colaboradoras e inhibir así la respuesta inmunitaria. En todos los casos, deberán tomarse las debidas precauciones para que la administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención no potencie la respuesta autoinmunitaria.

Las composiciones farmacéuticas antes descritas son útiles para su administración parenteral. Preferentemente, las composiciones se administrarán por vía parenteral, es decir, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa. De este modo, la invención proporciona composiciones para su administración parenteral a un paciente, en donde las composiciones comprenden una solución o dispersión de los polipéptidos en un vehículo aceptable, como antes se ha descrito. La cantidad de la proteína o polipéptido en la composición farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de 0,1% en peso aproximadamente, siendo normalmente de al menos 1% en peso aproximadamente, hasta una cantidad tan elevada como del 20% en peso o más. Las composiciones farmacéuticas típicas para inyección intramuscular serán preparadas para que contengan, por ejemplo, 1 ml de agua tamponada estéril y de 1 a 100 \mug del ligando purificado de la presente invención. Una composición típica para infusión intravenosa podría producirse de manera que contenga de 100 a 500 ml de solución estéril de Ringer y de 100 a 500 mg del ligando purificado. Los métodos actuales para la preparación de composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos en la técnica y han sido descritos con detalle en diversas fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª Edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

Las composiciones farmacéuticas de polipéptidos de la presente invención se pueden administrar para el tratamiento profiláctico de individuos prediabéticos identificados por los métodos de ensayo de la presente invención o para el tratamiento terapéutico de individuos que padecen de diabetes mellitus dependiente de insulina pero que presentan una masa residual importante de células \beta pancreáticas. Para aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un paciente que padece de diabetes establecida en una cantidad suficiente para inhibir o prevenir la destrucción adicional de células \beta. Para individuos susceptibles a la diabetes, las composiciones farmacéuticas se administran profilácticamente en una cantidad suficiente para prevenir o inhibir la destrucción inmunitaria de las células \beta. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Dicha dosis eficaz dependerá de la severidad de la respuesta autoinmunitaria y del estado general de la salud del paciente, pero en general oscilará entre 1 y 500 mg aproximadamente de ligando purificado por kg de peso corporal, utilizándose más generalmente dosis de 5 a 25 mg aproximadamente por kg.

Los métodos terapéuticos de la presente invención comprenden administrar las composiciones farmacéuticas de la presente invención en las cantidades y bajo las circunstancias descritas anteriormente.

Además de utilizar los péptidos de GAD directamente en composiciones farmacéuticas, también es posible emplear los péptidos de GAD para mejorar la tolerancia al antígeno de 64 k en individuos diabéticos y prediabéticos. Se recogen linfocitos de sangre periférica del individuo de manera convencional y se estimulan por exposición al péptido de GAD o ligando equivalente, como se ha definido anteriormente. En general, estarán presentes otros mitógenos y realzadores del crecimiento, por ejemplo, fitohemaglutinina, interleuquina 2. Las células T colaboradoras en proliferación pueden ser aisladas y cloradas, también bajo la estimulación del péptido de GAD. Los clones que continúan proliferándose pueden utilizarse entonces para preparar composiciones terapéuticas para el individuo. Las células T clonadas pueden ser atenuadas, por ejemplo, por exposición a radiación, y administradas al hospedante con el fin de inducir tolerancia. Alternativamente, el receptor de células T o porciones del mismo puede ser aislado por métodos convencionales de purificación de proteínas a partir de las células T clonadas y administrado al individuo. Dichos métodos de inmunoterapia son descritos en general en Sinha et al. (1990) Science 248:1380-1388.

En algunos casos, una vez que la célula T colaboradora ha sido clonada como antes se ha descrito, puede ser posible desarrollar péptidos terapéuticos a partir del receptor de células T, en donde los péptidos serán beneficiosos para el tratamiento de una población de individuos diabéticos y/o prediabéticos. En tales casos, el gen del receptor de células T puede ser aislado y clonado por técnicas convencionales y pueden producirse péptidos, a base del receptor, mediante técnicas recombinantes, como anteriormente se ha descrito. Los péptidos producidos por técnicas recombinantes pueden ser entonces incorporados en composiciones farmacéuticas, como anteriormente se ha descrito.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a título ilustrativo y de ningún modo limitativo.

Experimental Los anticuerpos a GAD inmunoprecipitan el autoantígeno de 64 kD a partir de islotes

En primer lugar se evaluó si el suero S3, un antisuero de oveja promovido a GAD purificada de cerebro de rata (Oertel et al. (1980) Brain Res. Bull. 5 (Suppl 2): 713-719) y sueros de pacientes con síndrome del hombre rígido (SMS) positivos respecto a los anticuerpos a GAD (Solimena et al. (1988) supra. y Solimena et al. (1990) supra.) podrían inmunoprecipitar el autoantígeno de 64 kD a partir de islotes de rata. Para este fin, se emplearon fracciones de células de islotes de rata marcadas con ^{35}S-metionina, parcialmente enriquecidas en el antígeno de 64 kD (S-100 DP, Fig. 1). Los sueros positivos al anticuerpo a GAD inmunoprecipitaron un doblete de proteínas marcadas con ^{35}S-metionina, las cuales, en SDS-PAGE, son de idéntica movilidad que el autoantígeno \alpha/\beta de 64 kD inmunoprecipitado por sueros de IDDM (Fig. 1A, carriles 2-9).

