ES2224162T3

ES2224162T3 - Peptidos ndf.

Info

Publication number: ES2224162T3
Application number: ES96910630T
Authority: ES
Inventors: Josette Francoise Cranahan; Shinichi Hara; Hsieng Sen Lu; John Philip Mayer; Steven Kiyoshi Yoshinaga
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-04-06
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2016-03-27
Also published as: DK0820507T3; DE69633172D1; EP0820507B8; US5686415A; WO1996031599A1; EP0820507B1; PT820507E; JPH11503321A; CA2216165A1; AU5377196A; US5849705A; ATE274054T1; DE69633172T2; EP0820507A1; US5670342A; US5929032A; CA2216165C

Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS PEPTIDOS QUE SON DERIVADOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS DEL DOMINIO SIMILAR A EGF DE LAS NDF/HEREGULINAS Y QUE ESTIMULAN LA PROLIFERACION Y DIFERENCIACION DE CELULAS EPITELIALES DEL COLON Y APOYAN LA SUPERVIVENCIA Y EL CRECIMIENTO DE CELULAS DE SCHWANN.

Description

Péptidos NDF.

Área de la invención

Esta invención se refiere a péptidos nuevos derivados de polipéptidos de la familia denominada NDF/heregulina. Estos péptidos presentan propiedades biológicas como un factor mitógeno y de diferenciación para las células epiteliales del colon y como un factor trófico y mitógeno para las células de Schwann.

Antecedentes de la invención

La proteína llamada factor de diferenciación neu, o "NDF", es un polipéptido de 44 kilodaltons aislado originariamente de fibroblastos de rata que se ha visto que induce el crecimiento o diferenciación de células epiteliales; Peles et al., Cell, Volumen 69, páginas 205-216 (1992). Tanto esta proteína de roedores estable frente al calor como su homóloga humana, llamada heregulina, son proteínas secretadas que se purificaron originariamente mediante cromatografía de unión de heparina del medio de células cancerosas en cultivo; Peles et al., Cell, arriba, y Holmes et al., Science, Volumen 256, páginas 1205-1210 (1992). Se ha demostrado que diferentes factores de crecimiento de células gliales (GGF) aislados de tejido de cerebro bovino están relacionados con estas NDF/heregulinas; Marchionni et al, Nature, Volumen 362, páginas 312-318 (1993). De manera similar, se ha demostrado que un grupo de proteínas denominado ARIA, que tienen un peso molecular de 33 a 44 kilodaltons y que se han purificado de tejido cerebral de pollo en base a su actividad inductora del receptor de acetilcolina, están relacionadas estructuralmente con las NDF/heregulinas; Falls et al., Cell, Volumen 72, páginas 801-815 (1993). Actualmente se sabe que la familia de proteínas NDF/heregulina contiene al menos doce moléculas distintas. Se ha publicado que los miembros humanos homólogos de esta familia están codificados por un único gen, localizado en el cromosoma humano 8p^{12}-p^{21}, que contiene al menos 13 exones cuya organización precisa no se ha determinado; Orr-Urtreger et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, Volumen 90, páginas 1867-1871 (1993).

Las formas precursoras unidas a la membrana celular de estas proteínas (referidas en esta memoria como "proNDF/ heregulinas") son mosaicos de fracciones estructurales reconocibles. Incluyen un péptido señal hidrofóbico N-terminal, seguido bien de un dominio denominado "kringle" (que consiste en aproximadamente 250 restos de aminoácidos) o de una secuencia no hidrofóbica N-terminal (que consiste en aproximadamente 40 restos de aminoácidos). Otras regiones incluyen un dominio semejante al de inmunoglobulina (Ig) (aproximadamente 70 restos de aminoácidos), un dominio llamado "espaciador" que contiene numerosos sitios de unión para N- y O-glicosilación, un dominio semejante al del factor de crecimiento epidérmico (EGF) de aproximadamente 60-75 restos de aminoácidos que incluye 6 restos de cisteína, una región hidrofóbica de aproximadamente 25 restos de aminoácidos que funciona como un dominio transmembrana, y una "cola citoplasmática" que puede variar en longitud. Algunas de estas formas precursoras transmembrana sufren rotura proteolítica en la célula tanto en el extremo N-terminal como en una secuencia corta (yuxtamembrana) que conecta el dominio semejante a EGF con el dominio transmembrana. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos en esta región yuxtamembrana, las NDF/heregulinas se han designado subtipo 1, subtipo 2, subtipo 3, etc. Las variaciones adicionales comprenden dos formas del bucle C-terminal del dominio semejante a EGF, que se denominan alfa (\alpha) y beta (\beta), dependiendo de la secuencia de aminoácidos en esa región; Wen et al., Molecular and Cellular Biology, Volumen 14, Número 3, páginas 1909-1919 (1994).

