JPH07505882A - 表面抗原に関連したｃ‐ｅｒｂＢ‐２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）に対する免疫毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　表面抗原に関連したＣ−ＢｒｂＢ−２（ｌ（ＥＲ−２／ｎｅｕ）に 対する免疫毒素 且里五丑盈 茜里り公団 本発明は一般的には腫瘍性疾患の措置の分野に関するものである。より具体的に は、本発明は新しい免疫接合体および腫瘍性疾患の措置に使用する方法に関する ものである。

先行技術の説明 西側社会においては、腫瘍性疾患は人の死および罹病の主要な原因のひとつであ る。腫瘍状態、例えば、疾患あるいは「ガン」は少なくともそのひとつの特性、 つまり、細胞成長抑制プロセスにおける欠陥を有している。

正常な細胞が悪性細胞に変わるプロセスはここ数十年、集中的な研究の対象とな っている。より最近、ガン・プロセスにおける腫瘍遺伝子の役割に、研究の焦点 が絞られてきている。腫瘍遺伝子は真核細胞を腫瘍細胞と似た形で成長するよう に変質させてし、よう能力を有する遺伝子である。

腫瘍遺伝子は、正常な遺伝子、または原・腫瘍遺伝子が突然変異し、再構成され 、あるいは増幅された場合につくられる。こうした腫瘍遺伝子のひとつはｃ　− ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ　）原・腫瘍遺伝子である。以後、この腫瘍 遺伝子はｃ　−ｅｒｂＢ−２と呼ぶ。この遺伝子は表皮成長因子受容体と類似し た蛋白質をコード表現する。この原・腫瘍遺伝子の増幅は、不規制細胞の成長に より一連の細胞状態をもたらす。

抗体は、通常、外来抗原または抗原性決定子に反応して、動物の免疫システムに よってつくりだされる蛋白質である。

抗体はそれに対して向けられている特定の抗原と結合する。

特殊なモノクローナル抗体の開発は研究者に対して、定義された抗原を過剰に表 現する細胞に治療剤を選択的に向けさせることができる手段を提供する。

腫瘍形成性形質変換におけるｃ−ｅｒｂＢ−２原・真核細胞の過剰表現の問題が 研究の対象となっている。いくつかの乳房悪性腫瘍およびいくつかの卵巣悪性腫 瘍などを含むいくつかのタイプのヒトの癌も増幅されたｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子 を有している。さらに、ｃ−ｅｒｂＢ−２の増幅と、それに続く過剰表現が疾病 詮所と関連づけられている。したがって、ｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子の過剰表 現を示す細胞に化学的治療剤を選択的に向かわせて、その蛋白質を過剰表現する 細胞の成長を調節するための方法に関する強いニーズと要望が存在している。本 発明はこうした目的を達成するための手段を提供するものである。

又ユ久ｌ豊 本発明は、たとえば抗原結合領域など、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に対しての結合 特性を示す細胞標的部分と、毒素あるいは成長抑制剤など、細胞成長調節剤との 接合体で構成される新しい組成物を提供する。こうした組成物は細胞成長調節剤 をＣ−ｅｒｂＢ−２蛋白質を過剰に表現している腫瘍細胞に選択的に向かわせる 免疫毒素として作用することができる。

したがって、本発明のひとつの実施例において、ＴＡｂ　２５０モノクローナル 抗体など、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に対しての結合特性を有する標的部分と細胞 毒性部分との接合体で構成されている物質の新しい組成物が提供される。この細 胞毒性部分は毒素、細胞致死剤、あるいは生物学的反応修飾子などである。ひと つの特殊な実施例において、細胞毒性部分はゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）である 。

本発明によるもうひとつの実施例は、腫瘍状態、例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍 遺伝子の増幅、あるいは過剰表現によって特徴づけられる疾患などを処理するた めの、そうした措置を必要とする個人に対して、本発明による免疫毒素を細胞を 殺すのに必要な量だけ投与するステップで構成される方法を提供する。

別の実施例は、イン・ビトロで腫瘍細胞を殺し、その後、ホストに再導入する方 法を提供する。例えば、骨髄の悪性腫瘍性状態の措置においては、腫瘍性疾患を 有する個人から骨髄を取り出し、本発明による組成物で処理する。

本発明のさらに別の実施例においては、腫瘍性疾患の再発を阻止する方法が提供 される。再発は、目標の毒素例えば、ＴＡｂ　２５０抗体−ゲロニンなどの免疫 毒素を細胞を殺すのに有効な量だけ投与することによって阻止される。

本発明のさらに別の実施例において、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に対する結合親和 性を有する標的部分と細胞毒性部分との溶融構造で構成されている組成物を提供 する。好ましくは、この標的部分は、ｃ−ｅｒｂＢ−２、例えばＴＡｂ　２５０ の細胞外エピトープを識別する抗体であり、そして、細胞毒性部分は、ゲロニン などの標的部分とは別個に適用されると、比較的不活性である。本発明の他の実 施例において、本発明による標的毒素を哺乳動物に投与することによって、腫瘍 を持っているその哺乳動物の生き残り時間を延長する方法、および本発明による 標的毒素を投与することによって腫瘍の成長速度を遅らせる方法が提供されてい る。通常、標的毒素は、抗体結合分節（ｓｅｇｍｅｎｔ）など、免疫性結合領域 によって標的とされる。

さらに、基本的にはモノクローナル抗体に接合された細胞毒性部分によって構成 される免疫毒素をよむ医薬品組成物が提供されている。もっとも好ましいくは、 この抗体はＴＡｂ　２５０であり、細胞毒性部分はゲロニンである。

］　の　１゛−な１１ 図１は、Ｅｌ、ＩＳＡで測定された、ＺＭＥ抗体、ＴＡｂ　２５０抗体またはＴ Ａｂ　２５０とゲロニンの接合体の、５ＫＯＶ−３細胞に対する影響を示してい る。

図２は、ＴＡｂ　２５０ゲロニン構造の５ＫＯＶ−３細胞上での細胞毒性を示し ている。

図３は、５ＫＯＶ−３細胞上での適切な抗体と不適切な抗体との上記接合体との 競合を示している。

図４は、ＴＡｂ　２５０−ゲロニンの容量応答関係および５ＫＯＶ−３細胞に対 する影響を示している。

図５は、ＴＡｂ　２５０オヨびＴＡｂ　２５０−ゲロニン接合体（７）ＳＫＯＶ −３細胞に対する細胞毒性を示している。

図６は、種々の細胞株に内部化するＴＡｂ　２５０抗体の能力を示している。

図７は、ＭＴＴアッセイにおけるＴＡｂ　２５０−ゲロニン免疫接合体の細胞毒 性を示している。

且里二韮鳳皇五里 ここで使われている細胞標的部分は、細胞上、通常はその表面に表現されている ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に選択的に結合する。

これは、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に特に結合するリガンドと、抗原語領域、例え ば、完全な抗体、あるいはそのエピトープ結合フラグメントに結合するリガンド の両方を含んでいる。これには固定的な抗体分子、キメラバージョン、単鎖、お よびエピトープ結合性およびアフィニティを保持する修飾抗体フラグメントの両 方を含んでいる。

ここで使われている「免疫グロブリン」あるいは「抗体ペプチド」とは、免疫グ ロブリンあるいは抗体全体、または免疫グロブリン分子の機能的結合フラグメン トを意味している。こうしたペプチドの例としては、完全な抗体分子、Ｆａｂ　 。

Ｆ　（ａｂ’　Ｌ　、　ＣＤＲ５，ＶＬ　、　ＶＨおよびひとつの抗体のいずれ がの他の部分、特に抗原結合特性またはアフィニティを示すものを含んでいる。

例えば、ＴｇＧ抗体分子は、それぞれ２つの重鎮に対するジスルフィド結合によ って結合された２つの軽鎖によって構成されている。これら２つの重鎮自体は、 その抗体のヒンジ領域として知られている領域でジスルフィド結合によって相互 に結合されている。単一のＩｇＧ分子は通常、１５０−１６０ＫＤ程度の分子量 を有しており、２つの抗原結合部位を有している。これらの分子のフラグメント 、たとえば、重鎮、あるいは軽鎖だけでも、場合によって抗原と結合する場合が ある。抗体、抗体のフラグメント、および個々の鎖は機能的に免疫グロブリンと 同等である場合がある。

通常の抗体の重鎮、または軽鎖はＮ−末端（ＮＨ□）可変（Ｖ）領域、およびＣ −末端（−ＣＯＯＨ）不変（Ｃ）領域を有している。重鎮可変領域はＶＨ（例え ば、■アを含む）と称され、軽鎖可変領域はＶＬ　（’Ｖにまたは■λを含む） と称される。これら可変領域は抗体の同族抗原に結合する分子の一部であり、Ｆ ｃ領域（Ｃ領域の第二および第三ドメイン）はその抗体のエフェクター機能（例 えば、補体固定、オプソニン化）を決定する。完全な長さの免疫グロブリン、あ るいは抗体の「軽鎖」（通常、約２５Ｋｄ、約２１４個のアミノ酸）は、Ｎ−末 端（通常約１１０個のアミノ酸で構成される）の可変領域遺伝子、およびＣ００ Ｈ−末端のに（カッパー）またはλ（ラムダ）不変領域遺伝子によってコード表 現される。完全な長さの免疫グロブリンまたは抗体「重鎮」　（通常は約５０Ｋ ｄ、約４４６個のアミノ酸で構成される）も、同様に、可変領域遺伝子（通常、 約１１６個のアミノ酸をコード表現する）および、不変領域遺伝子のひとつ、た とえば、ガンマ（３３０個程度のアミノ酸をコード表現する）によってコード表 現される。通常、ｒ　Ｖ、、　ＪはＶＬおよび／またはＪＬ　（Ｊまたは結合領 域）遺伝子部分によってコード表現される軽鎖の部分を含み、ｒ　ＶＨＪはＶＨ および／またはＤＨ（Ｄあるいは多様性領域）およびＪＨ遺伝子部分によってコ ード表現される重鎮の部分を含んでいる。基本的には、引用により本文に組み入 れているＲｏｉｔｔ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｍｎｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｃｈａｐｔｅｒ　６　（２ｄ　ｅｄ、　１９８９）と 、Ｐａｕｌ、　ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｒａｖｅｎ　 Ｐｒｅｓｓ　（２ｄ　ｅｄ、　１９８９）参照。

免疫グロブリンの軽鎖または重鎮可変領域は、補足性決定領域またはＣＤＲとも 呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域によって 構成されている。このフレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている （引用によって本文に組み入れている’５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉ ｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、″　Ｅ、Ｋａｂａ ｔ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｒＨｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕ＋ｕａｎ　 ５ｅｒｖｉｃｅｓ、　（１９８７）参照）。異なった軽鎖あるいは重鎮のフレー ムワーク領域の配列は種の内部で比較的よく保存されている。構成軽鎖および重 鎮の結合フレームワーク領域である、ひとつの抗体のフレームワーク領域はＣＩ ）Ｒを三次元空間に位置付け、揃えるのに寄与している。これらのＣＤＲは抗原 のエピトープへの結合に基本的に関与している。これらのＣＨＤは、通常、ＣＤ Ｒ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ−末端から順々に番号が付されてい る。

２つのタイプの軽鎖におよびλはアイソタイプと呼ばれる。

アイソタイプの決定因子は通常、一般にＣ１１、Ｃにまたは特にＣλとも呼ばれ る軽鎖の不変領域に存在している。ＣＨとも呼ばれる重鎮分子の不変領域はその 抗体のアイソタイプを決定する。抗体は重鎮のアイソタイプに基づいて、ＩｇＭ 、　ＩｇＤ。

ＩｇＧ、　ＩｇＡおよびＩｇＥに分類される。これらのアイソタイプはそれぞれ 、重鎮不変領域のミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α） およびイプシロン（ε）部分においてコード表現される。さらに、多数のγサブ タイプが存在する。