Para evaluar la posible identidad común de las proteínas reconocidas por los sueros positivos a anticuerpo de 64 kD y por los sueros positivos a anticuerpo a GAD, los sobrenadantes resultantes de la inmunoprecipitación con sueros positivos a anticuerpo a GAD fueron reprecipitados posteriormente con sueros de IDDM positivos a anticuerpo de 64 kD. Similarmente, los sobrenadantes resultantes de la inmunoprecipitación con sueros de IDDM positivos a anticuerpo de 64 kD fueron reprecipitados con sueros positivos a anticuerpo a GAD. Los resultados de dichos experimentos demostraron que los sueros positivos a anticuerpo a GAD y los sueros positivos a anticuerpo de 64 kD separaron cada uno de ellos cuantitativamente la proteína reconocida por el otro grupo de sueros, demostrando ello una reactividad cruzada completa entre los sueros positivos a anticuerpo a GAD y a anticuerpo de 64 kD, sugiriendo ello firmemente que la proteína de 64 kD es GAD de islotes de rata (Fig. 1A, carriles 10-20).

La digestión con tripsina de extractos de células de islotes marcadas con ^{35}S-metionina, seguido por inmunoprecipitación, demostró la formación de un fragmento inmuno-reactivo de 55 kD tanto a partir de la proteína de 64 kD como de la GAD, verificando con ello aún más su identidad común (Fig. 1B). Por otro lado, análisis 2D de GAD inmunoprecipitada a partir de islotes marcados con ^{35}S-metionina con el antisuero de S3, revelaron un modelo idéntico al descrito para la proteína de 64 kD (Baekkeskov et al. (1989) supra.) (resultados no mostrados). Este modelo fue también idéntico al modelo 2D de GAD pancreática y de cerebro, como quedó demostrado por la transferencia Western de geles 2D con el suero de S3 (véase Fig. 5A).

La figura 1A es un fluorograma de un SDS-PAGE que muestra la inmunoprecipitación de fracciones solubles purificadas en fase de detergente Triton X-114 a partir de los islotes de rata marcados con ^{35}S-metionina (S-100 DP) son sueros positivos a anticuerpo a GAD, sueros de IDDM positivos a anticuerpo de 64 kD y sueros de control. Carriles 2-9, muestras de una sola inmunoprecipitación con los sueros indicados en la parte superior de cada carril; carriles 10-20, muestras de una segunda inmunoprecipitación de los sobrenadantes que permanecen después de una primera inmunoprecipitación. Los sueros empleados para las inmunoprecipitaciones primera y segunda se indican en la parte superior de cada carril. Los sueros empleados para las inmunoprecipitaciones se indican en la parte superior de cada carril. Los sueros empleados para las inmunoprecipitaciones fueron: C, sueros procedentes de individuos sanos; SMS, sueros de pacientes SMS que previamente mostraron ser positivos a anticuerpo a GAD (Solimena (1990) supra.); 1, sueros procedentes de pacientes de IDDM positivos a anticuerpo de 64 kD recientemente diagnosticados (Sigurdsson et al. Genetic, Environmental and Autoimmune Etiology. Current Topics in Microbiology and Immunology (eds. Baekkeskov et al.) Vol. 164 Springer, Verlag, Heidelberg, 1990) (los números indican el código del paciente); S3, un antisuero de oveja promovido a GAD purificada de cerebro de rata (Oertel et al. (1980) supra.). Los marcadores del peso molecular se muestran en el carril 1. Los sueros positivos a anticuerpo a GAD inmunoprecipitan GAD de los sobrenadantes después de la inmunoprecipitación con sueros positivos a anticuerpo de 64 kD (carriles 11 y 18). Los sueros positivos a anticuerpo de 64 kD inmunoprecipitan la proteína de 64 kD de los sobrenadantes después de la inmunoprecipitación con suero de control (carril 16), pero no de los sobrenadantes después de la inmunoprecipitación con sueros positivos a anticuerpo a GAD (carriles 13-15). La triple banda representa la forma de 65 kD y las formas de 64 kD \alpha y \beta del antígeno de 64 kD (Baekkeskov et al. (1989) supra.). Los sueros de SMS 1, 2 y 3 corresponden a los pacientes #190, 188 y 1 (Solimena et al. (1990) supra.).

La figura 1B es un fluorograma que muestra la inmunoprecipitación de la proteína de 64 kD y de GAD a partir de S-100 DP de islotes de rata marcados con ^{35}S-metionina antes de la digestión con tripsina (carriles 2-4) y después de la digestión con tripsina (carriles 4-10). Los códigos de los sueros son como en la leyenda para A. NSS es un suero de oveja preinmune. La digestión con tripsina da lugar a un fragmento inmuno-reactivo de 55 kD que es reconocido tanto por los sueros positivos a anticuerpo de 46 kD como por el suero S3 positivo a anticuerpo a GAD.

Se aislaron islotes de ratas neonatales y se marcaron con ^{35}S-metionina en la forma ya descrita (Baekkeskov et al. (1989) supra.). Los islotes se hincharon en hielo durante 10 minutos en 10 mM Hepes pH 7,4, 1 mM MgCl_{2} y 1 mM EGTA (tampón HME) y luego se homogeneizaron mediante 20 pasadas por un homogenizador de vidrio. El homogenado fue centrifugado a 2.000 g para separar restos celulares y el sobrenadante post-nuclear se centrifugó a 100.000 g durante 1 hora para obtener un citosol (S-100) y una fracción de macropartículas (P-100). Las proteínas anfófilas fueron purificadas a partir de la fracción S-100 mediante una modificación del método descrito en Bordier, C. (1981) J. Biol. Chem. 256:1604-1607 para la separación de fases con Triton TX-114. De forma resumida, la fracción S-100 se hizo 1% en TX-114, se calentó a 37ºC durante 2 minutos para inducir la transición de fases con TX-114 y se centrifugó a 15.000 g durante 2 minutos, para separar las fases acuosa y detergente. La fase detergente fue diluida en 20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl (TBS) e inmunoprecipitada en la forma ya descrita (Baekkeskov et al. (1981) supra.) empleando DP de 300 islotes para cada inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados fueron analizados mediante SDS-PAGE (10%) y procesados por fluorografía (Baekkeskov et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6456-6560). Para la digestión con tripsina, se diluyó S-100 DP a partir de 4.000 islotes a 200 \mul 10 mM Hepes, 5 mM EDTA, 5 mM pirofosfato, 5 mM benzamidina/HCl, pH 7,5. El material digerido y sin digerir fue inmunoprecipitado y los inmunoprecipitantes fueron analizados mediante SDS-PAGE (15%). Los marcadores del peso molecular mostrados son \beta-fosforilasa ^{14}C metilada (PM 94.000 y 100.000), albúmina de suero bovino (PM 69.000), ovalbúmina (PM 45.000) y anhidrasa carbónica (PM 30.000). Los sueros positivos a anticuerpo de 64 kD procedía de 3 pacientes de IDDM recientemente diagnosticados, los sueros de control procedían de 2 individuos sanos, los sueros SMS procedían de 3 individuos positivos a anticuerpo a GAD (Solimena et al. (1990) supra.). El antisuero S3 se obtuvo en Dr. I. J. Kopin, NIH.

