PL191965B1 - Zastosowanie peptydu do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stwardnienia rozsianego - Google Patents
Zastosowanie peptydu do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stwardnienia rozsianegoInfo
- Publication number
- PL191965B1 PL191965B1 PL336085A PL33608598A PL191965B1 PL 191965 B1 PL191965 B1 PL 191965B1 PL 336085 A PL336085 A PL 336085A PL 33608598 A PL33608598 A PL 33608598A PL 191965 B1 PL191965 B1 PL 191965B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mbp
- peptide
- patients
- csf
- patient
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 9
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 title description 7
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 title description 7
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 title description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 172
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 96
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 108010051539 HLA-DR2 Antigen Proteins 0.000 claims abstract description 9
- XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims abstract description 5
- SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N His-Phe-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 claims abstract description 5
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N Lys-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims abstract description 5
- DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N Val-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 44
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 claims description 31
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 claims description 31
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 8
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 91
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 91
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 89
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 62
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 28
- 101001018318 Homo sapiens Myelin basic protein Proteins 0.000 description 25
- 102000054064 human MBP Human genes 0.000 description 25
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 23
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 9
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 7
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 6
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 6
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 5
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 5
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 2
- 208000009017 Athetosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010033892 Paraplegia Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N (2s)-2-[2-[[(1s)-1,2-dicarboxyethyl]amino]ethylamino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NCCN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 206010005186 Blindness unilateral Diseases 0.000 description 1
- 241001416152 Bos frontalis Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010051290 Central nervous system lesion Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000003164 Diplopia Diseases 0.000 description 1
- 108010064885 HLA-DR3 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010046732 HLA-DR4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010001041 HLA-DR7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- 102000055324 Myelin Proteolipid Human genes 0.000 description 1
- 108700021862 Myelin Proteolipid Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 1
- 206010053395 Progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000001077 Spastic ataxia Diseases 0.000 description 1
- 208000032930 Spastic paraplegia Diseases 0.000 description 1
- 101001018322 Sus scrofa Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000002502 anti-myelin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000037456 inflammatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229940124625 intravenous corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000007694 polyacrylamide gel isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000026526 progressive weakness Diseases 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- IKGXIBQEEMLURG-NVPNHPEKSA-N rutin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 IKGXIBQEEMLURG-NVPNHPEKSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
1. Zastosowanie peptydu o wzorze Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, zdolnego do zobojetniania lub modulowania wytwarzania przeciwcial skierowanych przeciwko zasadowemu bialku mieliny, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stward- nienia rozsianego u pacjenta z haplotypem HLA-DR2. PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Wynalazek dotyczy zastosowania peptydu zdolnego do immunoregulacji przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu białku zasadowemu mieliny. Peptyd ma zastosowanie do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stwardnienia rozsianego.
Stan techniki
Stwardnienie rozsiane (sclerosis multiplex - SM) jest wieloogniskową chorobą demielinizacyjną ośrodkowego układu nerwowego (o.u.n.) u ludzi, związaną z zapaleniem. Charakterystyczną cechą SM jest zwiększenie wewnątrzpłynowej (to znaczy, do wewnątrz od bariery krew-mózg - blood-brain barrier, BBB) syntezy IgG (Tourtelotte, W.W., J Neurol Sci 10: 279-304, 1970; Link, H. i Tibbling G., Scand J Clin Lab Invest 37: 397-401, 1977; Tourtelotte, W.W., i Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J.M. i Tourtelotte, W.W., w: Hallpike J.F., Adams, C.W.M. i Tourtelotte, W.W. (red.), Multiple sclerosis, Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 275-358, i Warren, K.G. i Catz, I., Ann Neurol 17: 475-480, 1985).
U pacjentów z klinicznie pewnym SM, zarówno w aktywnym, jak i w nieaktywnym stadium choroby, synteza IgG w obrębie BBB jest zwykle podwyższona (Schumacher, G.A., Beebe, G., Kibler R.E. i wsp., Ann NY Acad Sci 15: 266-272, 1965). Nie jest znana swoistość większości IgG o.u.n. Mała część z nich wykazuje działanie przeciwwirusowe lub reaguje z przeciwciałami mózgowia, kwasami nukleinowymi, erytrocytami lub antygenami mięśni gładkich, natomiast część nieswoista może odpowiadać poliklonalnemu pobudzeniu limfocytów B (Tourtelotte, W.W., i Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978). W ciągu ostatnich dziesięciu lat dużo uwagi poświęcono badaniu przeciwciał skierowanych przeciwko swoistym białkom mieliny.
Po odkryciu krążących kompleksów immunologicznych, zawierających jako składnik antygenowy zasadowe białko mieliny (myelin basie protein - MBP) (Dasgupta, M.K., Catz, I., Warren, EE K.G. i wsp., Can J Neurol Sci 10: 239-243, 1983) u chorych z czynną postacią SM stwierdzano zwiększenie miana przeciwciał skierowanych przeciwko MBP (anty-MBP) w płynie mózgowo-rdzeniowym (cerebrospinal fluid - CSF) (Warren, K.G. i Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986). Klinicznie SM cechuje się występowaniem faz aktywności choroby, takich jak ostre rzuty lub przewlekły postęp choroby, i fazami klinicznej remisji. W czynnym SM podwyższony jest poziom wewnątrzpłynowej syntezy anty-MBP (Warren, K.G. i Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; i Catz, I. i Warren, K.G., Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986). Przeciwciała te wykrywa się głównie w postaci wolnej (F) w okresach ostrych rzutów i głównie w postaci związanej (B) w podstępnie postępującym przebiegu choroby (Warren, K.G. i Catz, l. Ann Neurol 209: 20-25, 1986). W okresie ostrego rzutu miana przeciwciał anty-MBP w CSF korelują z aktywnością choroby (Warren, K.G. i Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Poziom przeciwciał antyMBP jest również podwyższony u pacjentów z pierwszym rzutem zapalenia nerwu wzrokowego i u większości pacjentów z pierwszym rzutem SM (Warren, K.G., Catz, I. i Bauer C., Ann Neurol 23: 297-299; Warren, K.G. i Catz I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989).
Długoterminowe badania kinetyki poziomu przeciwciał anty-MBP w CSF u pacjentów wchodzących w fazę remisji po ostrym rzucie wykazały stopniowy spadek miana F anty-MBP proporcjonalny do stopniowego wzrostu frakcji B (Warren, K.G. i Catz I., J Neurol Sci 91:143-151, 1989; Warren, K.G. i Catz I., J Neurol Sci 88:185-194, 1988). W fazie remisji anty-MBP w CSF mogą stawać się niewykrywalne, co sugeruje zobojętnianie anty-MBP w nieaktywnych stadiach SM (Warren, K.G. i Catz I., J Neurol Sci 88: 185-194, 1988). Przeciwnie, w SM o przebiegu przewlekle postępującym utrzymywaniu się zwiększonego poziomu anty-MBP przez długi czas towarzyszyło zahamowanie zobojętniania anty-MBP (Warren, K.G. i Catz I., J Neurol Sci 88: 185-194, 1988). Ostatnio stwierdzono, że kaskada przeciwciał przeciwko białku zasadowemu mieliny, wykryta we frakcji IgG oczyszczonej z CSF pacjentów z SM, zawierała anty-MBP, przeciwciała zobojętniające anty-MBP i przeciwciała hamujące zobojętnianie anty-MBP (Warren, K.G. i Catz I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990).
Nasze wcześniejsze badania wykazały, z punktu widzenia zjawisk autoimmunologicznych związanych z limfocytami B, że istnieją co najmniej dwie odrębne postacie SM, przy czym większość pacjentów posiada autoprzeciwciała na białko zasadowe mieliny (anty-MBP), a mniejsza część pacjentów posiada przeciwciała przeciwko białku proteolipidowemu (anty-PLP) (Warren, K. G. i wsp., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994). W SM związanym z anty-MBP w ostrych rzutach stwierdza się podwyższony (powyżej 1) stosunek anty-MBP wolne (F)/anty-MBP związane (B), natomiast w fazie przewlekle postępującej stosunek anty-MBP F/B jest równy lub mniejszy od 1, a chorzy w rePL 191 965B1 misji wykazują niekiedy nieco podwyższone miana anty-MBP B (Warren, K.G. i Catz I., J Neurol Sci 88,
185-194, 1989) .
Udowodniono, że niektóre proliferujące limfocyty T u pacjentów z SM są skierowane przeciwko MBP (Allegretta i wsp., Science, 247, 718-721, 1990) i że ludzkie limfocyty T mogą rozpoznawać wiele epitopów na cząsteczce (Richert i wsp., J Neuroimmun 23, 55-66, 1989). Wydaje się również, że MBP jest zdolne do aktywowania niektórych limfocytów T bez współudziału komórek prezentujących antygen (Altman i wsp., Eur. J Immun 17, 1635-1640, 1987). Publikacja WO 93/21222 i WO 96/12737 ujawnia, że peptydy pochodzące z autoantygenów meliny takie jak MBP mogą mieć aktywność T-komórek. Możliwe, że limfocyty T są w stanie rozpoznawać drobnocząsteczkowe peptydy MBP bez konieczności obróbki wewnątrzkomórkowej, po prostu poprzez swą zdolność do wiązania głównych antygenów zgodności tkankowej klasy IIna powierzchni komórek prezentujących.
Ponieważ doświadczalne alergiczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu (EAE), akceptowany zwierzęcy model SM, można wywoływać poprzez podawanie podatnemu gryzoniowi MBP lub PLP wraz z pełnym adiuwantem Freunda, proces SM może mieć mechanizm autoimmunologiczny (Fritz, R. B. i wsp., J. Immunol. 130, 1024-1026, 1983; Trotter, J.L. i wsp., J. Neurol. Sci. 79, 173-188, 1987). Z punktu widzenia autoprzeciwciał wytwarzanych przez limfocyty B, epitop MBP, na który kieruje się proces chorobowy, zlokalizowano proksymalnie od sekwencji tri-Prolil (reszty -99-100-101-) w obszarze między resztami 80 i 100 (Warren K.G. i wsp., Ann Neurol. 35, 280-289, 1994). Ten epitop limfocytów B nakłada się na immunodominujący epitop limfocytów T, reagujących z MBP, wykrywany w zmianach w mózgu w przebiegu SM (Oksenberg, J.R. i wsp., Nature, 68-70, 1993).
Uprzednie badania wykazały, że anty-MBP jest zobojętniane przez MBP. Nie powiodły się jednak dotychczasowe próby leczenia SM poprzez domięśniowe lub podskórne podawanie heterologicznego MBP (Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. i Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R.E., Delmotte, P i Demonty, L., J Neurol 216: 27-31; i Romine, J.S. i Salk, J., w: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. i Tourtelotte W.W. (red.), Multiple sclerosis, Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Stosowanie natywnego MBP nastręcza dwojakiego rodzaju problemy. Po pierwsze, białko wytwarza się z próbek mózgu ludzkiego, w związku z czym istnieje potencjalne zagrożenie obecnością neurowirusów powolnych w próbkach. Po drugie, mimo że rozpuszczalne MBP nie ma zwykle właściwości immunogenu, możliwe jest, że przy podawaniu go osobom z zaburzeniami układu immunologicznego rozpuszczalne MBP może działać jako antygen i powodować wytwarzanie przeciwciał przeciwko MBP.
W związku z powyższym, niniejszy wynalazek określa, czy anty-MBP, oczyszczone z CSF pacjentów z SM, można zobojętniać wybranymi syntetycznymi peptydami ludzkiego MBP (h-MBP). W tym celu stosowano rozpuszczalne peptydy syntetyczne, pokrywające całą długość h-MBP, w celu oznaczenia możliwego zakresu epitopów h-MBP, zobojętniającego anty-MBP uzyskane od pacjentów z SM. Tak więc dobrane peptydy rozpuszczalne, wykazujące właściwości zobojętniania anty-MBP, można stosować do bardziej skutecznego leczenia SM, niż leczenia całą cząsteczką. Te rozpuszczalne peptydy można wytwarzać syntetycznie, tak więc nie ma zagrożenia neurowirusami. Ponadto, z uwagi na małe rozmiary tych wybranych peptydów, stosowanych w leczeniu SM< możliwe będzie opanowanie wspominanych problemów z zastosowaniem białka natywnego.
Następnie peptydy według niniejszego wynalazku badano w celu określenia ich skuteczności w wiązaniu lub modulowaniu wytwarzania anty-MBP SM in vivo.
Krótki opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie peptydu o wzorze Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, zdolnego do zobojętniania lub modulowania wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko zasadowemu białku mieliny, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stwardnienia rozsianego u pacjenta z haplotypem HLA-DR2.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia umiejscowienie osiemnastu peptydów syntetycznych (małe liczby) w stosunku do nienaruszonej cząsteczki ludzkiego MBP. Peptydy oznaczono jako pionowe słupki, umieszczone zaraz za odpowiadającym im obszarem na cząsteczce MBP. Duże liczby oznaczają reszty aminokwasowe na ludzkim MBP.
Figura 2 przedstawia krzywe hamowania anty-MBP, oczyszczonego i zebranego od 10 różnych pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, przez ludzkie MBP i peptydy MBP.
Figura 3 przedstawia zobojętnienie anty-MBP, wyizolowanego od jednego pacjenta ze stwardnieniem rozsianym, przez ludzkie MBP i peptydy MBP80-97, MBP91-106 i MBP75-95.