重鎮アイソタイプはオプソニン化や補体固定など、抗体の種々のエフェクター機 能を決定する。加えて、重鎮アイソタイプはその抗体の分泌形態である。分泌さ れたＩｇＧ、　ＩｇＤおよびＩｇＥアイソタイプは、通常、単一ユニットまたは 単量体形態で見いだされる。分泌された１ｇＭアイソタイプは五量体形態で、そ して、分泌されたＩｇＡは単量体および二量体形態で見いたされる場合がある。

Ｆ　（ａｂ’　）、フラグメントは重鎖不変領域のＣ−末端部分を欠いており、 そして、通常、ｌｌ０ＫＤ程度の分子量を有している。

それは二つの抗原結部位およびヒンジ領域の銀量ジスルフィド結合を保持してい るが、完全なＩｇＧ分子のエフェクター機能は有していない。Ｆ　（ａｂ’　） 、フラグメントは、ＩｌａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、　１ｎｆｒａに述べられて いるような標準的な方法を用いて、ｐＨ３，０−３，５でペプシンによる蛋白質 分解消化によってＩｇＧ分子から得ることもできる。

ｒ　Ｆａｂ　Ｊフラグメントはジスルフィド結合によって結合された軽鎖および 重鎖のＮ−末端部分とによって構成されている。それは通常、５０ｋＤ程度の分 子量を有しており、単一抗原結合部位を含んでいる。Ｆａｂフラグメントは限定 還元によってＦ　（ａｂ’　）、フラグメントから、あるいは還元剤の存在下で パパインによる消化によって抗体全体から得ることができる（ｔｌａｒｌｏｗお よびＬａｎｅ、　１ｎｆｒａ参照）。ある種のケースでは、大気中の酸素の存在 の下でパパインの活性を維持するのに必要な還元剤の濃度は、抗体に対する銀量 結合を完全に還元するのに十分である。これは抗原認識能力の喪失をもたらす場 合がある。こうした問題を回避するためには、パパインを活性化し、そして、抗 原結合活性を維持できる程度の濃度の抗原を含んだバッファーに交換する方法が ある。抗体の消化は通常、パパインの非活性化を防ぐために、不活性雰囲気ガス の存在下で行われる。以下の手順はこのプロセスの一例である。

Ａ）パパインの活性化：　１０ｍｇ／ｍｌ　ＮＨ，Ｓｏ、懸濁液の形態で提供さ れるパパインを、最終濃度が２　ｍｇ／ｍｌとなるように、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ 、　２０ｍＭシスティン、　ｐｉ（＝８．０に溶解する。この溶液からガスを抜 き、窒素の存在下、室温で２時間培養する。

Ｂ）活性化されたパパインは２０ｍＭ　ＮａＰＯ４，ｐｆ（＝７．０．１５０ｍ ＭＮａＣ］、、　］ＯｍＭ　ＮａＣ１，ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ、　３０μＭ　ＤＴ Ｔに内部に入れられる。

Ｃ）　抗体の消化：抗体］００ｍｇ毎に１ｍｇの活性化パパインを加え、その溶 液を大過剰の２０ｍＭ　ＮａＰＯ，、ｐＨ＝７．０．　＋５０ｍＭ　ＮａＣ］、 　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　３０μＭ　ＤＴＴで、継続的にヘリウム・スパーンン グを行いながら透析を行う。透析は、消化の過程での還元剤のモル過剰を維持す るために行われる。

Ｄ）　室温で２−４時間放置した後、ヨードアセトアミドを加えて消化を終わら せる。

Ｅ）　標準的なりロフトグラフィー法を用いて、未消化あるいは部分的に消化さ れた抗体からＦａｂフラグメントを分離する。

ここで用いられているｒ　Ｆａｂ　Ｊあるいはいずれかの他の抗体フラグメント という用語は、本発明の場合、「抗体」あるいは「免疫グロブリン」におけると の同様の分類を持っている。したがって、　「哺乳類Ｊ　Ｆａｂ蛋白質、「キメ ラ性Ｆａｂ　Ｊなとは、一般の使用法における対応する定義と同じような意味で 、さらに以下の諸項において規定されているような意味で用いられている。

ここで用いられている「キメラ性抗体」または「キメラ性ペプチド」とは、ペプ チドの一部が最初の遺伝子ソースから誘導される抗体あるいはペプチド内の対応 する配列から誘導される、その配列とあるいは構造的に一致しているアミノ酸配 列を有しており、その鎖の残りの部分が他の遺伝子ソースと構造的に一致してい る抗体あるいは抗体ペプチドのことを指している。例えば、キメラ性重鎖抗体ペ プチドはネズミの可変領域とヒトの不変領域とによって構成することができる。

これら２つの遺伝子ソースは通常２つの別個の種であるが、場合によっては、ひ とつの種である場合もある。

キメラ性抗体あるいはペプチドは通常は、分子および／または細胞組み替え技術 を用いてつくられる。多くの例で、キメラ性抗体はひとつの哺乳動物種から得ら れた抗体の可変領域と同様の挙動を示す軽鎖および重鎖両方の可変領域を有して おり、不変および／またはフレームワーク部分は第二の、異なった哺乳動物種か ら得られる抗体内の配列と構造が同じである。

しかしながら、ここで使われているキメラ性抗体の定義は上の例に限定されるも のではない。キメラ性抗体とは、その軽鎖および重鎮のいずれか一方、または両 方が、抗体のソースが異なったクラスのものであるか、異なった抗体反応を示す か、あるいは別の起源の種であるかどうかには関係なく、さらに、融点が可変境 界と不変境界のいずれにあるかには関係なく、種々のソースからの抗体内の配列 を模倣する配列の組み合わせで構成されている。例えば、キメラ性抗体はそのフ レームワークおよびＣＤＲが異なったソースからのものである抗体を含む場合が ある。例えば、非ヒトＣＤＲが「ヒト化抗体」をつくるために、ヒトの不変領域 に結合されたヒトのフレームワーク領域に一体化される。例えば、ＰＣＴ出願公 開ＮｃＬＷ０８７１０２６７１、米国特許第４，８１６，５６７、ヨーロッパ特 許出願０１７３４９４、　、Ｊｏｎｅｓ、６ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２１ 　：　５２２−５２５　（１９８６）　、およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ、　ｅｔ　 ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９　：　１５３４−１５３６（＋９８８）参 照。これらはすべて引用により本文に組み入れている。

ここで使われている「ヒト様フレームワーク領域」という用語は各抗体鎖のフレ ームワーク領域を意味しており、通常、少なくとも、約７０個のアミノ酸残基、 典型的には７５−８５個、あるいはそれ以上の残基で構成されている。ヒト様フ レームワーク領域のアミノ酸残基は少なくとも約８０％、好ましくは約８０−８ ５％であり、より好ましくは、ヒト免疫グロブリン内のものと、８５％以上、構 造などが同じである。この他の内発的抗体との共通した特徴は、副次的な免疫反 応、例えば、「自己」マーカーに対する反応を減少させるメカニズムだけを導入 する標的部分を発生させるので有益である。

ここで使われている「ヒト化」あるいは［ヒト様免疫グロブリン」という用語は 、ヒト様フレームワーク領域とヒト免疫グロブリン不変領域と構造などが基本的 に一致している、例えば、少なくとも約８０％以上、好ましくは約８５−９０％ 以上、そし−Ｃｍも好ましくは約９５％あるいはそれ以上の同一性を有している 不変領域で構成されている免疫グロブリンを指している。したがって、おそら＜ 　ＣＤＲを除いて、ヒト様免疫グロブリンのほとんどの部分は、ひとつ、あるい はそれ以上の自然なヒト免疫グロブリン配列の対応部分と基本的には構造などが 同一である。

ここで使われている「ハイブリッド抗体」という用語は、重鎖が哺乳動物抗体鎖 に関して個別的には同様であるが、組み合わせ自体は新しい集合を示しており、 したがって、２つの異なった抗原がその抗体によって認識されるような抗体を指 している。ハイブリッド抗体においては、重鎮と軽鎖によるひとつの対は、例え ばエピトープなど、ひとつの抗原識別特性に対して発生する抗体内に見いたされ るものと同様であるが、他の重鎮と軽鎖の対は別のエピトープに対して発生する 抗体内に見いだされる対と同様である。これによって多機能性結合価、例えば、 少なくとも２つの異なったエピトープと同時に結合する能力をもたらしてくれる 。こうしたハイブリッドは、もちろん、キメラ重鎖を用いても形成することがで きる。

ここで使われている「モノクローナル抗体」という用語は個別抗原決定因子を認 識する抗体構成を意味している。それは、抗体の供給源や、そのつくられ方を限 定することは意図していない。

先行技術で用いられている標準的な方法を用いて、ｃ　−ｅｒｂＢ−２に特有な モノクローナル抗体をつくりだすハイブリドーマから異なった領域およびＣＤＲ を誘導することができる。最終的に望ましいキメラ性抗体を表現することができ る、本発明による核酸配列は、多様なヌクレオチド配列（遺伝子性またはｃＤＮ Ａ、合成オリゴヌクレオチドなど）および構成因子（Ｖ、Ｊ、ＤおよびＣ領域な ど）を用い、そして種々の技術を使って形成することができる。適当な遺伝子性 配列を結合させるのは、今日では一般的な生産方法であるが、ｃＤＮＡ配列も用 いることができる（ヨーロッパ特許公報４０２３９４００およびｅｉｃｈｍａｎ ｎ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔ、ｕｒｅ、　３３２　：　３２３−３２ ７　（１９８８）参照。両方とも引用により本文に組み入れる）。

ヒトの不変領域ＤＮＡ配列は好ましくは、不死化Ｂ−細胞から分離される（例え ば、引用により本文に組み入れているＨｅ１ｔｅｒ。

ｅｔａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　２２　：　１９７−２０７　（１９８０）参照）る が、他の種々のソースから分離あるいは合成することも可能である。ヒト免疫グ ロブリンＣγ１遺伝子はＥｌｌｉｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ １ｄ。

Ｒｅｓ、、　１０　：　４０７１　（１９８２）　；　Ｂｅ１ｄｌｅｒ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

＋４１　：　４０５３　（１９８８）　；　Ｌｉｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ、　８４　：　３４３９　（１９８７）　（すべて引用により本文に組 み入れる）に述べられている。

本発明による免疫グロブリンをつくりだすためのＣＤＲは好ましくは望ましい抗 原、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に結合することができるモノクローナル抗体から誘 導され、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、あるいは他の公知の方法で抗体 をつくりだすことができるを椎動物ホスト細胞などを含むいずれか適切な哺乳動 物ソース内でつくられる。ＤＮＡ配列のための適切なソース細胞細胞および免疫 グロブリン表現および分泌のためのホスト細胞は、アメリカ・タイプ培養コレク ション（”ＡＴＣＣ”　）　（”Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏ「Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅ ｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”第５版（１９８５）　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、引用により本文に組み入れる）な ど、いろいろな供給源から入手することができる。

ここで具体的に述べられているキメラ性抗体ペプチドに加えて、他の「実質的に は同様」修飾免疫グロブリンは、当業者に公知のＤＮＡ組み替え技術を用いて設 計、製造することができる。これらの遺伝子の修飾は部位指向変異誘発（ｓｉｔ ６−ｄｉｒｅｃｔｅｕ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　（ＧｉｌｌｍａｎおよびＳ ｍ１ｔｈ、　Ｇｅｎｅ、８　：８］−９７（１９７９）およびＲｏｂｅｒｔｓ、 　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２８　ニア３１−７３４　（１ ９８７）参照、いずれも引用により本文に組み入れる）など、種々の公知の手法 によって容易に行うことができる。これらの修飾にはアミノ酸の追加、消去、置 換、好ましくは、適切な性質や生物学的活性を保持しつつ、ポリペプチドの配列 における保存的、あるいはその他の変化を含む。別の方法として、−吹拭体構造 の一部だけを含み、結合および／またはエフェクター活性を有するむポリペプチ ド・フラグメントもつくることができる。また、多くの遺伝子と同様、免疫グロ ブリン関連遺伝子は、それぞれひとつまたは複数の別個の生物学的活性を有する 個別の機能性領域を含んでいるので、これらの遺伝子を他の遺伝子からの機能性 領域に溶融させて、新しい性質または新しい性質の組み合わせを有する蛋白質（ 免疫毒素など）をつくりだすことができる。

