ES2224099T3 - Inmunotoxinas dirigidas contra antigenos de superficies relacionados con c-erbb-2 (her-2/neu). - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN NUEVAS INMUNOTOXINAS Y METODOS DE TRATAR ENFERMEDADES NEOPLASICAS. MAS ESPECIFICAMENTE, SE PROPORCIONAN INMUNOTOXINAS QUE COMPRENDEN CONJUGACION DE UNA FRACCION DE DESTINO C-ERBB-2 Y UN MODULADOR DE CRECIMIENTO CELULAR. ESTAS INMUNOTOXINAS ESPECIFICAMENTE Y SELECTIVAMENTE MATAN CELULAS TUMORALES QUE SUPER-EXPRESAN LA PROTEINA C-ERBB-2. LAS NUEVAS INMUNOTOXINAS PODRIAN SER USADAS EN TRATAMIENTO DE CARCINOMAS MAMARIOS HUMANOS, CARCINOMAS OVARIOS HUMANOS, CARCINOMAS PULMONARES, TUMORES GASTRICOS, ADENOCARCINOMAS DE GLANDULAS SALIVARES, Y ADENOCARCINOMAS DE COLON.

Description

Inmunotoxinas dirigidas contra antígenos de superficie relacionados con c-erbB-2 (HER-2/neu).

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo del tratamiento de la enfermedad neoplásica. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevos inmunoconjugados y a su uso en el tratamiento de la enfermedad neoplásica.

Descripción de la especialidad relacionada

La enfermedad neoplásica es una de las principales causas de mortalidad y morbidez en el mundo occidental. Los estados neoplásicos, por ejemplo enfermedades o "cánceres", comparten al menos una característica, es decir, la implicación de defectos en el proceso regulador del crecimiento celular.

El proceso por el que las células normales se transforman en células malignas ha sido objeto de estudio intenso durante décadas. Más recientemente, el estudio se ha enfocado al papel de los oncogenes en el proceso del cáncer. Los oncogenes son genes que tienen la capacidad de transformar células eucarióticas de modo que crecen de una manera análoga a las células tumorales.

Un oncogén se crea cuando un gen normal o proto-oncogén se muta, se transpone o se amplifica. Uno de tales oncogenes es el proto-oncogén c-erbB-2(HER-2/neu). En lo sucesivo este oncogén se denominará c-erbB-2. Este gen codifica una proteína similar al receptor del factor de crecimiento epidérmico. La amplificación de este proto-oncogén puede dar como resultado una cascada de sucesos celulares que conducen a un crecimiento celular no
regulado.

Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmunitario de un animal, normalmente en respuesta a antígenos o determinantes antigénicos extraños. Los anticuerpos se unen al antígeno específico al que se dirigen. El desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos ha proporcionado a los investigadores posibles medios para orientar selectivamente agentes terapéuticos a células que sobreexpresan antígenos definidos.

Tecce y otros (Anti-Cancer Research 1990, Vol. 10(5A) página 1454) han producido inmunotoxinas para el producto HER-2 que emplean dos anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes epítopos sobre gp185 que se han conjugado a la saporina de toxina de plantas. Sivam y otros (Cancer Research 47, 3169-3175, 15 de Junio de 1987) han conectado covalentemente gelonina a anticuerpo monoclonal 9.2.27, dirigido a una glicoproteína/un proteoglicano asociados con melanoma humano.

Se ha postulado la sobreexpresión del proto-oncogén c-erbB-2 en la transformación neoplásica. Varios tipos de cánceres humanos incluyendo algunos carcinomas mamarios y algunos carcinomas ováricos tienen un gen c-erbB-2 amplificado. Por otra parte, la amplificación y la sobreexpresión subsiguiente del gen c-erbB-2 se han correlacionado con una escasa prognosis de la enfermedad. Así, existe una gran necesidad y un deseo en esta especialidad de un método para orientar selectivamente un agente quimioterapéutico a una célula que exhiba la sobreexpresión del oncogén c-erbB-2 para modular el crecimiento de células que sobreexpresan la proteína. La presente invención proporciona medios para realizar esto.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una nueva composición que comprende un conjugado de un resto de orientación a proteínas, por ejemplo una región que se une antígeno, que exhibe especificidad de unión para un dominio antigénico para la proteína c-erbB-2 y una toxina derivada de planta, donde dicha toxina se selecciona del grupo que consiste en gelonina y gelonina recombinante de longitud completa. Tal composición puede actuar como una inmunotoxina para orientar específicamente un modulador del crecimiento celular a células tumorales que sobreexpresan la proteína c-erbB-2.

Así, en una realización de la presente invención, se proporciona una nueva composición de interés que comprende un conjugado y un resto de orientación a proteínas con especificidad de unión para la proteína c-erbB-2, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal TAb 250, un segmento V_{H} de un anticuerpo, cadena pesada de inmunoglobulina intacta, un segmento V_{L} de un anticuerpo, cadena ligera de inmunoglobulina intacta, cadena pesada de inmunoglobulina intacta o anticuerpo monocatenario, y un resto tóxico. El resto tóxico puede ser un modificador de la respuesta biológica. En una realización particular, el resto tóxico es una toxina derivada de planta que tiene un efecto celular muy inferior cuando no está conjugada al resto de orientación. Esta toxina puede seleccionarse del grupo que consiste en toxina natural o toxina recombinante. En una realización adicional, el resto tóxico es gelonina.

Otra realización de la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar un estado neoplásico, por ejemplo una enfermedad, que se caracteriza por la amplificación o la sobreexpresión del oncogén c-erbB-2 en células, que comprende administrar una dosis citocidamente eficaz de una inmunotoxina de la presente invención a un individuo que necesite tal tratamiento.

Otra realización proporciona una composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otra realización proporciona un método para destruir células tumorales in vitro, seguido típicamente por la reintroducción en un paciente. Por ejemplo, al tratar un estado neoplásico de la médula ósea, la médula ósea se retira de un individuo que tiene la enfermedad neoplásica y se trata con una composición de la presente invención.

Otra realización proporciona una composición para usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la sobreexpresión de la proteína c-erbB-2 o células neoplásicas, por ejemplo, células de carcinoma mamario, células de carcinoma ovárico, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de las glándulas salivares, células de tumor gástrico, células de adenocarcinoma de colon y células de leucemia de la médula ósea.

Otra realización proporciona un método in vitro para el tratamiento de una célula neoplásica, comprendiendo el método administrar una dosis eficaz de la composición a las células.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un método para prevenir la recurrencia de una enfermedad neoplásica. La recurrencia se evita mediante la administración de un tratamiento citocidamente eficaz de la toxina orientada, por ejemplo una inmunoglobulina tal como anticuerpo TAb 250-gelonina.

En otra realización más de la presente invención, se proporcionan nuevas composiciones de interés que comprenden construcciones de fusión de restos de orientación con afinidad de unión para proteína c-erbB-2, y un resto tóxico. Preferiblemente, el resto de orientación es un anticuerpo que reconoce un epítopo extracelular de c-erbB-2, por ejemplo, TAb 250, y el resto tóxico es relativamente inerte cuando se aplica separadamente del resto de orientación, por ejemplo, gelonina. En otras realizaciones de la presente invención, se proporcionan métodos para prolongar el tiempo de supervivencia de un mamífero que tiene un tumor mediante la administración de toxinas orientadas de la presente invención a este mamífero y también un método para retardar la velocidad de crecimiento de tumores al administrar toxinas orientadas de la presente invención. Típicamente, las toxinas orientadas estarán orientadas por una región de unión inmunológica, por ejemplo un segmento que se une a anticuerpo. Adicionalmente, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una inmunotoxina que consiste en un resto tóxico conjugado a un anticuerpo monoclonal. Lo más preferiblemente, el anticuerpo es TAb 250 y el resto tóxico es gelonina.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 demuestra los efectos de anticuerpo ZME, anticuerpo TAb 250 o inmunoconjugados de TAb 250 y gelonina sobre células SKOV-3 según se mide mediante ELISA.

La Figura 2 demuestra la citotoxicidad de la construcción de TAb 250-gelonina sobre células SKOV-3.

La Figura 3 demuestra la competición de anticuerpo relevante frente a irrelevante con el conjugado sobre células SKOV-3.

La Figura 4 demuestra la relación dosis-respuesta y los efectos del conjugado de TAb 250-gelonina sobre células SKOV-3.

La Figura 5 demuestra la citotoxicidad de TAb 250 y el conjugado de TAb 250-gelonina sobre células SKOV-3.

La Figura 6 demuestra la capacidad del anticuerpo TAb 250 para internalizarse en diversas líneas celulares.

La Figura 7 demuestra la citotoxicidad del inmunoconjugado de TAb 250-gelonina en el ensayo de MTT.

Descripción detallada de la invención

Según se usa aquí, un resto de orientación celular es capaz de unirse selectivamente a una proteína c-erbB-2 que se expresa sobre una célula, típicamente sobre su superficie. Esto incluye una proteína que exhibe unión específicamente para un dominio antigénico para la proteína c-erbB-2, por ejemplo, anticuerpos intactos o sus fragmentos que se unen a epítopos. Esto abarca moléculas de anticuerpo clásicas, versiones quiméricas, una cadena simple y fragmentos de anticuerpo modificados que retienen especificidad y afinidad de unión a epítopos.

Según se usa aquí, el término "inmunoglobulina" o "péptido o péptidos de anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo entero o cualquier fragmento de unión funcional de una molécula de inmunoglobulina. Ejemplos de tales péptidos incluyen moléculas de anticuerpo completas, fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, F(ab')_{2}, CDRs, V_{L}, V_{H} y cualquier otra porción de un anticuerpo, particularmente las que exhiben especificidad o afinidad de unión a antígeno. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo de IgG está compuesta por dos cadenas ligeras, cada una conectada por enlaces disulfuro a dos cadenas pesadas. Las dos cadenas pesadas están, a su vez, conectadas entre sí por enlaces disulfuro en un área conocida como la región de bisagra de un anticuerpo. Una molécula de IgG simple tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 150-160 kD y contiene dos sitios de unión a antígeno. Los fragmentos de estas moléculas, por ejemplo, cadenas pesadas o ligeras solas, a veces pueden unirse al antígeno. Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos y las cadenas individuales pueden ser funcionalmente equivalentes a las inmunoglobulinas.