Aisladas en un principio como una familia de moléculas que induce la fosforilación de restos de tirosina en el producto de la expresión del proto-oncogen erbB2/Her2, se pensó que las NDF/heregulinas eran un posible ligando de ese receptor; Peles et al., Cell, arriba; Wen et al., Cell, Volumen 69, páginas 559-572 (1992); Holmes et al., Science, arriba, y Bacus et al., Cancer Research, Volumen 53, páginas 5251-5261 (1993). Sin embargo, más recientemente se ha demostrado que las NDF/heregulinas se unen a y estimulan las proteínas receptoras codificadas por los genes conocidos como erbB3/Her3 y erbB4/Her4; Plowman et al., Volumen 366, páginas 473-475 (1993); Kita et al., FEBS Letters, Volumen 349, páginas 139-143 (1994); Carraway et al., The Journal of Biological Chemistry, Volumen 269, Número 19, páginas 14303-14306 (1994); y Carraway et al., Cell, Volumen 78, páginas 5-8 (1994). Los dominios semejantes a EGF de las diferentes NDF/heregulinas parecen ser responsables del reconocimiento del receptor y actúan de manera independiente de otras fracciones estructurales; véase Holmes et al., Science, arriba.

Se ha demostrado que in vitro las NDF/heregulinas son débilmente mitógenas para diferentes células epiteliales, incluyendo células epiteliales mamarias, de pulmón y gástricas; Holmes et al., Science, arriba. Sin embargo, determinadas células de tumor mamario sufren aparentemente una parada en su crecimiento en respuesta a NDF o a su homólogo humano; Peles et al., Cell, arriba; y Bacus et al., Cell Growth and Differentiation, Volumen 3, páginas 401-411 (1992). Las células tratadas presentan un fenotipo maduro que incluye una morfología plana, síntesis de la molécula intracelular de adhesión celular ICAM-1, y en el caso de células mamarias, la secreción de componentes de la leche; Bacus et al., Cell Growth and Differentiation, arriba; y Bacus et al.,Cancer Research, arriba. Se ha visto que los factores de crecimiento gliales (GGF) producidos por técnicas recombinantes son mitógenos para células de Schwann en cultivo, que de otra manera se dividen muy lentamente incluso en presencia de factores mitógenos conocidos; véase Marchionni et al., Nature, arriba. El miembro de la familia NDF/heregulina derivado de neuronas motoras conocido como ARIA parece que induce la síntesis de receptores de acetilcolina, y posiblemente de otras moléculas, en células musculares post-sinápticas; véase Falls, Cell, arriba.

Compendio de la invención

En base a estudios conducidos respecto a la localización de los extremos N- y C-terminales de la porción extracelular ("soluble") de polipéptidos NDF/heregulina unidos a membrana, se ha asignado un sitio de procesamiento C-terminal potencial a estos polipéptidos. Este extremo C-terminal se ha incorporado al diseño de dos formas de los polipéptidos de menor longitud dirigidas específicamente al dominio semejante a EGF. Estos péptidos, que son biológicamente activos, comprenden un aspecto de la presente invención. Específicamente, la presente invención proporciona un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:

SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARCQNYVMAS

(SEC ID NO:1), o

un péptido con la secuencia de aminoácidos siguiente:

SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMAS

(SEC ID NO:2)

La presente invención comprende además moléculas de ADN que codifican estos péptidos, vectores de expresión para dirigir la expresión de los péptidos codificados en las células anfitrionas, células anfitrionas eucariotas y procariotas transformadas o transfectadas útiles en la producción de los péptidos, un método para la producción recombinante de los péptidos, métodos de utilización de los péptidos en el tratamiento ex vivo de células, péptidos de la invención para ser utilizados en terapia humana, composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos como un componente biológicamente activo, y utilizaciones de los péptidos de la invención para la fabricación de células in vivo, para producir la proliferación, crecimiento y diferenciación de células epiteliales de colon in vivo, para tratar una enfermedad o trastorno del colon, para promover la reepitelización del colon o para tratar una enfermedad o trastorno del sistema nervioso.