Los autoanticuerpos a la proteína de 64 kD inmunoprecipitan GAD a partir de cerebro e islotes

A continuación se analizó si los sueros positivos a anticuerpo de 64 kD podían inmunoprecipitar GAD a partir de cerebro y de islotes de la rata. Se prepararon fracciones de membrana y fracciones solubles a partir de cerebro e islotes y se sometieron a inmunoprecipitación con suero S3, sueros SMS positivos a anticuerpo a GAD, sueros IDDM positivos a anticuerpo de 64 kD y sueros de control. La presencia de GAD en los inmunoprecipitados fue analizada mediante transferencia Western. Las manchas fueron soldadas con suero S3 o suero 7673, un suero de conejo promovido a un péptido sintético de 17 aminoácidos correspondiente al terminal C de la isoforma más grande de GAD de cerebro de la rata (Julien et al. (1990) supra.). Ambos sueros proporcionaron resultados idénticos. La figura 2 muestra una mancha Western que contiene algunos de tales inmunoprecipitados soldados son suero S3. Como cabía esperar, se detectó una banda inmuno-reactiva con la movilidad electroforética de GAD en los inmunoprecipitados obtenidos con sueros positivos a anticuerpo a GAD (Fig. 2, carriles 11, 12 y 16). Se visualizó una banda de movilidad idéntica en todos los inmunoprecipitados obtenidos con sueros positivos a anticuerpo de 64 kD (7/7) (Fig. 2, carriles 1-7 y 14), pero no en los obtenidos con los sueros de control (Fig. 2, carriles 8-10, 13, 15 y 17). Estos resultados demuestran que la proteína inmunoprecipitada a partir de cerebro e islotes por los sueros positivos a anticuerpo de 64 kD es indistinguible de GAD.

La figura 2 representa una transferencia Western de inmunoprecipitados de fracciones de células de cerebro de rata (S-100 DP) y de islotes de rata (P-100 DP), obtenidas con sueros positivos a anticuerpo de 64 kD y con sueros positivos a anticuerpo a GAD. La mancha fue sondada con el suero S3. Los sueros empleados para la inmunoprecipitación vienen indicados en la parte superior de cada carril por los mismos códigos que en la figura 1. La proteína de 64 kD inmunoprecipitada tanto a partir del cerebro como de los islotes es inmuno-manchada por los anticuerpos a GAD. En el gel se muestra que la GAD migra como una sola banda.

Se homogenizó cerebro de rata neonatal a 4ºC en siete volúmenes de tampón HME seguido por centrifugado a 100.000 g durante 1 hora para obtener fracciones solubles (S-100) y en partículas (P-100). Se preparó S-100 DP y se inmunoprecipitaron partes alícuotas (1/13 cerebro por carril) como se ha descrito en la leyenda respecto a la figura 1. Se preparó P-100 a partir de islotes de ratas neonatales y se extrajo en 200 ml de TBS con 1% Triton X-114 durante 2 horas a 4ºC (Baekkeskov et al. (1989) supra.). Se preparó P-100 DP en la forma descrita para S-100 DP y se inmunoprecipitaron partes alícuotas (1.500 islotes por carril). Los inmunoprecipitados fueron sometidos a SDS-PAGE seguido por electrotransferencia a una membrana de PVDF (Immobilon®) (Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4850-4854), sondando con el suero S3 y visualización por IgG de conejo anti-oveja, conjugada a fosfatasa alcalina.

La proteína de 64 kD tiene actividad enzimática de GAD

La implicación de que el autoantígeno de 64 kD es de hecho GAD pronostica que la proteína de 64 kD deberá tener las propiedades enzimáticas de GAD y esta posibilidad ha sido examinada. Se ha investigado si la actividad enzimática de GAD podría separarse de lisados de células de islotes y cerebro de ratas neonatales por inmunoprecipitación con un suero de IDDM positivo al anticuerpo de 64 kD, y si la actividad de GAD podía medirse entonces en los inmunoprecipitados. Se sometieron fracciones de células de cerebro y de islotes a inmunoprecipitación con cantidades cada vez mayores de un suero de IDDM positivo al anticuerpo de 64 kD y se midió la actividad enzimática de GAD después de la inmunoprecipitación, tanto en los sobrenadantes como en los pellets (Figs. 3A y B). Los resultados demostraron que la inmunoprecipitación con cantidades cada vez mayores de suero positivo al anticuerpo de 64 kD, pero no con el suero de control, separó la actividad de GAD de los lisados de células tanto del cerebro como de los islotes, de un modo dependiente de la dosis, y que, en paralelo, aparecieron cantidades cada vez mayores de actividad GAD en los inmunoprecipitados. La actividad de GAD recuperada en los inmunoprecipitados no tuvo en cuenta toda la actividad perdida a partir de los sobrenadantes, debido probablemente a un efecto inhibidor de los anticuerpos sobre la actividad de la enzima. En el caso de extractos de células de islotes, obtenidas a partir de islotes marcados con ^{35}S-metionina, el análisis SDS-PAGE reveló que la única proteína de células de islotes, detectada específicamente en los inmunoprecipitados obtenidos con el suero de IDDM positivo al anticuerpo de 64 kD, fue el autoantígeno de 64 kD (ver Fig. 1). De este modo, la actividad de la enzima GAD medida en los inmunoprecipitados obtenidos con el suero de IDDM positivo al anticuerpo de 64 kD, es una propiedad del autoantígeno de 64 kD.