Una cadena pesada o ligera de anticuerpo normal tiene una región variable (V) N-terminal (NH_{2}) y una región constante (C) C-terminal (-COOH). La región variable de la cadena pesada se denomina V_{H} (incluyendo, por ejemplo, V_{\gamma}) y la región variable de la cadena ligera se denomina V_{L} (incluyendo V_{\kappa} o V_{\lambda}). La región variable es la parte de la molécula que se une al antígeno cognado del anticuerpo, mientras que la región Fc (los dominios segundo y tercero de la región C) determina la función efectora del anticuerpo (por ejemplo, fijación del complemento, opsonización). La inmunoglobulina de longitud completa o las "cadenas ligeras" del anticuerpo (generalmente aproximadamente 25 Kd, aproximadamente 214 aminoácidos) son codificadas por un gen de la región variable en el extremo N (generalmente aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante \kappa (kappa) o \lambda (lambda) en el extremo COOH. la inmunoglobulina de longitud completa o las "cadenas pesadas" del anticuerpo (generalmente aproximadamente 50 Kd, aproximadamente 446 aminoácidos) son codificadas de forma similar por un gen de la región variable (que codifica generalmente aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los genes de la región constante, por ejemplo gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). Típicamente, la "V_{L}" incluirá la porción de la cadena ligera codificada por los segmentos génicos V_{L} y/o J_{L} (J o región de ligazón), y la "V_{H}" incluirá la porción de la cadena pesada codificada por los segmentos génicos V_{H} y/o D_{H} (D o región de diversidad) o J_{H}. Véanse generalmente Roitt y otros, Immunology, Capítulo 6, (2ª ed. 1989) y Paul; Fundamental. Immunology, Raven Press (2ª ed. 1989).

Una región variable de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste en una región de "armazón" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones que determinan la complementariedad o CDRs. La extensión de la región de armazón y las CDRs se ha definido (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", E. Kabat y otros, U.S. Department of Health and Human Services, (1987).

Las secuencias de las regiones de armazón de diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente dentro de una especie. Las regiones de armazón de un anticuerpo, esto es, las regiones de armazón combinadas de las cadenas ligeras y pesadas integrantes, sirven para situar y alinear las CDRs en el espacio tridimensional. Las CDRs son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDRs se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando desde el extremo N.

Los dos tipos de cadenas ligeras, \kappa y \lambda, se denominan isotipos. Los determinantes isotípicos residen típicamente en la región constante de la cadena ligera, también denominada la C_{L} en general y C_{\kappa} o C _{\lambda} en particular. La región constante de la molécula de la cadena pesada, también denominada C_{H}, determina el isotipo del anticuerpo. Los anticuerpos se clasifican como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, dependiendo del isotipo de la cadena pesada. Los isotipos se codifican en los segmentos mu (\mu), Delta (\Delta), gamma (\gamma), alfa (\alpha) y épsilon (\in) de la región constante de la cadena pesada, respectivamente. Además, hay un número de subtipos \gamma.

El isotipo de la cadena pesada determina diferentes funciones efectoras del anticuerpo, tales como opsonización o fijación del complemento. Además, el isotipo de la cadena pesada determina la forma secretada del anticuerpo. Los isotipos IgG, IgD e IgE secretados se encuentran típicamente en forma unitaria simple o monómera. El isotipo IgM secretado se encuentra en forma pentámera; IgA secretada puede encontrarse en forma tanto monómera como dímera.

El fragmento F(ab')_{2} carece de la porción C-terminal de la región constante de la cadena pesada, y habitualmente tiene un peso molecular de aproximadamente 110 Kd. Retiene dos sitios de unión a antígeno y los enlaces disulfuro intercatenarios en la región de bisagra, pero no tiene las funciones efectoras de una molécula de IgG intacta. Un fragmento F(ab')_{2} puede obtenerse a partir de una molécula de IgG mediante digestión proteolítica con pepsina a pH 3,0-3,5 usando métodos estándar tales como los descritos en Harlow y Lane, posteriormente.

Un fragmento "Fab" comprende una cadena ligera y la porción N-terminal de la cadena pesada que están conectadas entre sí mediante enlaces disulfuro. Típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 50 Kd y contiene un solo sitio de unión a antígeno. Los fragmentos Fab pueden obtenerse a partir de fragmentos F(ab')_{2} mediante reducción limitada, o a partir del anticuerpo entero mediante digestión con papaína en presencia de agentes reductores. (Véase Harlow y Lane, posteriormente). En ciertos casos, la concentración de agente reductor necesaria para mantener la actividad de papaína en presencia de oxígeno atmosférico es suficiente para reducir completamente los enlaces disulfuro intercatenarios con el anticuerpo. Esto puede dar como resultado una pérdida de reconocimiento de antígeno. Para evitar este problema, la papaína puede activarse y a continuación intercambiarse en tampón que contiene una concentración de agente reductor compatible con mantener la actividad de unión a antígeno. La digestión del anticuerpo se lleva a cabo típicamente bajo una atmósfera inerte para prevenir la desactivación de la papaína.

El siguiente sistema es un ejemplo de este procedimiento:

A) Activación de papaína: La papaína, suministrada como 10 mg/ml de suspensión de NH_{4}SO_{4}, se disuelve en EDTA 10 mM, cisteína 20 mM, pH = 8,0, hasta una concentración final de 2 mg/ml. La solución se desgasifica y se deja incubar 2 horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno.

B) La papaína activada se intercambia en NaPO_{4} 20 mM, pH = 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, DTT 30 \muM.

C) Digestión de anticuerpo: Se añade 1 mg de papaína activada para cada 100 \mug de anticuerpo y la solución se dializa contra un gran exceso de NaPO_{4} 20 mM, pH = 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, DTT 30 \muM, con rociadura continua de helio. La diálisis se usa para mantener un exceso molar de agente reductor durante el transcurso de la digestión.

D) Después de 2-4 horas a temperatura ambiente, la digestión se termina mediante la adición de yodoacetamida.

E) Los fragmentos Fab se separan del anticuerpo no digerido o parcialmente digerido usando métodos cromatográficos estándar.

Según se usan aquí, los términos "Fab", o cualesquiera otros fragmentos de anticuerpo, tienen clasificaciones similares cuando se aplican a la presente invención que los términos generales "anticuerpos" o "imunoglobulinas". Así, proteína de Fab de "mamífero", "Fab quimérico" y similares se usan análogamente a las definiciones correspondientes en el uso general, y según se indica en los párrafos subsiguientes.

Según se usa aquí, el término "anticuerpos quiméricos" o "péptidos quiméricos" se refiere a los anticuerpos o péptidos de anticuerpo en los que una porción del péptido tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de, o es homóloga a, una secuencia correspondiente en un anticuerpo o péptido derivado de una primera fuente génica, mientras que el segmento restante de la cadena o las cadenas es homólogo a secuencias correspondientes de otra fuente génica. Por ejemplo, un péptido de anticuerpo de la cadena pesada quimérico puede comprender una región variable murina y una región constante humana. Las dos fuentes génicas serán típicamente dos especies separadas, pero ocasionalmente implicarán una especie.

Los anticuerpos o péptidos quiméricos se producen típicamente usando técnicas moleculares y/o celulares recombinantes. En muchos casos, los anticuerpos quiméricos tienen regiones variables de las cadenas tanto ligeras como pesadas que imitan las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes y/o de armazón son homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de una segunda especie de mamífero diferente.

Según se usa aquí, la definición de anticuerpo quimérico, sin embargo, no está limitada a este ejemplo. Un anticuerpo quimérico es cualquier anticuerpo en el que cualquiera o ambas de las cadenas pesadas o ligeras están compuestas por combinaciones de secuencias que imitan las secuencias en anticuerpos de fuentes diferentes, ya sean estas fuentes clases diferentes, respuestas antigénicas diferentes o especies de origen diferentes, y esté o no el punto de fusión en el límite variable/constante. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos pueden incluir anticuerpos en los que el armazón y las CDRs son de fuentes diferentes. Por ejemplo, CDRs no humanas se integran en regiones de armazón humanas conectadas a una región constante humana para formar "anticuerpos humanizados". Véanse, por ejemplo, la Publicación de Solicitud PCT Nº WO 87/02671; la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; la Solicitud de Patente EP 0173494; Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986); y Verhoeyen y otros, Science, 239:1534-1536 (1988).

Según se usa aquí, el término "región de armazón similar a humana" es una región de armazón para cada cadena de anticuerpo, y habitualmente comprende al menos aproximadamente 70 residuos de aminoácido, típicamente de 75 a 85 o más residuos. Los residuos de aminoácido de la región de armazón similar a humana son al menos aproximadamente 80%, preferiblemente aproximadamente 80-85% y lo más preferiblemente más de 85% homólogos con los de una inmunoglobulina humana. Esta característica compartida con otros anticuerpos endógenos es útil para generar un resto de orientación que introduce sólo una reacción inmune secundaria, por ejemplo un mecanismo que minimiza la respuesta a "auto"-marcadores.

Según se usa aquí, el término inmunoglobulina "humanizada" o "similar a humana" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región de armazón similar a humana y una región constante que es sustancialmente homóloga a una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, que tiene al menos aproximadamente 80% o más, preferiblemente aproximadamente 85-90% o más y lo más preferiblemente aproximadamente 95% o más de homología. De ahí que la mayoría de las partes de una inmunoglobulina similar a humana, excepto posiblemente las CDRs, sean sustancialmente homólogas a partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana natural.

Según se usa aquí, el término "anticuerpo híbrido" se refiere a un anticuerpo en el que cada cadena es homóloga separadamente con referencia a una cadena de anticuerpo de mamífero, pero la combinación representa un nuevo ensamblaje de modo que dos antígenos diferentes son reconocidos por el anticuerpo. En anticuerpos híbridos, un par de cadena pesada y ligera es homólogo al encontrado en un anticuerpo producido contra una secuencia característica de reconocimiento del antígeno, por ejemplo, un epítopo, mientras que el otro par de cadena pesada y ligera es homólogo a un par encontrado en un anticuerpo producido contra otro epítopo. Esto da como resultado la propiedad de la valencia multifuncional, es decir, la capacidad para unirse a al menos dos epítopos diferentes simultáneamente. Por supuesto, tales híbridos también pueden formarse usando cadenas quiméricas.