クローンされた可変および不変領域をプラスミドから分離して、ｐＳＶ２−ｎｅ ｏ、あるいはｐＲ５Ｖ−ｇｐｔなどの哺乳動物表現ベクターに結紮することによ って、機能性転写単位を形成することができる。そして、これらの表現ベクター をホスト細胞にトランスフェクトすることができる。５Ｐ２１０またはＰ３Ｘ細 胞などのマウス骨髄腫はそれらが内発性免疫グロブリン蛋白質を分泌せず、免疫 グロブリン表現に用いられるすべての構成因子を持っているので、好ましいホス トである。骨髄腫細胞は上に述べたような適切な手法を用いて、トランスフェク トすることができる。

他のタイプの、他のホスト細胞に固有のプロモーターおよびエンハンサ−が先行 技術において知られている。Ｋａｍｅｙｏｍａ　。

Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒａ参照。例えば、キメラ性抗体アミノ酸配列 をコード表現するＤＮＡ配列をイースＩ・・プロモーターおよびエンハンサ−に 結合させて、先行技術で公知の方法を用いてイースト菌にトランスフェクトさせ ることができる。

Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、　５ｕｐｒａ参照。

この同じ方式を、ひとつの哺乳動物種などのひとつのソース、および異なった哺 乳動物種などの他のソースのフレームワーク領域から、ｃ−ｅｒｂＢ−２固有Ｃ ＤＲを分離するために適用することができる。次にＣＤＲをフレームワーク領域 および不変領域に結紮させて、キメラ性抗体を形成することが可能である。それ ぞれ引用により本文に組み入れる、ＰＣＴＮｃ　ＧＢ８８１００７３１（１９８ ９）　、および１９９１年１２月１２日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／８０８ ，４６２参照。ＣＤＲは、例えば、ヒト・７１ノ−ムワークおよび不変領域で構 成される表現ベクターにクローンすることができる。

別の例は、マウスなど、ひとつの種の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ ２およびＣＤＲ３と、ｃ−ｅｒｂＢ−２に固有な抗体をコード表現するヒト重鎮 のフレームワーク領域で構成される、組み替えＤＮＡ配列である。他の可能性と しては、ｃ　−ｅｒｂＢ−２に固有なＣＤＲを用いるか、ひとつの哺乳動物種か らのＣＤＲ１およびＣＤＲ３を含む可変領域の一部を用い、次にこの配列を、第 二の哺乳動物種の、第一の哺乳動物のＣＤＲ３に対するフレームワーク部分をコ ード表現している別の配列に結紮し、あるいは、第一の哺乳動物種から誘導され 、第二の哺乳動物種のフレームワーク内に、第一の種から誘導された可変領域Ｄ ＮＡ配列と第二の種から誘導された不変領域とが分散されているＣ−ｅｒｂＢ− ２固有重鎮ＣＤＲをコード表現する組み替えＤＮＡ配列で、ホスト細胞株をトラ ンスフェクトするなどの方法である。

抗体配列で構成されている組み替えＤＮＡ表現ベクターはホスト細胞へのエレク トロポレーション（ｅｉｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によってトランスフェクト することもできる。標準的な選択手順は、ｃ−ｅｒｂＢ−２固有キメラ性抗体を つくりだすクローンを分離するために用いられている。

抗体は大腸菌などのバクテリアからの単鎖抗体など、適切な形態で表現すること ができる。すべて引用により本文に組み入れているＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　９　：　５４５　（１９９１）　；Ｈｕｓｅ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６　：　１２７５　（１９８９）　；お よびＷａｒｄ。

ｅｔ、　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４１　：　５４４　（１９８９）参照。

これら抗体ペプチド配列は、Ｔａｑポリメラーゼなどの、熱的に安定したＤＮＡ ポリメラーゼ、およびポリメラーゼとオリゴヌクレオチドプライマーを用いて特 定のＤＮＡ配列を増幅するための用いられる技術であるポリメラーゼ鎖反応また はＰＣＲの使用することによって、クローニングのために増幅することも可能で ある。これらはすべて、引用により本文に組み入れているＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏ ｌｓ、　ｅｄ、Ｉｎｎ１ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、 　Ｉｎｃ、（１９９０）に記載されている。また、引用により本文に組み入れて いる０ｒｌａｎｄｉ、　５ｕｐｒａおよびＬａｒｒｉｃｋ、　ｅｔａｌ、、　Ｂ ｉｏｔ、ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７　：　９３４　（＋９８９）も参照。

（ここでは単にｃ−ｅｒｂＢ−２とも記されている）　ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質 は、分子ｆｔ１８５Ｋｄ　（キロドルトン）で、タイロシンキナーゼ活性を有す る糖蛋白質膜であり、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に関連しているが、それ とは別個のものである。ＥＧＦＲ蛋白質と同様、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質は、２ つのシスティンを豊富に含む反復クラスター、トランスメンプレイン・ドメイン （ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ）と、細胞内キナーゼ領域を含む 細胞外ドメインを有している。さらに、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質のアミノ酸配列 は、ヌクレオチド配列と同様に、引用により本文に組み入れているＣｏｕｓｓｅ ｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０３　：　１１３２（＋９８ ５）によって述べられている。

ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質は１９８５に３つの異なった研究グループ：Ｓｅｍｂａ 、　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩ ＳＡ、　８２　：６４９７（その遺伝子をｃ−ｃｒｂＢ−２と命名）　；　Ｃｏ ｕｓｓｅｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、。

５ｕｐｒａ　（その遺伝子をＩＩＥＲ−２と命名）、そして、Ｋｉｎｇ、　ｅｔ 、　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９　：　１１３２　（その遺伝子をｖ−ｅｒｂＢ関連と 命名）によって発表されたｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子によってコード表現され る。したがって、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子配列と、その対応する蛋白質配列は先 行技術において公知であり、発表されている。ｃ−ｃｒｂＢ−２蛋白質は明確な 細胞内設計、トランスメンプレイン設計、および細胞外領域を有している。通常 、本発明による標的部分は、腫瘍細胞の外部に露出される筈の細胞外領域に結合 する。この標的部分は、通常、リガンド結合領域、あるいはエピトープなどの抗 原認識分を含む、そこに見いだされるひとつ、あるいは複数の特徴を識別する。

エピトープは通常、直線ペプチド配列決定子あるいは立体配座性決定子など、純 粋なポリペプチド・エピトープを指して使われることが多いが、含水炭素成分を 有するエピトープを指して使われる場合もある。これらエピトープは、したがっ て、結合蛋白質／含水炭素成分、あるいは含水炭素成分だけを含んでいる場合が ある。この蛋白質に対する他の修飾は、正常なものであれ、異常なものであれ、 重要なエピトープ性決定子を提供するであろう。

ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質の検出は、ここに述べられているような、ｃ−ｅｒｂＢ −２蛋白質に固有の抗体を用いる公知の免疫アッセイを用いて行うことができる 。こうした抗体は、例えば、カリフォルニア州テメキュラのＣｈｅｍｉｃｏｎ　 Ｉｎｔｃｒｎａｔ、１ｏｎａｌ　Ｉｎｃ、などから入手することができ、あるい は、標準的な免疫的手順によって作成することもできる。例えば、ここに引用に より本文に組み入れているＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　：　ＡＬａｂｏｒａＬｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｎ。

Ｙ、　（１９８８）参照。

ここでは、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質の定義に、例えば、ヒトのＣ−ｅｒｂＢ−２ 蛋白質に免疫学的に関連のある蛋白質など、他のポスト・システムから開発され た蛋白質も含むことを意図している。例えば、関連するラットの遺伝子（ｎｅｕ と命名されている）は、５ｅｈｅｃｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、　 ２２９　：　９７６　（１９８５）に報告されている。

抗体の作用を容易に発揮させることができる有益なエピトープには標的細胞の− Ｅに見いだされる細胞外エピトープが含まれる。これらのエピトープは、一般的 には腫瘍細胞上に見いだされる蛋白質の直線、あるいは立体配座エピトープなど 、蛋白質エビ１ヘーブである。他の有用なエピトープとしては、含水炭素、およ び、ｃ、−ｅｒｂＢ−２蛋白質上に見いたされ、通常、ボスト一トランスレーシ ョナル（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　）な修飾部位を含む非蛋白性 成分を含む。過剰に表現されたｃ　−ｅｒｂＢ−２に対する結合特性を示す抗体 および他の結合領域も、この蛋白質のフラグメントに対して発生する。

ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外部分に対して、マウスのモノクローナル抗体がつくら れている。そうした抗体の一例はメリーランド州ロックビルのアメリカ・タイプ 培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｖｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ　：　ＡＴＣＣ）にＮｃｔ　ＨＢ１０６４６の番号で寄託されている ＴＡｂ　２５０である。

また、ｃ−ｅｒｂＢ−２表現細胞に対する親和性および特殊性を示す他のいずれ かの標的方法からも標的部分を誘導することができる。例えば、ｃ−ｅｒｂＢ− ２蛋白質によって識別され、結合されるリガンドも有益な標的部分であろう。例 えば、ＥＧＦ受容体のためのリガンドとして機能するらしく、さらに、Ｃ−ｅｒ ｂＢ−２蛋白質に対する結合特性を有するように見える分子であるＣＲＩＰＴＯ について述べているＣ１ｃｃｏｄｉｃｏｌａ、　ｅＬ　ａｌ、　（１９８９）　 Ｅｍｂｏ　Ｊ、８　：　１９８７−１９９１　；　Ｃ１ａｒｄｉｅｌｌｏ、　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５１　：　１０５ １−＋０５４　；およびＣ１ａｒｄｉｅｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ。

（１９９１）　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ　８８　：　７７９２−７７９６参照 。

なお、ここで述べられている配列には、置換、付加、および／または消去などの 変異によるこれらの配列の変異体、あるいはいずれか他の、そこから誘導された 、あるいは類似している配列に対する基本的に同様の結合活性を有する配列も含 まれている。

本発明の場合、抗体あるいはペプチドが、例えば、競合的アッセイ、飽和アッセ イ、またはＥＬＩＳＡあるいはＲＩＡなどの標準的な免疫アッセイなど、標準的 な抗体−抗原、あるいは抗原−受容体アッセイなどで測定、または判定された場 合に、ｃ−ｅｒｂＢ−２と結合する、または結合することができる場合に、それ らの抗体あるいは抗体はｃ−ｅｒｂＢ−２に対して特殊性を有するものと判断さ れる。特殊性に関するこの定義は、単一の重鎖および／または軽鎖、ＣＤＲ１溶 融蛋白質、または重鎖および／または軽鎖のフラグメントなとは、それらがｃ　 −ｅｒｂＢ−２蛋白質と結合するが、あるいは、相補的な可変領域および不変領 域を有する免疫グロブリン立体配座内に適切に組み込まれた場合、特にｃ−ｅｒ ｂＢ−２蛋白質と結合することができる場合にも適用される。

競合アッセイの場合、抗体あるいはペプチド・フラグメントの抗原と結合する能 力は、そのペプチドの、その抗原と結合することが知られている化合物の結合能 力と競合する能力を探知することによって判定される。いろいろな種類の競合ア ッセイが知られており、ここでも検討の対象となっている。

また、抑制因子が不在の場合にテスト化合物の結合力を測定するアッセイも用い ることができる。例えば、ひとつの分子あるいは他の化合物のｃ−ｅｒｂＢ−２ 蛋白質と結合する能力は、問題の分子を直接ラベルするか、あるいはラベルしな い場合は、種々のサンドウィッチ・アッセイ形式を用いて間接的に検出すること ができる。競合結合アッセイなどのいろいろなタイプの結合アッセイが知られて いる（例えば、引用により本文に組み入れている米国特許第３，３７６．１１０ 、第４，０１６，０４３、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｔ （ａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔ、１ｏｎｓ、　Ｎ、Ｙ、（＋９８８）　、およ びＣｏｌｉｇａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　（ｅｄｓ）　、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｎ、　Ｙ参照）。競合アッセイを用いる以外 のテスト化合物のひとつの成分との結合を測定するためのアッセイも用いること ができる。例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質の存在を確認するために、免疫グロ ブリンを用いることもできる。