La figura 3A es un gráfico obtenido por inmunoprecipitación de partes alícuotas (700 islotes por muestra) de S-100 DP de islotes de ratas neonatales con cantidades cada vez mayores del suero 1-1 de IDDM positivo a 64 kD (símbolos negros) o del suero de control C-1 (símbolos blancos). La actividad de GAD se midió en los sobrenadantes después de la inmunoprecipitación (cuadrados) y en los pellets (círculos). La actividad en los sobrenadantes se calculó como el porcentaje de la actividad en muestras no inmunoprecipitadas e incubadas con la misma cantidad de suero de control. La actividad en los inmunoprecipitados se calculó como al porcentaje de la actividad en muestras incubadas sin suero. Los valores son la media de 3 experimentos \pm desviación estándar. La figura 3B es similar a la figura 3A, excepto que, en lugar de material celular de islotes, se utilizaron partes alícuotas de S-100 DP de cerebro de rata neonatal.

Se preparó S-100 DP a partir de islotes y cerebro como se ha descrito en las leyendas para las figuras 1 y 2, excepto que los tampones fueron suplementados con 1 mM hidrobromuro de bromuro de aminoetilisotiouronio (AET) y 0,2 mM piridoxal-5'-fosfato (PLP). Se diluyó S-100 DP 10 veces en 50 mM fosfato potásico pH 6,8, 1 mM AET, 0,2 mM PLO (tampón A) y se incubó con las cantidades indicadas de sueros en un volumen total de 150 ml durante 7 horas a 4ºC. Los inmunocomplejos se absorbieron a 150 \mul perlas de proteína A-Sepharose (PAS, Pharmacia) y se aislaron por centrifugado. Los sobrenadantes fueron recogidos y centrifugados 3 veces para separar trazas de PAS. Los pellets de PAS fueron lavados 5 veces por centrifugado en tampón A. La actividad enzimática en los pellets de PAS y en los sobrenadantes se midió empleando una versión modificada del ensayo descrito por primera vez en Albers et al. (1959) J. Biol. Chem. 234:926-928. Tanto los pellets de PAS como los sobrenadantes fueron transferidos a tubos de 1,5 ml provistos de tapón roscado. Se añadieron 20 \mul de 5 mM L-glutamato en tampón A y 0,4 \muCi [1-^{14}C]-L-glutamato (59 mCi/mmol, Amersham). Los tubos se cerraron inmediatamente con un tapón que contiene papel de filtro Whatman impregnado en 50 \mul de hidróxido de hiamina 1 M en metanol y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. El papel de filtro fue retirado entonces y se midió el ^{14}CO_{2} absorbido en un contador de escintilación. La actividad específica de GAD en los homogenados de material celular de cerebro y de islotes de ratas neonatales fue similar (aproximadamente 40-70 mU/g proteína).

Análisis comparativos de GAD de cerebro y de células \beta

El análisis de la actividad enzimática de GAD en tejidos de ratas neonatales y adultas demostró que la GAD se expresa a niveles muy altos en células de cerebro y de islotes y está ausente, o presente en niveles muy bajos, en una variedad de otros tejidos analizados (resultados no mostrados) que confirman los informes anteriores (Erdo y Bowery (eds.) GABAergic Mechanisms in the Mammalian Periphery, New York, Raven Press (1986)). Dentro de los islotes, el doble inmunomanchado con un anticuerpo monoclonal a GAD y glucagon o somatostatina, confirmó la localización de GAD en el núcleo de las células \beta y la ausencia de GAD en las otras células endocrinas, las cuales están localizadas en la periferia de los islotes (figura 4). Se comprobó que la GAD del cerebro y de los islotes presentaba una movilidad idéntica según SDS-PAGE (figura 2) y según la electrofóresis bi-dimensional en gel empleando IEF/SDS-PAGE (figura 5A). Se comparó además los fragmentos de tripsina inmuno-reactivos generados a partir de GAD de cerebro y de islotes. La tripsina generó un fragmento inmuno-reactivo de 55 kD a partir de GAD tanto de islotes como de cerebro (figura 5B, véase también la figura 1). En ambos tejidos, la GAD se encontró en una forma hidrófoba soluble y también en una forma hidrófoba unida a la membrana (figura 5B), como se ha descrito para el autoantígeno de 64 kD de células de islotes. El componente de 65 kD de la proteína de 64 kD fue detectado en células de cerebro y de islotes en algunos (Fig. 1A, Fig. 5A, carriles b y c, Fig. 5B y Fig. 6) pero no en otros análisis (Fig. 1B y Fig. 2). Además, el doblete \alpha/\beta de 64 kD fue detectado en algunos análisis (Fig. 1A y 6). En resumen, los análisis de las propiedades inmunoquímicas y bioquímicas de la GAD de cerebro y de islotes sugiere que las mismas son altamente homólogas.

La figura 4 es una micrografía de inmunofluorescencia que muestra islotes pancreáticos. El islotes de los carriles a y c fue marcado doblemente para GAD y glucagon. El islote de carril b y d fue marcado doblemente para GAD y somatostatina. Las flechas apuntan hacia las correspondientes células de los dos pares de carriles. Las células \beta del núcleo central del islote están manchadas con brillo con el anticuerpo a GAD, mientras que las células positivas a glucagon y somatostatina no están manchadas con el mismo anticuerpo.