Según se usa aquí, el término "anticuerpo monoclonal" significa una composición de anticuerpo que reconoce un determinante antigénico discreto. No pretende estar limitado en cuanto a la fuente del anticuerpo o la manera en la que se elabora.

Usando métodos estándar que son bien conocidos en la especialidad, las regiones variables y las CDRs pueden derivarse de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que es específico para c-erbB-2. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención capaces de expresar finalmente los anticuerpos quiméricos deseados pueden formarse a partir de una variedad de diferentes secuencias nucleotídicas (genómicas o cDNA, RNA, oligonucleótidos sintéticos, etc.) y componentes (por ejemplo, regiones V, J, D y C), así como mediante una variedad de técnicas diferentes. Ligar secuencias genómicas apropiadas es actualmente un método de producción común, pero también pueden utilizarse secuencias de cDNA (véanse la Publicación de Patente Europea Nº 0239400 y Reichmann, L. y otros, Nature, 332:323-327 (1988).

Las secuencias de DNA de la región constante humana se aislan preferiblemente de células B inmortalizadas, véase, por ejemplo, Heiter y otros, Cell, 22:197-207 (1980), incorporado aquí mediante referencia, pero pueden aislarse o sintetizarse a partir de una variedad de otras fuentes. La secuencia nucleotídica de un gen de inmunoglobulina C_{\gamma 1} humana se describe en Ellison y otros, Nucl. Acid. Res. 10:4071 (1982); Beidler y otros, J. Immunol., 141:4053 (1988); Liu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439 (1987).

Las CDRs para producir las imunoglobulinas de la presente invención se derivan preferiblemente de anticuerpos monoclonales capaces de unirse al antígeno deseado, proteína c-erbB-2, y se producen en cualquier fuente de mamífero conveniente, incluyendo ratones, ratas, conejos, hámsteres u otras células huésped de vertebrado capaces de producir anticuerpos mediante métodos bien conocidos. Células originarias adecuadas para las secuencias de DNA y células huésped para la expresión y secreción de inmunoglobulinas pueden obtenerse a partir de un número de fuentes, tales como ("ATCC") ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Quinta edición (1985) Rockville, Maryland,
U.S.A.

Además de los péptidos de anticuerpo quiméricos descritos específicamente aquí, otras inmunoglobulinas modificadas (sustancialmente homólogas) pueden diseñarse y fabricarse fácilmente utilizando diversas técnicas de DNA recombinante conocidas por los expertos en la especialidad. Las modificaciones de los genes pueden efectuarse fácilmente mediante una variedad de técnicas bien conocidas, tales como mutagénesis dirigida al sitio (véase Gillman y Smith, Gene, 8: 81-97 (1979) y Roberts, S. y otros, Nature, 328:731-734 (1987).

Estas modificaciones pueden incluir adiciones, supresiones, sustituciones, preferiblemente conservativas, de aminoácidos y otros cambios en la secuencia del polipéptido mientras se retenga la propiedad o actividad biológica apropiada. Alternativamente, pueden producirse fragmentos de polipéptido que comprenden sólo una porción de la estructura de anticuerpo primario y que poseen actividades de unión y/o efectoras. Además, debido a que, como muchos genes, los genes relacionados con imunoglobulinas contienen regiones funcionales separadas, teniendo cada una una o más actividades biológicas distintas, los genes pueden fusionarse a regiones funcionales de otros genes para producir proteínas de fusión (por ejemplo, inmunotoxinas) que tienen nuevas propiedades o nuevas combinaciones de propiedades.

La variable clonada y las regiones constantes pueden aislarse de plásmidos y ligarse entre sí en un vector de expresión de mamífero, por ejemplo pSV2-neo o pRSV-gpt, para formar una unidad de transcripción funcional. Estos vectores de expresión pueden transferirse a continuación a células huésped. Las células de mieloma de ratón, tales como células SP 2/O o P3X, son un huésped preferido debido a que no secretan proteína de inmunoglobulina endógena y que tienen todos los componentes usados en la expresión de inmunoglobulinas. Las células de mieloma pueden transfectarse usando técnicas apropiadas como las descritas anteriormente.

Otros tipos de promotores y estimuladores específicos para otras células huésped son conocidos en la especialidad. Véase, Kameyoma, K. y otros, anteriormente. Por ejemplo, la secuencia de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo quimérico puede conectarse a promotores y estimuladores de levadura y transfectarse en levadura mediante métodos bien conocidos en la especialidad. Véase Kriegler, anteriormente.

Este mismo sistema puede tomarse para aislar las CDRs específicas de c-erbB-2 de una fuente tal como una especie de mamífero y las regiones de armazón de otra fuente, tal como una especie de mamífero diferente. Las CDRs pueden ligarse a continuación a las regiones de armazón y las regiones constantes para formar un anticuerpo quimérico. Véanse los documentos PCT Nº GB88/00731 (1989) y U.S.S.N. 07/808.462, presentado el 12 de Diciembre de 1991.

Las CDRs pueden clonarse en un vector de expresión que comprende, por ejemplo, regiones de armazón y constantes humanas.

Otro ejemplo es una secuencia de DNA recombinante que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de una especie, tal como el ratón, y la región de armazón de la cadena pesada humana para codificar un anticuerpo específico para c-erbB-2. Otras posibilidades incluyen usar CDRs específicas para c-erbB-2; usar parte de la región variable que abarca CDR1 y CDR2 de una especie de mamífero y a continuación ligar esta secuencia a otra que codifica las porciones de armazón de una especie de mamífero a la CDR3 de la primera; o transfectar una línea de células huésped con una secuencia de DNA recombinante que codifica CDRs de la cadena pesada específicas de c-erbB-2 derivadas de una primera especie de mamífero, intercaladas dentro del armazón de una segunda especie de mamífero con una cadena ligera que contiene una secuencia de DNA de la región variable derivada de la primera especie y la región constante derivada de la segunda especie.

Vectores de expresión de DNA recombinante que comprenden secuencias de anticuerpo pueden transfectarse mediante electroporación en células huésped. Se usan procedimientos de selección estándar para aislar clones que producen el anticuerpo quimérico específico para c-erbB-2.

Los anticuerpos pueden expresarse en una forma plegada apropiada, incluyendo anticuerpos monocatenarios, a partir de bacterias tales como E. coli. Véanse, Pluckthum, Biotechnology, 9:545 (1991); Huse y otros, Science, 246:1275 (1989) y Ward y otros, Nature, 341:544 (1989).

Las secuencias peptídicas de anticuerpo pueden amplificarse para clonación mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, una técnica usada para amplificar una secuencia de DNA de interés usando una DNA polimerasa termoestable, tal como polimerasa de Taq, y polimerasa y cebadores oligonucleotídicos, todo según se describe en PCR Protocols, ed. Innis y otros, Academic Press, Inc. (1990). Véanse además Orlandi, anteriormente, y Larrick y otros, Biotechnology, 7:934 (1989).

La proteína c-erbB-2 (también denominada aquí simplemente c-erbB-2) es una glicoproteína de membrana de 185 Kd (kilodaltons) que tiene actividad de tirosina quinasa y está relacionada con, pero es distinta de, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Como la proteína del EGFR, la proteína c-erbB-2 tiene un dominio extracelular que incluye dos aglomerados repetidos ricos en cisteína, un dominio de transmembrana y un dominio de quinasa intracelular. Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína c-erbB-2, así como la secuencia nucleotídica, ha sido descrita por Coussens y otros, Science, 230:1132 (1985).

La proteína c-erbB-2 está codificada por el oncogén c-erbB-2 descrito en 1985 por tres grupos de investigación diferentes: Semba y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6497 (que denominan al gen c-erbB-2); Coussens y otros, anteriormente (que denominan al gen HER-2) y King y otros, Science, 229:1132 (que denominan al gen relacionado con v-erbB). Así, la secuencia génica de c-erbB-2 y su secuencia proteínica correspondiente son bien conocidas y se describen en la especialidad. La proteína c-erbB-2 tiene un diseño intracelular definido, una región de transmembrana y una región extracelular. Típicamente, los restos de orientación de la presente invención se unirán a la región extracelular, que debe exponerse al exterior de la célula neoplásica. El resto de orientación reconocerá generalmente una secuencia característica o secuencias características encontradas allí, incluyendo sitios de reconocimiento del antígeno, por ejemplo epítopos. Los epítopos a menudo se dirigirán a epítopos polipeptídicos puros, determinantes de la secuencia peptídica lineal o determinantes de la conformación, pero también pueden dirigirse a epítopos que tienen componentes de carbohidrato. Los epítopos pueden así incluir componentes de proteína/carbohidrato combinados o componentes de carbohidrato solos. Además, otras modificaciones para la proteína, normales o anormales, presentarán determinantes epitópicos importantes.

La detección de la proteína c-erbB-2 puede efectuarse mediante inmunoensayos bien conocidos que emplean anticuerpos específicos para la proteína c-erbB-2, tales como los descritos aquí. Tales anticuerpos están disponibles comercialmente, por ejemplo de Chemicon International, Inc., Temecula, CA, o pueden prepararse mediante procedimientos inmunológicos estándar. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N.Y. (1988).

Se pretende aquí que la definición de la proteína c-erbB-2 también incluya las proteínas desarrolladas a partir de otros sistemas hospedantes, por ejemplo proteínas que están inmunológicamente relacionadas con la proteína c-erbB-2 humana. Por ejemplo, un gen de rata relacionado (denominado neu) se ha presentado en Schecter y otros, Science, 229:976 (1985).

Epítopos útiles para los que pueden producirse fácilmente anticuerpos incluyen epítopos extracelulares encontrados sobre células diana. Estos epítopos generalmente serán epítopos proteínicos, por ejemplo epítopos lineales o de conformación de la proteína como los encontrados en células neoplásicas. Otros epítopos útiles incluirán componentes no proteínicos incluyendo carbohidrato u otras modificaciones, habitualmente post-traduccionales, encontrados en la proteína c-erbB-2. Los anticuerpos y otras regiones de unión que exhiben especificidad de unión para c-erbB-2 sobreexpresada pueden producirse contra fragmentos de la proteína.