PL 191 965B1
Figura 4 - długoterminowe monitorowanie miana anty-MBP w CSF u pacjenta z przewlekle postępującą postacią SM:
poziom anty-MBP wolnego (F) i związanego (B) był przez cały czas podwyższony, przy pobieraniu próbek 26 razy w czasie 11 lat, od 1983 do 1993 roku.
cpm: zliczeń na minutę jednostki radioaktywności = cpm próbki-cpm tła/cpm całkowite - cpm tła otwarte kółka: związane (B) MBP, oznaczone po kwasowej hydrolizie kompleksów immunologicznych CSF zamknięte kółka: wolne (F) MBP.
Figura 5 - pacjenci stanowiący kontrolę: poziom anty-MBP w CSF u dwóch pacjentów stanowiących „kontrolę czasową” (1F56, fig. 5A i 3M66, fig. 5B) i dwóch pacjentów stanowiących „kontrolę czasową z podaniem soli fizjologicznej” (4M45, fig. 5C i 5M59, fig. 5D). U wszystkich czterech pacjentów poziom anty-MBP F i B pozostawał stale podwyższony przy pobieraniu próbki CSF co 30 minut przez pierwsze dwie godziny, jak również 24 godziny później. Symbole - takie same, jak na fig. 4.
Figura 6 - badanie peptydów u różnych pacjentów: poziom anty-MBP w CSF w grupie czterech pacjentów (10F38, fig. 6A, 13F43, fig. 6C, 5M59, fig. 6D i 3M66, fig. 6G), otrzymujących rosnącą ilość (odpowiednio, 1, 2,5, 5 i 10 mg) nie ulegającego wiązaniu, kontrolnego peptydu syntetycznego MBP35-58 i w dobranej grupie czterech innych pacjentów z SM (6F53, fig. 6B, 8M41, fig. 6D, 4M45, fig. 6F i 1F56, fig. 6H), otrzymujących rosnącą ilość (odpowiednio, 1, 2,5, 5 i 10 mg) ulegającego wiązaniu syntetycznego peptydu anty-MBP MBP75-95. anty-MBP F w CSF wiązał się w sposób zależny od dawki z peptydem MBP75-95, a nie reagował z peptydem MBP35-58. Związane anty-MBP nie uległo żadnej zmianie.
Figura 7 - badanie zmian poziomu peptydów u poszczególnych pacjentów: gdy pacjenci z SM stanowili „kontrolę czasową” (1F56, fig. 7C i 3M66, fig. 7D) lub „kontrolę czasową z podaniem soli fizjologicznej” (5M59, fig. 7A i 4M45, fig. 7B), lub gdy otrzymywali nie ulegający wiązaniu kontrolny peptyd MBP35-58 (5M59 i 3M66), poziom anty-MBP F i B w CSF pozostawał u nich niezmieniony. Przeciwnie, gdy ci sami pacjenci - 4M45, 1F56 i 3M66 - otrzymywali później 5-10 mg ulegającego wiązaniu peptydu anty-MBP MBP75-95, forma F anty-MBP stawała się u nich niewykrywalna na czas do 7 dni i powracała do poziomu podstawowego między 10 a 21 dniem.
Figura 8 - wielokrotne wstrzyknięcia dokanałowe peptydu syntetycznego: pacjent z przewlekle postępującym SM otrzymał 10 cotygodniowych wstrzyknięć po 10 mg MBP75-95, podawanego bezpośrednio do CSF; mierzono miano anty-MBP F i B przed (kółka) i 30 minut po (kwadraty) każdym wstrzyknięciu. Anty-MBP F (zamknięte kółka i kwadraty) stawały się niewykrywalne na czas 10 tygodni, natomiast przeciwciało B pozostawało w zasadzie niezmienione (otwarte kółka i kwadraty).
Figura 9 - dożylne podawanie peptydu syntetycznego: poziom anty-MBP w CSF po jednorazowym wstrzyknięciu 500 mg MBP75-95: poziom anty-MBP zarówno F, jak i B zmniejszał się znacząco w badaniu 10, 16 i 30 dni po wstrzyknięciu. Symbole jak na fig. 4. fig. 10 - dalsza rafinacja epitopu MBP dla anty-MBP SM z zastosowaniem zestawu 41 dekapeptydów, pokrywających obszar między resztami 61 a 110.
Legenda:
- słupki oznaczają procentowe hamowanie = 100 - jednostki radioaktywności
- jako kontrolę dodatnią stosowano MBP i peptyd MBP75-95, które dały pełne (100%) hamowanie przeciwciał, zarówno F, jak i B
- jako kontrolę ujemną stosowano peptydy MBP51-60 i MBP111-120, które dały niezamienne hamowanie (0-10%) anty-MBP F i B
- dekapeptydy MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 i MBP87-96, które dały maksymalne hamowanie (90-100%) przeciwciał zarówno F, jak i B, mają wyraźny związek z epitopem MBP
- linia kropkowana: 95% granice przedziału ufności testu hamowania
Figura 11a ukazuje poziom anty-MBP w CSF, wolnego (F) - • - i związanego (B) - Ο - u pacjenta z jednostronnym zapaleniem nerwu wzrokowego, po dwóch dokanałowych wstrzyknięciach (it#1 i it#2) po 50 mg pMBP86-95, w odstępie 4 tygodni; w = liczba tygodni.
Figura 11b ukazuje poziom anty-MBP w CSF, wolnego (F) - • - i związanego (B) - Ο - u pacjenta z pełnym jednostronnym zapaleniem nerwu wzrokowego, po wielu dokanałowych wstrzyknięciach (it#1, it#2, it#3, it#4 i it#5) po 50 mg pMBP82-98 w pierwszym tygodniu rzutu choroby.
PL 191 965B1
Figura 11c ukazuje poziom anty-MBP w CSF, wolnego (F) - • - i związanego (B) - Ο - u pacjenta z atetozą rzekomą po pięciu codziennych dokanałowych wstrzyknięciach (it#1, it#2, it#3, it#4 i it#5) po 50 mg pMBP82-98.
Figura 11d ukazuje poziom anty-MBP w CSF, wolnego (F) - • - i związanego (B) - Ο - u pacjenta z SM z rzutami i powolnym postępem choroby po czterech dokanałowych wstrzyknięciach (it#1, it#2, it#3 i it#4) po 50 mg pMBP86-95 co 2-3 dni w pierwszym tygodniu rzutu choroby i jednym wstrzyknięciu dożylnym (i.v.) 400 mg pMBP86-95 po ponownym wejściu choroby w fazę postępującą.
Figura 12 ukazuje poziom anty-MBP wolnego i związanego u pacjenta z wieloobjawowym rzutem choroby po w sumie siedmiu dokanałowych wstrzyknięciach po 50 mg pMBP86-95. Po it#2 nie pobrano próbki po 30 minutach; próbkę CSF pobrano 24 godziny później. Symbole takie same, jak na fig. 11.
Figura 13 ukazuje poziom anty-MBP wolnego i związanego u pacjenta z SM z rzutami i powolnym postępem choroby po dokanałowych (it#1, it#2 i it#3) i dożylnych (iv#1 i iv#2) wstrzyknięciach pMBP86-95. Nie pobrano próbki CSF ani przed, ani po it#2. Symbole takie same, jak na fig. 11.
Figura 14 ukazuje poziom anty-MBP wolnego i związanego u pacjenta z SM z rzutami i powolnym postępem choroby po dożylnych (iv#1, iv#2 i iv#3) i dokanałowych (it#1-it#9) wstrzyknięciach pMBP86-95 i pMBP82-98. Symbole takie same, jak na fig. 11. Figura 15 przedstawia próbę zapobieżenia przyszłym rzutom u pacjenta z SM z rzutami i powolnym postępem choroby po dwóch wstrzyknięciach dożylnych (iv#1 i iv#2) 400 mg pMBP86-95 i pMBP82-98. Nie pobrano próbki CSF w czasie pierwszego rzutu, 3 miesiące po iv#1. Na górze oznaczono naturalną częstość rzutów, strzałkami odpowiadającymi miesiącowi rzutu. Pola ujęte w ramki oznaczają czas doświadczenia. Symbole takie same, jak na fig. 11.
Figura 16 przedstawia próbę zapobieżenia przyszłym rzutom u pacjenta z SM z rzutami i powolnym postępem choroby po dwóch wstrzyknięciach dokanałowych (it#1 i it#2) i jednym wstrzyknięciu dożylnym (iv) pMBP86-95. - duża dawka metylprednizolonu dożylnie. Na górze oznaczono naturalną częstość rzutów, strzałkami odpowiadającymi miesiącowi rzutu. Pola ujęte w ramki oznaczają czas doświadczenia. Symbole takie same, jak na fig. 11.
Figura 17 przedstawia wpływ dokanałowego i dożylnego podawania peptydów - skierowanych swoiście przeciwko MBP autoprzeciwciał w CSF pacjenta z przewlekle postępującym SM; na fig. 17a pMBP75-95 wstrzyknięto bezpośrednio do CSF (2,5 mg w 5 ml soli fizjologicznej), a autoprzeciwciała skierowane swoiście przeciwko MBP mierzono testem radioimmunologicznym fazy stałej w różnych punktach czasowych (od 0,5 godziny do 7 dni po wstrzyknięciu). Wstrzyknięcie peptydu spowodowało czasowe zobojętnienie wolnego anty-MBP (zamknięte kółka), nie wpłynęło jednak na anty-MBP związane (otwarte kółka). Autoprzeciwciała były niewykrywalne po 1 i 2 godzinach, a ich poziom zaczął wracać do wartości podstawowych po 12-24 godzinach od wstrzyknięcia. U siedmiu innych pacjentów z przewlekle postępującym SM obserwacje były podobne. Na fig. 17b, w trzynaście miesięcy po dokanałowym wstrzyknięciu peptydu, ukazanym na fig. 17a, podano dożylnie 500 mg pMBP75-95 w 50 ml soli fizjologicznej i mierzono poziom w CSF autoprzeciwciał skierowanych swoiście przeciwko MBP w czasie 3 miesięcy (średnia ± odchylenie standardowe).
Figura 18 przedstawia sumaryczny poziom MBP w CSF u trzynastu pacjentów z przewlekle postępującym SM po dożylnym wstrzyknięciu (iv#1 5-6 mg/kg masy ciała (256-500 mg w soli fizjologicznej) pMBP75-95 (2 pacjentów) lub pMBP86-95 (11 pacjentów); oznaczano zarówno wolne, jak i związane anty-MBP (odpowiednio, kółka zamknięte i otwarte). W czasie od jednego do czterech miesięcy po iv#1 poziom autoprzeciwciał był niski lub niewykrywalny, następnie zaczął wracać do poziomu podstawowego. W czasie od 6 do 10 miesięcy po iv#1 wszystkim pacjentom podano drugie dożylne wstrzyknięcie pMBP86-98 w tej samej dawce (iv#2).
Szczegółowy opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest peptyd o wzorze Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, w zasadzie homologiczny w sekwencji z częścią sekwencji aminokwasowej ludzkiego zasadowego białka mieliny. W rozumieniu niniejszego opisu w zasadzie homologiczne oznacza, że może istnieć pewna różnica w sekwencji aminokwasowej między ludzkim zasadowym białkiem mieliny a peptydem, pod warunkiem, że peptyd, ze zmianą sekwencji aminokwasowej, nadal wykazuje działanie odpowiadające celowi jego zastosowania, to znaczy powoduje regulację w dół wytwarzania przeciwciał przeciwko ludzkiemu zasadowemu białku mieliny (anty-MBP). Po zapoznaniu się z niniejszym wynalazkiem specjalista oznaczy empirycznie, jakich zmian można dokonać w sekwencji wybranych peptydów tak aby nie spowodować zaburzenia ich funkcji.
PL 191 965B1
Na podstawie dalszych badań związanych z niniejszym wynalazkiem i testów hamowania kompetycyjnego z zastosowaniem serii 41 dekapeptydów, rafinowano epitop MBP dla anty-MBP SM i umiejscowiono go w obszarze między aminokwasem 86 a aminokwasem 95. Ponieważ najwyższy poziom hamowania (równy lub wyższy od 95%) anty-MBP B, epitop MBP dla anty-MBP SM znajduje się między aminokwasem 86 a aminokwasem 95. Najmniejszy wspólny obszar skutecznych dekapeptydów znajduje się między aminokwasem 87 a aminokwasem 93.
Można dokonywać modyfikacji, w tym podstawień, addycji lub delecji, w sekwencji -Val-HisPhe-Phe-Lys-Asn-Ile, pod warunkiem, że tak wytworzone peptydy zachowają swoje działanie zgodne z celem ich zastosowania, to znaczy zdolność zobojętniania lub modulowania wytwarzania przeciwciał przeciwko zasadowemu białku mieliny.
Przedmiotowy peptyd można wytwarzać znanymi sposobami syntezy polipeptydów. Pojęcie peptyd obejmuje również peptydy wytwarzane technikami rekombinacji DNA. Przy znanej sekwencji wybranych peptydów, jak to opisano w niniejszym wynalazku, oznaczenie odpowiedniej sekwencji DNA, kodującej wybraną sekwencję aminokwasową, pozostaje w zakresie niniejszego wynalazku. Odpowiednią sekwencję DNA można wytwarzać konwencjonalnymi, znanymi sposobami syntezy sekwencji DNA. Tak wytworzone sekwencje DNA można następnie klonować do odpowiedniego nośnika klonowania i stosować w celu transformacji odpowiedniej komórki-gospodarza w celu wytworzenia peptydu rekombinacyjnego. Wspomniane powyżej sposoby są konwencjonalne i znane specjalistom.