Secciones congeladas de páncreas de rata, fijadas con formaldehído, fueron marcadas primero con rodamina para GAD empleando una GAD6 monoclonal de ratón, promovida a GAD purificada de cerebro de rata (Chang et al. (1988) supra.) y luego marcadas con fluoresceína para glucagon o somatostatina empleando anticuerpo policlonales de conejo a cualquiera de las hormonas y empleando métodos ya descritos (Baumert et al. (1990) J. Cell. Biol. 110:1285-1294). La GAD6 se obtuvo en Dr. D.I. Gottlieb, University of Washington. Bar = 25 mm.

La figura 5A es una electrofóresis bi-dimensional (2D) en gel de antígeno de GAD/64 kD de células de ratas neonatales y de islotes. Carriles a y b, transferencias Western de geles 2D de una fracción en partículas de islotes neonatales (a) y de una fracción de cerebro (b) sondadas con el antisuero S3 a GAD; carriles c y d, fluorogramas de geles 2D de inmunoprecipitados de un extracto de islotes de rata marcado con ^{35}S-metionina (S-100 DP) con el suero 1-1 de IDDM positivo a anticuerpo de 64 kD (c) y con un suero de control C-1 (d). Las fracciones solubles de cerebro y de islotes (carriles b y c) contienen ambas el componente de 65 kD p1 7,1 y el componente de 64 kD p1 6,7. Tanto el componente de 65 kD como el componente de 64 kD muestran una heterogeneidad de carga previamente descrita para el autoantígeno de 64 kD en islotes (Baekkeskov et al. (1989) supra.). Ambos carriles demuestran el comportamiento idéntico de la proteína de 64 kD (carril c) y de GAD (carriles a y b), probando además que son la misma proteína y muestran las similitudes de GAD de cerebro y de islotes con respecto tanto a la carga como al tamaño.

La figura 5B es una transferencia Western de GAD soluble y en partículas obtenida a partir de cerebro e islotes de ratas neonatales y después de la digestión con tripsina. Carriles 1-8, sondado con suero S3; carriles 9-16, sondado con suero normal (preinmune) de oveja. La digestión con tripsina de ambas GAD de cerebro y de islotes da lugar a un fragmento inmuno-reactivo de GAD de 55 kD.

Se preparó una fracción en partículas de homogenados de islotes de ratas neonatales por centrifugado a 36.000 g (carril a). Se preparó un sobrenadante sinaptosomal de baja velocidad a partir de cerebro en la forma descrita por (Huttner et al. (1983) J. Cell Biol. 96:1374-1388) (carril b). Se preparó S-100 DP a partir de islotes de ratas neonatales y se inmunoprecipitó en la forma descrita en las leyendas para la figura 1 (carriles c y d). Se llevó a cabo una electrofóresis bi-dimensional en gel en la forma descrita por O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250:4007-4021 y modificada según Ames et al. (1976) Biochemistry 15:616-623. La inmuno-transferencia se realizó de acuerdo con Towbin et al. (1979) supra. La GAD de los carriles a y b fue visualizada mediante sondado con el suero S3 anti GAD, seguido por suero de conejo anti-IgG de oveja y I^{125} proteína A y autoradiografía. Para el experimento del carril B, se prepararon S-100 DP y P-100 DP a partir de islotes y de cerebro en la forma descrita en las leyendas para las figuras 1 y 2 y se realizó la digestión con tripsina en la forma descrita en las leyendas para la figura 1. Las fracciones de células de cerebro y de islotes se sometieron a SDS-PAGE empleando gel de poliacrilamida al 15%. La transferencia Western y los procedimientos de manchado fueron como se ha descrito en las leyendas para la figura 2.

Comparación de anticuerpos a GAD en sueros de SMS e IDDM

La reactividad de GAD en sueros de SMS ha sido demostrada mediante transferencia Western y mediante manchado inmunocitoquímico de secciones de tejido fijadas (Solimena et al. (1988) supra. y Solimena et al. (1990) supra.), es decir, ensayos que implican la desnaturalización completa o parcial del antígeno. El ensayo estándar para los anticuerpos de 64 kD en sueros de IDDM ha sido la inmunoprecipitación a partir de lisados de células de islotes preparados en condiciones no desnaturalizantes (Baekkeskov et al. (1987) J. Clin., Invest. 79:926-934, Baekkeskov et al. (1982) supra., y Baekkeskov et al. (1989) supra.). Se seleccionaron sueros de los individuos que presentaban la inmuno-reactividad más alta al autoantígeno de 64 kD en experimentos de inmunoprecipitación en un estudio con 112 pacientes de IDDM e individuos prediabéticos sin SMS (Sigurdsson et al. (1990) supra.), ensayándolos respecto a la inmuno-reactividad a la proteína de GAD de cerebro en transferencias Western (5 sueros) y respecto al inmunomanchado de neuronas GABA-érgicas (7 sueros). Los resultados fueron comparados con los obtenidos para sueros de SDS. En contraste con los sueros de SMS, ninguno de los sueros de IDDM detectaron la proteína de GAD desnaturalizada en las transferencias Western (figura 6) y solo uno de ellos fue capaz de inmunomanchar débilmente las neuronas GABA-érgicas (figura 7, carril C). La valoración de sueros de IDDM y SMS en experimentos de inmunoprecipitación demostraron además que los sueros de SMS tenían habitualmente un título 10-200 veces mayor de anticuerpos a GAD que los sueros de IDDM (resultados no mostrados). En otro estudio con 74 pacientes de IDDM, solo tres de ellos resultaron ser positivos para anticuerpos a neuronas GABA-érgicas (figura 7, carril B) incluyendo los dos que únicamente fueron positivos mediante transferencia Western (13 y resultados no mostrados). Por el contrario, todos los sueros de SMS positivos mediante inmunoquímica y/o transferencia Western fueron también positivos mediante inmunoprecipitación (resultados no mostrados).