La invención se basa en el descubrimiento de una subregión importante en el dominio semejante a EGF conocido de las NDF-heregulinas extracelulares, encontrándose esta subregión cerca del extremo C-terminal y extendiéndose desde el resto de aminoácido 222 al resto de aminoácido 228 de la NDF/heregulina extracelular (que corresponde a la numeración de la secuencia de aminoácidos de la solicitud PCT publicada WO 94/28133, como se explica con más detalle más adelante). Más específicamente, actualmente se ha aceptado que la secuencia de siete restos de aminoácidos de 222 a 228 en la forma \beta de las NDF/heregulinas extracelulares confiere una actividad biológica mayor en los ensayos mostrados en la presente memoria que la secuencia correspondiente de la forma \alpha de las NDF/heregulinas extracelulares, a pesar de la identidad de secuencia en el resto de la molécula. Este hecho ha permitido el diseño y construcción de péptidos biológicamente activos que son capaces de duplicar los efectos fisiológicos de las NDF/heregulinas de mayor longitud, a la vez que permiten una mayor facilidad potencial de administración en determinadas administraciones terapéuticas debido a su menor tamaño.

Más aún, como se verá a partir de los resultados biológicos presentados más adelante, los péptidos de esta invención son útiles en cantidades eficaces apropiadas como factores de crecimiento de células epiteliales de colon humanas y de células de Schwann, y poseen la capacidad de estimular la proliferación y maduración de estas células. De acuerdo con esto, estos péptidos se pueden utilizar como nutrientes para la supervivencia y estudio de estas células en cultivo, y, de manera potencial, como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades o condiciones que resultan en deficiencias, deterioro o anormalidades de estas células en el cuerpo.

Descripción breve de las figuras

Figura 1. Esta figura es un dibujo esquemático (no está en escala proporcional) de la estructura extracelular de la NDF/heregulina humana, que comprende (distante del extremo que se une a la membrana celular): la región potencial N-terminal que "une heparina", un dominio semejante a inmunoglobulina (Ig), un dominio de carbohidrato (o "espaciador"), y un dominio semejante a EGF próximo al extremo C-terminal. Los círculos abiertos en el dominio espaciador representan azúcares unidos en O y los círculos cerrados ramificados representan azúcares unidos en N. También se muestran cuatro enlaces disulfuro, uno de los cuales está en el dominio semejante a Ig y tres de los cuales están en el dominio semejante a EGF. Los números designan las posiciones de los restos de aminoácidos en puntos seleccionados a lo largo de la cadena polipeptídica, empezando de manera secuencial desde el extremo N-terminal y terminando hacia el extremo C-terminal. El dominio semejante a EGF empieza aproximadamente en el resto de aminoácido de la posición 177 (marcado) y termina aproximadamente en el resto de aminoácido de la posición 228 (no marcado).

Figura 2. Esta figura es una representación gráfica del efecto proliferativo de los péptidos de la invención en células epiteliales de colon humanas in vitro. Estos péptidos se designan en la figura como EGF-\beta (SEC ID NO: 2, arriba), representado por los círculos cerrados, y como EGF-\alpha/\beta (SEC ID NO: 1, arriba), representado por los círculos abiertos. Por motivos de comparación, se incluyen dos péptidos más de igual longitud, designados como EGF-\alpha y EGF-\beta/\alpha, y representados por los cuadrados cerrados y abiertos, respectivamente. Los dos últimos son homólogos basados en el dominio EGF de NDF/heregulinas extracelulares y consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas más adelante en este texto (SEC ID NOS: 3 y 4, respectivamente). La proliferación se determina con la tinción cristal violeta que tiñe la proteína celular y es indicativa del número de células. Los resultados se muestran en el eje vertical en unidades de veces de estimulación, que es la absorbancia de las células tratadas con el péptido dividida por la absorbancia de las células no tratadas. La concentración picomolar (pM) del péptido utilizado para tratar las células se muestra en el eje horizontal. Los mejores resultados de proliferación celular se obtienen con EGF-\beta y EGF-\alpha/\beta, de acuerdo con la invención. Se obtuvo alguna proliferación con EGF-\alpha, aunque es claramente inferior a EGF-\beta y EGF-\alpha/\beta. No se observó ningún efecto con EGF-\beta/\alpha.