Peptydy według niniejszego wynalazku jest w zasadzie homologiczny co do sekwencji z częścią sekwencji aminokwasowej ludzkiego białka zasadowego mieliny. Przez „część sekwencji aminokwasowej” rozumie się, że sekwencja może mieć dowolną długość, pod warunkiem, że sekwencja aminokwasowa jest dostatecznie długa, aby wykazywać działanie „regulacji w dół” wytwarzania przeciwciał przeciwko ludzkiemu zasadowemu białku mieliny, jednak nie jest dostatecznie długa, aby powodować znane ze stanu techniki problemy, pojawiające się przy stosowaniu peptydów MBP w leczeniu stwardnienia rozsianego in vivo.
MBP82-98
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
Peptyd MBP82-98 wykazuje ulepszoną rozpuszczalność w porównaniu z innymi peptydami ze względu na pięć dodatkowych reszt hydrofilowych w tym peptydzie. Tak więc zastosowanie według niniejszego wynalazku wyżej wymienionego peptydu jest bardziej korzystne, niż zastosowanie innych peptydów.
Potencjalna rola anty-MBP w patogenezie SM jest nadal badana. Jako pierwsi podwyższone miano anty-MBP u chorych z SM opisywali Panitch i wsp. (Panitch, H. S., Hooper, C. S., i Johnson, K. P., Arch Neurol 37:206-209, 1980), którzy stosowali test radioimmunologiczny fazy stałej z MBP świnek morskich. U pacjentów z ostrym rzutem SM poziom anty-MBP jest zwykle podwyższony - głównie postaci wolnej - natomiast u niektórych pacjentów w remisji klinicznej poziom anty-MBP może być niewykrywalny. W czasie przechodzenia od ostrego rzutu do remisji miano wolnego anty-MBP stopniowo spada w czasie kilku tygodni lub miesięcy, natomiast poziom frakcji związanej przeciwciała rośnie w porównaniu z wartością wyjściową. U pozostałych pacjentów z remisją można obserwować niskie miano wolnego i związanego anty-MBP, przy czym stosunek F/B wynosi zwykle poniżej 1, co sugeruje, że przeciwciało lub przeciwciała zobojętniające anty-MBP wiąże się z anty-MBP.
Niekiedy u pacjentów spełniających kryteria klinicznie pewnego SM lub u pacjentów z SM potwierdzonym neuropatologicznie anty-MBP jest niewykrywalne w aktywnej fazie choroby. Możliwe, że pacjenci tacy posiadają przeciwciała przeciwko innym białkom mieliny. Brak swoistego przeciwciała nie wyklucza potencjalnego znaczenia anty-MBP w mechanizmie demielinizacji u większości pacjentów z SM.
Ostatnio opisywano kaskadę przeciwciała MBP we frakcji IgG oczyszczonej z CSF pacjentów z SM (Warren, K.G. i Catz, I.J., J Neurol Sci 96:19-27, 1990). Pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko MBP, zarówno w postaci wolnej, jak i związanej, występują w ostrej fazie choroby; stosunek F/B jest większy od 1 u pacjentów z ostrym rzutem, a mniejszy od 1 u pacjentów z postacią przewlekle postępującą (Warren, K.G. i Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz, I.J. i Warren, K.G., Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986; i Warren, K.G. i Catz, I.J., Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Przeciwciała drugorzędowe, zobojętniające anty-MBP, pojawiają się po przejściu choroby w stadium nieaktywne. Przeciwciała trzeciorzędowe, hamujące zobojętnianie anty-MBP, obecne są wówczas, gdy choroba ma przebieg przewlekle postępujący i nie przechodzi w stadium nieaktywne. To, że kaskada przeciwPL 191 965B1 ciał MBP wiąże się z różnymi fazami SM, sugeruje jej możliwe znaczenie dla naturalnego przebiegu tej choroby.
Mimo że w CSF pacjentów z aktywnym SM wykrywa się anty-MBP, ich bezpośrednia rola w patogenezie demielinizacji wymaga potwierdzenia. Rolę anty-MBP w mechanizmie SM można najlepiej stwierdzić poprzez powodowaną przez te białka regulację w dół, in vivo, być może przez podawanie wybranych peptydów i kontrolowanie klinicznego przebiegu choroby. Jeżeli anty-MBP jest (są) jedynym pierwszorzędowym przeciwciałem (przeciwciałami) związanymi z demielinizacją w SM, możliwe byłoby zablokowanie tego procesu poprzez dokanałowe i/lub dożylne podawanie wybranych peptydów MBP, które powodowałyby regulację w dół anty-MBP i sprzyjałyby tolerancji MBP in situ. W demielinizacji w SM mogą uczestniczyć również inne ludzkie białka mieliny, zatem zakresem niniejszego wynalazku objęte jest zastosowanie peptydów w zasadzie homologicznych co do sekwencji z częścią sekwencji aminokwasowej tych innych białek mieliny, w celu regulacji w dół odpowiednich przeciwciał. Jakkolwiek uprzednie próby leczenia SM poprzez domięśniowe lub podskórne podawanie heterologicznego MBP nie były uwieńczone pełnym powodzeniem (Campbell, B., Vogel, R.J., Fisher, E. i Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R.E., Delmotte, P. i Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977, i Romine, J.S. i Salk, J., w: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. i. Tourtelotte W.W. (red.), Multiple sclerosis, Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 621-630), dla dokanałowego i/lub dożylnego podawania peptydów MBP, zobojętniających lub regulujących w dół wytwarzanie anty-MBP, według niniejszego wynalazku, udowodniono korzystniejsze wyniki.
Zwierzęcy model SM - doświadczalne alergiczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu (EAE) -jest chorobą demielinizacyjną, której mediatorem są limfocyty T. Poprawę w EAE można uzyskać poprzez dootrzewnowe podawanie chorym myszom peptydów syntetycznych MBP (Gaur., A. i wsp., Science 258: 1491-1494, 1992). Ponadto podawanie dużych dawek peptydów MBP hamowało autoreaktywne limfocyty T i znosiło kliniczne i patologiczne objawy EAE u myszy (Critchfield, J.M. i wsp., Science 263: 1139-1143, 1994). Nawet doustne podawanie MBP modulowało EAE poprzez indukowanie tolerancji obwodowej (Chen, W. i wsp., Science 265, 1237-1240, 1994). W celu modulowania limfocytów T, limfocytów B i makrofagów, uczestniczących w niszczeniu mieliny u chorych z SM, konieczne może być połączenie antygenów mieliny lub syntetycznych peptydów tych antygenów podawane drogą dożylną lub dokanałową.
Preparat farmaceutyczny może zawierać jako składnik czynny peptyd opisany powyżej sam, lub w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników są dobrze znane ze stanu techniki; takim nośnikiem jest na przykład sól fizjologiczna.
Przedmiotowy peptyd ma zastosowanie do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia lub modulowania stwardnienia rozsianego. Dawka terapeutyczna, dla podawania dożylnego, w leczeniu SM, może wynosić od około 1,0 mg na kg masy ciała do około 10,0 mg na kg masy ciała; dla podawania dokanałowego, dawka całkowita może wynosić od około 1do około 100 mg. W jednym z przykładów według niniejszego wynalazku peptyd podaje się dożylnie lub dokanałowo, lub i dożylnie, i dokanałowo. Peptydy można podawać w dawce pojedynczej lub sekwencyjnej, w zależności od potrzeby.
Według niniejszego wynalazku stwierdzono, że dożylne podawanie powoduje regulację w dół anty-MBP zarówno wolnego, jak i związanego, natomiast podawanie dokanałowe było skuteczne jedynie w zobojętnianiu lub modulowaniu wolnego anty-MBP. W jednym z wykonań niniejszego wynalazku stwierdzono, że sekwencyjne dokanałowe podawanie peptydów MBP może zmniejszać poziom anty-MBP F i utrzymywać go na niskim poziomie przez wiele miesięcy po podaniu peptydów, u pacjentów z rzutami jednoobjawowymi. W jednym z przykładów tego wykonania, pacjentowi podawano dziennie, przez 4-5 dni, 50 mg peptydu MBP. W jeszcze innym przykładzie po 1-2 tygodniach po pierwszym wstrzyknięciu można podawać kolejną dawkę.
Wynalazek opisano szczegółowo poniżej w odniesieniu do jego korzystnych wykonań, poniższe przykłady jednak służą jedynie ilustracji, nie zaś ograniczeniu zakresu wynalazku.
Przykład 1
Zobojętnianie przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu zasadowemu białku mieliny in vivo fig. 1 przedstawia umiejscowienie 18 peptydów h-MBP, stosowanych w niniejszym badaniu, w stosunku do nienaruszonej cząsteczki MBP. Natywne MBP izolowano z tkanki mózgowia osób nie chorujących na SM (Diebler, G.E., Martenson, R.E., Kies, M.W., Prep Biochem 2: 139-165, 1972) i dalej oczyszczano przez filtrację żelową i wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (HPLC). Czystość ostatecznego preparatu antygenu sprawdzano poprzez elektroforezę
PL 191 965B1 na żelu SDS-poliakrylamidowym. Do dalszych badań stosowano jedynie preparaty, które migrowały przy masie cząsteczkowej 18,5 kD. Oczyszczone MBP stosowano w swoistej antygenowe chromatografii powinowactwa, w badaniach zobojętniania i w teście radioimmunologicznym antyMBP fazy stałej.
Osiemnaście peptydów, pokrywające całą długość h-MBP i zawierające od 8 do 25 reszt aminokwasowych wytworzono metodą Fmoc, opisywaną uprzednio (Groome, N.P., Dawkies, A., Barry, R. i wsp., J Neuroimmun 19: 305-315, 1988. Czystość peptydów sprawdzano HPLC z odwróconymi fazami z kolumną C18 i gradientem woda/acetonitryl (0,1% TFA). Przeprowadzono również, stosując standardową analizę, analizę aminokwasów peptydów. Wiele peptydów, stosowanych w tym badaniu, zawierało nie występującą w naturze resztę cysteinową, ponieważ wytworzono je, aby działały jako immunogeny w połączeniu z adiuwantem Freunda. Mało prawdopodobne jest, aby wpływało to na wyniki badania. Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) pobierano, w ciągu tygodnia od wystąpienia objawów, od 35 pacjentów z ostrym rzutem SM, i nefelometrycznie oznaczano poziom IgG. Próbki CSF stosowane w tym badaniu dobrano tak, aby miały początkowo wysoki absolutny poziom IgG (>0,080 g/l) i rosnące miano anty-MBP (stosunek F/B = 1,0). U wszystkich pacjentów rozpoznawano klinicznie pewne SM.
IgG oczyszczano z zatężonego CSF pacjentów z ostrym rzutem SM poprzez chromatografię powinowactwa białka A-Sepharose (Pharmacia™), jak to opisywano uprzednio (Warren, K.G. i Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Czystość każdego z preparatów IgG sprawdzano poprzez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym i ogniskowanie izoelektryczne. Gdy podwyższony poziom anty-MBP z oczyszczonego IgG absorbowano do zera z użyciem MBP, nadsącz po absorpcji zawierał resztkowe IgG, co wskazuje, że anty-MBP stanowi jedynie frakcję podwyższonego IgG Oczyszczone MBP sprzęgano z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia™), zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczone IgG CSF, zawierające podwyższony poziom anty-MBP, od 35 pacjentów z ostrym rzutem SM, stosowano do izolowania anty-MBP poprzez chromatografię powinowactwa MBP-Sepharose (Warren, K.G. i Catz, I., J Neurol Sci 103: 90-96, 1991). Oczyszczone próbki anty-MBP porównywano z pierwotnym źródłem IgG poprzez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym. Gdy oczyszczone próbki anty-MBP absorbowano do zera z użyciem MBP, nadsącz po absorpcji nie zawierał resztkowego IgG, co wskazuje na czystość anty-MBP. Stałą ilość anty-MBP (15 jednostek wiązania radioaktywności, odpowiadających 100 w skali ekspansji -%0) inkubowano z rosnącą ilością h-MBP (0-1000 ng) lub poszczególnymi peptydami MBP (0-10000 ng) w teście fazy płynnej i po 1,5 godziny inkubacji we wszystkich mieszaninach oznaczano poziom wolnego anty-MBP. Do doświadczeń z zobojętnianiem zastosowano anty-MBP izolowany od 7 pojedynczych pacjentów z SM lub zmieszano anty-MBP od 10 różnych pacjentów z SM. Jako ujemną kontrolę antygenową zastosowano histon z grasicy cielęcej i ludzką albuminę surowicy (zakres: 10-1000 ng). Jako dodatnią kontrolę antygenową zastosowano jedno przeciwciało monoklonalne (MAb) przeciwko peptydowi MBP64-78 i poliklonalną króliczą surowicę odpornościową przeciwko peptydowi MBP1-8 (Groome, N., Harland, J. i Dawkes, A., Neurochem Int 7: 291-300, 1991). Jako ujemną kontrolę antygenową zastosowano inne mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko epitopowi 45-50.