Se han elaborado anticuerpos monoclonales de ratón contra la porción extracelular de c-erbB-2. Un ejemplo de tal anticuerpo es TAb 250, que está depositado en the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC), teniendo el Nº de Registro HB10646.

Alternativamente, un resto que se orienta a proteínas puede derivarse de cualquier otro método de orientación que exhiba afinidad y especificidad para una célula que expresa c-erbB. Por ejemplo, un ligando que es reconocido y unido mediante la proteína c-erbB-2 sería un resto de orientación útil. Véanse, por ejemplo, Ciccodicola y otros, (1989) Embo J. 8:1987-1991; Ciardiello y otros (1991) Cancer Research 51:1051-1054 y Ciardiello y otros (1991) P.N.A.S. USA 88:7793-7796, que describen CRIPTO, una molécula que parece servir como un ligando para el receptor de EGF, y probablemente también se unirá con especificidad a la proteína c-erbB-2.

En el caso de las secuencias descritas aquí, debe entenderse que también se incluyen variantes de estas secuencias, tales como mutaciones de sustitución, adición y/o supresión, o cualquier otra secuencia que posea actividad de unión sustancialmente similar a las secuencias de las que se derivan o a las que son similares de otra manera.

Para esta invención, un anticuerpo u otro péptido es específico para una proteína c-erbB-2 si el anticuerpo o el péptido se une o es capaz de unirse a proteína c-erbB-2, por ejemplo según se mide mediante ensayos de anticuerpo-antígeno o ligando-receptor estándar, por ejemplo ensayos competitivos, ensayos de saturación o inmunoensayos estándar tales como ELISA o RIA. Esta definición de especificidad se aplica a cadenas pesadas y/o ligeras simples, CDRs, proteínas de fusión o fragmentos de cadenas pesadas y/o ligeras, que también son específicos para proteínas c-erbB-2 si se unen a proteína c-erbB-2 solos o si, cuando se incorporan apropiadamente en la conformación de inmunoglobulina con regiones variables y regiones constantes complementarias según sea apropiado, son capaces entonces de unirse a proteína c-erbB-2 con especificidad.

En ensayos de competición la capacidad de un anticuerpo o un fragmento peptídico para unirse a un antígeno puede determinarse al detectar la capacidad del péptido para competir con la unión de un compuesto que se sabe que se une al antígeno. Numerosos tipos de ensayos competitivos son conocidos y se analizan aquí. Alternativamente, también pueden usarse ensayos que miden la unión de un compuesto de prueba en ausencia de un inhibidor. Por ejemplo, la capacidad de una molécula u otro compuesto para unirse a la proteína c-erbB-2 puede detectarse al marcar la molécula de interés directamente o puede estar no marcada y detectarse indirectamente usando diversos formatos de ensayo tipo sándwich. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión tales como ensayos de unión competitiva (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 3.376.110, 4.016.043, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N.Y. (1988) y Coligan y otros (eds), Current Protocol in Immunology, Wiley and Sons, N.Y.

También están disponibles ensayos para medir la unión de un compuesto de prueba a un componente solo en lugar de usar un ensayo de competición. Por ejemplo, las inmunoglobulinas pueden usarse para identificar la presencia de la proteína c-erbB-2. Pueden usarse procedimientos estándar para ensayos de anticuerpos monoclonales, tales como ELISA (véase Harlow y Lane, anteriormente). Para una revisión de diversos sistemas que producen señales que pueden usarse, véase la Patente de EE.UU. Nº 4.391.904.

Además, la especificidad de los restos de unión a c-erbB-2 puede determinarse mediante su afinidad. Tal especificidad existe si la constante de disociación (K_{D} = 1/K, donde K es la constante de afinidad) del resto es < 1 \muM, preferiblemente < 100 nM, y lo más preferiblemente < 1 nM. Las moléculas de anticuerpo tendrán típicamente una K_{D} en los intervalos inferiores. K_{D} = [R-L]/[R][L] donde [R], [L] y [R-L] son las concentraciones en el equilibrio del receptor o c-erbB-2 (R), el ligando, el anticuerpo o el péptido (L) y el complejo receptor-ligando (R-L), respectivamente. Típicamente, las interacciones de unión entre el ligando o el péptido y el receptor o el antígeno incluyen asociaciones no covalentes reversibles tales como atracción electrostática, fuerzas de Van der Waals y enlaces de
hidrógeno.

Otros formatos de ensayo pueden implicar la detección de la presencia o ausencia de diversos cambios fisiológicos o químicos que resultan de la interacción, tales como modulación a la baja, internalización o un incremento en la fosforilación, según se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 07/644.361, presentada el 1/18/91.

Véase además, Receptor-Efector Coupling - A Practical Approach, ed. Hulme, IRL Press, Oxford (1990).

Un péptido preferido específico para la proteína c-erbB-2 induce un incremento en la fosforilación de la proteína c-erbB-2 cuando se pone en contacto con células tumorales que expresan la proteína c-erbB-2. Una molécula que "induce un incremento en la fosforilación de proteína c-erbB-2" es una que provoca un incremento detectable en la incorporación de fosfato en la proteína sobre la que se produce en ausencia de la molécula. Típicamente, este incremento detectable será un incremento de dos veces o más en la fosforilación, preferiblemente un incremento de más de tres veces sobre los controles. La fosforilación puede medirse mediante los métodos conocidos en la especialidad para detectar la fosforilación de receptores. Véanse, por ejemplo, Cooper y otros, Methods in Enzymology, 99:387-402 (1983); Antoniades y Pantazis, Methods in Enzymology, 147:36-40 (1987) y Lesniak y otros, Methods in Enzymology, 150:717-723 (1987).

Típicamente, la fosforilación puede medirse mediante fosforilación in vivo de células intactas (Lesniak, previamente) o mediante una reacción de autofosforilación in vitro (Antonaides, anteriormente). Para medir la fosforilación in vivo, por ejemplo, pueden efectuarse ensayos en los que células que tienen la proteína c-erbB-2 se ponen en contacto con fosfato marcado radiactivo. Para detectar la fosforilación del receptor de proteína c-erbB-2 en el ensayo in vivo, es ventajoso incubar las células de prueba durante aproximadamente 12 a aproximadamente 18 horas, con el fosfato marcado. Las células se dividen en dos o más partidas, en las que algunas se exponen a la molécula que se espera que incremente la fosforilación del receptor y algunas se separan como controles. Las partes alícuotas se inmunoprecipitan subsiguientemente, el receptor se reconoce, por ejemplo, mediante gel de poliacrilamida en SDS o métodos autorradiográficos y un incremento en la fosforilación se considera estadísticamente significativo cuando hay un incremento de dos veces o más en el fondo de la parte alícuota expuesta a la molécula de prueba sobre las partes alícuotas de control.

Para medir la autofosforilación in vitro, por ejemplo, células o extractos celulares pueden incubarse en presencia o ausencia del péptido específico para c-erbB-2. Después de la inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-c-erbB-2, el complejo inmune puede incubarse con \gamma^{32}P-ATP y analizarse mediante autorradiografía en SDS-PAGE.

Otro péptido preferido específico para proteína c-erbB-2 es uno que provoca la modulación a la baja de la proteína c-erbB-2. La "modulación a la baja de la proteína c-erbB-2" se determina mediante una disminución detectable en presencia sobre las células tumorales del receptor de c-erbB-2. Tal modulación a la baja se detecta mediante una disminución en la capacidad de los anticuerpos u otras moléculas de unión específica para unirse a o reconocer la proteína receptora de c-erbB-2 sobre las células tumorales. Por ejemplo, la modulación a la baja puede determinarse al incubar células tumorales que tienen el receptor de proteína c-erbB-2 con el péptido de interés, lavar las células y a continuación poner en contacto las células con anticuerpos marcados (preferiblemente radiomarcados) específicos para la proteína c-erbB-2. La extensión de la unión de los anticuerpos anti-c-erbB-2 marcados a las células expuestas al péptido específico para proteína c-erbB-2 se compara con la extensión de unión de los anticuerpos a células de control (es decir, no expuestas al péptido específico para c-erbB-2). Preferiblemente, para estos ensayos, las células se someten directamente a los anticuerpos anti-c-erbB-2 marcados después de lavar.

La modulación a la baja observada es típicamente dependiente de la dosis, es decir, la extensión de la modulación a la baja se incrementa con la cantidad de péptido específico para proteína c-erbB-2 expuesto a la proteína c-erbB-2. Se prefiere un péptido que provoca una disminución en 90% o más de la unión de las células no tratadas frente a las células de control para anticuerpos anti-c-erbB-2.

Otro péptido específico preferido para proteína c-erbB-2 es uno que se une a células tumorales que expresan proteína c-erbB-2 y se internaliza cuando se pone en contacto con tales células tumorales. La "internalización" se produce cuando el péptido queda secuestrado en el citoplasma de las células. Una vez internalizado, el receptor y/o el péptido puede degradarse en los lisosomas celulares o puede reciclarse a la superficie celular. Un método para determinar la internalización de un complejo de ligando-receptor también se describe en Haigler y otros, J. Biol. Chem., 255:1239-1241 (1980).

Un modulador del crecimiento celular es una molécula que afecta al crecimiento de una célula a la que se orienta. Típicamente, el modulador debe internalizarse en la célula diana, pero esta función es habitualmente proporcionada por la internalización que resulta del resto de orientación.

La modulación será típicamente una disminución en el metabolismo o la velocidad de crecimiento, preferiblemente un efecto tóxico, pero también será útil un incremento significativo en el metabolismo o la velocidad de crecimiento. Cuando se efectúa un incremento significativo en el metabolismo o la velocidad de crecimiento, podría usarse un veneno a corto plazo en combinación para destruir sólo las células que exhiben esto.

Para moduladores que disminuyen el metabolismo o la velocidad de crecimiento, se prefiere que el modulador sea altamente potente, por ejemplo tenga una actividad muy alta.