ＥＬＩＳＡなと、モノクローナル抗体アッセイのための標準的な手順を用いるこ ともできる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、　５ｕｐｒａ参照）。ここに用いる ことができる種々の信号発生システムをさらに詳しく知るためには、ここに引用 により本文に組み入れている、米国特許第４，３９１，９０４参照。

さらに、結合部分のｃ−ｅｒｂＢ−２に対する結合特性は、その親和性によって 判定することができる。その部分の解離定数（ＫＤ＝ｌ／Ｋ、ここでＫは親和定 数）は、１μＭ以下、好ましくは１１００ｎ以下、そして最も好ましくはｌｎＭ 以下である。

抗体分子は通常はその下方範囲でＫＤを有している。ＫＤ＝［Ｒ−Ｌ］　／　［ Ｒ，］　［Ｌ］で、ここで［Ｒ］、［Ｌ］および［Ｒ−Ｌ］はそれぞれ均衡時の 受容体またはｃ　−ｅｒｂＢ−２［Ｒ］、リガンド、抗体またはペプチド（Ｌ） 、および受容体−リガント複合体（Ｒ−Ｌ）の濃度である。通常、リガンドある いはペプチドと、受容体または抗原との間の結合作用は静電引力、ファンデルワ ールス力、そして水素結合など、可逆的な、非共有結合などを含む。

他のアッセイ形式としては、ダウン・モジュレーション（ｄｏｗｎ　ｍｏｄｕｌ ａｔｉｏｎ）　、内部化、あるいはフオスフオリル化傾向の増大など、ここに引 用により本文に組み入れている１９９１年１月１８日に出願された米国特許出願 筒０７７６４４，３６１に述べられているような相互作用がもたらす種々の生理 学的、あるいは化学的変化の存在、あるいは不存在の検出などが含まれる。Ｒｅ ｃｅｐｔｏｒ−Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

ｅｄ、　Ｈｕｌｍｅ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　（１，９９０） 参照。

ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に特有の好ましいペプチドは、ｃ　−ｅｒｂＢ−２蛋白 質を表現している腫瘍細胞と接触する状態で置かれると、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白 質のフォスフォリル化傾向の増大を誘発する。

ｒ　ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質のフオスフオリル化傾向の増大を誘発する」分子と は、その分子が不在の時に起きるもの以上の、蛋白質へのフォスフェートへの組 み込みにおける検出可能な増大を引き起こす分子のことを意味している。通常、 こうした検出可能な増大とは、コントロールと対比して２倍以上のフオスフオリ ル化の増大、好ましくは３倍以上の増大のことである。フオスフオリル化は受容 体のフオスフオリル化を検出するために従来の技術で知られている方法で測定す ることができる。例えば、ここで引用により本文に組み入れている、Ｃｏｏｐｅ ｒ、　ｅＬａｌ、、　Ｍｅｔ、ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　９９ 　：　３８７−４０２（１９８３）　；　ＡｎＬｏｎｉａｄｃｓおよびＰａｎｔ 、ａｚｉｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

１４７　：　３６−４０　（１９８７）　；およびＬｅｓｎｉａｋ、　ｅｔ、　 ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１５０　：　７１７ −７２３　（１９８７）参照。

通常、フオスフオリル化は完全な細胞のイン・ビボでのフオスフオリル化（Ｌｅ ｓｎｊａｋ、　５ｕｐｒａ）　、あるいはイン・ビトロでの自動フオスフオリル 化反応によって測定することができる。例えば、イン・ビボでのフオスフオリル 化の測定のためには、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質を持つ細胞が放射性物質でラベル されたフォスフェートに接触する状態で配置されるアッセイを実施することがで きる。イン・ビボでのアッセイにおけるＣ−ｅｒｂＢ−２蛋白質受容体のフオス フオリル化を検出するためには、ラベルされたフォスフェートと共に１２時間か ら１８時間程度テスト細胞を培養するのが有利である。これらの細胞は２つ、あ るいはそれ以上のバッチに分けられ、一部は受容体のフオルフオリル化を増大す ると予想される分子に露出され、一部はコントロールとして分離される。それら 画分はその後免疫沈降され、受容体が、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲルま たはオートラジオグラフィーによって識別され、フオスフオリル化における増大 は、コントロール画分と比較して、テスト分子に露出された画分のバックグラン ドにおいて２倍以上の増大があった場合に、統計的に有意であるとみなされる。

イン・ビトロでの自動フオスフオリル化を測定するためには、細胞、または細胞 抽出物をｃ−ｅｒｂＢ−２に特殊な作用を発揮するペプチドの存在、あるいは不 存在下で培養することができる。抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体による免疫沈降に続い て、この免疫複合体をγ”Ｐ−ＡＴＰによって培養し、５ＤＳ−ＰＡＧＥオート ラジオグラフィーによって分析する。

ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に固有に作用を発揮するもうひとつの好ましいペプチド は、ｃ−ｅｒｂＢ−２のダウン・モジュレーションを引き起こすものである。ｒ 　ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に対するダウン・モジュレーションＪは、腫瘍細胞上 でのｃ−ｅｒｂＢ−２受容体の検出可能な減少によって判定される。こうしたダ ウン・モジュレーションは、その腫瘍細胞上でｃ−ｅｒｂＢ−２受容体蛋白質に 結合する、あるいはそれを識別する抗体、または他の固有結合性を有する部分の 能力の低下によって検出される。

例えば、ダウン・モジュレーションは、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質受容体を保有し ている腫瘍細胞を特定のペプチドで培養し、その細胞を洗浄し、次に、それらの 細胞をラベルされた（好ましくは放射性物質でラベルされた）　ｃ−ｅｒｂＢ− ２蛋白質に固有の作用を発揮する抗体に接触させることによって判定することが できる。ラベルされた抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体のｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に固有 な作用を発揮するペプチドに露出された細胞への結合の程度は、抗体のコントロ ール細胞（つまり、ｃ　−ｅｒｂＢ−２固有ペプチドに露出されなかったペプチ ド）への結合の程度と比較される。好ましくは、これらのアッセイに場合、これ らの細胞は洗浄後、ラベルされた抗ｃ−ｅｒｂＢ−２交代に直接摂取される。

観察されるダウン・モジュレーションは、通常、用量に依存し、つまり、ダウン ・モジュレーションの程度は、ｃ　−ｅｒｂＢ−２蛋白質に露出されたｃ−ｅｒ ｂＢ−２蛋白質に固有なペプチドの量の増大に伴って増大する。処理された細胞 の抗ｃ　−ｅｒｂＢ−２抗体に対する結合の程度が、コントロール細胞の場合と 比較して９０％以上の減少を引き起こすペプチドが好ましい。

ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に対して特有の作用を発揮するもうひとつの好ましいペ プチドは、ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質を表現する腫瘍細胞と結合し、そうした腫瘍 細胞と接触する状態で置かれると内部化されるものである。「内部化」は、細胞 の細胞質においてペプチドが封鎖された場合に起きる。一度内部化されると、受 容体および／またはペプチドが細胞リゾソーム内で劣化するか、あるいは細胞表 面に循環される。リガンド−受容体複合体の内部化を判定するための方法も、こ こに引ようにより本文に組み入れている、Ｈａｉｇｌｅｒ、　ｅＬａｌ、、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２５５　：　１２３９−１２４１　（＋９８０）に述べられてい る。

細胞成長調節因子とは、それが標的とする細胞の成長に影響を及ぼす分子のこと である。通常、この調節因子は標的の細胞内に内部化されねばならないが、この 機能は通常、標的部分から発生する内部化によってもたらされる。

調節は、通常、代謝または成長速度の減少、好ましくは、細胞毒性影響の減少と して行われるが、代謝や成長速度の大幅な増大も有益である。代謝または成長速 度の大幅な増大が起きた時は、そうした傾向を示す細胞だけを殺す短期毒性も組 み合わせで用いることができる。

代謝や成長速度を低下させる調節因子の場合、その調節因子が高い活性を有して いるなど、強力である方が望ましい。

この毒素は無機または単純な有機分子を含んでいるが、通常、生物の分子の方が より強力である。ウィルス性または菌毒素も存在しているが、特定のバクテリア 性または植物性毒素は知られているものの中では最も高い活性を持っている。成 長抑制は、核酸合成、蛋白質合成、および細胞代謝など、一般的なものであれ、 特殊なものであれ、多数の基本的な細胞機能を阻止することによって起こすこと ができる。例えば、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素は真核細胞にお ける蛋白質合成を非可逆的に抑制することによってその作用を発揮する。両方の 例とも、蛋白質合成において基本的な役割を果す伸長因子２を酵素的に非活性化 する。他の伸長因子も他の毒素の標的とされる場合がある。対照的に、リシンは リボゾームに直接作用し、２８５ｒＲＮＡに作用する植物毒素である。

好ましくは、成長調節因子は高い代謝回転数を持つ酵素活性を有しており、した がって、非常に少数の分子が内部化されるだけでも、標的の細胞を殺すことがで きる。引用により本文に組み入れている、Ｐａ５ｔａｉｎ、　ｅｔ、　ａｌ、、 　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４　：　ｌｌ７３−１１７７参照。

ゲロニンはゲロニウム・マルチフォーラムの種子から精製された糖蛋白（分子量 ：約２９−３０，０ＯＯＫｄ）であり、強力なりボゾーム非活性化植物毒素のタ イプに属する。このタイプに属する他のものとしては、アブリン、リシン、およ びモデシンの鎖などを含んでいる群のものである。ゲロリンは、アブリンおよび リシンと同様、哺乳動物リポソームの６ＯＳサブユニツトを破壊することによっ て蛋白質合成を抑制する。ゲロニンは化学的および物理的処理に対しては安定的 である。さらに、ゲロニン自体は細胞には結合せず、単独で投与された場合、通 常は非毒性（濃度が高い場合を除いて）であり、実験室で取り扱う場合は安全で ある。リポソームの非活性化は非可逆的であり、補助因子が関与するようには思 われず、効率的に行われるので、これはゲロニンが酵素的に作用することを示唆 している。

ゲロニンおよびリシンは蛋白質合成を抑制し、蛋白質の重量ペースでは最も活性 の高い毒素である。ゲロニンは蛋白質合成の抑止においては、リシンＡ鎖と比較 して、１０−１０００倍も活性が高い。リシンおよびアブリンなどのペプチドは 、毒性単位であるＡ鎖と、細胞に結合することによって作用するＢ鎖との２つの 鎖により構成されている。リシンおよびアブリンとは違って、ゲロニンは単鎖で 構成されており、そして、細胞に結合するためのＢ鎖がないので、それ自体は比 較的不活性で、普通の細胞に対しては、非毒性である。結合あるいは標的部分に 接合されない場合、細胞に対する影響がずっと低いというこの特徴は、本発明の いろいろな実施例における重要な特徴である。この状況に応じて異なって現れる 毒性はｃ−ｅｒｂＢ−２を表現する細胞に対する高い選択性を実現する上には極 めて重要である。

哺乳動物細胞は天然のゲロニン分子に結合する、および／またはそれを内部化す る能力を明らかに欠いている。ある種の腫瘍細胞上に存在する腫瘍関連抗原に向 けられたモノクローナル抗体ＴＡｂ　２５０など、腫瘍標的試薬とゲロニンの接 合体はゲロニンをその細胞に結合させるための方法と、ゲロニン−抗体複合体の 内部化のためのルートの両方を提供する。