Figura 3. Esta figura comprende microfotografías de actina marcada con fluorescencia en células epiteliales de colon humanas LIM 1215, bien sin tratamiento (panel superior) o incubadas durante tres días con suero fetal bovino 5% (FBS, panel inferior). En ausencia de tratamiento (panel superior), las células tienen una apariencia pequeña y redondeada. Las células mostraron algún cambio con el tratamiento con FBS, y aparecen ligeramente más grandes.

Figura 4. Esta figura comprende microfotografías de actina marcada con fluorescencia en células epiteliales de colon humanas LIM 1215, después de una incubación durante tres días con EGF-\alpha (comparación, panel superior) y con EGF-\beta (esta invención, panel inferior). Se observa evidencia de cambios en la morfología celular en las células tratadas con EGF-\beta, pero no en las células tratadas con EGF-\alpha. Todos los péptidos se añadieron a una concentración de 420 picomolar.

Figura 5. Esta figura comprende microfotografías de actina marcada con fluorescencia en células epiteliales de colon humanas LIM 1215, después de una incubación durante tres días con EGF-\beta/\alpha (comparación, panel superior) y con EGF-\alpha/\beta (esta invención, panel inferior). Como en el caso de EGF-\beta (Figura 4, más arriba), se observa evidencia de desarrollo celular y maduración en las células tratadas con EGF-\alpha/\beta. Por el contrario, las células tratadas con
EGF-\beta/\alpha aparecen sin cambios. Todos los péptidos se añadieron a una concentración de 420 picomolar.

Descripción detallada de la invención

Los estudios llevados a cabo respecto a los ADNc para las formas \alpha y \beta de NDF/heregulina extracelular, expresados en células de ovario de hamster chino (CHO), han tenido éxito en la localización del extremo C-terminal en el resto de aminoácido 228 como el sitio principal de rotura proteolítica. Utilizando las NDF/heregulinas particulares conocidas como \alpha2 y \beta1, se diseñaron varios péptidos en base a la identidad con u homología con los dominios semejantes a EGF en esas proteínas. Como se utiliza en la presente memoria, las proteínas referidas como "\alpha2" y "\beta1" son aquellas que han sido descritas en la solicitud PCT WO 94/28133, publicada el 8 de Diciembre de 1994. La secuencia de \alpha2 (desde el resto de aminoácido 1 hasta el resto de aminoácido 462) se muestra en la Figura 32 de la solicitud PCT (véase también SEC ID NO: 8 en la solicitud PCT). La secuencia de \beta1 se muestra parcialmente (desde el resto de aminoácido 95 hasta el resto de aminoácido 645) en la Figura 35 de la solicitud PCT publicada (véase también SEC ID NO: 14 en la solicitud PCT). Los primeros noventa y cuatro restos de aminoácidos (extremo N-terminal) de \beta1, que no se muestran en la Figura 35 de PCT, son idénticos a los primeros noventa y cuatro restos de aminoácidos de \alpha2 mostrados en la Figura 32 de PCT. En la Figura 1 de la presente descripción se muestra una representación de la porción extracelular ("soluble") de las formas \alpha y \beta de NDF/heregulina.