Poziom anty-MBP oznaczono poprzez test radioimmunologiczny fazy stałej z ludzkim MBP (Warren, K.G. i Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Warren, K.G. i Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987; i Warren, K.G. i Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989). Poziom wolnego anty-MBP mierzono we wszystkich frakcjach z chromatografii powinowactwa i we wszystkich mieszaninach zobojętniających. Dla każdej próbki przeprowadzano równolegle cztery pomiary, stosując ten sam jodowany materiał, w celu zminimalizowania zmienności między testami.
Oczyszczone anty-MBP ulegało całkowitemu zobojętnieniu przez MBP i przez peptydy MBP80-97, MBP91-106 i MBP75-95, i częściowemu zobojętnieniu przez peptydy MBP64-78, MBP69-83 i MBP61-75 (tabela 1i fig. 2). Pozostałe dwanaście peptydów nie zobojętniało oczyszczonego anty-MBP, a ich krzywe kinetyczne wypadały w zakreskowanym obszarze, ukazanym na fig. 2. Histon z grasicy cielęcej i ludzka albumina surowicy nie reagowały z oczyszczonym anty-MBP nawet w stężeniu aż 1000 ng. MAb przeciwko peptydowi MBP64-78 ulegał hamowaniu jedynie przez peptyd MBP64-78, a MAb przeciwko peptydowi MBP1-8 ulegał hamowaniu jedynie przez peptyd MBP1-8, Peptyd MAb MBP45-50 nie reagował z MBP ani żadnym z peptydów (dla jasności rysunku, nie ukazano na nim danych kontrolnych). Próbki kontrolne dowodzą prawidłowości zrozumienia mechanizmu zobojętniania, ponieważ każde z przeciwciał kontrolnych ulegało hamowaniu przez oczekiwany peptyd i nie ulegało hamowaniu przez żaden inny peptyd. Wskazuje to, że nawet przy wysokim stężeniu peptydu (10000 ng) obserwowano swoistość.
PL 191 965B1
T a b e l a 1
| Sekwencja MBP ludzkiego | Reaktywność z anty-MBP |
| 1-170 | ++ |
| 1-8 Cy | - |
| Cy 4-18 | - |
| Cy 11-24 | - |
| 18-32 | - |
| 26-40 | - |
| Cy 35-58 | - |
| Cy 51-64 Gly | + |
| Cy 64-78 | + |
| Cy 61-75 | + |
| Cy 69-83 | ++ |
| Cy 75-95 | ++ |
| Cy 80-97 Gly | ++ |
| Cy 91-106 | - |
| 117-129 | - |
| Cy 127-140 | - |
| Cy 136-149 | - |
| 141-155 | - |
| Cy 149-162 | - |
++ - całkowite zobojętnienie + - częściowe zobojętnienie
- nieznamienna reaktywność
Anty-MBP wyizolowane od 7 pojedynczych pacjentów z SM ulegało całkowitemu zobojętnieniu przez h-MBP i peptydy MBP80-97, MBP91-106 i MBP75-95 (zob. fig. 3 jako ilustracja). Ze względu na ograniczoną ilość przeciwciał uzyskanych od pojedynczych pacjentów z SM, anty-MBP nie poddawano reakcji z pozostałymi 15 peptydami.
Jak to wspomniano powyżej, anty-MBP ulegało zobojętnieniu przez peptydy położone od reszty aminokwasowe około 61 do reszty aminokwasowej około 106. Peptydy nie zobojętniające anty-MBP pokrywają zarówno aminowy (reszty od około 1 do 63), jak i karboksylowy (reszty od około 117 do 162) koniec h-MBP. Wydaje się, że peptydy z różnych, nie nakładających się na siebie obszarów MBP zobojętniają to samo przeciwciało lub te same przeciwciała. Można to wyjaśnić, jeżeli założyć, że przeciwciała rozpoznają nieciągły (złożony z kilku elementów) epitop, zawierający aminokwasy z różnych obszarów. Podobne zjawisko obserwowali uprzednio Hruby i wsp., (Hruby, S., Alvord, E.C., Groome, N.P. i wsp., Molec Immun 24: 1359-1364, 1987), którzy wykazali, że szczurze przeciwciało monoklonalne posiadało główny epitop w sekwencji MBP 112-121, lecz wykazywało silną reakcję krzyżową z innym epitopem w peptydzie 39-91. Jest to bardziej prawdopodobne, niż możliwość, że przeciwciało reaguje krzyżowo z dwiema całkowicie różnymi sekwencjami, nie tworzącymi nieciągłego epitopu (Hruby, S., Alvord, E.C., Martenson, R.E. i wsp., J Neurochem 44: 637-650, 1985).
Dane dotyczące zobojętniania można wyjaśnić zdolnością peptydów z różnych części MBP do zajmowania przez każdy z nich części kieszonki wiążącej antygen poprzez interakcję z różnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów o właściwościach przeciwciał. Wyjaśnienie to jest zgodne z obserwacją, że peptydy dające całkowite hamowanie (MBP80-97, MBP91-106 i MBP75-95 są około 100 razy
PL 191 965 B1 mniej skuteczne w stosunku do ich masy molowej, niż nienaruszone MBP, w odniesieniu do powodowania hamowania Przy przyjęciu powyższej hipotezy mogłoby to być spowodowane tym, że każdy klon peptydowy nie jest zdolny do osiągnięcia energii wiązania oryginalnego epitopu MBP.
P r z y k ł a d 2
Zobojętnianie lub modulowanie wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu zasadowemu białku mieliny in vivo
Dobór pacjentów i badania kontrolne
W badaniu uczestniczyli pacjenci leczeni w Klinice Opieki nad Pacjentami ze Stwardnieniem Rozsianym i Badań nad Stwardnieniem Rozsianym (Multiple Sclerosis Patient Care and Research Glinie) Uniwersytetu Alberta w Edmonton (Kanada). U pacjentów tych postawiono rozpoznanie klinicznie pewnego SM na podstawie kryteriów Schumachera (1965) i potwierdzono to rozpoznanie badaniem rezonansu magnetycznego mózgowia i profilem immunochemicznym CSF. W celu zobrazowania, że w przewlekle postępującej postaci SM poziom anty-MBP jest przez długi czas (wiele miesięcy lub lat) podwyższony, u pacjentów wykonywano wielokrotnie nakłucie lędźwiowe i monitorowano poziom anty-MBP F i B. U pacjentów z przewlekle postępującą postacią SM stwierdzono, że poziom autoprzeciwciał utrzymywał się na podwyższonym poziomie przez aż 11 lat, i że nie dochodziło do samoistnego spadku poziomu anty-MBP (fig. 4 stanowi ilustrację tej obserwacji).
W celu stwierdzenia, że początkowo podwyższony poziom anty-MBP w CSF pozostawał względnie stały przez 24 godziny, u dwóch pacjentów (1F56 i 3M66) CSF pobierano co 30 minut przez 2 godziny i 24 godziny później, monitorując poziom anty-MBP F i B (odpowiednio, fig. 5A i 5B). Pacjenci 1F56 i 3M66 stanowili „kontrolę czasową” Poziom anty-MBP F i B pozostawał cały czas podwyższony przy pobieraniu CSF co 30 minut przez 2 godziny i 24 godziny później.
Oprócz tego u dwóch innych pacjentów (4M45 i 5M59; odpowiednio, fig. 5C i 5D) w podobny sposób oznaczano wpływ wstrzyknięcia 5 cc soli fizjologicznej do CSF. Pacjenci ci stanowili „kontrolę czasową z podaniem soli fizjologicznej”. Po wstrzyknięciu 5 cc soli fizjologicznej dokanałowo, poziom anty-MBP F i B pozostawał podwyższony na poziomie wyjściowym przy pobieraniu CSF w sposób opisany powyżej, co dowodzi, że wpływ „efektu rozcieńczenia” na miano anty-MBP jest nieistotny i można go pominąć.
Poziom anty-MBP oznaczono testem radioimmunologicznym fazy stałej z ludzkim MBP opłaszczonym na zagłębieniach do mikromiareczkowania Immulon. Zagłębienia do mikromiareczkowania
Immulon opłaszczono 100 μΐ 10 μg/ml MBP (1 μg/zagłębienie) i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Po przerwaniu reakcji przez dodanie bydlęcej albuminy surowicy (BSA1 i trzykrotnym przepłukaniu wodą, zagłębienia przechowywano w temperaturze pokojowej. W zagłębieniach opłaszczonych MBP inkubowano próbki po 100 μΐ CSF lub wyciągów tkankowych, rozcieńczone do 0,010 gm IgG/1 (z zastosowaniem 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej barbitolem - BBS), pH 6,9-7,1, 0,5% BSA i 0,05% Tween 20) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Po 5 płukaniach buforem (z zastosowaniem 0,01 M BBS, 0,5 BSA i 0,05% Tween 20) zagłębienia inkubowano z kozim przeciwciałem skierowanym przeciwko króliczemu Fc IgG (w 0,01 M BBS, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA) przez
125 godzinę w temperaturze pokojowej i następnie płukano jak wyżej. Na koniec dodano 125I-białko A
125 (lub 125I- białko G) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Gdy jako wskaźnik sto125 sowano 125I-białko G, w buforze testowym BSA zastępowano albuminą jaja kurzego, która służyła jednocześnie do przerwania reakcji. Po trzech końcowych płukaniach dokonywano indywidualnego zliczania dla poszczególnych zagłębień. Wyniki wyrażono w jednostkach radioaktywności, definiowanych jako (liczba zliczeń dla próbki liczba zliczeń dla tła) / (liczba zliczeń radioaktywności całkowitej liczba zliczeń dla tła). Wszystkie próbki badano równolegle 10 razy, a czas zliczania wynosił 10 minut w celu uzyskania >10000 zliczeń dla każdej próbki dodatniej.
Przed poddaniem testowi wszystkie próbki CSF i/lub tkanek rozcieńczono do uzyskania końcowego stężenia IgG 0,010 g/l. Anty-MBP F wykrywano bezpośrednio w CSF lub wyciągach tkankowych, natomiast poziom przeciwciał B oznaczano po kwasowej hydrolizie kompleksów immunologicznych buforem HCL glicynowym o pH 2,2. Dla każdej próbki w nieopłaszczonym zagłębieniu przeprowadzano wiązanie nieswoiste.
W celu umiejscowienia epitopów, peptydy syntetyczne poddawano najpierw reakcji z oczyszczonym przeciwciałem w teście kompetycyjnym fazy płynnej, po czym oznaczano testem radioimmunologicznym anty-MBP we wszystkich pozostałych nadsączach. Wyniki połączenia testu wiązania kompetycyjnego i testu radioimmunologicznego wyrażono jako procentowe hamowanie peptydu syntetycznego, definiowane jako 100-jednostki radioaktywności. Próbki badano równolegle dziesięcioPL 191 965B1 krotnie i zliczano każdą z nich przez 10 minut w liczniku LKB1275 Minigamma. Jako kontrolę dodatnią stosowano, w 5 z góry ustalonych rozcieńczeniach, mieszaninę pochodzących od różnych pacjentów, wyizolowanych z tkanek anty-MBP. Jako kontrolę ujemną stosowano mieszaninę CSF pochodzącego od różnych pacjentów z chorobami nieneurologicznymi. Powtarzalność dla każdego testu wynosiła od 3 do 5%, a zmienność międzytestowa wynosiła poniżej 7%.
Utrzymywanie się anty-MBP CSF na stałym, podwyższonym poziomie u pacjentów stanowiących kontrolę (kontrolę czasową i kontrolę przy zastosowaniu rozcieńczalnika) umożliwiła następny etap niniejszych badań.
Podwójnie ślepe doświadczenie fazy I, kontrolowane peptydem - wstrzyknięcia dokanałowe
Przeprowadzono doświadczenie fazy I w celu określenia wpływu peptydu syntetycznego MBP75-95 na miano w CSF anty-MBP F i B. Po uzyskaniu zgody Komisji Etycznej do spraw Badań Naukowych Uniwersytetu Alberta, przeprowadzono badanie według tego projektu u chorych z klinicznie pewnym SM (Schumacher i wsp., Ann N.Y. Acad Sci 122, 552-568, 1965), z ciężką niepełnosprawnością i z zaawansowaną, postępującą postacią choroby. Po uzyskaniu świadomej zgody do badania włączono 14 pacjentów; ośmiu z nich wybrano na podstawie wyjściowego miana anty-MBP F w CSF (powyżej 8 jednostek radioaktywności) (tabela 2) w celu podania im jednego wstrzyknięcia dokanałowego peptydu MBP75-95, wiążącego anty-MBP in vitro, lub niewiążącego peptydu kontrolnego (MBP35-58 (Warren i Catz, 1993b). Doświadczenie przeprowadzono metodą próby podwójnie ślepej, tak że ani badacze, ani pacjenci nie wiedzieli, jaką substancję podawano pacjentom.
Wszystkie peptydy kodowano 7-cyfrowym numerem, losowo generowanym przez niezależnego lekarza. Pary peptydów rozcieńczano w 5 cc soli fizjologicznej i podawano do CSF poprzez nakłucie lędźwiowe w rosnących dawkach 1, 2,5, 5 i 10 mg. Próbki CSF pobierano przed wstrzyknięciem (wartość wyjściowa), co 30 minut przez 2 godziny po wstrzyknięciu, 24 godziny później i następnie co tydzień przez 3-4 tygodnie, aż do powrotu poziomu anty-MBP do wartości wyjściowych. We wszystkich próbkach CSF oznaczano liczbę komórek, poziom białka całkowitego, glukozy, IgG i albuminy. Poziom anty-MBP F i B oznaczono testem radioimmunologicznym, jak to opisano powyżej.