免疫毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬あるいはバクテリア性または植物性由来の 酵素活性毒素、あるいはそうした毒素の酵素活性フラグメント（「Ａ鎖」）であ ってもよい。酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントが好ましく、ゲロ ニン、ジフテリアＡｆｉＬ、ジフテリア毒素の非活性フラグメント、（シュード モナス・アルギノーサからの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ、アブリンＡ鎖、メドクシ ンＡ鎖、アルファーサルシン、アラウライト　ホーディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ 　ｆｏｒｄｉｉ）蛋白質、ダイアンシン蛋白質、ヒトイア力　アメリカナ（Ｐｈ ｙｔｏｉａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）蛋白質（ＰＡＰ　Ｉ　、　ＰＡＰＩ［お よびＰＡＰ−３）、モルモデイカチャランテイアインヒビター、カルジン（ｃｕ ｒｃｉｎ）、クロチン、サボナリアオフイシナリス・インヒビター（ｓａｐｏｎ ａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　１ｎｈｉｂｉＬｏｒ）　、　ミトゲリン、レ ストリフトシン、フェノミシン、およびエノミシンなどがその具体例である。

活性毒素はいろいろなメカニズムを通じてその作用を発揮し、そのそれぞれは細 胞生理および成長に影響を及ぼす。これらの毒素は代謝インヒビターまたは毒素 、核酸合成インヒビター、蛋白質合成インヒビター、あるいは異常または悪性機 能の他の仲介者などとして機能する。もつとも好ましいのは、ゲロニンとの接合 体である。

活性フラグメントおよい誘導体にはゲロニンの全長構造と同じ核構造を有してい るが主要配列全体を欠いている化合物を含んでいる。これらのフラグメントまた は誘導体は、ゲロニンと同じ、あるいはそれより改善された生物学的、あるいは 細胞毒性活性を有している。ゲロニン・フラグメントまたは誘導体はウサギ網状 赤血球細胞溶解物アッセイを用いて、当業者によって、簡単に判定することがで きる。

ＴＡｂ　２５０抗体に結合され、本発明において用いることができる生物学的応 答修飾子としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、インターフェロン（α、β、またはγ ）、ＴＮＦ、ＬＴ、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６などのリンフ才力インおよびサイ トカインなどである。これら生物学的応答修飾子は腫瘍細胞に対しているいろな 影響を及ぼす。こうした影響の中には、直接の作用によって殺される腫瘍細胞の 増大、および、ホスト細胞防衛仲介プロセスの増大によって殺される腫瘍細胞の 増大などかある。抗体ＴＡｂ　２５０とこれら生物学的応答修飾子との接合体は 選択的局在化、またはｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰表現する腫瘍または細胞への移行 を可能にし、したがって、改良された抗増殖効果をもたらす。非標的細胞の毒性 につながる不特定効果は、選択された細胞成長伝達因子が標的成分がないときは 効果を発揮しないので、最小限に押さえられる。

本発明において有益な細胞毒性薬（およびその誘導体）には、アドリアマイシン 、シス−プラチナ複合体、ブレオマイシン、およびメソトレキセートなどがある 。これらの細胞毒性薬は再発性腫瘍の治療的管理のためには有益であるが、副作 用が激しく、非標的細胞の受ける損傷も激しいので、その使用法は非常に難しい 。ＴＡｂ　２５０抗体は、腫瘍への伝達と、腫瘍細胞自体への侵入をしやすくる ための両方の効率的な手段を提供してくれ、こうした薬剤の有益なキャリアとし ての役割を果すことができる。さらに、特定の抗体による細胞毒性薬の腫瘍への 伝達は肝臓や骨髄などｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰表現しない鋭敏な場所を、化学治 療剤の悪性の作用から保護してくれる。伝達システムとしてのＴＡｂ　２５０に 接合された薬剤の使用は、すべての薬剤部分が腫瘍細胞に集中する抗体に接合さ れており、通常、そこに内部化されるので、薬剤自体の用量を減らすことができ る。

標的部分および細胞成長調節因子は、種々の高蛋白質結合剤を用いて接合するこ とができる。こうした薬剤の例としては、Ｎ−サクシミジル３−（２−ピリジル ジチオ）　（プロピオネート）（Ｓ’ＰＤＰ）　、２−ＩＴ、　４−サクシミジ ルオキシカルボニルーα−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰ Ｔ）、ジメチルアジビミデートなどイミドエステルの二機能性誘導体、ＨＣＩ、 ジサクシミジルスベレートなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアル デヒド類、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミドなどのビスホアジド 化合物、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミドなどのビス ホジアゾニウム誘導体、トルエン２，６−ジイツチアネート、および１．５−ジ フロオロー２，４−ジニトロベンゼンなどのビス−活性ふっ素化合物などである 。

これらの研究で使用するに先立って、ＳＰ２１０−Ａｇ１４細胞は、まず、０． １μｇ／ｍｌの天然ゲロニンの存在下で成長される。数か月間のうちに、ゲロニ ンの濃度は、細胞がｌｏｍｇ／ｍｌのレベルで維持できるようになるまで、徐々 に増やされていく。次に、ｌ０ｍｇ／ｍｌの存在下での限定希釈によってそれら の細胞のクローニングが行われ、その結果できるゲロニンに抵抗性を有するクロ ーンが拡大される。次に、２つの継代（ｐａｓｓａｇｅ）のために、ゲロニンが 培養媒体からゲロニンが取り除かれ、その後、その細胞が再びゲロニンに露出さ れて、安定的に抵抗性のあるクローンの成長が確認される。キメラ性ＴＡｂ　２ ５０の生産およびその活性を確認するためのテストを実施した後、抗体をつくり だすゲロニンに抵抗性のある５Ｐ２１０細胞が成長され、ＴＡｂ　２５０抗体に 関するｃＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼによる培養によってトータルＤＮＡか ら取り除かれる。それと平行して、最適化されたゲロニンを表現するＪＭ１０５ 大腸菌からのｃＤＮＡが取り出され、精製され、そしてＨｉｎｄＩＩｌおよびＥ ｃ。

Ｒ１による消化を行った後にそのＤＮＡをコード表現するゲロニンが取り出され る。このゲロニン遺伝子は重鎮フラグメントに結紮され、この挿入物がゲロニン に抵抗性を有する５Ｐ２１０細胞に入れられる。この細胞は、次に、限定希釈に よってサブクローンされ、それらのクローンはキメラ性抗体生産およびそのゲロ ニン成分のためにスクリーニングされる。最後に、ポジティブ・クローンが拡大 されて、組み替え溶融蛋白質がイン・ビトロ細胞毒性アッセイおよびイン・ビボ 繊維分散、薬理力学的、治療的、および毒性に関する実験の両方において使用、 テストされる。ＴＡｂ　２５０−ゲロニン溶融蛋白質の性質を前に述べたＴＡｂ 　２５０ゲロニン構造の特性とを比較して、それぞれの長所と欠陥の判定が行わ れる。こうした研究の結果に基づいて、キメラ性ＴＡｂ　２５０ゲロニン溶融蛋 白質のフェーズＩ臨床調査を、進行した乳癌を持つ患者の体内で行うことができ る。腫瘍細胞、例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子が望ましくないレベルで表 現されている腫瘍を持っていると診断された個人に対して、本発明による免疫毒 素を投与すると、細胞毒性薬を、それらの細胞を殺すのに必要な場所にその細胞 毒性薬に移行させ、集中させることが可能になる。このように、細胞毒性薬を標 的に移行させ、他の器官、組織、および細胞に対する不特定な毒性が除去、最小 限化、あるいは少なくとも減少される。

イン・ビボで治療のために用いられる場合、本発明による免疫毒素は、治療的に 効果のある量、つまり腫瘍による負担を除去するかあるいは減少する量で、患者 あるいは動物に投与される。それらは通常、経皮的に、好ましくは静脈注射によ って投与されるが、他の投与ルートも適切であれば用いられる。これらの用量お よび用量に関する処方は癌の性質（−成性か、転移したものが）、およびその密 度、その治療指数などの特定の免疫毒素の特性、患者、および患者の病歴やその 他の要素に依存する。投与される免疫毒素の量は通常、０．１からＬｏｎｇ／ｋ ｇ程度の範囲である。こうした調整は、措置の否定的な影響に対するバランスを 考慮に入れつつ、最適な有効性が得られるまで続けられる。引用により本文に組 み入れているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅ、　１７ｔｈ　Ｅｄ、　（１９９０）　Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ、；およびＧｏｏｄｍａｎｄおよびＧ ｉ１ｍａｎ’ｓ　：　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　 ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ８　ｔｈ　Ｅｄ　（１９９０）　Ｐｅｒｇａｍ ｏｎ　Ｐｒｅｓｓ参照。

経皮投与を行うためには、免疫毒素は最も一般的には、薬学的に受け入れ可能な 経皮投与ベヒクルとの組み合わせによる、ユニット投与による注射可能な形態（ 溶液、懸濁液、およびエマルジョン）の形で処方される。そうしたベヒクルは非 毒性で、治療上の効果をもたないものであることが好ましい。そうしたベヒクル の実例どしては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および５％ヒト 血清アルブミンなどがある。固定オイルおよびエチルオレエートなどの非水性ベ クトルも用いることが可能である。キャリアとしてリポソームの使用も可能であ る。これらのベヒクルは、緩衝剤や保存剤など、等張性および化学的安定性を強 化する物質などの添加物を多少含んでいてもよい。免疫毒素は通常、そうしたベ クトル内でＯ，１ｍｇ／ｍｌ　−ｌｏｎｇ　ｍｌ程度の濃度で調製される。

本発明による免疫毒素はイン・ビトロの方法でも用いることができる。例えば、 そうした方法を骨髄の腫瘍細胞を殺すのに用いることができる。この方法では、 まず、骨髄を腫瘍性疾患を有する固体から取り出す。次に、その骨髄を細胞毒性 的に有効な量の本発明による免疫毒素で処理して、残留腫瘍細胞を取り除く。処 理された骨髄は、すべての内発性同種毒性細胞を取り除くための集中的な化学療 法および／または放射線治療を受けた後、免疫システムを再確立するために患者 に再投与される。

本発明による免疫毒素は、腫瘍を持った哺乳動物の生き残り時間を延長したレバ 哺乳動物が体内に持っている癌細胞によって構成される腫瘍の成長速度を遅らせ るために用いることもできる。例えば、皮下あるいは腹膜内で成長しているヒト の腫瘍の異種移植を受けたヌード・マウスをいろいろな用量の免疫毒素、抗体の み、毒素のみ、あるいは２５−１００ｍｇ／ｋｇの範囲の食塩水で処理する。腫 瘍成長抑止は皮下腫瘍の物理的な大きさの変化や、５ＫＯＶ−３細胞などの腹膜 内腫瘍をもったマウスの生き残り期間の延長を手ががりに測定することができる 。そうした研究は、霊長類を含む他の哺乳動物に適用できる方法論の確立に役立 つであろう。

以下の実例は、本発明による免疫毒素の調製、特徴付け、および使用法に関する 詳細な説明である。これらの例はいずれの意味においても、本発明を限定するこ とは意図していない。

ヌ壜■生上 Ｉ」し＝２１コＬ袈 ゲロニンを分離するための手順はＳｔ、１ｒｐｃ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｉ　。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５５．６９４１−５３　（１９８０）に述べられ ている。ゲルマニウム　マルチフォーラム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ　ｍｕｌＬｉｆｌ ｏｒｕｍ）の種子の外皮をとり、その実をホモジナイザーで、５ｍＭリン酸ナト リウム（ｐＨ７，４）を含む０．１４Ｍ　ＮａＣ１８容積分と共に砕く。この均 一化されたものを一昼夜４℃の温度で継続的に撹拌しながら放置し、水上で冷や して、０℃の温度で、２０分間、３５．０００回遠心分離にかける。上澄液を取 り除いて、５ｍト１リン酸すトリウム（ｐＨ６，５）で透析してから、ｐｍＩＯ フィルターを用いて遠心分離する。サンプルを５１リン酸ナトリウム（ｐＨ６， ５）で均衡化させたＣＭ−５２イオン交換カラム（２ｏ　ｘ　１．５ｃｍ）」二 で層状に置く。このイオン交換樹脂に結合した物質を４００ｍ１のＯ−０，３Ｍ 線形勾配を持つＮａＣ１で、４℃の温度下、１時間あたり２５ｍ１の割合で溶出 させた。５ｍ１画分が集められた。