De este modo, en resumen, los anticuerpos a GAD en pacientes de SMS son en general de un mayor título y de un reconocimiento distinto de epitopos en comparación con anticuerpos a GAD en pacientes de IDDM. Sin embargo, en raros casos, los anticuerpos a GAD en pacientes de IDDM pueden reconocer GAD desnaturalizada. De manera interesante, mientras que los antisueros 7673 y S3 reconocen ambas isoformas \alpha y \beta de 65 kD y 64 kD en transferencias Western (figura 6, carriles 2 y 4), los autoanticuerpos a GAD humano así como la GAD6 de anticuerpo monoclonal reconocen preferentemente las isoformas \alpha y \beta más pequeñas de 64 kD (figura 2, carriles 5 y 7-11). El anticuerpo a GAD6 fue anotado como específico para la isoforma de GAD más pequeña en el cerebro.

La figura 6 ilustra transferencias Western de S-100 DP de cerebro de rata neonatal (carriles 1-4 y 7-24) y de islotes (carriles 5 y 6) sondados con sueros de SMS positivos al anticuerpo a GAD y con sueros de pacientes de IDDM e individuos prediabéticos con alta inmuno-reactividad a la proteína de 64 kD/GAD en experimentos de inmunoprecipitación. Los sueros están indicados en la parte superior de cada carril por los mismos códigos que en la figura 1. El suero S3, el suero 7673, el suero GAD6 y los sueros de SMS positivos al anticuerpo a GAD reconocen la forma desnaturalizada de GAD en cerebro e islotes, mientras que no lo hacen los sueros de IDDM positivos a 64 kD. Los sueros S3 y 7673 reaccionan tanto con la forma de 65 kD como con las formas \alpha y \beta de 64 kD, mientras que la GAD6 (que previamente se demostró que reaccionaba selectivamente con la isoforma más pequeña de GAD de cerebro (Chang et al. (1988) supra.) y los sueros de SMS solo reaccionan con los componentes \alpha y \beta de 64 kD.

Se sometieron partes alícuotas de S-100 DP de cerebro e islotes de ratas a SDS-PAGE, electrotransferencia e inmunomanchado en la forma descrita en las leyendas para la figura 2. Las diluciones para el inmunomanchado en las transferencias Western fueron de 1/200 para GAD6, 1/250 para sueros de IDDM, sueros humanos de control, sueros 2 y 5 de SMS, el suero 7673 y el suero de conejo normal, 1/500 para los sueros 3 y 4 de SMS y 1/2.000 para los sueros S3 y normal (preinmune) de oveja. (Los sueros 4 y 5 de SMS corresponden a los pacientes #161 y 176 en Solimena et al. (1990) supra.).

Las micrografías del microscopio de luz de campo claro muestran el inmunomanchado de terminales nerviosos GABA-érgicos en la corteza cerebelar de la rata con sueros de SMS y de IDDM. Carril a, suero SMS-3; carril b, suero IDDM 1-8 (paciente 69 de Solimena et al. (1990) supra.); carril c, suero IDDM 1-2; carril d, suero IDDM 1-1. Todos los sueros, excepto 1-1, muestran la mancha típica de terminales nerviosos GABA-érgicos. Ha de observarse la acumulación de inmuno-reactividad en la base de las células Purkinje, en donde finalizan los terminales nerviosos GABA-érgicos de células en cesta. Los procedimientos fueron realizados en la forma descrita en Solimena et al. (1990) supra

Los autoanticuerpos de pacientes IDDM reconocen ambas formas de peso molecular de GAD pancreática

Se clonó la forma de mayor peso molecular de GAD pancreática (GAD_{67kD}) a partir de una biblioteca de cDNA de islotes de rata. Mediante la expresión de esta proteína en una línea celular de mamífero (COS), se pudo producir GAD_{67kD} que retenía su actividad enzimática y que se reconoció por anticuerpos bien caracterizados a GAD de cerebro. Este sistema de expresión celular fue utilizado para evaluar si GAD_{67kD} es o no una diana de autoanticuerpos en IDDM y, si lo es, si los anticuerpos se presentan o no con una incidencia similar a los anticuerpos dirigidos hacia la forma de menor peso molecular de GAD pancreática (GAD_{64kD}).

Las células COS transfectadas con plásmidos que contienen el gen clonado de GAD_{67kD} y las células COS que contienen plásmidos con el mismo gen insertado en una dirección inversa (control), se cultivaron bajo condiciones estándar y se marcaron con ^{35}S-metionina. A partir de las células marcadas se aislaron proteínas hidrófilas solubles (Baekkeskov et al. (1990) Nature 347:151-156) y se inmunoprecipitaron con sueros de 27 pacientes de IDDM recientemente diagnosticados, 15 individuos prediabéticos (4 meses a 7 años antes del inicio clínico), 8 pacientes de SMS y 10 individuos sanos. En el 91,4% de todos los sueros positivos al anticuerpo a GAD_{64kD} de los pacientes de IDDM recientemente diagnosticados y de individuos prediabéticos, reconocieron GAD_{67kD} (Fig. 7). Además, 2/5 (40%) de los individuos negativos al anticuerpo a GAD_{64kD} fueron positivos al anticuerpo a GAD_{67kD}. Todos los controles negativos al anticuerpo a GAD_{64kD} fueron también negativos para anticuerpos a GAD_{67kD}. Todos los pacientes de SMS ensayados en el estudio, mostraron anticuerpos contra ambas formas de GAD. Las células COS que contienen el gen de GAD_{67kD} insertado en la dirección inversa no contenían proteínas que fuesen precipitadas de manera específica por los sueros de IDDM.