T ab el a 2
| ID pacjenta nr, płeć, wiek | Czas trwania choroby (lat) | Ocena w skali EDSS Kurtzkego | Poziom anty-MBP w CSF (jednostki radioaktywności); | Chory wybrany do badań | |
| Wolne (F) | Związane (B) | ||||
| 1F56 | 10 | 8,5 - porażenie trzykończynowe | 9 | 10 | tak |
| 2M50 | 18 | 6 - niedowład kończyn dolnych | 2 | 10 | nie |
| 3M66 | 20 | 9 - porażenie czterokończynowe | 11 | 12 | tak |
| 4M45 | 21 | 9 - porażenie czterokończynowe | 10 | 11 | tak |
| 5M59 | 28 | 9 - porażenie czterokończynowe | 8 | 10 | tak |
| 6F53 | 19 | 9 - porażenie czterokończynowe | 10 | 9 | tak |
| 7F33 | 11 | 6 - niedowład kończyn dolnych, niezborność | 5 | 13 | nie |
| 8M41 | 8 | 8 - porażenie trzykończynowe | 9 | 12 | tak |
| 9M49 | 7 | 7 - niedowład kończyn dolnych | 5 | 10 | nie |
| 10F38 | 7 | 8,5 - porażenie kończyn dolnych | 11 | 10 | tak |
| 11M49 | 20 | 8 - porażenie trzykończynowe | 6 | 13 | nie |
| 12M35 | 12 | 6,5 -niedowład kończyn dolnych, niezborność | 7 | 12 | nie |
| 13F43 | 15 | 8 - porażenie kończyn dolnych | 9 | 10 | tak |
| 14F32 | 4 | 6 - niedowład kończyn dolnych, niezborność | 8 | 7 | nie |
PL 191 965B1
Tabela 2. Dane kliniczne i poziom anty-MBP w CSF u 14 pacjentów z przewlekle postępującym SM, którzy zgłosili się do udziału w badaniu fazy I, z jednorazowym do kanałowym wstrzyknięciem syntetycznych peptydów MBP. Ponieważ do osiągnięcia znamiennej zmiany po wstrzyknięciu niezbędny był wysoki poziom wyjściowy anty-MBP F (>8 jednostek radioaktywności), do badania wybrano tylko 8 z 14 pacjentów.
Wszystkie peptydy stosowane w niniejszych badaniach wyprodukowano zgodnie z zasadami Właściwej Praktyki Produkcji (GMP), metodą Fmoc (9-fluorenylometoksykarbonylową) w firmie Procyon (London, Ontario, Kanada). Czystość peptydów sprawdzono chromatografią cieczową wysokociśnieniową z odwróconymi fazami na kolumnie C18 przy gradiencie woda-acetonitryl zawierającym 0,1% TFA. Przeprowadzono, standardowymi metodami, spektroskopię masową i analizę aminokwasów. Przed wstrzyknięciem wszystkie peptydy badano pod kątem pirogenności (Vancouver General Hospital, Kanada), jałowości (Provincial Laboratory for Public mit Health for Northern Alberta, Edmonton, Kanada) i ostrej toksyczności (Health Sciences Laboratory Animal Services, Uniwersytet Alberta, Edmonton, Kanada) i określono je jako „nadające się do zastosowania u człowieka”. Odpowiednią ilość kodowanego peptydu syntetycznego rozpuszczano w 5 cc jałowej soli fizjologicznej (0,9% chlorku sodowego do wstrzyknięć, USP, apirogennego, Baxter Corp., Toronto, Kanada), przefiltrowanej dwukrotnie przez 0,11 μm filtrowe jednostki wyjaławiające (Millex-GX, Millipore Corp. Bedford, MA,
Stany Zjednoczone) i podawano do CSF poprzez nakłucie lędźwiowe.
Porównanie peptydów u różnych pacjentów
Pacjentom 6F53, 8M41, 4M45 i 1F56 podano peptyd syntetyczny MBP75-95, zdolny do wiązania anty-MBP in vitro, a pacjentom 10F36, 13F43, 5M59 i 3M66 podano kontrolny, niewiążący peptyd syntetyczny MBP35-58, w rosnącej ilości, odpowiednio, 1, 2,5, 5 i 10 mg (fig. 6). U pacjentki 6F53 (fig. 6B), która otrzymała 1 mg MBP75-95, obserwowano 75% spadek anty-MBP F i następnie natychmiastowy powrót do wartości wyjściowych; u pacjenta 8M41 (fig. 6D), który otrzymał 2,5 mg MBP75-95, obserwowano całkowite wiązanie-zobojętnienie anty-MBP F i następnie powrót do wartości wyjściowych w ciągu 24 godzin; u pacjenta 4M45 (fig. 6F), który otrzymał 5 mg MBP75-95, doszło do szybkiego i całkowitego zobojętnienia anty-MBP F, które utrzymywało się przez 7 dni i następnie powróciło do wartości wyjściowych w następnych badaniach, pobranych 14 i 28 dni później. Poziom związanego anty-MBP nie uległ istotnej zmianie po jednym wstrzyknięciu dokanałowym MBP75-95. U pacjentów 10F38, 13F43, 5M59 i 3M66, którzy otrzymali, odpowiednio, 1, 2,5, 5 i 10 mg kontrolnego, niewiążącego peptydu MBP35-58, poziom w CSF anty-MBP B i F pozostawał niezmieniony w porównaniu z wyjściowymi wysokimi wartościami w czasie 24-godzinnego doświadczenia (odpowiednio, fig. 6A, 6C, 6E i 6G). Tradycyjne parametry zapalenia w CSF w przebiegu SM, takie jak liczba komórek, bezwzględny poziom białka całkowitego, IgG i albuminy, prążki oligoklonalne, indeks IgG i synteza IgG w CSF, pozostawały niezmienione przed i po podaniu peptydu.
Badanie poziomu peptydów u poszczególnych pacjentów
W celu zminimalizowania zmienności pomiędzy pacjentami przeprowadzono badanie poziomu peptydów u poszczególnych pacjentów. U pacjenta 5M59, który był jeden raz kontrolą czasową, a drugi raz otrzymywał 5 mg niewiążącego peptydu MBP35-58, poziom anty-MBP F pozostawał podwyższony, na poziomie wyjściowym, w czasie obu doświadczeń (fig. 7A). Pacjent 4M45 był za pierwszym razem „kontrolą z zastosowaniem rozcieńczalnika”, a po dwóch miesiącach otrzymał 5 mg MBP75-95. Poziom anty-MBP F pozostawał u niego ciągle podwyższony we wszystkich próbkach pobranych w czasie doświadczenia z „rozcieńczeniem”, a po podaniu MBP75-95 stał się niewykrywalny (fig. 7B). Podobne wyniki uzyskano u pacjentki 1F56, u której w czasie doświadczenia z „kontrolą czasową” poziom przeciwciała F był cały czas podwyższony, natomiast po podaniu 10 mg MBP75-95 stał się niewykrywalny (fig. 7C). U pacjenta 3M66 przeprowadzono całe badanie. Poziom anty-MBP F utrzymywał się u niego cały czas na podwyższonym poziomie w czasie doświadczenia z „kontrolą czasową” i po podaniu 10 mg MBP35-58, natomiast po wstrzyknięciu 10 mg MBP75-95 anty-MBP F uległo całkowitemu zobojętnieniu i pozostało niewykrywalne przez 7 dni (fig. 7D).
Wielokrotne podawanie syntetycznego peptydu MBP75-95
Po stwierdzeniu, że peptyd MBP75-95 zobojętnia anty-MBP F in vivo przez czas ponad 7 dni, wybrano go do wielokrotnego wstrzykiwania do płynu mózgowo-rdzeniowego co tydzień przez 10 tygodni. Doświadczenie to przeprowadzono u trzech różnych pacjentów z przewlekle postępującym SM, którzy nie uczestniczyli w badaniu z jednorazowym wstrzyknięciem peptydu, a zgłosili się do tego badania. Poziom anty-MBP F i B oznaczano 1-2 tygodnie przed pierwszym wstrzyknięciem, bezpośrednio przed każdym wstrzyknięciem, 30 minut po każdym z 10 wstrzyknięć i znowu miesiąc po ostatnim
PL 191 965B1 wstrzyknięciu. We wszystkich próbkach CSF pobranych przed każdym z 10 wstrzyknięć oznaczano liczbę komórek, poziom białka całkowitego, glukozy, IgG i albuminy. Przed pierwszym wstrzyknięciem i po ostatnim wstrzyknięciu pobierano krew i wykonywano oznaczenie elektrolitów, kreatyniny, enzymów sercowych i wątrobowych oraz zestaw badań morfologicznych.
U pacjentów z przewlekle postępującym SM, otrzymujących wielokrotne dokanałowe wstrzyknięcia po 10 mg MBP75-95 co tydzień przez czas do 10 tygodni, początkowo wysokie anty-MBP F stawało się niewykrywalne na cały czas podawania peptydu; po zaprzestaniu podawania peptydu anty-MBP F powracały do poziomu wyjściowego w ciągu 1 miesiąca (fig. 8). Miano przeciwciał B pozostawało przez cały czas doświadczenia podwyższone, co sugeruje, że u tych pacjentów nadal trwała synteza anty-MBP, a dokanałowe podawanie peptydu dawało „działanie wymiatające” anty-MBP F.
Pacjenci, którzy otrzymali jednorazowe wstrzyknięcie peptydu syntetycznego lub wielokrotne, cotygodniowe wstrzyknięcia, byli pacjentami z przewlekle postępującym stwardnieniem rozsianym z zaawansowanego stopnia niepełnosprawnością neurologiczną. U żadnego z tych pacjentów nie doszło do nasilenia objawów neurologicznych ani do zaostrzenia SM po dokanałowym podaniu peptydu, a w CSF nie rozwinęła się reakcja komórkowa. Pacjentów z SM, otrzymujących wielokrotne wstrzyknięcia MBP75-95, obserwowano pod kątem ogólnoustrojowych powikłań, takich jak zmiany poziomu elektrolitów, jak również zaburzenia czynności serca, wątroby i nerek oraz układu krwiotwórczego; nie wystąpiły żadne objawy niepożądane ani powikłania.
Dożylne podawanie MBP75-95
Po stwierdzeniu, że dokanałowe podawanie peptydu MBP75-95 powoduje całkowite wiązanie i zobojętnienie anty-MBP F, bez zmiany poziomu przeciwciała B, zdecydowano zbadać wpływ dożylnego podawania tego samego peptydu na miano anty-MBP F i B w CSF; 500 mg MBP75-95 rozpuszczono w 100 cc soli fizjologicznej i wstrzyknięto dożylnie, w czasie 30 minut, pacjentowi 8M41 przy monitorowaniu anty-MBP w CSF co 30 minut przez pierwsze dwie godziny, 18 godzin później, jak również 10, 16 i 30 dni później. Krew pobierano przez wstrzyknięciem, jak również 16 i 30 dni później i przeprowadzano oznaczenie poziomu elektrolitów, kreatyniny, enzymów sercowych i wątrobowych oraz zestaw badań morfologicznych. Płyn mózgowo-rdzeniowy monitorowano pod kątem liczby komórek, poziomu białka całkowitego, glukozy, IgG i albuminy. Nie stwierdzono działań niepożądanych.
Jak to przedstawiono na fig. 8, dożylne podanie 500 mg MBP75-95 nie wywołało żadnych zmian miana anty-MBP F i B w CSF w czasie pierwszych dwóch godzin. 18 godzin później zaobserwowano 30% spadek anty-MBP F w CSF. Po ponownym pobraniu CSF 10, 16 i 30 dni później stwierdzono spadek poziomu anty-MBP zarówno F, jak i B, w porównaniu z wartościami wyjściowymi -11 jednostek radioaktywności -do, odpowiednio, 4, 2 i 1 jednostki radioaktywności.
U wszystkich pacjentów leczonych dokanałowo MBP75-95 stwierdzano utrzymywanie się podwyższonego poziomu przeciwciała związanego, natomiast anty-MBP F stawał się niewykrywalny w sposób zależny od dawki. Sugeruje to, że synteza autoprzeciwciał pozostawała aktywna w czasie i po dokanałowym podawaniu MBP75-95. W wyniku tej obserwacji pacjentowi, który uprzednio otrzymał jednorazowe dokanałowe wstrzyknięcie peptydu, podano MBP75-95 dożylnie. Po podaniu dożylnie stwierdzono istotny spadek poziomu w CSF anty-MBP zarówno F, jak i B, przy monitorowaniu przez czas do jednego miesiąca. Spadek poziomu anty-MBP i F, i B w CSF po dożylnym podaniu MBP75-95 wskazuje, że ta droga podawania spowodowała regulację w dół autoimmunologicznego procesu zapalnego, odpowiedzialnego za syntezę anty-MBP. W dalszej długoterminowej obserwacji pacjentów jak do tej pory stwierdzono, że poziom anty-MBP zaczynał rosnąć 4-6 miesięcy po pierwszym wstrzyknięciu dożylnym; drugie dożylne wstrzyknięcie tego samego peptydu (dawka przypominająca) wywoływało regulację w dół syntezy anty-MBP aż do 2 lat u70 różnych pacjentów z przewlekle postępującym SM.