各両分を電子顕微鏡で観察した。ゲロニンは画分５５−７０で溶出し、最後の主 要溶出ピークであった。画分５５〜７０が集められ、二重に蒸留された水で透析 され、凍結乾燥の方法で濃縮された。各製剤の純度および分子量を、ＴＳＫ３０ ００ゲル浸透カラムを用い、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４およ び１５％ナトリウム・ドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＳＤＳ−ページ）によって、高圧液体グロマトグラフィーで検査した。ゲロニ ンは単一の帯として移動し、その分子量は２９，０００−３０，０００ドルトン と推定された。

１五１ ゛ロニンー：のアッセイ ゲロニンの活性は無細胞蛋白質合成抑止アッセイによって観察された。この無細 胞蛋白質合成抑止アッセイは、５０μｌウサギ細胞質溶解物に以下の成分（０， ５ｍｌの０．２１Ｖｌリス刊（Ｃ１（ｐＨ７，８）　、　８．９ｍｌのエチレン ・グリコール、および０．２５ｍ１のＩ　Ｍ　ＨＣＩ　）を追加し、追加する度 によくかき回した。

０．３７５Ｍ　ＫＣＩ、　ｌ０ｍＭ　Ｍｇ（ＣＨ，Ｃｏ、）、、１５ｍＭグルコ ース、０．２５２５−１ｏアミノ酸（ロイシンを除＜）　、５ｍＭ　ＡＴ　Ｐ、 １ｍＭ　ＧＴＰ、　５０＋ｎＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐｉ（７，６）　、　１０ μｍクレアチニンフォスフエートークレアチニンフオスフォキナーゼ、１２μｍ ３Ｈロイシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　７４ｍＣ１／ｍｍｏｌ）で構成される塩− アミノ酸エネルギー混合体（ＳＡＥＭ）に、いろいろの濃度のゲロニン混合物を 含む溶液１．５μｍを加える。この混合物を３０’Ｃの温度で６０分間培養した 。′Ｈ−ロイシンのとり込みが、グラスファイバーフィルター上に合成された蛋 白質を沈殿させ、１ｏ％ＴＣＡおよびアセトンで洗浄し、そして、アクアゾルシ ンチレーション液を用いるベータカウンターでその放射能を測定することによっ て観察した。これら抗体との接合には特殊な活性が４ＸＩＯ°Ｕ／ｍｇ以上のゲ ロニンを用いられた。ゲロニンの活性の単位は、無細胞アッセイにおいて［″’ Ｃ］ロイシンの蛋白質への取り込みを５０％抑制するゲロニンの量を基準として いる。

ス１■引１ ＴＡｂ　２５０の２−ＩＴ　゛コニ２ の゛ロニンパ　との　ム リン酸緩衝食塩水をセントリドリップ１０コンセントレータでｌｏｎｇ／ｍ１程 度に濃縮した。トリエタノールアミンヒドロクロライド（ＴＥＡ／）ＩｃＩ）　 、　ｐＨ８，０、およびＥＤＴＡが加えられ、最終的な濃度が６０ｍＭ　ＴＥＡ ／ＨＣ１および１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０に調整された。そして、この 最終的な濃度の溶液１ｍｌ’Ｈこ２−イミノチオラン・ストック溶液（１ｍＭ　 ＥＤＴＡを含む６０ｍＭ　ＴＥＡ／Ｉ（Ｃ１に５００ｍＭ）を加え、そのサンプ ルを窒素ガス流の存在下で、４℃の温度下で、撹拌しながら９０分間培養した。

過剰なイミノチオランは０．ＯＩＭ　Ｎａ、ｔ（ＰＯ，、０，００１８Ｍ　Ｋ！ （、ＰＯ４，０，００３４Ｍ　ＫＣＩ、　０．００１Ｍ　ＥＤＴＡおよび０，１ ７Ｍ　ＮａＣ１を含むフォスフェート−ＥＤＴＡ緩衝液で予め均衡化したシエパ デツクスＧ−２５（１ｘ２４ｃｍ）のカラム上でのゲルろ過によって除去した。

蛋白質の含有率を調べるために両分を、バイト−ラッド（Ｂｊ　ｏ−Ｒａｄ　） アッセイを用いてマイクロタイター板で分析した。空隙容積にゲロニンが溶出し た。これらの画分を集めて、４℃の温度で保存した。

去】ｌ生先 モノクローナル　の　１ 完全のフロイド・アジュバント内で１：１の割合でエマルジョン化した２　ｘ　 ｌｏ”　−１ｘ　ｌｏ’ＮＩＨ３Ｔ３Ｔ細胞（Ｃ−ｅｒｂＢ−２でトランスフェ クトされたＮ１）（３７３細胞）を皮下（ｉ、ｐ、　）および腹膜（ｓ、ｃ）に 投与して、ＢＡＬＢ／　ｃマウスを免疫化した。供試動物には２週間から４週間 に一度づつ、追加刺激を与えた。

ＥＬＩＳＡ　（以下に説明）内でポジティブ・タイターが検出されたら、融合４ 日前に最終的な皮下または静脈注射を行った。

牌臓細胞をＲＰＭ１１６４０．１０％ＦＢＳおよび２ｍＭＬ−グルタミン内で保 存されていたＰ　３−３−Ｘ６３Ａ、６５３骨髄腫細胞と融合させた。

ハイブリドーマ細胞液のポジティブ反応性をＥＬＩＳＡ　（下記参照）内でテス トしたところ、４℃での未固定ＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３Ｔ細胞を用いた 間接免疫蛍光法と、それに次いで行われたフローサイトメトリック分析によって 、細胞外ドメイン反応性が検出された。このモノクローナル抗体ＴＡｂ　２５０ はどのソースからでも得ることができる。最も好ましくは、本発明で用いられる 抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体はヒトの抗体か、マウスの抗体のいずれかである。

ＴＡｂ　２５０をつくりだすハイブリドーマ細胞は２■、継続潅流バイオリアク ター内で成長される。バイオリアクターからの細胞上澄液をろ過して、蛋白質− 〇トリオ・システム内を通過させ、その後で、イオン交換グロマトグラフイーを 行う。

その物質を、次ぎに濃縮し、無菌ろ過する。最終的な生成物に関するテストとし ては、総ＤＮＡ、蛋白質純度、ｐＨ１（ＩＥＦ）、総蛋白質、内毒素、能力、同 一性、および蛋白質−〇抗原に関するテストが含まれる。

本発明は、なかんずく、ハイブリッド抗体、あるいはヒト化またはヒト状抗体を 含むキメラ性抗体を用いる。好ましい実施例において、マウスＴＡｂ　２５０抗 体のひとつの配列から、種々の配列が発生し、それらは基本的にはマウスＴＡｂ 　２５０抗体の配列と同一である。ＢＡＣｈ−２５０はそのようなキメラ性抗体 である。

ス」１伝」− ＥＬＩＳＡアッセイ 無菌９６−ウェル・プレートを無菌ＰＢＳ内で１　ｍｇ／ｍｌの仔ウシ・コラー ゲンで３７℃の温度下で２時間前処理した。ＮＩＨ３Ｔ３．細胞（ベクターで形 質転換されたＮ１１−１３５３細胞）を８０％の融合度まで成長させ、温パック のバーセン（Ｐｕｃｋ’ｓ　Ｖｅｒｓｅｎｅ）　（ＰＢＳ内で０．０２％ＥＤＴ Ａ　）で取り出し、洗浄し、３７℃で一昼夜処理したウェル内に０．５−　Ｉ　 ＸＩＯ”細胞／ｍｌの割合で入れた。プレートを静かに洗浄して、１０％中性緩 衝化フォルマリンで処理し、その後、１％仔ウつ血清アルブミンＢＳＡ／ＰＢＳ でブロッキングした。次ぎにサンプル上澄液または抗体希釈液をプレートに加え て、３７℃の温度で２時間培養し、その後、アルカリフォスフォターゼ接合ヤギ ・抗マウスＩｇＧ　Ｆｃ−固有二次抗体で、３７℃の温度で１時間培養した。プ レートを１）ＢＳで洗浄し、パラ−ニトロフェニルフォスフェートおよびジェタ ノールアミン基質を加えて、さらに室温で１５分間培養し、モしてＡ４０．を測 定した。ネガティブ・コントロール抗体に対する吸収度より０．２−１．０以上 高い吸収度でトランスフェクトされた細胞と反応した上澄液または抗体がポジテ ィブとみなされた。

ス上■生色 ロ昏Ｔ−ＴＡｂ師犯刀１１と駁返 メーカーの処方に基づいてヨード粒（Ｐｒｊｅｃｅ）を用いて、ＴＡｂ　２５０ を放射性ラベルした。基質なしのＮａ”’　Ｉ　（４００ｕＣｉのＩＭＳ、３０ ．　Ａｍｅｒｓｈａｍ）を３ヨ一ド粒の存在下で、１００ｍＭ　Ｎａ−フォスフ ェート緩衝液（２００μｌ、　ｐＨ７，４）中で、２５ｕｇ　ＴＡｂ　２５０と 反応させた。この操作によって、ヨード原子と１ｇ０分子の比率は約１＝１にな った。この取り込みは時々かき回しながら、７．５分間、室温で進行させられた 。反応混合物をビーズから取り除き、５分後に、体積をＮａ−フォスフェート緩 衝液で０．５ｍｌに調節し、特殊な活性（以下参照）を評価するために、２μｍ を取り出した。残りは、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％アジドを含むＰＢＳで 均衡化したＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　）を用いたゲルろ過で脱 塩した。放射性ラベル抗体を１ｍｌのカラム緩衝液中で溶出して、４℃の温度で 、最大６週間保存したが、結合活性のロスは認められなかった。この脱塩された 物質は、９５％以上がＴＣＡ沈殿可能であったので、取り込まれない要素は基本 的に含まれていなかった。

放射性物質でラベルした抗体の特殊な活性は、この脱塩ステップの前に、ＴＣＡ 沈殿によって評価された。こうして、２μｌの反応混合物をカラム緩衝液内で５ ００倍に希釈して、２画分を等しい体積の水冷２０％ＴＣＡと混合した。氷上に ２５分放置した後、遠心分離（１０分、３０００Ｘｇ）で沈殿物を収集した。

上澄液とペレットを別個にカウントし、取り込みはＴＣＡ−沈殿可能カウントの パーセントを基準として判定された。個別の沃素化で達成された取り込みの程度 は２７％から４５％の範囲で、特殊活性の評価値は３．９−７．２ｕＣｉ／ｕｇ であった。それぞれの結合実験の前に、結合バッファで均衡化したＮＡＰ−５カ ラムを用いたゲルろ過によって、適切な量の’　Ｉ　−ＴＡｂ　２５０の脱塩を 行った。この手順により、アジドと、通常、９８％以上のＴＣＡ−沈殿可能な物 質とが取り除かれた。

去り且工 鳳−Ｌ−１一旦 ヒト乳房悪性腫瘍細胞株系統５ＫＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＤＡ −ＭＢ−２３１、およびヒト卵巣悪性腫瘍細胞系統５ＫＯＶ−３が用いられた。

５ＫＢＲ−３，ＭＤＡ−ト２３１．　ＭＤＡ−ＭＢ−４５３が１０％ＦＢＳおよ び２ｍＭＬ−グルタミンを補足した最小限必要な培地中で維持された。

ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞のための培養液は１％の不可欠ではないアミノ酸およ び１％ビタミンも含んでいた。５ＫＯＶ−３細胞はｌＯ％ＦＢＳおよび２ｍＭＬ −グルタミンを補足したｌ５ｃｏｖｅ社の修正ダルベツコ培養液中で培養された 。すべての培養株は５％または１０％ＣＯ１の存在下で、３７℃の温度で培養さ れた。