Aunque existen toxinas virales y fúngicas, toxinas bacterianas o de plantas particulares tienen las actividades específicas más altas conocidas. La detención del crecimiento puede producirse al evitar cualquiera de un número de funciones celulares esenciales incluyendo la síntesis de ácidos nucleicos, la síntesis de proteínas y el metabolismo celular, general o específico. Por ejemplo, la exotoxina de pseudomonas y la toxina de la difteria funcionan deteniendo irreversiblemente la síntesis de proteínas en células eucarióticas. Ambos ejemplos inactivan enzimáticamente el factor de elongación 2, que es un componente esencial de la síntesis de proteínas. Otros factores de elongación pueden ser dianas para otras toxinas. La ricina, en contraste, es una toxina de planta que actúa directamente sobre el ribosoma, actuando sobre el rRNA 285.

Preferiblemente, los moduladores del crecimiento tendrán actividades enzimáticas con números de renovación altos de modo que la internalización de muy pocas moléculas puede destruir la célula diana. Véase Pastain y otros, Science 254:1173-1177.

La gelonina es una glicoproteína (P.M. aproximadamente 29-30.000 Kd) purificada a partir de las semillas de Gelonium multiflorum y pertenece a una clase de potentes toxinas de planta inactivadoras de ribosomas. Otros miembros de esta clase incluyen cadenas de abrina, ricina y modecina. La gelonina, como la abrina y la ricina, inhibe la síntesis de proteínas al dañar la subunidad 60S de ribosomas de mamífero. La gelonina parece ser estable al tratamiento químico y físico. Por otra parte, la propia gelonina no se une a células y normalmente es atóxica (excepto en altas concentraciones) cuando se administra sola, y es segura para manipular en el laboratorio. La inactivación de los ribosomas es irreversible, no parece implicar cofactores y se produce con una eficacia que sugiere que la gelonina actúa enzimáticamente.

La gelonina y la ricina inhiben la síntesis de proteínas y están entre las toxinas más activas sobre una base en peso de la proteína. La gelonina es 10 a 1.000 veces más activa para inhibir la síntesis de proteínas que la cadena de ricina A. Péptidos como la ricina y la abrina están compuestos por dos cadenas, una cadena A que es la unidad tóxica y una cadena B que actúa al unirse a las células. A diferencia de la ricina y la abrina, la gelonina está compuesta por una sola cadena y, debido a su falta de una cadena B para unirse a células, es ella misma relativamente inerte o atóxica para células intactas. Esta característica de tener un efecto celular muy inferior cuando no se conjuga a un resto de unión u orientación es una característica importante de diversas realizaciones de la presente invención. Esta toxicidad diferencial es importante en la alta especificidad para células que expresan c-erbB-2.

Las células de mamífero carecen aparentemente de la capacidad de unirse a y/o internalizar la molécula de gelonina natural. Los conjugados de gelonina con un reaccionante que se orienta a tumores, tal como el anticuerpo monoclonal TAb 250 dirigido a un antígeno asociado con tumor presente sobre ciertas células tumorales, proporcionan tanto un método específico para unir la gelonina a la célula como una ruta para la internalización del complejo gelonina-anticuerpo.

El resto tóxico de la inmunotoxina puede ser un fármaco tóxico o una toxina enzimáticamente activa de origen de planta, o un fragmento enzimáticamente activo ("cadena A") de tal toxina.

Las toxinas activas pueden funcionar mediante cualquiera de un número de mecanismos, cada uno de los cuales afecta a la fisiología y el crecimiento celulares. Las toxinas pueden ser inhibidores o venenos metabólicos, inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos, inhibidores de la síntesis de proteínas o cualesquiera otros mediadores de funciones anormales o perjudiciales. Lo más preferido es la conjugación con gelonina.

Fragmentos y derivados activos incluyen cualesquiera compuestos que tengan la misma estructura nuclear que la estructura de longitud completa de la gelonina pero carezcan de la secuencia primaria completa. Estos fragmentos o derivados tendrán la misma actividad biológica o tóxica mejorada que la gelonina. La toxicidad de los fragmentos o derivados de gelonina puede ser determinada habitualmente por los expertos en la especialidad usando el ensayo del lisado de reticulocitos de conejo.

El resto de orientación y el modulador del crecimiento celular pueden conjugarse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales. Ejemplos de tales reaccionantes son 3-(2-piridilditio)(propionato) de N-succinimidilo (SPDP), 2-IT, 4-succinimidiloxicarbonil-\alpha-metil-\alpha(2-piridilditio)tolueno (SMPT), derivados bifuncionales de imidoésteres tales como adipimidato de dimetilo, HCl, ésteres activos tales como suberato de disuccinimidilo, aldehídos tales como glutaraldehído, bis-azido-compuestos tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina, derivados de bis-diazonio tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina, diisocianatos tales como 2,6-diisocianato de tolileno, y compuestos de bis-fluoro activo tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno.

Antes de usar en estos estudios, las células Sp2/0-Ag14 se harán crecer inicialmente en presencia de 0,1 \mug/ml de gelonina natural. Durante varios meses, la concentración de gelonina se incrementará gradualmente hasta que las células puedan mantenerse en hasta 10 mg/ml. Las células se clonarán a continuación mediante dilución limitativa en presencia de 10 mg/ml de gelonina y las colonias resultantes resistentes a gelonina se expandirán. La gelonina se retirará a continuación del medio de cultivo durante dos pasadas y las células se estimularán de nuevo con exposición a gelonina para confirmar el desarrollo de clones establemente resistentes. Después de pruebas para confirmar la producción y la actividad de TAb-250 quimérico, se harán crecer células SP2/0 resistentes a gelonina que producen anticuerpo y el cDNA para el anticuerpo TAb 250 se retirará del DNA total mediante incubación con endonucleasa de restricción. En paralelo, el cDNA de E. coli JM105 que expresa gelonina optimizada se retirará, se purificará y el DNA que codifica gelonina se liberará después de la digestión con HindIII y Eco RI. El gen de gelonina se ligará en el fragmento de la cadena pesada y el inserto se recolocará en células SP2/0 resistentes a gelonina. Las células se subclonarán a continuación mediante dilución limitativa y los clones se rastrearán con respecto tanto a la producción de anticuerpos quiméricos como al contenido de gelonina. Finalmente, los clones positivos se expandirán y la proteína de fusión recombinante se purificará y se probará tanto en ensayos de citotoxicidad in vitro como en distribución de tejidos in vivo, farmacocinética, terapéutica y experimentos de toxicidad. Una comparación de las propiedades de la proteína de fusión TAb-250-gelonina con las características de las construcciones de TAb 250-gelonina descritos previamente se realizará para determinar las ventajas y los inconvenientes de cada uno. Basándose en estos estudios, puede realizarse un estudio clínico de Fase I de proteína de fusión de TAb 250 quimérico-gelonina en pacientes con cáncer de mama avanzado.

La administración de las inmunotoxinas de la presente invención a un individuo al que se le ha diagnosticado que tiene células neoplásicas, por ejemplo un tumor con un nivel no deseable de expresión del oncogén c-erbB-2, permitirá la orientación y la concentración del agente citotóxico en el sitio en el que se necesita destruirlas. Orientando así los agentes tóxicos, la toxicidad no específica para otros órganos, tejidos y células se eliminará, se minimizará o al menos disminuirá.

Cuando se usan in vivo para terapia, las inmunotoxinas de la presente invención se administran a los pacientes o a un animal en cantidades terapéuticamente eficaces, es decir cantidades que eliminan o reducen la carga del tumor. Normalmente se administrarán parenteralmente, preferiblemente intravenosamente, pero se usarán otras rutas de administración según sea apropiado. La dosis y el régimen de dosificación dependerán de la naturaleza del cáncer (primario o metastático) y su población, las características de la inmunotoxina particular, por ejemplo su índice terapéutico, el paciente, la historia del paciente y otros factores. La cantidad de inmunotoxina administrada estará típicamente en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente. El programa se continuará para optimizar la eficacia mientras se equilibra contra efectos negativos del tratamiento. Véanse Remington's Pharmaceutical Science, 17ª Ed. (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; y Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8ª Ed (1990) Pergamon Press.

Para la administración parenteral, las imunotoxinas se formularán lo más típicamente en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión) en asociación con un vehículo parenteral aceptable. Tales vehículos son preferiblemente atóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También pueden usarse vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo. Pueden usarse liposomas como portadores. El vehículo puede contener cantidades secundarias de aditivos tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo tampones y conservantes. La inmunotoxina se formulará típicamente en tales vehículos en concentraciones de aproximadamente 0,1 mg/ml a 10 mg/ml.

Las inmunotoxinas de la presente invención también pueden usarse en un método in vitro. Por ejemplo, el método puede usarse para destruir células tumorales de la médula ósea. En este método, la médula ósea se retira en primer lugar de un individuo que tiene una enfermedad neoplásica. Subsiguientemente, la médula ósea se trata con una dosis citocidamente eficaz de una inmunotoxina de la presente invención para eliminar las células tumorales residuales. Las células de la médula ósea tratadas pueden readministrarse al paciente para restablecer un sistema inmunitario después de recibir quimioterapia y/o radioterapia intensivas para eliminar todas las células hematotóxicas neoplásicas endógenas.

Las inmunotoxinas de la presente invención también pueden usarse para prolongar el tiempo de supervivencia de animales que tienen tumores y para retardar la velocidad de crecimiento de tumores comprendidos por células cancerígenas soportados por un mamífero. Por ejemplo, ratones desnudos que tienen xenoinjertos de tumores humanos que crecen subcutáneamente o intraperitonealmente pueden tratarse con dosis de inmunotoxina, anticuerpo solo, toxina sola o solución salina a una dosis entre 25 y 100 mg/kg. La inhibición del crecimiento de tumores puede medirse mediante el cambio en el tamaño físico de los tumores subcutáneos o mediante la prolongación de la supervivencia en ratones que tienen tumores intraperitonealmente, tales como células SKOV-3. Tales estudios pueden ser útiles o indicativos de metodologías y podrían ser aplicables a otros mamíferos, incluyendo primates.

Los siguientes ejemplos proporcionan una descripción detallada de la preparación, la caracterización y el uso de las inmunotoxinas de esta invención. Estos ejemplos no pretenden limitar la invención de ningún modo.