De este modo, queda demostrado que los antígenos de GAD_{67kD} y GAD_{64kD} contienen ambos epitopos reconocidos por anticuerpos asociados con las fases inicial y tardía de la destrucción de células \beta. La alta correlación entre anticuerpos contra GAD_{64kD} y GAD_{67kD}, encontrada en este estudio, apunta a un alto grado de homología entre epitopos autoantígenos en las dos formas de la enzima. Sin embargo, los datos indican también que la forma de GAD_{67kD} contiene distintos epitopos autoantígenos no presentes en la forma de GAD_{64kD} y que el ensayo respecto a anticuerpos contra ambas formas aumenta la sensibilidad en pacientes recientemente diagnosticados y en individuos prediabéticos.

La clonación de la GAD_{67kD} de islotes de rata se realizó como sigue. Cuatro secuencias de consenso de oligonucleótidos 128-151, 1112-1137 (inversa); 1035-1061 y 1883-1909 (inversa) de la forma de cerebro publicada de cDNA de GAD de rata (Julien et al. (1990) J. Neurochem. 54:703-705). Las mismas se emplearon en combinaciones de dos (128-151/1112-1137 y 1035-1061/1883-1909) en reacciones PCR para amplificar las secuencias homólogas en cDNA de islotes de rata. Los productos de amplificación de cada reacción PCR fueron analizados entonces mediante electrofóresis en gel de agarosa y los productos dentro del intervalo de tamaños esperado, fueron posteriormente recogidos y amplificados adicionalmente con el par cebador adecuado para aislar bandas individuales de PCR. Se investigó entonces si cualquiera de estas bandas separadas consistía en una sola especie de DNA, reflejando la amplificación de parte del gen deseado. Las moléculas aisladas fueron digeridas con enzimas de restricción específicas. En la mayoría de los casos, el conjunto generado de fragmentos tenían el tamaño del cDNA de cerebro original. Por tanto, dichas bandas PCR parecen contener cada una de ellas una sola especie de cDNA. Para determinar la naturaleza de dichos cDNAs, una parte alícuota de la reacción fue clonada en el vector plasmídico Bluescript KS+ y las colonias fueron evaluadas con una sonda consistente en un fragmento de un clon de cDNA de GAD_{67kD} de cerebro de rata, obtenido en Dr. A. Tobin de la Universidad de California. Las colonias de hibridación fueron sometidas a amplificación PCR y solo aquellas que proporcionaban un producto PCR del tamaño adecuado fueron purificadas y sometidas adicionalmente a análisis de secuencias de DNA. La secuencia de cada clon fue completada con cebadores internos correspondientes a los nucleótidos 500-516, 1305-1321 (antisentido) y 1440-1556 (antisentido). Se emplearon experimentos PCR empleando cebadores encajados (cebadores estándar seguido por cebadores a secuencias internas) para verificar que fragmentos que proporcionaban una señal positiva estaban libres de moléculas falsas. La secuenciación de los cDNAs mostró una homología completa de las secuencias con GAD_{67kD} de cerebro. De este modo, las células de islotes de rata expresan una forma de GAD que es idéntica a GAD_{67kD}. Tomando como base dichos resultados y el análisis comparativo de GAD_{67kD} en cerebro y la forma de 65 kD en islotes, al nivel de la proteína, se llegó a la conclusión de que la célula \beta de 65 kD es codificada por el gen de GAD_{67kD}.

Se obtuvieron resultados similares con células COS que expresan GAD_{67kD} de cerebro humano (la forma de mayor peso molecular) y GAD_{65kD} (la forma de menor peso molecular). Los clones de cDNA aislados de una biblioteca de cDNA de cerebro humano y que codifican GAD_{67kD} o GAD_{65kD}, obtenidos en Dr. Tobin, fueron insertados en un vector de expresión de células COS 91023B (Wong et al. (1985) Science 228:810-815). Las células COS7 fueron trasnfectadas empleando un reactivo de lipofección y marcadas con ^{35}S-metionina 48 horas después de la transfección. Se emplearon lisados celulares de la transfección de COS para analizar sueros de 25 pacientes de IDDM recientemente diagnosticados, 14 individuos prediabéticos, 8 pacientes de SMS y 10 controles. Previamente, se había comprobado que todos estos sueros (excepto los controles) contienen anticuerpos a la forma anfífila de 64 kD de GAD, empleando islotes aislados como fuente de antígeno. Todos los sueros que fueron previamente positivos con respecto a la forma de 64 kD de células de islotes, resultaron también ser positivos con respecto a GAD_{65kD} de células COS. Similarmente, todos los sueros negativos para anticuerpos a la forma de 64 kD de islotes fueron negativos para anticuerpos a GAD_{65kD} de células COS, confirmando con ello que la GAD y la forma de 64 kD de células de islotes son antigénicamente idénticas. Aunque la mayoría de los sueros de IDDM (18/25) y de los sueros de prediabéticos (8/14) y todos los sueros de SMS (8/8) reconocieron ambas GAD_{65kD} y GAD_{67kD}, los sueros de unos cuantos pacientes de IDDM reconocieron o bien GAD_{65kD} (3/25) o bien GAD_{67kD} (3/25), pero no ambas formas. Además, entre los individuos prediabéticos, 3 de 14 reconocieron específicamente GAD_{65kD}, mientras que ninguno de ellos fueron específicos para los anticuerpos a GAD_{67kD}. Se llega a la conclusión de que los autoanticuerpos en ambos pacientes de IDDM y de SMS pueden reconocer ambas formas de GAD en una configuración natural y que algunos pacientes de IDDM e individuos prediabéticos pueden reconocer preferentemente una u otra forma de GAD. Los resultados en el grupo de prediabéticos sugieren que pueden desarrollarse anticuerpos a GAD_{65kD} antes que a GAD_{67kD}.