Epitop MBP dla anty-MBP SM
W celu dalszego umiejscowienia epitopu MBP dla anty-MBP SM, anty-MBP F i B, oczyszczone przez chromatografię powinowactwa z CSF i tkanki mózgowej pacjentów z SM (Warren, K.G. i wsp., Ann Neurol. 35, 280-289, 1994) poddano reakcji w kompetycyjnych testach hamowania z 41 kolejnymi peptydami syntetycznymi MBP o równej długości (10 reszt każdy, z nakładaniem się na sąsiednie o 9), pokrywającymi obszar pomiędzy resztami 61 a 110 ludzkiego MBP. Peptyd (peptydy) wywołujące maksymalne hamowanie uznawano za najściślej związane z miejscem wiązania przeciwciała. Maksymalne hamowanie (> 80%) obu oczyszczonych anty-MBP, F i B, z tkanki mózgowej pacjentów z SM (fig. 10) było wywołane przez cztery dekapeptydy, a mianowicie MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95
PL 191 965B1 i MBP87-96, co wskazuje -, że epitop MBP dla anty-MBP SM znajduje się pomiędzy resztami 87 a 93.
Zakres dla anty-MBP B był bardziej ograniczony, niż dla przeciwciała F.
Nie wyjaśniono roli przeciwciał anty-MBP w patogenezie demielinizacji w przebiegu SM; można ją jedynie określić przez modulowanie anty-MBP in vivo i obserwowanie dalszego przebiegu klinicznego i patologicznego. Na przykład, w ostrym rzucie SM, gdy stosunek przeciwciał F/B wynosi powyżej jedności, można podawać dokanałowo peptyd, o którym wiadomo, że wiąże anty-MBP F, w celu związania wolnego krążącego przeciwciała i zakończenia klinicznego ostrego rzutu; konieczne może być cotygodniowe podawanie peptydu aż do wystąpienia remisji. U pacjentów z przewlekle postępującym SM z nakładającymi się ostrymi rzutami konieczne może być zarówno dokanałowe, jak i dożylne podawanie peptydu w celu regulacji w dół mechanizmów zapalnych, powodujących wytwarzanie anty-MBP.
P r zyk ł a d 3
Korzystne dawkowanie dokanałowo podawanego MBP86-95 lub MBP82-98 u pacjentów z ostrym rzutem
W rzucie SM stosunek anty-MBP F/B jest wyższy od 1,0 z powodu wyższego poziomu w CSF przeciwciała wolnego, niż związanego.
Zwykle w czasie 3 miesięcy, w miarę przechodzenia rzutu w późniejszy okres zdrowienia/remisji, poziom anty-MBP F stopniowo spada, a gdy biologiczna remisja jest pełna, anty-MBP F i B w CSF stają się zwykle niewykrywalne.
W badaniach opisanych w poniższych przykładach uczestniczyli pacjenci z SM o przebiegu z rzutami i remisjami lub z rzutami i przewlekłym postępem choroby.
W poniższym i następnych przykładach stosowano MBP86-95 lub MBP82-98. MBP86-95 wykazuje bardzo słabą rozpuszczalność w soli fizjologicznej, ponieważ zawiera cztery reszty hydrofilowe i sześć reszt hydrofobowych. Z drugiej strony MBP82-98 wykazuje zwiększoną rozpuszczalność w soli fizjologicznej, ponieważ zawiera pięć dodatkowych reszt hydrofilowych.
W celu oznaczenia korzystnej dawki dokanałowo podawanego MBP86-95 lub MBP82-98, która powodowałaby natychmiastowe zmniejszenie anty-MBP F do poziomu niewykrywalnego, badano dwóch pacjentów. U jednego z nich wystąpił ostry rzut z niezbornością chodu i zaburzeniami równowagi tułowia. Na początku rzutu chory ten otrzymał jednorazowe wstrzyknięcie dokanałowe 10 mg MBP86-95; poziom anty-MBP F i B mierzono przed wstrzyknięciem i 1 godzinę po wstrzyknięciu, oraz jeszcze pięciokrotnie w czasie następnych trzech miesięcy. Dawka ta spowodowała tylko częściową supresję anty-MBP F, a krzywa powrotu przeciwciała do wartości wyjściowych była ściśle zgodna z naturalnym przebiegiem; u pacjenta utrzymywał się postępujący niedowład spastyczny i niezborność.
Stwierdzono, że pojedyncze dokanałowe wstrzyknięcie 10 mg MBP86-95 nie wystarcza do całkowitej supresji anty-MBP F i zmiany naturalnej prędkości powrotu przeciwciała do wartości wyjściowych. U drugiej pacjentki, 18-letniej kobiety z ostrym zapaleniem nerwu wzrokowego, która otrzymała jednorazowe wstrzyknięcie dokanałowe 50 mg MBP86-95, poziom przeciwciał F i B mierzono przed wstrzyknięciem i 30 minut po wstrzyknięciu. Trzydzieści minut po wstrzyknięciu poziom przeciwciała F stał się niewykrywalny. Pacjentka nie zgodziła się na dalsze nakłucia lędźwiowe. Stwierdzono zatem, że w celu związania i zobojętnienia anty-MBP F w CSF na co najmniej 30 minut niezbędne jest podawanie dawki co najmniej 50 mg.
P r zyk ł a d 4
Częstość i czas trwania podawania u pacjentów z rzutami jednoobjawowymi
W niniejszym przykładzie ustalano częstość i czas trwania podawania pMBP, które utrzymywałyby niski lub niewykrywalny poziom przeciwciała F przez dłuższy czas. Czworo pacjentów uczestniczących w tym badaniu otrzymywało peptydy syntetyczne w ciągu tygodnia od początku rzutu.
U pierwszych dwóch pacjentów wystąpiły rzuty ostrego jednostronnego zapalenia nerwu wzrokowego. Jeden z tych pacjentów (fig. 11a) otrzymał dokanałowo dwa wstrzyknięcia po 50 mg pMBP86-95 (it#1, it#2) w odstępie czterech tygodni. Po każdym wstrzyknięciu anty-MBP F stawało się w ciągu 1 h niewykrywalne. Przy pomiarze 1 tydzień po pierwszym wstrzyknięciu stwierdzono podwyższony poziom anty-MBP F, a cztery tygodnie później przeciwciało F miało znamiennie wysoki poziom. W tym czasie pacjent otrzymał drugie wstrzyknięcie dokanałowe (it#2) i anty-MBP F stały się niewykrywalne po 30 minutach, jednak po upływie 24 godzin nie prowadzono dalszego monitorowania. Stwierdzono, że ta częstość podawania była niedostateczna i że w pierwszym tygodniu rzutu konieczne mogą być wielokrotne wstrzyknięcia dla utrzymania nieistotnie niskiego poziomu przeciwciał.
PL 191 965B1
Drugi pacjent, z pełnym jednostronnym zapaleniem nerwu wzrokowego, otrzymał wielokrotne dokanałowe wstrzyknięcia peptydu - po 50 mg MBP82-98 - w pierwszym tygodniu rzutu: cztery codzienne wstrzyknięcia (fig. 11b: it#1, it#2, it#3, it#4) i piąte wstrzyknięcie (it#5) tydzień później. Profil anty-MBP tego pacjenta wykazywał stały szybki spadek w okresie 7 dni. Co ważniejsze, 7 tygodni i 6 miesięcy po it#5, poziom anty-MBP w CSF u tego pacjenta pozostawał niewykrywalny, a u pacjenta nie nastąpił nawrót zapalenia nerwu wzrokowego ani żaden inny typ rzutu SM. Ponadto nastąpiło całkowite wycofanie się jednostronnej ślepoty, wywołanej zapaleniem nerwu wzrokowego.
Następnie według tego samego schematu codziennych dokanałowych wstrzyknięć po 50 mg MBP82-98 leczono pacjentów z SM z różnymi typami rzutów jednoobjawowych. Figura 11c przedstawia profil anty-MBP pacjenta z ostrą atetozą rzekomą lewej ręki, który otrzymał dokanałowo pięć codziennych wstrzyknięć po 50 mg MBP82-98 (it#1, it#2, it#3, it#4, it#5) w drugim tygodniu rzutu. Poziom przeciwciał F spadł do wartości niewykrywalnych w ciągu 4 dni i pozostawał niewykrywalny w badaniu po 11 dniach i po miesiącu. Pacjent stopniowo odzyskał władzę w lewej ręce, tak że mógł znowu jeździć na motocyklu i grać na gitarze.
U ostatniego pacjenta wystąpił rzut ostrego niedowładu lewostronnego, nakładający się na przewlekle postępujący SM. Otrzymał on cztery dokanałowe wstrzyknięcia po 50 mg MBP86-95 co 2-3 dni. Poziom anty-MBP mierzono przed każdym wstrzyknięciem i 30 minut po wstrzyknięciu (fig. 11d: it#1, it#2, it#3, it#4) oraz 10 dni po pierwszym wstrzyknięciu. Początkowo podwyższone anty-MBP F stały się niewykrywalne w ciągu 7 dni, w czasie których pacjent powrócił, klinicznie i biochemicznie, do wyjściowego stanu przewlekłego postępu choroby; wkrótce potem otrzymał on dożylnie 400 mg MBP86-95. Spowodowało to supresję poziomu przeciwciał związanych na 4 miesiące po wstrzyknięciu i.v. Jednakże po ostatnim nakłuciu lędźwiowym 8,5 miesiąca po wstrzyknięciu dożylnym choroba powróciła do stanu przewlekle postępującego, zarówno klinicznie, jak i biochemicznie.
Przykła d 5
Częstość i czas trwania podawania u pacjentów z rzutami wieloobjawowymi
Następnie te same peptydy MBP wstrzykiwano pacjentom z rzutami wieloobjawowymi, dotyczącymi wielu obszarów o.u.n. Grupa ta składała się z trzech pacjentów: jednego z SM z rzutami i remisjami i jednego z chorobą z rzutami nakładającymi się na przebieg postępujący. U pierwszej pacjentki wystąpiło ciężkie, wieloobjawowe pogorszenie. W pierwszym tygodniu rzutu otrzymała ona trzy wstrzyknięcia 50 mg MBP86-95 w dniach 1, 3 i 7 (fig.12: it#1, it#2 i it#3). Poziom anty-MBP mierzono przed każdym wstrzyknięciem i 30 minut później. Po tych trzech wstrzyknięciach anty-MBP F uległo supresji do poziomu niemal niewykrywalnego. W pomiarze miesiąc później stwierdzono wzrost antyMBP F a po 1,5 miesiąca rzut był znowu klinicznie aktywny i potwierdzony biochemicznie.
W tym czasie chora otrzymała drugi kurs czterech wstrzyknięć dokanałowych po 50 mg MBP86-95 w dniach 45, 48, 49 i 50 rzutu (it#4, it#5, it#6 i it#7). Poziom anty-MBP mierzono przed każdym wstrzyknięciem, 30 minut po każdym wstrzyknięciu, i jeszcze trzy razy w czasie następnych dwóch miesięcy. Poziom anty-MBP F uległ ponownie supresji na co najmniej dwa tygodnie, jednak u pacjentki wystąpił znowu rzut, i w tym czasie poziom przeciwciał F powrócił u niej do początkowego poziomu sprzed rzutu. Niewątpliwie konieczne jest bardziej długotrwałe podawanie peptydu syntetycznego w celu utrzymania niskiego/niewykrywalnego poziomu anty-MBP F przez dłuższy czas.
U drugiego pacjenta SM miał przebieg postępujący z nakładającymi się rzutami (fig. 13). Początkowo w stadium postępującym (F=B) otrzymał on dożylnie 500 mg MBP86-95 (iv#1). Mimo że poziom przeciwciał zarówno F, jak i B, był nieco obniżony po jednym miesiącu, 9 tygodni po wstrzyknięciu i.v., u chorego wystąpił wieloobjawowy rzut kliniczny ze znacznym zwiększeniem poziomu antyMBP F. W tym czasie otrzymał on trzy dokanałowe wstrzyknięcia po 50 mg MBP86-95 (it#1, it#2 i it#3) w dniach 1, 3 i 12 rzutu, i anty-MBP mierzono przed, 30 minut po i 24 godziny po pierwszym i trzecim wstrzyknięciu.
Przy badaniu w miesiąc później chory powrócił do wyjściowego klinicznego i biochemicznego stanu postępującego spastycznego niedowładu kończyn dolnych, i wówczas, w ciągu 2 tygodni, otrzymał drugie dożylne wstrzyknięcie 500 mg MBP86-95 (iv#2). Jak do tej pory, to znaczy przez następne 26 miesięcy, poziom anty-MBP F i B, monitorowany wielokrotnie, pozostawał w stanie supresji w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Doszło do znacznej poprawy w zakresie stania i chodzenia. Ostatni pacjent w tej grupie, chory z SM, początkowo w fazie postępującej (F=B) (fig. 14), otrzymał dożylnie 500 mg MBP86-95 (iv#1). Poziom anty-MBP w CSF mierzono po 9 dniach, następnie co miesiąc przez 2 miesiące i 4,5 miesiąca po iv#1.