スＪＪＬ支 １″”　Ｔ　−ＴＡｂ　２５０の　化 ゛’　Ｉ　−ＴＡｂ　２５０の内部化を、酸に感受性のある部分と、感受性のな い部分における放射能の量を判定することによって判定した。細胞を取り出して 、”’　Ｉ　−ＴＡｂ　２５０単独（６ｎｇ／ｍｌから１５３ｎｇ／ｍｌ）　、 および過剰な、ラベルされていなし５ＴＡｂ　２５０で氷冷結合緩衝液中に再懸 濁され、不特定（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合を判定した。放射性物質でラ ベルした抗体の細胞表面結合が均衡状態に達した後、細胞を２００Ｘｇで４℃の 温度で、５分間ペレット化し、非結合抗体を取り除くために、水冷結合緩衝液に よって、三度洗浄した。この細胞ベレツトを水冷結合培養液内で再懸濁させ、両 分をとって、最初の””Ｉ−ＴＡｂ２５０表面結合の量を判定した。放射性物質 でラベルした抗体の内部化を開始するために、これらの細胞を３７℃に暖めた。

１５分間から１５０分間の間に、画分を取り出し、遠心分離（１４００Ｘｇ、５ 分間、４℃）で収集した。分離され、循環された抗体を含む上澄液が集められた 。酸洗浄（１００μｌ／チユーブＰＢＳ、１％グルコース、ｐＨ１）で、ペレッ トの２度、再懸濁させた。表面結合抗体を含む上澄液を集め、カウントした。残 りの細胞関連放射能を含んだチューブの先端を切り取って、カウントした。

図６は、モノクローナル抗体ＴＡｂ　２５０がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に内部 化されないことを示している（パネルＢ）。対照的に、５ＫＢＲ−３細胞はＴＡ ｂ　２５０抗体を最も効率的に内部化し、その抗体の５ＫＯＶ−３細胞およびＭ ＤＡ−ＭＢ−４５３内への取り込みは中間程度であることを示している（それぞ れ、パネルＣおよびＤ）。

：１９１１隻 ５ＰＤＰに［（±ユ≧尤西ｊ」σＭニ臣部侃４縫ジメチルフォルムアミド内のＮ −サクシミジル３−（２−ピリジルジチオ）（プロピネート）　（ＳＰＤＰ）を ３ｍｇｍ１の細胞株溶液として、乾燥ジメチルフォルムアミド内で調製した。

結晶性５Ｉ）ＤＰは加水分解を受けるので、化学的に反応性のあるクロスリンカ −の実際の濃度は、二重ビーム分光計で２６０ｎｍでの吸収度を分析することに よって、分光法で判定した５ＰＤＰ細胞株の濃度は、以下の式で計算した。

１、Ｏｍｌのフォスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）内の１ミリグラムのモノクロ ーナル抗体ＴＡｌ）２５０をガラス・チューブに加えた。５ｌ）ＤＰ細胞株溶液 を５モル程度過剰（１０μｍ程度の細胞株溶液）の割合で、継続的にかき混ぜな がら、チューブに加えた。この混合物を、室温で３０分間培養し、培養期間中、 ５分子σに攪拌した。

過剰の未反応５ＰＤＰを０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　（緩衝液Ａ）を含む１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝［ｐＨ７，０で予め均衡させたセファデックスＧ−２５カ ラム（Ｉ　Ｘ２４ｃｍ）上で、ゲルろ過グロマトグラフィーでサンプルから除去 した。その一部（０，５ｍ１）を集めて、ブラッドフォード色素結合アッセイ（ Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２　：　２４８−２５４　（１９７６）　）を用いて、そ の蛋白質含有率を分析した。Ｂｉ　ｏ−ＴＥＫマイクロプレート・オーロリーダ ーを用いて、９６−ウェル・プレート内で吸収度（６００ｎｍ）が観察された。

空隙容積（フラグジョン１４．−２０）で溶出された抗体およびそれらのフラク ションを集めて、４℃で保存した。

蛋白質はセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｒ＋）−３０マイクロコンセントレー タで濃縮された。このセントリコンレチンチー１・をＥＤＴＡ（０，５ｍＭ）を 含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。

この抗体は最終体積０．５−０．７５ｍ１に濃縮された。

１五丘並 ５ＰＤＰ−−モノクローナｋ　ｆ、　’ＴＡｂ　２５０とイミノチオラン自　゛ ロニンのｔ今 ユニ匹修ｌ」シＬ二２上ノびＴＡｂ　２５０の接合ＳＭＰＴと結合したＴＡｂ　 ２５０ゲロニンが、２−ＩＴ−修飾ゲロニンをＳＭＰＴ−修飾モノクローナル抗 体ＴＡｂ　２５０に結合させることによって分離した。簡単に言うと、ＳＭＰＴ でＴＡｂ　２５０を修飾するために、１．、ＯｍｌのＰＢＳ内のｌｏｍｇの抗体 を２ｘ硼酸塩緩衝液（０，０５Ｍ硼酸すトリウム１．７％塩化ナトリウム、ｐＨ ９，０）　テｌ　：１に希釈して、その抗体溶液に、乾燥ＤＭＦ中の４　ｍＭ　 ＳＭＰＴ　２５μ［をゆっくりと加える。この反応物をＮ、の存在下で攪拌しな がら２時間室温で培養する。さらに、これら反応物をフォスフニー１−ＥＤＴＡ 緩衝液、ｐＨ７，５を含むセファデックスＧ−２５カラムを通過させることによ って、過剰なＳＭＰＴが取り除かれ、ぞして、抗体ポジティブフラクションをＢ ｉｏ−Ｒａｄアッセイによって評価する。これらのフラグジョンを集めて、Ｎｔ の存注下、４℃の温度で保存する。Ｎ３の存在下、２７℃の温度で、９６時間、 攪拌しながら、２−ＩＴとのクロス−リンクを行う。最終的な生成物を、実例９ で５ＰＤＰに関して述べたのと同様の手順で精製する。

実例１で述べたのと同様に調製された精製ゲロニン（ＰＢＳ内に２　ｍｇ／＋１ 　）の１ミリグラムを、実例３で述べたのと同様の方法で、イミノチオレインで 修飾した。実例９で述べたように修飾されたモノクローナル抗体ＴＡｂ　２５０ を等量の修飾ゲロニンと混合した。この割合は、抗体に対してのゲロニンの５倍 モル過剰に相当するこの混合物のｐＨを０．０５Ｍ　ＴＥＡ／ＨＣＩ緩衝液ｐＨ ８，Ｏを加えて７．０に調整し、そしてその混合物を窒素の存在下、４℃の温度 で、２０時間培養した。遊離スルフヒドリル基の残留を防ぐために、ヨードアセ トアミド（０，１Ｍ）を最終濃度に調整されたちの２ｍＭに加えて、培養をさら に１時間、２５℃程度の温度で継続された。この反応混合物を４℃の温度で保存 し、ゲルろ過で精製を行った。

１思亘ユ ゲロニンーモノクローナル打　の　り 旦」二農皇左 非接合ゲロニンと低分子量精製物を、ＰＢＳで予めろ過したセファデックスＳ− ３００カラム（１，６ｘ　３１ｃｍ）上でゲルろ過を行うことによって、実例１ ０の反応混合物から取り出した。

実例１０からの反応混合物を、セファデックスカラムに入れる１ｉｉ７に、セン トリコン３０マイクロ濃縮器によって１ｍｌ程度に濃縮された。このカラムはＰ ＢＳによって洗浄した。１ｍｌフラクションを集め、その蛋白質含有率を調べる ために、その５０μｌをブラッドフォードアッセイで分析した。

０、ＩＭ　ＮａＣ１を含むＩ　Ｏ＋ｎＭフォスフェート緩衝液、ｐＨ７，２で予 め均衡化させたブルーセファロースＣＬ−６Ｂのカラム（ＬＸ２４ｃｍ）上での 親和性クロマトグラフィーによって取り出した。

Ｓ−３００溶離液を入れた後に、非接合抗体を完全に溶離するために、このカラ ムを同じ緩衝液３０ｍ１で洗浄した。

カラムに結合したゲロニン−接合抗体を１０ｍＭフォスフェート緩衝液、ｐＨ７ ，２内で、０．２−２Ｍ直接塩勾配（７）ＮａＣ１テ溶離した。この抗体−ゲロ ニン複合体は０．７Ｍ、ＮａＣ１で溶離した。溶離されたフラクションの蛋白質 含有率をブラッドフォード・アッセイで判定した。蛋白質含有フラクションを集 めて、５−２０％勾配非還元ポリアクリルアミド・ゲルでの電気泳動によって、 その溶離物のパターンが確認された。フロースルービーク（フラクション１４− ２０　）は遊離抗体のみを含んでいるが、高塩分で溶離されたフラクションは、 非接合ゲロニンまたは抗体を含まないＴＡｂ　２５０−ゲロニン接合体のみを含 んでいた。最終的な生成物は１，２および３ゲロニン分子と結合したＴＡｂ　２ ５０を含んでいた。平均ゲロニン含有率は抗体１分子あたり１．５分子であった 。基本的には純粋なゲロニン−ＴＡｂ　２５０複合体のゲロニン活性を評価する ために、ウサギ網状赤血球イン・ビトロ・トランスレーション・システムを用い た。

このアッセイでの活性の一単位は、特別の処理をしないコントロールと比較して 、蛋白質合成を５０％抑制するのに必要な蛋白質の量として定義された。このア ッセイを用いて、天然ゲロニンとＴＡｂ　２５０ゲロニン接合体の両方の特殊活 性が、それぞれ、２×１０°［ｊ／ｍｇおよび８．２　Ｘ　ＩＱ’　Ｕ　７ｍｇ と判定された。

基本的に純粋なゲロニン−ＴＡｂ　２５０抗体は網状赤血球溶解物アッセイで活 性である。最初のサンプルを１　：　１０００で希釈すると、蛋白質合成の５０ ％抑制、つまり、゛°Ｃ−ロイシンの蛋白質への取り込みの５０％抑制が起きた 。したがって、最初の調製物の活性は１０００　Ｕ　／ｍｌであった。

本発明による組成物は、ＴＡｂ　２５０モノクローナル抗体と細胞毒性部分との 溶融構造を含んでいた。本発明による免疫毒素は、例えば、以下の方法で調製さ れた。ｌ−１および［、鎖両方のＴＡｂ　２５０のｖｖＡ域のヌクレオチド配列 は簡単に判定することができる。例えば、カンジニウム（ｑｕａｎｄｉｎｉｕｍ ）　・チオシアネートでＴＡｂ　２５０生産細胞から総ＲＮＡを抽出する。ポリ Ａ＋ＲＮＡはオリゴ（ＧＴ）セルロースクロマトグラフィーによって分離するこ とができる。適切な遺伝子は、可逆転写およびＰＣＲ法などの標準的な技術で分 離することができる。ｃＤＮＡストランドはオリゴ−ｄＴプライマーおよび可逆 トランスクリプターゼを用いて合成することができる。こうしたｃＤＮＡストラ ンドは、適切なプライマーによる標準的なＰＣＲ法によって増幅することができ る。このメツセージのポリ−Ａテイル近くのプライマーは、ポリーＡ配列に基づ く場合と、マウス免疫グロブリン内に見いだされる共通のアジュバント配列のい ずれかに基づいている。ライスコンシン大学、バイオテクノロジー・センター、 遺伝学コンピュータ・グループのＤｅｖｅｒｅａｕｘおよびそれに関連した配列 データベース参照。遺伝子の他端のプライマーは、マウス免疫グロブリンに見い だされる共通配列から選択することもできる。０ｒｌａｎｄｉ　ｅｔ　ａｌ、　 （＋９８９）　ＰＮＡＳ　８６　：　３８３３−３８３７およびＬａｒｒｉｃｋ 　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７　：９３４− ９３８参照。ＴＡｂ　２５０重鎖遺伝子はＡＴＡＴＡＧ　ＣＡＧＧＡＣＣＡＴＡ ＴＧの５′アツプストリ一ム配列を有し、ＡＴＧＡＡ　ＣＴＴＧＧ　ＧＧＣＴＣ からコーディングが開始される。また、ＴＡｂ　２５０軽鎖遺伝子は、５′アツ プストリ一ム配列ＴＴＴＡＣＴＴＣＣＴ　ＴＡＴＴＴを有し、ＡＴＧＧＧ　ＣＡ ＴＣＡ　ＡＧＡＴＧ　テ：＋−ディングが開始される。ＰＣＫ技術によってこれ ら遺伝子を増幅するために、これらプライマーを用いることができ、プラズミド 表現ベクターにクローンすることができる。