Los estudios iniciales referidos a los péptidos utilizados en la presente memoria se basaron exclusivamente en secuencias del dominio semejante a EGF de las formas \alpha2 y \beta1 de NDF/heregulina mencionadas anteriormente, es decir, la porción de la proteína extracelular desde el resto de aminoácido 177 hasta el resto de aminoácido 228 (véase la Figura 1 de la presente memoria). Los estudios revelaron que el péptido \beta, referido en la presente memoria como EGF-\beta, era más activo biológicamente que el péptido \alpha (EGF-\alpha) en determinados ensayos. La razón de esta diferencia no resultó aparente en un inicio. Sin embargo, durante los estudios de mapeo peptídico de los dominios semejantes a EGF de las NDF/heregulinas, se descubrió que las formas \alpha y \beta se rompían (degradaban) a diferentes velocidades cuando se sometían a digestión con endoproteinasa Lys-C. Específicamente, la forma \beta era más resistente a esta enzima y se rompía a menor velocidad. Más aún, este fenómeno parecía limitado al resto de lisina en la posición 211. No se observó una diferencia aparente en la velocidad de rotura entre \alpha y \beta en otros restos de lisina en el extremo N-terminal del dominio semejante a EGF. Esta observación sugirió que la conformación estructural de la región de la molécula que contiene la lisina 211 puede ser diferente entre las formas \alpha y \beta, dando lugar a una rotura enzimática más rápida en el caso de la forma \alpha.

Además, se observó que la secuencia de aminoácidos en el dominio semejante a EGF de las formas \alpha y \beta era idéntico desde la posición del resto de aminoácido 177 hasta la posición del resto de aminoácido 212. Se supuso que la diferencia en la susceptibilidad a la rotura podía ser debida a diferenciales conformacionales en el extremo C-terminal del dominio semejante a EGF, desde el resto de aminoácido 212 hasta el resto de aminoácido 228. Este razonamiento sugería que el extremo C-terminal podía ser crítico para la actividad biológica e incitó la síntesis de dos quimeras para probar y confirmar esta hipótesis. Específicamente, estos dos péptidos quiméricos se basaron en el "intercambio" de la secuencia de aminoácidos 222-228 entre EGF-\alpha y EGF-\beta, con el fin de estudiar el efecto en la actividad biológica de esta secuencia. En total, se sintetizaron cuatro péptidos, incluyendo los dos péptidos quiméricos mencionados anteriormente. Los cuatro péptidos tenían las secuencias siguientes:

(1) SHLVK (A) QNYVMAS, o EGF-\alpha/\beta	(SEC ID NO:1)
(2) SHLVK (B) QNYVMAS, o EGF-\beta	(SEC ID NO:2)

(3) SHLVK (A) TENVPMK, o EGF-\alpha	(SEC ID NO:3)
(4) SHLVK (B) TENVPMK, o EGF-\beta/\alpha	(SEC ID NO:4)

en los que "(A)" indica la secuencia de aminoácido

CAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARC (SEC ID NO:5),

y

"(B)" indica la secuencia de aminoácido

CAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRC (SEC ID NO:6).

La longitud relativamente corta de estos péptidos se presta en sí misma a preparación para síntesis química, utilizando el método siguiente.

Síntesis química de los péptidos

Cada péptido se preparó por el método químico en fase sólida para la síntesis de péptidos basado en Fmoc (fluorenil-metoxicarbonilo)/t-butilo. Se utilizó un instrumento ABI-431 (Applied Biosystems, Foster City, CA), con un único programa de acoplamiento, para realizar el ensamblaje de la cadena peptídica empezando con una resina de poliestireno derivatizada con hidroximetil-fenilacetilo (HMP) disponible comercialmente. El acoplamiento del resto C-terminal mediado por diciclohexilcarbodiimida (DCC), FmocLys (t-Boc)OH, se catalizó con 4-dimetilaminopiridina (DMAP). Todos los restos posteriores se acoplaron bien como anhídridos simétricos o como ésteres de hidroxibenzotriazol (HOBt). Después de terminar la síntesis, cada resina de péptido se secó en vacío durante toda la noche, y se sometió después a desprotección acidolítica y rotura utilizando 20 ml de una mezcla que comprendía ácido trifluoracético: tioanisol: \beta-mercaptoetanol: agua: fenol en una proporción 80:5:5:5:5, respectivamente. Después de agitar durante cuatro horas a temperatura ambiente, se filtró la suspensión, el filtrado se concentró (utilizando un evaporador con rotación), y el péptido crudo se precipitó utilizando éter dietílico frío.