PL 191 965B1
Po tym wstrzyknięciu, poziom anty-MBP F i B pozostawał w stanie supresji przez 2 miesiące;
4,5 miesięcy po iv#1 pacjent zaczął się uskarżać na narastające osłabienie, potwierdzone klinicznie, jak również biochemicznie, poprzez zwiększenie poziomu przeciwciał, odpowiadające postaci przewlekle postępującej. W czasie następnego miesiąca pacjent otrzymał drugie wstrzyknięcie dożylne
500 mg MBP82-98 (iv#2).
Analiza CSF próbki pobranej tuż przed drugim wstrzyknięciem wskazywała na ostry rzut (F>B), a następnego dnia u chorego wystąpiło ostre dwojenie w oczach wskutek niedowładu lewego mięśnia prostego bocznego oka. W tym czasie u pacjenta ewidentnie występowały kliniczne i biochemiczne cechy ostrego rzutu, który utrzymywał się przez następne 4,5 miesiąca i cechował się ciężkimi zaburzeniami równowagi stania i chodu, osłabieniem kończyn dolnych i podwójnym widzeniem. Próbując obniżyć podwyższony poziom anty-MBP F, pacjentowi podano dokanałowo dwa kursy MBP82-98.
W czasie pierwszego kursu, rozpoczętego 4,5 miesiąca od początku rzutu, otrzymywał on 50 mg MBP82-98 codziennie przez 5 dni (it#1, it#2, it#3, it#4 i it#5), a poziom anty-MBP, mierzony przed i 30 minut po każdym wstrzyknięciu pozostawał znacząco podwyższony. Ponieważ rzut utrzymywał się i powodował znaczną niesprawność, zdecydowano podać drugi kurs wyższej dawki peptydu z większą częstością, i chory otrzymywał po 100 mg MBP82-98 dwa razy dziennie przez dwa dni (dni 19 i 20; it#6, it#7, it#8 i it#9).
Poziom anty-MBP mierzono przed i 30 minut po każdym wstrzyknięciu. Po podwyższeniu dawki i częstości podawania anty-MBP F uległy supresji do wartości nieistotnych, a profil CSF badany tydzień później (dzień 28) odpowiadał postaci powoli postępującej (anty-MBP F/B = 1,0). W tym czasie pacjent otrzymał trzecie dożylne wstrzyknięcie 500 mg MBP82-98 (iv#3), które nie spowodowało dalszej regulacji w dół wytwarzania anty-MBP.
P r zyk ł a d 6
Dożylne podawanie peptydu MBP jako próba zapobiegania przyszłym rzutom
Dwóm pacjentom z SM z rzutami i przewlekłym postępem choroby podawano dożylnie MBP86-95 lub MBP82-98 w celu stwierdzenia, czy ta droga podawania zapobiegnie przyszłym rzutom. U pierwszej pacjentki od czterech lat występowały 2-3 rzuty rocznie, w związku z czym dochodziło do stopniowego nasilania się spastycznego niedowładu kończyn dolnych (fig. 15). Otrzymała ona dwa wstrzyknięcia dożylne w odstępie 6 miesięcy, jedno - 400 mg MBP86-95 (iv#1), a drugie - 400 mg MBP82-98 (iv#2); co miesiąc wykonywano kontrolne badanie kliniczne i analizę CSF.
Figura 15 przedstawia poziom anty-MBP w czasie 9 miesięcy (górne zakreskowane pole).
Pierwsze wstrzyknięcie dożylne spowodowało regulację w dół syntezy anty-MBP na około 2 miesiące. W czasie trzeciego miesiąca po wstrzyknięciu u chorej wystąpił kliniczny rzut choroby; niestety, nie pobrano wówczas CSF.
W czasie następnych 2-3 miesięcy, po zakończeniu rzutu, kiedy choroba ponownie przeszła w postać przewlekle postępującą, chorej podano drugie wstrzyknięcie dożylne (iv#2). Poziom antyMBP w CSF uległ ponownie supresji na 2 miesiące, jednak trzy miesiące po drugim wstrzyknięciu u chorej wystąpił kolejny rzut ze znacznym podwyższeniem anty-MBP F. Podobnie, jak w poprzednich 4 latach, u pacjentki nadal występowały 2-3 rzuty rocznie, mimo dwóch dożylnych wstrzyknięć MBP86-95 i MBP82-98.
Druga pacjentka (fig. 16), u której występowało 1-4 rzutów rocznie w czasie poprzednich 10 lat (skala na górze), była w znacznym stopniu niepełnosprawna, z porażeniem kończyn dolnych, i poruszała się na wózku inwalidzkim. W 11 roku u chorej znowu wystąpiły cztery rzuty (górne zakreskowane pole), mimo otrzymywania syntetycznych peptydów MBP dokanałowo i dożylnie.
W czasie pierwszego rzutu, po otrzymaniu dwóch dokanałowych wstrzyknięć po 50 mg MBP8695 w dniach 1 i 6 (it#1, it#2), poziom anty-MBP F uległ u tej pacjentki znacznemu obniżeniu; w dniu 6, otrzymała ona również dożylnie 300 mg MBP86-95 (iv), w wyniku czego doszło do supresji przeciwciał, zarówno F, jak i B, na następne 3 miesiące.
Cztery miesiące po wstrzyknięciu dożylnym u chorej wystąpił kolejny rzut kliniczny, który z czasem systematycznie się nasilał; poziom przeciwciał w CSF był znacznie podwyższony, i 6,5 miesiąca po wstrzyknięciu i.v. pacjentka otrzymała kurs czterech wstrzyknięć dziennie po 50 mg MBP82-98 (it#3, it#4, it#5 i it#6) , które jednak nie spowodowały supresji poziomu przeciwciał F i zakończenia klinicznego rzutu choroby.
PL 191 965B1
P r zyk ł a d 7
Porównanie różnych dróg podawania peptydów
W badaniach wstępnych syntetyczne peptydy MBP podawano ośmiu pacjentom z przewlekle postępującym SM. Pacjenci otrzymywali dokanałowo wiążący peptyd MBP - MBP75-95 - lub kontrolny peptyd niewiążący MBP35-58, w dawkach rosnących od 1 do 10 mg, w 5 ml soli fizjologicznej; czworo pacjentów, którzy początkowo otrzymali kontrolny peptyd niewiążący (MBP35-58), otrzymali później peptyd wiążący - MBP75-95.
Wstrzyknięcie MBP75-95 do CSF powodowało przejściowe zobojętnienie przeciwciał skierowanych swoiście przeciwko MBP F; nie było wpływu na związane autoprzeciwciała MBP. Czas trwania tego efektu wynosił 1 godzinę (1 mg peptydu), 24 godziny (2,5 mg peptydu) lub 7 dni (5-10 mg peptydu). Ponieważ skutek dokanałowego podania peptydu był niepełny (anty-MBP B pozostawały podwyższone) i względnie krótkotrwały, tę drogę podawania porównano ze wstrzyknięciem dożylnym. W przeciwieństwie do podawania dokanałowego, autoprzeciwciała zarówno wolne, jak i związane, stawały się niewykrywalne miesiąc po pojedynczym wstrzyknięciu dożylnym 500 mg MBP75-95 i pozostawały na niskim poziomie przez trzy miesiące, a po podaniu dawki przypominającej przez czas do 26 miesięcy (fig. 17).
Podobne są dotychczasowe obserwacje u 70 pacjentów z przewlekle postępującym SM, którym podano dożylnie wiążący peptyd MBP, taki jak MBP75-95, MBP86-95, MBP82-98. Wybrano dawkę 500 mg (5 mg/kg masy ciała) w 10-50 ml soli fizjologicznej z uwagi na większą objętość krwi, niż CSF (współczynnik 15) i szybkie usuwanie peptydów z krwiobiegu przez nerki; dokanałowo nie podawano dawek peptydów odpowiadających dawkom dożylnym, ponieważ nie byłoby możliwe wstrzyknięcie takiej objętości do CSF.
Podsumowując, dokanałowe podawanie w zakresie dawek testowanych u tych pacjentów spowodowało przejściowe „wymiecenie” tylko anty-MBP F, w przeciwieństwie do dożylnego wstrzyknięcia (wstrzyknięć), które spowodowały regulację w dół syntezy anty-MBP; pojedyncze wstrzyknięcie dożylne indukowało długotrwałą tolerancję.
P r zyk ł a d 8
Czas trwania tolerancji po dożylnym podaniu peptydu MBP
W oparciu o te wyniki kinetykę tolerancji na MBP zbadano dotychczas u 70 pacjentów z przewlekle postępującym SM, których obserwowano przez ponad dwa lata po wielokrotnych dożylnych wstrzyknięciach MBP75-95, MBP86-95 lub MBP82-98. Peptydy podawano w dawkach 5-6 mg/kg masy ciała (256-500 mg) i wstrzykiwano dożylnie w 10-50 ml soli fizjologicznej. Przed dożylnym podaniem peptydu u wszystkich 13 pacjentów stwierdzano wysoki poziom wolnych i związanych przeciwciał MBP w CSF (fig. 18, tabela 3).
W miesiąc po podaniu peptydu przeciwciała skierowane swoiście przeciwko MBP stawały się niewykrywalne i pozostawały na niskim poziomie zwykle przez 3-4 miesiące, po których poziom przeciwciał zaczynał ponownie rosnąć; niekiedy następował powrót do poziomu wyjściowego po 8 miesiącach. W sześć do dziesięciu miesięcy po iv#1 wszyscy pacjenci otrzymali dawkę przypominającą (iv#2) 275-500 mg (5-6 mg/kg masy ciała) MBP82-98 w 10 ml soli fizjologicznej (iv#2). Dłuższy peptyd wybrany do drugiego wstrzyknięcia był bardziej rozpuszczalny i można go było rozcieńczyć i podać w mniejszej objętości.
W całości tej grupy poziom anty-MBP w CSF dramatycznie zmniejszył się w czasie od 6 tygodni do 2 miesięcy od wstrzyknięcia i pozostawał niewykrywalny przez dłuższy czas (do 26 miesięcy). Z całej grupy, liczącej około 70 pacjentów, jeden nie był w stanie ukończyć badania z powodu zatorowości płucnej, innego wykluczono z długofalowej obserwacji z uwagi na otrzymywanie wysokich dawek kortykosteroidów dożylnie. Spośród około 70 pacjentów u około 63 poziom anty-MBP był niewykrywalny 18-26 miesięcy po dawce przypominającej.
P r zyk ł a d 9
Długotrwała tolerancja u pacjentów z haplotypem HLA-DR2
Oznaczono haplotypy HLA-DR2 u pacjentów z SM poprzez molekularne typowanie DNA genomowego (tabela 3). Czworo spośród jedenastu pacjentów, którzy ukończyli badanie, miało związany z chorobą haplotyp HLA-DR2 (DRB1*1501 lub DRB1*15021); u wszystkich tych pacjentów poziom autoprzeciwciał w rok po drugim dożylnym wstrzyknięciu peptydu MBP był niski lub niewykrywalny. Peptyd MBP wiąże się z wysokim powinowactwem z HLA-DR2 i jest immunodominujący dla ograniczonych do HLA-DR2, swoistych dla MBP limfocytów T.
PL 191 965B1
HLA-DR4 (DRB1*0401) i HLA-DR7 (DRB1*0701) wiążą podany peptyd MBP; nie wykonano badania wiązania dla cząsteczek DR pacjenta k(M) (DRB1*0407, DRB1*0801). Peptyd MBP nie ulega wiązaniu przez HLA-DR3 (DRB1*03011); dwóch pacjentów, u których przy zakończeniu badania antyMBP było podwyższone, miało haplotyp DRB1*03011 (tabela 3).
Dane te wskazują, że czas trwania tolerancji na MBP zależy od haplotypu HLA-DR pacjenta. Tolerancja może być bardziej długotrwała, jeżeli nadaje się ją skierowanym swoiście przeciwko MBP limfocytom zarówno T, jak i B.
Tabela 3
Haplotypy HLA-DR pacjentów z SM
A. Niski poziom całkowitego anty-MBP w rok po iv#2
Pacjent Haplotypy HLA-DR Całkowity poziom anty-MBP (Ru) b(F) DRB1*1501 4,1 e(F) DRB1*1501 DRB1*1303 2,5 m(M) DRB1*1501 DRB1*0101 3,9 l(F) DRB1*15021 DRB1*0403 3,9 a(M) DRB1*1401 DRB1*0701 4,1 f(F) DRB1*0701 2,4 k(M) DRB1*0407 DRB1*0801 4,5
B. Podwyższony poziom całkowitego anty-MBP w rok po iv#2
Pacjent Haplotypy HLA-DR Całkowity poziom anty-MBP (Ru) j (M) DRB1*03011 7,3 h(F) DRB1*0101 DRB1*0701 9,7 g(F) DRB1*0101 DRB1*1101 19,1
I(M) DRB1*0403 DRB1*03011 19,0
Całkowity poziom anty-MBP: anty-MBP wolne + związane
Haplotypy HLA-DR 11 pacjentów z SM, którzy ukończyli roczny okres obserwacji po drugim dożylnym wstrzyknięciu peptydu (iv#2). U wszystkich czterech pacjentów z haplotypem HLA-DR2 (DRB1*1501 lub DRB1*15021) poziom autoprzeciwciał był niski w rok po iv#2.