Ejemplo 1 Purificación de gelonina

Un procedimiento para el aislamiento de gelonina está disponible en Stirpe y otros, I. Biol. Chem., 255, 6947-53 (1980). Semillas de Gelonium multiflorum se descascararon y las nueces se trituraron en un homogeneizador con ocho volúmenes de NaCl 0,14 M que contenían un fosfato sódico 5 mM (pH 7,4). El homogenado se dejó durante la noche a 4ºC con agitación continua, se enfrió sobre hielo y se centrifugó a 35.000 veces g durante 20 minutos a 0ºC. El sobrenadante se retiró, se dializó contra fosfato sódico 5 mM (pH 6,5) y se concentró usando un filtro pm10. La muestra se estratificó sobre una columna de intercambio iónico CM-52 (20 x 1,5 cm) equilibrada con fosfato sódico 5 mM (pH 6,5). El material que se unía a la resina de intercambio iónico se eluyó con 400 ml de un gradiente de NaCl lineal de 0 a 0,3 M a una velocidad de 25 ml por hora a 4ºC. Se recogieron fracciones de 5 ml. Las fracciones se controlaron a 280 nm en un espectrofotómetro. La gelonina se eluyó en aproximadamente las fracciones 55-70 y era el último pico de elución principal. Las fracciones 55-70 se reunieron, se dializaron frente a agua doblemente destilada y se concentraron mediante liofilización. La pureza y el peso molecular de cada preparación se verificó en cromatografía líquida a alta presión usando una columna de penetración en gel TSK 3000 con tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,4, y electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-page) al 15%. La gelonina migraba como una banda simple con un peso molecular aproximado de 29-30.000 daltons.

Ejemplo 2 Ensayo de actividad de gelonina

La actividad de gelonina se controló en un ensayo de inhibición de la síntesis de proteínas libre de células. El ensayo de inhibición de la síntesis de proteínas libre de células se realizó al añadir secuencialmente a 50 \mul de lisado de reticulocitos de conejo, mezclando después de cada adición, los siguientes componentes: 0,5 ml de Tris-HCl 0,2 M (pH 7,8), 8,9 ml de etilenglicol y 0,25 ml de HCl 1M).

Veinte microlitros de una mezcla energética de sales-aminoácidos (SAEM) que consiste en: KCl 0,375 M, Mg(CH_{3}CO_{2})_{2} 10 mM, glucosa 15 mM, aminoácidos (excluyendo leucina) 0,25-10 mM, ATP 5 mM, GTP 1 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), 10 \mul de fosfato de creatinina-creatinina fosfoquinasa, 12 \mul de [^{3}H]-leucina (Amersham, 74 mCi/milimol) y añadir 1,5 \mul de soluciones que contienen concentraciones variables de la mezcla de gelonina. La mezcla se incubó durante 60 minutos a 30ºC. La incorporación de [^{3}H]-leucina se controló en una parte alícuota de la mezcla al precipitar proteína sintetizada sobre filtro de fibra de vidrio, lavar en TCA al 10% y acetona y controlar la radiactividad en un contador Beta usando fluido de centelleo Aquasol. Se usó gelonina con una actividad específica no inferior que 4 x 10^{9} U/mg para la conjugación con los anticuerpos. Una unidad de actividad de gelonina es la cantidad de proteína de gelonina que provoca 50% de inhibición de la incorporación de [^{14}C]-leucina en proteína en el ensayo libre de células.

Ejemplo 3 Conjugación de Tab 250 con preparación de gelonina de gelonina modificada con 2-IT

La gelonina en solución salina tamponada con fosfato se concentró hasta aproximadamente 10 mg/ml en un concentrador Centriprep 10. Se añadieron hidrocloruro de trietanolamina (TEA/HCl), pH 8,0, y EDTA hasta una concentración final de TEA/HCl 60 mM y EDTA 1 mM, pH 8,0. Una solución de reserva de 2-iminotiolano (500 mM en tampón de TEA/HCl 60 mM que contenía EDTA 1 mM, pH 8,0) se añadió hasta una concentración final de 1 mM y la muestra se incubó durante 90 min a 4ºC bajo una corriente de nitrógeno gaseoso con agitación. El iminotiolano en exceso se retiró mediante filtración en gel sobre una columna de Sephadex G-25 (1 x 24 cm) preequilibrada con tampón de fosfato-EDTA, pH 7,5, que contenía Na_{2}HPO_{4} 0,01 M, KH_{2}PO_{4} 0,0018 M, KCl 0,0034 M, EDTA 0,001 M y NaCl 0,17 M. Las fracciones se analizaron con respecto al contenido de proteínas en placas de microvaloración usando el ensayo Bio-Rad. La gelonina se eluía en el volumen de huecos (aproximadamente fracciones 21-23). Estas fracciones se reunieron y se almacenaron a 4ºC.

Ejemplo 4 Preparación de anticuerpos monoclonales

Ratones BALB/c fueron imunizados intraperitonealmente (i.p.) y subcutáneamente (s.c.) con 2 x 10^{6}-1 x 10^{7} células NIH3T3_{\tau} (células NIH373 transfectadas con c-erbB-2) emulsificadas 1:1 en adyuvante completo de Freund. Se les administraron a los animales dosis de refuerzo cada 2 a 4 semanas. Cuando se detectaban valoraciones positivas en un ELISA (descrito más adelante), se administró una dosis de refuerzo i.p. o intravenosa (i.v.) final 4 días antes de la fusión. Las células de bazo se fusionaron con células de mieloma P3-X63Ag8.653 mantenidas en RPMI 1640, FBS al 10% y L-glutamina 2 mM. Los sobrenadantes de hibridoma se probaron con respecto a la reactividad positiva en un ELISA (véase posteriormente), y la reactividad de los dominios extracelulares se determinó mediante inmunofluorescencia indirecta usando células NIH3T3 y NIH3T3_{\tau} no fijadas a 4ºC seguido por análisis citométrico de flujo. El anticuerpo monoclonal TAb 250 puede obtenerse de cualquier fuente. Lo más preferiblemente, el anticuerpo anti-c-erbB-2 usado en la presente invención es un anticuerpo humano o un anticuerpo murino.

Células de hibridoma que producen TAb 250 se hacen crecer en un biorreactor de perfusión continuo de 2 l. El sobrenadante celular del biorreactor se filtra y a continuación se hace pasar a través de un sistema Protein-G Trio seguido por cromatografía de intercambio iónico. El material se concentra a continuación y se filtra estérilmente. La prueba del producto final incluye pruebas para DNA total, pureza de proteínas, pH, (IEF), proteína total, endotoxina, potencia, identidad y antígeno de proteína G.

La presente invención, entre otras cosas, utiliza un anticuerpo quimérico, incluyendo un anticuerpo híbrido o un anticuerpo humanizado o similar a humano. En una realización preferida, la secuencia variable se origina a partir de y es sustancialmente idéntica a una secuencia del anticuerpo TAb 250 murino. Tal anticuerpo quimérico es BACh-250.

Ejemplo 5 Ensayo de ELISA

Placas de 96 pocillos estériles se pretrataron durante 2 horas a 37ºC con colágeno bovino a 1 mg/ml en PBS estéril. Células NIH3T3_{\tau} (células NIH353 transformadas con el vector) se hicieron crecer hasta 80% de la confluencia y se recogieron con Versene de Puck (0,02% de EDTA en PBS) caliente, se lavaron y se cultivaron en placas a 0,5-1 x 10^{6} células/ml en pocillos tratados durante la noche a 37ºC. Las placas se lavaron suavemente y se trataron con formalina tamponada neutra al 10% seguido por una etapa de bloqueo con albúmina de suero bovino BSA al 1%/PBS. Los sobrenadantes de muestra o las diluciones de anticuerpo se añadieron a continuación a las placas y se incubaron durante 2 horas a 37ºC seguido por la incubación con un anticuerpo secundario específico de Fc anti-(IgG de ratón) caprino conjugado a fosfatasa alcalina y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron con PBS, se añadieron fosfato de para-nitrofenilo y sustrato de dietanolamina y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y se midió la A_{405}. Los sobrenadantes o los anticuerpos que reaccionaban con las células transfectadas a una absorbancia de 0,1-1,0 mayor que la absorbancia para un anticuerpo de control negativo se consideraban
positivos.

Ejemplo 6 Preparación y manejo de ^{125}I-TAb 250

Se radiomarcó TAb 250 usando Iodobeads (Pierce) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Na^{125}I (400 \muCi de IMS 30, Amersham) libre de portador se hizo reaccionar con 25 \mug de TAb 250 en tampón de fosfato Na 100 mM (200 \mul, pH 7,4) en presencia de 3 Iodobeads. Esto daba como resultado una relación aproximada de un átomo de yodo por molécula de IgG. Se dejó que la incorporación avanzara a temperatura ambiente durante 7,5 minutos con mezcladura intermitente. La mezcla de reacción se retiró de las cuentas y, después de 5 minutos, el volumen se ajustó hasta 0,5 ml con tampón de fosfato Na y se tomaron 2 \mul para estimular la actividad específica (véase más adelante). El volumen restante se desaló mediante filtración en gel usando una columna NAP-5 (Pharmacia) equilibrada con PBS que contenía BSA al 0,1% y azida al 0,02%. El anticuerpo radiomarcado se eluyó en 1 ml de tampón de columna y se almacenó a 4ºC durante hasta seis semanas sin pérdida aparente de actividad de unión. El material desalado estaba esencialmente libre de yodo no incorporado ya que >95% era precipitable con TCA.

La actividad específica del anticuerpo radiomarcado se estimó mediante precipitación con TCA del material antes de la etapa de desalado. Así, 2 \mul de la mezcla de reacción se diluyeron 500 veces en tampón de columna y partes alícuotas duplicadas se mezclaron con un volumen igual de TCA al 20% enfriado con hielo. Después de 25 minutos sobre hielo el material precipitado se recogió mediante centrifugación (10 minutos, 3000 x g). Los sobrenadantes y los pelets se contaron separadamente y la incorporación se expresó como el porcentaje de conteos precipitables con TCA. La incorporación obtenido en yodaciones separadas variaba de 27% a 45%, dando estimaciones de la actividad específica de 3,9 a 7,2 \muCi/\mug. Antes de cada experimento de unión, una cantidad apropiada de ^{125}I-TAb 250 se desaló mediante filtración en gel usando una columna NAP-5 equilibrada en tampón de unión. Este procedimiento retiraba la azida y daba material que era habitualmente >98% precipitable con TCA.