Aunque la presente invención ha sido descrita detalladamente con el fin de poderla entender mejor, resultará evidente que pueden ponerse en práctica ciertas modificaciones en la misma dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Método para detectar, en sueros, autoanticuerpos a un autoantígeno de células \beta pancreáticas de aproximadamente 64 kD, comprendiendo dicho método exponer una muestra de suero a un ligando purificado para los autoanticuerpos que tiene una pureza de al menos 50% p/p y detectar la interacción específica entre el ligando purificado y los autoanticuerpos, en donde el ligando purificado es ácido glutámico decarboxilasa del SNC y de peso molecular más bajo o un fragmento de la misma que contiene un epitopo capaz de unir autoanticuerpos contra ácido glutámico
decarboxilasa.

2. Método según la reivindicación 1, en donde dicho ligando tiene una pureza de al menos 99%.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en donde la ácido glutámico decarboxilasa de SNC de menor peso molecular se produce mediante técnicas recombinantes.

4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en donde la ácido glutámico decarboxilasa de SNC de menor peso molecular se aísla a partir de una fuente de ácido glutámico decarboxilasa natural de SNC.

5. Método para diagnosticar o controlar diabetes mellitus dependiente de insulina o la susceptibilidad a la misma en un paciente mediante investigación de una muestra de suero del paciente, comprendiendo dicho método:

exponer la muestra de suero a ligando purificado que es ácido glutámico decarboxilasa de SNC de menor peso molecular o un fragmento de la misma y que contiene un epitopo capaz de unir autoanticuerpos contra ácido glutámico decarboxilasa y que tiene una pureza de al menos 50% p/p y

detectar la interacción entre la ácido glutámico decarboxilasa o dicho fragmento y autoanticuerpos que pueden estar presentes en la muestra de suero, en donde dicha interacción constituye un diagnóstico de diabetes mellitus dependiente de insulina o de la susceptibilidad a la misma.

6. Método según la reivindicación 5, en donde dicho ligando tiene una pureza de al menos 99%.

7. Método según la reivindicación 5 ó 6, en donde la ácido glutámico decarboxilasa de SNC de menor peso molecular se produce mediante técnicas recombinantes.

8. Método según la reivindicación 5 ó 6, en donde la ácido glutámico decarboxilasa de SNC de menor peso molecular se aísla a partir de células de SNC.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la muestra de suero se combina con autoanticuerpos solubles, marcados, de manera que los autoanticuerpos marcados y sin marcar compiten para formar complejos con el ligando purificado, en donde la cantidad de marcador unido en dichos complejos es inversamente proporcional a la concentración de autoanticuerpos inicialmente presentes en la muestra de suero.

10. Método según la reivindicación 9, en donde los autoanticuerpos se marcan con una enzima y en donde la unión del ligando a los autoanticuerpos inhibe la actividad de la enzima.

11. Método según la reivindicación 9, en donde el ligando purificado se une a una fase sólida y en donde el método comprende además separar la fase sólida de la muestra de suero con el fin de separar complejos marcados de autoanticuerpos marcados no unidos.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el ligando purificado se une a una fase sólida y en donde el método comprende además separar la fase sólida para retirar prácticamente todos autoanticuerpos presentes en la muestra y medir la cantidad de autoanticuerpos separados, en donde la cantidad es directamente proporcional a la concentración de autoanticuerpos presentes en la muestra.

13. Método según la reivindicación 12, en donde la cantidad de autoanticuerpos se mide exponiendo la fase sólida a un reactivo marcado específico para los autoanticuerpos y determinando la cantidad de reactivo marcado unido.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el ligando purificado posee actividad de ácido glutámico decarboxilasa y en donde la interacción entre el ligando y los autoanticuerpos se detecta en base a la pérdida de actividad enzimática del ligando purificado.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la interacción específica se detecta mediante inmunoprecipitación del ligando purificado y de los autoanticuerpos.

16. Método para diagnosticar o controlar diabetes mellitus dependiente de insulina o la susceptibilidad a la misma en un paciente, comprendiendo dicho método:

ensayar una muestra de suero del paciente para determinar la presencia de autoanticuerpos a ácido glutámico decarboxilasa de SNC de menor peso molecular, empleando ácido glutámico decarboxilasa de SNC de menor peso molecular con una pureza de al menos 50% en peso, para detectar los autoanticuerpos; y

ensayar la muestra para determinar la presencia de autoanticuerpos a ácido glutámico decarboxilasa de SNC de mayor peso molecular, empleando ácido glutámico decarboxilasa de SNC de mayor peso molecular, para detectar los anticuerpos,

en donde la presencia de autoanticuerpos a por lo menos una de las formas de peso molecular de GAD indica la susceptibilidad a diabetes mellitus dependiente de insulina, o bien el inicio o la persistencia de diabetes mellitus dependiente de insulina.

17. Método según la reivindicación 16, en donde los autoanticuerpos a cada forma de peso molecular de ácido glutámico decarboxilasa se detectan por separado, de manera que se conoce la presencia de cada forma.

18. Método según la reivindicación 16, en donde la presencia de autoanticuerpos a cada forma de peso molecular de ácido glutámico decarboxilasa, se determina por separado mediante reacción con ácido glutámico decarboxilasa producida por técnicas recombinantes y que está libre de la otra forma de peso molecular.

19. Método según la reivindicación 16, en donde los autoanticuerpos a cada forma de peso molecular de ácido glutámico decarboxilasa se detectan de manera simultánea, de modo que la presencia de ninguna de las formas se determina individualmente.

20. Método según la reivindicación 19, en donde la presencia de los autoanticuerpos se determina por reacción con una mezcla de ambas formas de peso molecular de ácido glutámico decarboxilasa.

21. Método según la reivindicación 20, en donde la mezcla se aísla a partir de una fuente de ácido glutámico decarboxilasa natural de SNC.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en donde el ensayo o cada uno de los ensayos consisten en un radioinmunoensayo que utiliza ácido glutámico decarboxilasa unida a una fase sólida.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en donde el ensayo o cada uno de los ensayos consiste en un inmunoensayo de adsorbente unido a una enzima y que utiliza ácido glutámico decarboxilasa unida a una fase sólida.