Przykład 10
Podskórne podawanie peptydu nie wywołuje tolerancji
Następnie badano, jaka droga podawania peptydu jest optymalna, poprzez podskórne wstrzyknięcia (jednorazowe lub wielokrotne) MBP82-98 w soli fizjologicznej w grupie 33 pacjentów z SM. U 26 pacjentów z SM, rosnące dawki (1-100 mg) pojedynczego podskórnego wstrzyknięcia MBP82-98 nie wpływało na poziom autoprzeciwciał przeciwko MBP w CSF (dane nie ukazane): ośmiu z tych pacjentów otrzymało następnie dożylne wstrzyknięcie peptydu i w ciągu dwóch miesięcy poziom przeciwciał w CSF stał się niewykrywalny (tabela 4A). U pięciu pozostałych pacjentów podanie całkowitej dawki 900-1000 mg (5x100 mg codziennie przez pięć kolejnych dni, i następnie jeszcze jedno podskórne wstrzyknięcie 400 lub 500 mg) spowodowało jedynie umiarkowany spadek poziomu przeciwciał MBP w CSF (tabela 4B).
W celu zbadania, czy inny schemat dawkowania byłby skuteczniejszy, dwóm pacjentom podano dwa podskórne wstrzyknięcia po 250 mg MBP82-98 w odstępie jednego miesiąca (tabela 4C). Ponownie nie stwierdzono wpływu na poziom autoprzeciwciał. W sumie dane te dowodzą, że tylko dożylne podanie peptydu MBP wywołuje długotrwałą tolerancję na MBP w dawkach testowanych w niniejszym badaniu
PL 191 965 B1
T ab el a 4
A
| ID pacjenta (płeć) | MBP 82-98 s.c. mg | Wartości wyjściowe | 6-7 tygodni | Czas (miesią- ce) | Wartości wyjściowe | MBP 82-98 iv# 1 mg | 2 miesiące | 4 miesiące | |||||
| f | b | f | b | f | b | f | b | f | b | ||||
| E (F) | 5 | 9,1 | 11,2 | 10,2 | 10,4 | 6 | 9,3 | 9,8 | 400 | 1,0 | 1,1 | 1,4 | 1,0 |
| K(F) | 7 | 2,1 | 3,4 | 3,1 | 5,9 | 6,5 | 6,3 | 6,7 | 500 | 1,5 | 0,8 | ||
| N (F) | 10 | 8,1 | 8,0 | 7,1 | 8,1 | 8 | 6,6 | 5,6 | 500 | 3,0 | 3,0* | ||
| Q(F) | 40 | 9,9 | 10,1 | 10,9 | 8,3 | 6 | 10,0 | 9,3 | 400 | 1,5 | 1,6 | 2,1 | 2,1 |
| R (M) | 50 | 10,2 | 10,3 | 11,1 | 7,4 | 6 | 7,5 | 9,9 | 500 | 1,5 | 1,6 | 1,5 | 1,7 |
| S (F) | 60 | 4,1 | 4,3 | 6,1 | 5,4 | 6,5 | 7,4 | 7,4 | 500 | 1,8 | 0,9 | ||
| X(M) | 100 | 9,9 | 7,3 | 9,5 | 8,2 | 4,5 | 9,7 | 9,0 | 500 | 1,4 | 1,0 | 1,5 | 1,1 |
| Z (M) | 100 | 9,9 | 8,4 | 10, 9 | 10,1 | 4,5 | 10,5 | 9,7 | 500 | 2,0 | 1,9 | 1,5 | 1,6 |
| Średnia | 7,9 | 7,9 | 8,6 | 8,0 | 8,4 | 8,4 | 1,7 | 1,5 | 1,6 | 1,5 | |||
| SD | 2,9 | 2,6 | 2,7 | 1,7 | 1,5 | 1,5 | 0,6 | 0,7 | 0,3 | 0,4 |
B
| ID pacjenta (płeć) | MBP 82-98 s.c. mg | Wartości wyjściowe | 6-7 tygodni | Czas (miesięcy) | MBP 82-98 s.c. mg | 7 tygodni | |||
| f | b | f | b | f | b | ||||
| AA(F) | 100/d x 5 | 7,7 | 8,1 | 4,4 | 4,9 | 0,5 | 400 | 4,3 | 3,4 |
| BB (F) | 100/d x 5 | 5,4 | 5,4 | 3,5 | 3,7 | 0,5 | 500 | 2,0 | 2,5 |
| CC (M) | 100/d x 5 | 5,9 | 5,4 | 6,9 | 8,8 | - | - | ||
| DD (F) | 100/d x 5 | 4,6 | 4,8 | 2,7 | 1,9 | 0,5 | 500 | 3,0 | 2,8 |
| EE (F) | 100/d x 5 | 7,4 | 8,9 | 3,7 | 3,9 | 0,5 | 400 | 2,6 | 2,4 |
| Średnia | 6,2 | 6,5 | 4,2 | 4,6 | 3,0 | 2,9 | |||
| SD | 1,2 | 1,7 | 1,4 | 2,3 | 0,8 | 0,7 |
C
| ID pacjenta (płeć) | MBP 82-98 s.c. mg | Wartości wyjściowe | 15 tygodni | ||
| f | b | f | b | ||
| GG (M) | 250/m x 2 | 8,4 | 8,7 | 7,1 | 8,3 |
| FF (F) | 250/m x 2 | 4,8 | 5,3 | 5,4 | 4,2 |
A. Ośmiu pacjentów otrzymało pojedyncze podskórne wstrzyknięcie MBP82-98 (5-100 mg w 1-5 ml soli fizjologicznej), co nie wpłynęło na poziom autoprzeciwciał MBP. Przeciwnie, pojedyncze dożylne wstrzyknięcie (400-500 mg) tego samego peptydu, podane 4,5-8 miesięcy później, spowodowało spadek poziomu autoprzeciwciał w CSF do wartości niewykrywalnych.
B. Wielokrotne podskórne wstrzyknięcia dużych dawek MBP82-98 (100 mg/dziennie przez pięć kolejnych dni) wywarło umiarkowane działanie na poziom anty-MBP w CSF; podanie dodatkowej dużej dawki (400 lub 500 mg) MBP82-98 podskórnie dwa tygodnie po pierwszej serii wstrzyknięć nie spowodowało dalszego spadku poziomu autoprzeciwciał.
C. Dwa podskórne wstrzyknięcia dużych dawek MBP82-98 (2x250 mg w odstępie jednego miesiąca) nie wywarło wpływu na poziom autoprzeciwciał MBP w CSF.
PL 191 965B1
W sumie dane te dowodzą, że tylko dożylna droga podawania jest skuteczna w wywoływaniu tolerancji na MBP.
W korzystnych wykonaniach wynalazku można dokonywać wielu modyfikacji bez wychodzenia poza zakres wynalazku, określony załączonymi zastrzeżeniami.
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie peptydu o wzorze Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, zdolnego do zobojętniania lub modulowania wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko zasadowemu białku mieliny, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stwardnienia rozsianego u pacjenta z haplotypem HLA-DR2.
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dotyczy wytwarzania leku zawierającego peptyd jako jedyny składnik czynny.
- 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dotyczy wytwarzania leku zawierającego peptyd i farmaceutycznie akceptowalny nośnik.
- 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dotyczy wytwarzania leku podawanego dożylnie, dokanałowo lub obiema tymi drogami.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dotyczy wytwarzanie leku zawierającego odpowiednią ilość peptydu taką, że postać dawki jednostkowej podawanej dożylnie zawiera peptyd w ilości od 1 mg/kg masy ciała do 10 mg/kg masy ciała.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że dotyczy wytwarzania leku zawierającego odpowiednią ilość peptydu taką, że postać dawki jednostkowej podawanej dokanałowo zawiera peptyd w ilości od 1 do 100 mg.
- 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że haplotyp HLA-DR2 dotyczy DRB1*1501 lub DRB1*15021.
- 8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dotyczy leku przeznaczonego do leczenia przewlekłego stwardnienia rozsianego.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA2201841A CA2201841C (en) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
| PCT/CA1998/000290 WO1998045327A1 (en) | 1997-04-04 | 1998-04-03 | Peptide fragments of myelin basic protein, their pharmaceutical compositions and their use in treating multiple sclerosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL336085A1 PL336085A1 (en) | 2000-06-05 |
| PL191965B1 true PL191965B1 (pl) | 2006-07-31 |
Family
ID=4160340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL336085A PL191965B1 (pl) | 1997-04-04 | 1998-04-03 | Zastosowanie peptydu do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia stwardnienia rozsianego |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1394178B1 (pl) |
| JP (1) | JP4173557B2 (pl) |
| AT (2) | ATE400582T1 (pl) |
| AU (1) | AU751303B2 (pl) |
| CA (2) | CA2494338C (pl) |
| CY (2) | CY1107445T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ299535B6 (pl) |
| DE (2) | DE69839163T2 (pl) |
| DK (2) | DK0970121T3 (pl) |
| ES (2) | ES2307317T3 (pl) |
| HU (1) | HU226768B1 (pl) |
| NO (1) | NO325018B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ338091A (pl) |
| PL (1) | PL191965B1 (pl) |
| PT (2) | PT1394178E (pl) |
| RO (1) | RO119303B1 (pl) |
| RU (1) | RU2198893C2 (pl) |
| SK (1) | SK285815B6 (pl) |
| UA (1) | UA60331C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998045327A1 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1541106A (zh) | 2001-06-11 | 2004-10-27 | 转新疗法公司 | 用维生素b12和治疗剂联合治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的方法 |
| RU2261713C1 (ru) * | 2004-04-27 | 2005-10-10 | Государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова Министерства здравоохранения Российской Федерации" | Способ лечения тяжелой формы острого оптического неврита у пациентов с рассеянным склерозом |
| JP5709876B2 (ja) | 2009-10-12 | 2015-04-30 | ライフバイオ ラボラトリーズ エルエルシーＬＩＦＥＢｉｏ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ ＬＬＣ | 多発性硬化症治療用組成物 |
| RU2646817C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2018-03-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Пептид из состава тяжелой цепи иммуноглобулина человека, пригодный для лечения рассеянного склероза |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2021611C1 (ru) * | 1991-04-19 | 1994-10-15 | Михайленко Анатолий Андреевич | Способ диагностики рассеянного склероза |
| US5817629A (en) * | 1991-10-22 | 1998-10-06 | The Governors Of The University Of Alberta | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
| CA2053799C (en) * | 1991-10-22 | 2002-03-12 | Kenneth G. Warren | Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid |
| DE69331501T2 (de) * | 1992-04-09 | 2002-08-29 | Autoimmune, Inc. | Unterdrückung der Proliferation von T-Zellen mittels Peptidfragmenten des basischen Proteins aus Myelin |
| US5824315A (en) * | 1993-10-25 | 1998-10-20 | Anergen, Inc. | Binding affinity of antigenic peptides for MHC molecules |
| CZ122697A3 (en) * | 1994-10-25 | 1997-09-17 | Immulogic Pharma Corp | Preparations and methods of treating disseminated sclerosis |
| US6329499B1 (en) * | 1994-11-18 | 2001-12-11 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogues of human myelin basic protein |
-
1997
- 1997-04-04 CA CA002494338A patent/CA2494338C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-04 CA CA2201841A patent/CA2201841C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-03-04 UA UA99116049A patent/UA60331C2/uk unknown
- 1998-04-03 DE DE69839163T patent/DE69839163T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 PL PL336085A patent/PL191965B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 CZ CZ0346499A patent/CZ299535B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 RU RU99122954/04A patent/RU2198893C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 ES ES98914725T patent/ES2307317T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 WO PCT/CA1998/000290 patent/WO1998045327A1/en not_active Ceased
- 1998-04-03 AT AT98914725T patent/ATE400582T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 NZ NZ338091A patent/NZ338091A/en unknown
- 1998-04-03 PT PT03022727T patent/PT1394178E/pt unknown
- 1998-04-03 DE DE69839694T patent/DE69839694D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 ES ES03022727T patent/ES2299657T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 AU AU69130/98A patent/AU751303B2/en not_active Ceased
- 1998-04-03 HU HU0000812A patent/HU226768B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 AT AT03022727T patent/ATE386941T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 PT PT98914725T patent/PT970121E/pt unknown
- 1998-04-03 RO RO99-01064A patent/RO119303B1/ro unknown
- 1998-04-03 JP JP54217098A patent/JP4173557B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-03 SK SK1329-99A patent/SK285815B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 DK DK98914725T patent/DK0970121T3/da active
- 1998-04-03 DK DK03022727T patent/DK1394178T3/da active
- 1998-04-03 EP EP03022727A patent/EP1394178B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 EP EP98914725A patent/EP0970121B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-10-01 NO NO19994806A patent/NO325018B1/no not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-04-24 CY CY20081100462T patent/CY1107445T1/el unknown
- 2008-08-05 CY CY20081100818T patent/CY1108239T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6258781B1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| US20080242616A1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basis protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| EP1394178B1 (en) | Method for the determination of the therapeutic activity of a MBP fragment | |
| US7090982B2 (en) | Methods of predicting therapeutic efficacy of treatment of a multiple sclerosis patient | |
| US20020111312A1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| HK1063805B (en) | Method for the determination of the therapeutic activity of a mbp fragment | |
| NZ513065A (en) | Peptide fragments of MBP, their pharmaceutical compositions and their use in treating multiple sclerosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification | ||
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20110403 |