Ejemplo 7 Cultivo celular

Se usaron las líneas celulares de adenocarcinoma de mama humano SKBR-3, MDA-MB-453 y MDA-MB-231 y la línea celular de adenocarcinoma ovárico humano SKOV-3. Las células SKBR-3, MDA-MB-231 y MDA-MB-453 se mantuvieron en medio esencial mínimo complementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM. El medio para las células MDA-MB-453 también contenía 1% de aminoácido no esencial y 1% de vitaminas. Las células SKOV-3 se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Iscove complementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM. Todos los cultivos se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5 ó 10% según se requiriera.

Ejemplo 8 Internalización de ^{125}I-TAb 250

La internalización de ^{125}I-TAb 250 se ensayó determinando la cantidad de radiactividad en compartimentos sensibles e insensibles al ácido. Las células se recogieron y se resuspendieron en tampón de unión enfriado con hielo con ^{125}I-TAB 250 solo (de 6 ng/ml a 153 ng/ml) o con TAb 250 no marcado en exceso para determinar la unión no específica. Después de que la unión en la superficie celular del anticuerpo radiomarcado alcanzara el equilibrio, las células se formaron como pelets a 200 x g durante 5 minutos a 4ºC y se lavaron 3 veces con tampón de unión enfriado con hielo para retirar anticuerpo no unido. Los pelets celulares se resuspendieron en medio de unión enfriado con hielo y se tomaron partes alícuotas para determinar la cantidad de unión superficial de ^{125}I-TAb 250 inicial. Para iniciar la internalización del anticuerpo radiomarcado, las células se calentaron hasta 37ºC. En los momentos de 15 a 150 minutos, se retiraron partes alícuotas y las células se recogieron mediante centrifugación (1400 x g 4 minutos, 4ºC). Los sobrenadantes que contenían anticuerpo disociado o reciclado se recogieron. Los pelets se resuspendieron 2 veces en un lavado ácido (100 \mul/tubo de PBS, glucosa al 1%, pH 1). Los sobrenadantes que contenían el anticuerpo unido superficialmente se combinaron y se contaron. Los extremos de los tubos que contenían la radiactividad asociada a células restante se cortaron y se contaron.

La Figura 6 ilustra que el anticuerpo monoclonal TAb 250 no se internaliza en células MDA-MB-231 (cuadro B). En contraste, las células SKBR-3 internalizaban el anticuerpo TAb 250 lo más eficazmente (cuadro A) mientras que la internalización del anticuerpo en células SKOV-3 y células MDA-MB-453 era intermedia (cuadros C y D), respectivamente.

Ejemplo 9 Modificación del anticuerpo monoclonal TAb 250 con SPDP

Se preparó 3-(2-piridilditio)(propionato) de N-succinimidilo (SPDP) en dimetilformamida como una solución de reserva de 3 mg/ml en dimetilformamida seca. Puesto que el SPDP cristalino puede sufrir hidrólisis, la concentración real de reticulador químicamente reactivo se determinó mediante métodos espectrofotométricos al analizar la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro de doble haz. La concentración de reserva de SPDP se calcula a partir de la siguiente ecuación

\frac{\text{Cambio en la absorbancia (260 nm);0}}{\text{02 x 103 ml/milimol}} \ x \ \frac{301;0}{01} = milimoles/ml/SPDP

Un miligramo de anticuerpo monoclonal TAb 250 en 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) se añadió a un tubo de vidrio. Se añadió lentamente solución de reserva de SPDP en aproximadamente un exceso molar de 5 veces al tubo (aproximadamente 10 \mul de solución de reserva), mezclando constantemente. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, mezclando cada 5 minutos durante el período de incubación.

El SPDP sin reaccionar en exceso se retiró de la muestra mediante cromatografía de filtración en gel sobre una columna Sephadex G-25 (1 x 24 cm) preequilibrada con tampón de fosfato sódico 100 mM, pH 7,0, que contenía EDTA 0,5 mM (Tampón A). Las fracciones (0,5 ml) se recogieron y se analizaron con respecto al contenido de proteína usando el ensayo de unión de colorante de Bradford (Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)). La absorbancia (600 nm) se controló en una placa de 96 pocillos usando un autolector de microplaca Bio-TEK. El anticuerpo se eluía en el volumen de huecos (fracciones 14-20) y estas fracciones se reunieron y se mantuvieron a 4ºC. La proteína se concentró en un microconcentrador Centricon-30. El retenido del Centricon se lavó con tampón de fosfato sódico 100 mM, pH 7,0, que contenía EDTA (0,5 mM). El anticuerpo se concentró hasta un volumen final de aproximadamente 0,5-0,75 ml.

Ejemplo 10 Conjugación de anticuerpo monoclonal TAb 250 modificado con SPDP con gelonina modificada con iminotiolato concentración de gelonina modificada con 2-IT y TAb 250

Se prepara TAb 250-gelonina conectado con SMTP al acoplar gelonina modificada con 2-IT con anticuerpo monoclonal TAb 250 modificado con SMPT. Brevemente, para modificar TAb 250 con SMTP, 10 mg de anticuerpo en 1,0 ml de PBS se diluyen 1:1 con 2 x tampón de borato (borato sódico 0,05 M, cloruro sódico al 1,7%, pH 9,0) y 52 \mul de SMPT 4 mM en DMF seca se añaden lentamente a la solución de anticuerpo. La reacción se incuba a temperatura ambiente durante 2 h con agitación bajo N_{2}. El SMPT en exceso se retira al hacer pasar la mezcla de reacción a través de una columna Sephadex G-25 que contiene tampón de fosfato-EDTA, pH 7,5, y las fracciones positivas al anticuerpo se evalúan mediante el ensayo Bio-Rad. Las fracciones se reúnen y se almacenan a 4ºC bajo N_{2}. La reticulación con 2-IT se lleva a cabo a 27ºC bajo N_{2} con agitación durante 96 h. El producto final se purifica como se describe para SPDP en el Ejemplo 9.

Un miligramo de gelonina purificada (2 mg/ml en PBS) preparada como se describe en el Ejemplo 1 se modificó con iminotiolano según se describe en el Ejemplo 3. Anticuerpo monoclonal TAb 250 modificado como se describe en el Ejemplo 9 se mezcló con un peso igual de la gelonina modificada. Esta proporción correspondía a un exceso molar de 5 veces de gelonina en comparación con el anticuerpo. El pH de la mezcla se ajustó hasta 7,0 mediante la adición de tampón de TEA/HCl 0,05 M, pH 8,0, y la mezcla se incubó durante 20 horas a 4ºC bajo nitrógeno. Se añadió yodoacetamida (0,1 M) hasta una concentración de 2 mM para bloquear cualesquiera grupos sulfhidrilo libres restantes y la incubación se continuó durante 1 hora adicional a aproximadamente 25ºC. La mezcla de reacción se almacenó a 4ºC hasta la purificación mediante filtración en gel.

Ejemplo 11 Purificación de complejos de gelonina-anticuerpo monoclonal TAb 250

La gelonina no conjugada y los productos de bajo peso molecular se retiraron de las mezclas de reacción del Ejemplo 10 mediante filtración en gel sobre una columna Sephadex S-300 (1,6 x 31 cm) preequilibrada con PBS.

Las mezclas de reacción del Ejemplo 10 se concentraron hasta aproximadamente 1 ml con un microconcentrador Centricon 30 antes de cargar en la columna Sephadex. La columna se lavó con PBS. Se recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron partes alícuotas de 50 \mul con respecto a la proteína mediante el ensayo de Bradford.

El anticuerpo no conjugado se retiró del anticuerpo conjugado con gelonina mediante cromatografía de actividad sobre una columna (1 x 24 cm) de Blue Sepharose CL-6B preequilibrada con tampón de fosfato 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 0,1 M. Después de cargar la muestra de eluato S-300, la columna se lavó con 30 ml del mismo tampón para eluir completamente anticuerpo no conjugado.

El anticuerpo conjugado a gelonina se unió a la columna y se eluyó con un gradiente salino lineal de NaCl 0,2 a 2 M en tampón de fosfato 10 mM, pH 7,2. El complejo de anticuerpo-gelonina se eluyó a aproximadamente NaCl 0,7 M. El contenido de proteína de las fracciones eluidas se determinó mediante el ensayo de Bradford. Las fracciones que contenían proteína se reunieron y el patrón de elución se confirmó mediante electroforesis sobre un gradiente de 5 a 20% de gel de poliacrilamida no reductor. El pico de flujo pasante (fracciones 14-20) contiene sólo anticuerpo libre mientras que las fracciones 50-80, eluidas con alto contenido de sal, contienen conjugado de TAb 250-gelonina libre de gelonina o anticuerpo no conjugados. El producto final contenía anticuerpo TAb 250 acoplado a 1, 2 y 3 moléculas de gelonina. El contenido medio de gelonina era 1,5 moléculas por molécula de anticuerpo. El reticulocito de conejo en el sistema de traducción in vitro se utilizó para estimar la actividad de gelonina del complejo de gelonina-anticuerpo TAb 250 esencialmente puro. Una unidad de actividad de este ensayo se definió como la cantidad de proteína requerida para proporcionar 50% de inhibición de la síntesis de proteína en comparación con controles no tratados. Utilizando este ensayo, se determinó que la actividad específica tanto de la gelonina natural como del conjugado de TAb 250-gelonina era 2 x 10^{8} U/mg y 8,2 x 10^{5} U/mg, respectivamente. El complejo de gelonina-anticuerpo TAb 250 esencialmente puro es activo en el ensayo de lisado de reticulocitos. Una dilución 1:1000 de la muestra original provocaba aproximadamente una dilución de 50% de la síntesis de proteína, es decir una reducción de 50% de la incorporación de [^{14}C]-leucina en la proteína. Así, la actividad de la preparación original era 1000 U/ml.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir construcciones de fusión del anticuerpo monoclonal TAb 250 y un resto citotóxico. Las construcciones de fusión de la imunotoxina de la presente invención pueden prepararse, por ejemplo, mediante el siguiente método. La secuencia nucleotídica de las regiones V de la cadena tanto H como L de TAb 250 se determina fácilmente. Por ejemplo, el RNA total se extrae de células que producen TAb 250 con tiocianato de guanidinio. RNA de poli A+ puede aislarse mediante cromatografía con oligo-(dT)-celulosa. Los genes apropiados pueden aislarse usando técnicas estándar, incluyendo técnicas de transcripción inversa y PCR. Una hebra de cDNA puede sintetizarse a partir de mRNA aislado usando un cebador de oligo-dT y transcriptasa inversa. Tal hebra de cDNA puede amplificarse usando técnicas de PCR estándar con cebadores apropiados. Un cebador cercano a la cola de poli-A del mensajero puede basarse en la secuencia de poli-A o en secuencias adyacentes comunes encontradas en inmunoglobulinas de ratón. Véase Devereaux, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center y sus bases de datos de secuencias asociadas. Un cebador en el otro extremo del gen puede seleccionarse de secuencias comunes encontradas en inmunoglobulinas de ratón. Véase Orlandi y otros (1989) PNAS 86:3833-3837 y Larrick y otros (1989) Bio/Technology 7:934-938. El gen de la cadena pesada de TAb 250 tiene una secuencia aguas arriba 5' de ATATAG CAGGAC CATATG y empieza codificando con ATGAA CTTGG GGCTC. El gen de la cadena ligera de TAb 250 tiene una secuencia aguas arriba 5' TTTAC TTCCT TATTT y empieza codificando con ATGGG CATCA AGATG. Estos cebadores pueden usarse para amplificar los genes mediante tecnología de PCK y clonarse en vectores de expresión plasmídicos.