エレクトロポレーションによるＤＮＡのマウスｆ　へのトランスフェクション これらの遺伝子に対しては、標準的なトランスフェクション法を用いることがで きる。例えば、ＤＮＡはエレクトロポレーションによって、マウスハイブリドー マ５ｐ２１０−ＡＧ１４内に導入することができる。１−２ＸＩＯ’急速に成長 する５Ｐ２１０−ＡＧＩ４細胞を洗浄して、１．ｏｍｌの無菌ＰＢＳ内に再懸濁 させる。この細胞懸濁液にキメラ性１ｇＫおよびＩｇＧ　ｌプラスミドを各３０ ミクログラムを加える。このＤＮＡ　／細胞を予め冷却したショツキング　クベ ットに移し、氷上で少なくとも５分間培養し、そして０．５ｋｖ／ｃｍ電子パル スをｌｏｍｓｅｃだけ与えた（トランスフェフタ−３００，ＢＴＸ）。ショック を与えた後、このＤＮ＾／細胞混合体を１０分間氷に戻し、５％ＮＣＴＣ−１０ ９および１０％ＦＣ５を含んでいるＤＭＥＮ　］ｈ＋１内で希釈し、そして、室 温で１０分間培養した。最後に、これらの細胞を７％Ｃ０８を含む３７℃培養器 に移して４８時間培養し、その後、ｌμｇ／ｍｇキサンチンを含む選択的培地に 移した。細胞は３×１０“細胞／ウェルの密度で、９６−ウェル・プレートに入 れ、ＴＡｂ　２５０抗原ポジテイブ標的細胞に結合した抗体を調査するために、 ＥＬＩＳＡによるアッセイが行われた。

１ｉ五二 ＮＴＴアッセイ ３−（４，５−ジメチル／チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾニウムブ ロマイド（ＭＴＴ）アッセイはベルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）　１　：　５０００ で組織培養フラスコから細胞を取り出し、５００Ｘｇで５分間遠心分離を行い、 それらの細胞を１×１０°細胞／＋ｎｌの濃度で培養液内に再懸濁した。細胞を １ＯＯｌｚｌ／ウエルの割合で９６−ウェルマイクロタイタープレートに入れ、 ３７℃の温度で、２４時間、加湿Ｃ０２培養器内で培養した。

次の日、ＴＡｂ　２５０またはＴＡｂ　２５０ゲロニンを加えた。最高濃度の抗 体を最初のカラムのウェル内に入れたら、すぐに、マルチチャネルピペットを用 いて、マイクロタイタープレート内で、抗体の１２希釈を直接行った。次に、プ レートを３日間培養してから、１０μｍ／ウェルの割合でＭＴＴを追加した。開 ＴＴは１）ＢＳの５　ｍｇ／ｍｌ　ｆ８液として調製、ろ過殺菌して、暗所で４ ℃の温度で保存した。プレートは暗所で保存し、３７℃の温度で、さらに４時間 培養した。ウェルの内容物を０．０４Ｎ　ＨＣＩおよび３％ナトリウムドデシル スルフェートと混ぜ合わせて溶解した。そして、酵素結合免疫吸収アッセイ（Ｅ ＬＩＳＡ）リーダーを用いて判定した。

１厘■旦 ＣＰＡ 細胞増殖アッセイ（ＣＰＡ）は細胞数および成長性を判定することによって、細 胞の成長の測定を行う。０日に、８０−９０％の融合度の細胞を組織培養フラス コから遊離して、２００×ｇで、２０℃の温度で６分間遠心分離を行ってペレッ ト化し、その後、２ｍＭグルタミンおよび１０％仔ウシつ児血清を含むＭＥＭに ６０００細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。この細胞懸濁液をｌウェルあたり１ ｍｌの割合で２４−ウェルプレートに加えた。このプレートを、５％Ｃ帆の存在 下、３７℃の温度で、２４時間培養した。１日に、３つのウェルの細胞をＰＢＳ で洗浄して、ＰＢＳ内に０．０５％トリプシンを加えたもの１ｍｌでプレートか ら遊離して、コウルターカウンターを用いて、５００μｍをカウントした。残り のウェルニは、２０μ１．　Ｉ）ＢＳ、　ＴＡｂ　２５０、あルイハＴＡｂ２５ ０−ゲロニンを、それぞれ図に示す濃度で加える。そして、プレートを培養器に 戻し、図に示されている時点で、それら細胞をトリプシンで遊離し、１０のデー タとしてカウトされる。のこりの５００μｍの細胞を沃化プロビジラムで染色す ると、フロー・サイトメＩ・リーによって成長性を判定することができる。グラ フの各点で、平均細胞数（ｎ＝３）が判定され、細胞数のパーセン（・をか（づ て、成長可能な細胞の数をめる。

これをＰＢＳで処理し７た生きた細胞の数で割って、Ｙ軸上のコントロールのパ ーセントをめる。

ｌ上側遅 ｊ」」ニ５ヒＬ話ヱ旦二≧コ択±四放体ＪＭｊｄｌヅυ引Ｉ工作図１に示されて いるように、ＺＭＥ抗体は５ＫＯＶ−３細胞にほとんど影響を及ぼさない。対照 的に、ＴＡ＋、＋　２５０−ゲロニン免疫接合体はｉＣｈ度に活性であった。

図２１は５ＫＯＶ−３細胞に対するＴＡｂ　２５０−ゲロニン免疫接合体の細胞 心性を、ゲロニンだけの場合と比較して示している。同じ濃度で、Ｔ　Ａ　ｂ　 ２５０−ゲロニン免疫接合体はゲロニンたけの場合と比較して１０，０００程度 高い細胞毒性を示した。

図３　ｉＪ、不適切な抗体、ＺＭＥモノクローナル抗体がＴＡｂ　２５０−ゲロ ニン免疫接合体の細胞毒性に関して、実質的な影響を及ぼさないことを示してい る。対照的に、ＴＡｂ　２５０モノクローナル抗体の濃度を増大すると、容量に 依存する形で、免疫接合体の細胞毒性は減少する。

図４は、５ＫＯＶ−３細胞に対するＴＡｂ　２５０−ゲロニン免疫接合体の用量 に対応した関係を示している。ＣＰＡアッセイの場合にも見られたように、Ｏｊ マイクログラム／ｍ１以上の用量は６１−１間の使用で８０％の抑止効果を生じ た。

図５は、モノグローナル抗体ＴＡｂ　２５０のみ、あるいは、ＴＡｂ２５０どゲ ロニンの接合体の５ＫＯＶ−３細胞に対する影響を示している。図に示されてい るように、ＣＰＡにおける丁Ａｂ　２５０−免疫接合体による用量に依存した抑 制効果が認められる。

図７は、４つの異なった細胞株に対するＴＡｂ　２５０−ゲロニン免疫接合体の 影響を示している。この図で分かるように、最大の毒性は５ＫＢＲ−３細胞株で 観察された。５ＫＯＶ−３細胞およテ、Ｆ　Ｍ　ＤＡ−ＭＢ−４５３細胞では明 らかであるが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においては細胞毒性は認められなかっ た。このように、ＴＡｂ　２５０−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性は、これらの 細胞内における細胞表面受容体を関連している。

結論として、ここで開示されている本発明およびその実施例は、冒頭に述べたよ うな目的を達成するのによく適合していることが分かるであろう。本発明の精神 および範囲を逸脱せずに、方法および装置に一定の修飾を加えることは可能であ る。さらに、以下の各請求項の各要素あるいはステップは、基本的に同様の方法 で基本的には同じ結果を達成するためのすべての同等の要素又はステップについ ても指しているものとして理解するべきである。

（山ｕｇ○シ） ％ ％ ％ 、、ｂ、１ｕｇ／ｍｌ　ＴＡｂ　２５０十０，０１　ｕｇ／ｍｌ　ＴＡｂ　２５ ０ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６４　ＦＩＧ、６８ ＦＩＧ、　６ＣＦＩＧ、　６Ｄ ％

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質に対する抗原ドメインに対して結合特性を示す蛋白 質と植物由来の毒素の接合体により構成され、上記毒素がゲロニン、全長組み替 えゲロニン、ゲロニンフラグメントおよびゲロニン誘導体により構成される組成 物。
2. ２．上記結合特性が。−ｅｒｂＢ−２の細胞外エピトープに対するものである請 求項１の組成物。
3. ３．上記蛋白質がＶＨセグメントで構成される請求項１の組成物。
4. ４．上記蛋白質が完全な免疫グロブリン重鎖で構成されている請求項１の組成物 。
5. ５．上記蛋白質がＶＬセグメントで構成されている請求項１の組成物。
6. ６．上記蛋白質がさらにＶＨセグメントを含んでいる請求項５の組成物。
7. ７．上記蛋白質が完全な免疫グロブリン軽鎖を含んでいる請求項１の組成物。
8. ８．上記蛋白質がさらに完全な免疫グロブリン重鎖を含んでいる請求項７の組成 物。
9. ９．上記蛋白質が単鎖抗体からのものである請求項１の組成物。
10. １０．上記蛋白質がＴＡｂ２５０またはＢＡＣｈ−２５０からのものである請求 項１の組成物。
11. １１．上記植物由来毒素が、上記標的部分に接合されない場合、ずっと低い細胞 影響を有する請求項１の組成物。
12. １２．上記毒素が天然の毒素および組み替え毒素により構成される群から選択さ れる請求項１の組成物。
13. １３．上記接合体が上記標的部分と上記成長調節子との間の融合蛋白質である請 求項１の組成物。
14. １４．請求項１の医薬品組成物。
15. １５．さらに、薬学的に許容可能なベヒクルを含んでいる請求項１の組成物。
16. １６．請求項１５の単一投与（ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅ）組成物。
17. １７．有効な量の請求項１による組成物を細胞に投与するステップで構成される 腫瘍細胞を措置するための方法。
18. １８．上記腫瘍細胞がｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質の過剰表現によって特徴づけられ る請求項１７の方法。
19. １９．上記細胞が哺乳動物悪性腫瘍細胞、卵巣，悪性腫瘍、肺悪性腫瘍細胞、唾 液腺悪性腫瘍細胞、胃癌細胞、唾液腺悪性腫瘍細胞、そして骨髄腫白血病細胞で 構成される群がら選択される請求項１７の方法。
20. ２０．上記組成物が上記細胞の成長速度を遅らせる請求項１７の措置法。
21. ２１．上記腫瘍細胞がヒトまたは動物のものである請求項１７の措置法。
22. ２２．上記組成物が腫瘍状態の再発を防ぐ請求項２１の措置法。
23. ２３．上記組成物が上記腫瘍細胞のホストの生き残り時間の措置法。
24. ２４．上記腫瘍細胞がイン・ビトロである請求項１７の措置法。
25. ２５．上記腫瘍細胞が骨髄腫瘍細胞である請求項１７の方法。
26. ２６．腫瘍性疾患を有する個人から骨髄腫瘍細胞を取り出すステップと、その骨 髄腫瘍細胞を細胞毒性的に有効な量だけ請求項１の組成物と接触させるステップ と、そして上記接触させられた骨髄腫傷を上記個人の体内に戻すステップとで構 成される、骨髄腫瘍の腫瘍細胞を殺す方法。
27. ２７．上記腫癌細胞がｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質の過剰表現で特徴づけられる請求 項２６の方法。