Transfección de DNA en células de ratón mediante electroporación

Métodos de transfección estándar pueden aplicarse a estos genes. Por ejemplo, puede introducirse DNA en células Sp2/0-AG14 de hibridoma murino mediante electroporación. Se lavan 1-2 x 10^{3} células SP2/0-AG14 que crecen activamente y se resuspenden en 1,0 ml de PBS estéril. Se añaden treinta microgramos de cada plásmido quimérico, IgK e IgG1, a la suspensión celular. El DNA/las células se transfieren a una cubeta de choque preenfriada, se incuban sobre hielo al menos 5 minutos y a continuación se aporta un electroimpulso de 0,5 kv/cm durante 10 ms (Transfector 300, BTX). Después del choque, la mezcla de DNA/células se devuelve a hielo durante 10 minutos, se diluye en 10 ml de DMEM que contiene NCTC-109 al 5% y FCS al 10% y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente, las células se transfieren a una incubadora a 37ºC con CO_{2} al 7% durante 48 horas antes de cultivar en placas en medio selectivo, que contiene 1 \mug/ml de xantina. Las células pueden cultivarse en placa en placas de 96 pocillos a 3 x 10^{4} células/pocillo y los sobrenadantes de cultivo ensayarse mediante ELISA con respecto al anticuerpo unido a células diana positivas a antígeno TAb 250.

Ejemplo 12 Ensayo con MTT

Se llevaron a cabo ensayos con bromuro de 3-(4,5-dimetil/tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) al retirar células de matraces de cultivo tisular con Versene 1:5000, centrifugar a 500 x g durante cinco minutos y resuspender las células en medio en una concentración de 1 x 10^{5} células/ml. Las células se cultivaron en placa a 100 \mul/pocillo en placas de microvaloración de 96 pocillos y se incubaron en una incubadora de CO_{2} humidificada a 37ºC durante 24 horas.

Al día siguiente, se añadió TAb 250 o TAb-250-gelonina. Inmediatamente después de la deposición de la concentración de anticuerpo más alta en la primera columna de pocillos, se realizaron directamente diluciones 1:1 de anticuerpo en las placas de microvaloración usando una pipeta de varios canales. Las placas se incubaron a continuación durante 3 días, seguido por la adición de 10 \mul/pocillo de MTT. El MTT se preparó como una solución de 5 mg/ml de PBS, se filtró, se esterilizó y se almacenó a 4ºC en la oscuridad. Las placas se mantuvieron en la oscuridad y se incubaron durante 4 horas adicionales a 37ºC. Los cristales de MTT se disolvieron al mezclar los contenidos de los pocillos vigorosamente con 100 microlitros de isopropanol que contenían HCl 0,04 N y dodecilsulfato sódico al 3%. Las absorbancias a 570 nm se determinaron usando un lector para ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA).

Ejemplo 13 CPA

El ensayo de proliferación celular (CPA) mide el crecimiento celular mediante la determinación del número y la viabilidad de las células. El Día 0, células a 80-90% de confluencia se liberan de un matraz de cultivo tisular, se forman como pelets a 200 x g a 20ºC durante 6 minutos y se resuspenden en MEM de Iscove que contiene glutamina 2 mM y suero bovino fetal al 10% hasta una concentración de 6000 células/ml. La suspensión de células se añade a placas de 24 pocillos a 1 ml por pocillo. Las placas se incuban a 37ºC, CO_{2} al 5%, durante 24 horas. El día 1, las células de tres pocillos se lavan con PBS y se liberan de la placa con 1 ml de tripsina al 0,05% en PBS y se cuentan 500 \mul usando un contador Coulter. Se añaden a los restantes pocillos 20 \mul de PBS, TAb 250 o TAb 250-gelonina, a las concentraciones indicadas en las figuras. Las placas se devuelven a la incubadora. En los puntos temporales indicados en las figuras, las células se liberan con tripsina y se cuentan como el Día 1. Los restantes 500 \mul de células se tiñen con yoduro de propidio de modo que la viabilidad puede determinarse mediante citometría de flujo. Para cada punto de la gráfica, se determina un número de células medio (n = 3) y se multiplica por el porcentaje de células vivas para encontrar el número de células viables. Este se divide por el número de células vivas tratadas con PBS para el porcentaje de control sobre el eje Y.

Ejemplo 14 Citotoxicidad de gelonina y complejo de gelonina-anticuerpo TAb 250

Como puede observarse en la Figura 1, el anticuerpo ZME virtualmente no tenía efecto sobre células SKOV-3. En contraste, el inmunoconjugado de TAb 250-gelonina era altamente activo.

La Figura 2 ilustra una citotoxicidad del inmunoconjugado de TAb 250-gelonina sobre células SKOV-3 en comparación con gelonina sola. A la misma concentración, el inmunoconjugado de TAb 250-gelonina era aproximadamente 10.000 veces más citotóxico que la gelonina sola.

La Figura 3 demuestra que un anticuerpo irrelevante, anticuerpo monoclonal ZME 18, no tiene efecto competitivo sobre la citotoxicidad del inmunoconjugado de TAb 250-gelonina. En contraste, incrementar la concentración de anticuerpo monoclonal TAb 250 disminuye la citotoxicidad del inmunoconjugado de un modo dependiente de la dosis.

La Figura 4 ilustra una relación de dosis-respuesta del inmunoconjugado de TAb 250-gelonina sobre células SKOV-3. Como se observa en el ensayo CPA, una dosis por encima de 0,1 microgramos/ml producía 80% de inhibición en seis días.

La Figura 5 ilustra los efectos del anticuerpo monoclonal TAb 250 solo o el conjugado de TAb 250 con gelonina sobre células SKOV-3. Como puede observarse, existe una inhibición dependiente de la dosis por el inmunoconjugado de TAb 250-gelonina en el ensayo CPA.

La Figura 7 representa los efectos del inmunoconjugado de TAb 250-gelonina sobre cuatro líneas celulares diferentes. Como podría esperarse, la mayor cantidad de toxicidad se producía en la línea celular SKOV-3. Una toxicidad intermedia se evidenciaba en células SKOV-3 y MDA-MB-453 mientras que virtualmente no se observaba citotoxicidad en células MDA-MB-231. Así, la citotoxicidad del inmunoconjugado de TAb 250-gelonina se correlaciona con el número de receptores de la superficie celular en estas células.

Por lo tanto, en conclusión, se observa que la presente invención y las realizaciones descritas aquí están bien adaptadas para llevar a cabo los objetivos de obtener los fines indicados al comienzo.

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1

Claims (25)

1. Una composición que comprende un conjugado de una proteína que exhibe especificidad de unión para un dominio antigénico para proteína c-erbB-2 y una toxina derivada de planta, en la que dicha toxina se selecciona del grupo que consiste en gelonina y gelonina recombinante de longitud completa.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha especificidad de unión es para un epítopo extracelular de c-erbB-2.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha proteína se deriva de un segmento V_{H} de un anticuerpo.

4. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína comprende una cadena pesada de inmunoglobulina intacta.

5. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína se deriva de un segmento V_{L} de un anticuerpo.

6. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína comprende una cadena ligera de inmunoglobulina intacta.

7. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína comprende además una cadena pesada de inmunoglobulina intacta.

8. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que dicha proteína es de un anticuerpo monocatenario.

9. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que dicha proteína es de TAb 250 (Nº de Registro del ATCC HB 10646) o BACh-250 (TAb 250 humanizado).

10. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que dicha toxina derivada de planta tiene un efecto celular muy inferior cuando no está conjugada a dicho resto de orientación.

11. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que dicha toxina se selecciona del grupo que consiste en toxina natural y toxina recombinante.

12. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que dicho conjugado es una proteína de fusión entre dicho resto de orientación y dicha toxina derivada de planta.

13. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un producto farmacéutico que comprende una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.

15. Uso de una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una célula neoplásica.

16. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la sobreexpresión de proteína c-erbB-2.

17. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de células neoplásicas, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una célula de carcinoma mamario, una célula de carcinoma ovárico, una célula de carcinoma pulmonar, una célula de carcinoma de las glándulas salivares, una célula de tumor gástrico, una célula de adenocarcinoma de colon y una célula de leucemia de la médula ósea.

18. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para retardar la velocidad de crecimiento de células neoplásicas.

19. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de células neoplásicas de ser humano o animal.

20. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para la prevención de la recurrencia de un estado neoplásico.

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21. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para prolongar el tiempo de supervivencia de un huésped de dicha célula neoplásica.

22. Un método in vitro para tratar una célula neoplásica, comprendiendo el método administrar a las células una dosis eficaz de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicha célula neoplásica es una célula de la médula ósea.

24. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para destruir células neoplásicas en la médula ósea.

25. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 24, en el que las células de la médula ósea sobreexpresan proteína c-erbB-2.