El péptido se resuspendió inmediatamente en 50 ml de un tampón de guanidina 8 M que contenía 100 mM de ditiotreitol (DTT) y 50 mM de TRIS, ajustado a pH 8. Después de agitar durante varias horas a temperatura ambiente, la disolución se aplicó a una columna preparativa de fase reversa Vydac C_{4} y se eluyó con un gradiente 0-60% de 0,1% TFA/acetonitrilo durante una hora, utilizando un sistema de suministro de disolvente Beckman modelo 114M. Las fracciones con el mejor perfil analítico se juntaron y se liofilizaron.

Las condiciones óptimas para el plegamiento del péptido para obtener un producto activo comprendieron disolver el material lineal (a aproximadamente 1 mg/ml) en un tampón que consistió en 25 mM de TRIS, pH 8, 1 mM de EDTA, 1 mM (para las formas \alpha) o 0,5 mM (para las formas \beta) de glutation (oxidado) y 1 mM de glutation (reducido), y agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. El material oxidado, plegado, se aisló utilizando una columna preparativa de fase reversa (YMC Co., Ltd., Japón) equipada con un termostato equilibrado a 40ºC y se eluyó con un gradiente 0,1% TFA/acetonitrilo.

La homogeneidad de los productos finales se evaluó mediante HPLC y CZE analítico. La caracterización completa se consiguió mediante análisis de aminoácidos, espectrometría de masas con electropulverización, secuenciación parcial, y fragmentación enzimática.

Proliferación de las células de colon a) Ensayo de proliferación con cristal violeta

Se creció la línea celular epitelial de colon humana, LIM 1215 (Whitehead, R.H. et al., J. Natl. Cancer Inst. 4:759-765, 1985) en medio RPMI-1640 suplementado con 5% FBS, 1 \mug/ml de hidrocortisona, 1 \mug/ml de insulina bovina, 10 \muM de alfa tioglicerol, y 1X PSG (0,292 mg/ml de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina G, y 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina). Al comienzo del ensayo, las células estaban un 30% confluentes y estaban proliferando rápidamente. Las células se despegaron con tripsina, se lavaron con PBS, y se sembraron en placas de 96 pocillos a 5.000 células/pocillo en medio (McCoy-5A suplementado con 4 \mug/ml de transferrina, 10 \mug/ml de insulina, 10 mM de ácido selénico, 4 nM de triyodotironina, y 0,03% BSA) con una concentración de suero baja (0,05%). Las diluciones del péptido a ensayar se añadieron inmediatamente en el día cero; el volumen total fue 100 \mul. Los controles incluyeron sin tratamiento y diluciones seriadas de FBS. Las placas de 96 pocillos se incubaron entonces durante tres días a 37ºC en una atmósfera con 5% CO_{2}. El medio se eliminó por aspiración y se añadieron 30 \mul de cristal violeta 2% (Difco) en metanol a las células durante quince minutos de tinción. El exceso de colorante se eliminó con agua destilada. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de HCl 0,04 N en isopropanol y el colorante se volvió a solubilizar mezclando. La absorbancia se determinó a 595 nm y los valores se representaron como veces de estimulación sobre la línea basal (o sin tratamiento).

b) Estimulación de la proliferación de las células de colon

Se trataron las células LIM 1215 con los péptidos mencionados anteriormente, y los resultados se muestran en la Figura 2. Como se muestra en la figura, EGF-\beta estimuló la proliferación de las células LIM 1215, mientras que EGF-\alpha no resultó un mitógeno tan potente. Esto sugiere que un determinante importante de la actividad mitógena reside en los últimos dieciséis aminoácidos de la porción C-terminal de EGF-\beta que corresponde a los aminoácidos 213-228 de la NDF/heregulina extracelular de longitud completa a la que se hace referencia más arriba. Los péptidos quiméricos ayudaron a concretar este determinante de actividad en los siete restos que corresponden a los aminoácidos 222-228 de la NDF/heregulina extracelular de longitud completa. Específicamente, EGF-\alpha/\beta consiste en los primeros cuarenta y cinco restos de aminoácidos de la porción N-terminal de EGF-\alpha y en los últimos siete restos de aminoácidos de la porción C-terminal de EGF-\beta (o \alpha177-221/\beta222-228 que corresponden a la numeración de aminoácidos de NDF/heregulina extracelular de longitud completa). A la inversa, EGF-\beta/\alpha consiste en los primeros cuarenta y cinco restos de aminoácidos de la porción N-terminal de EGF-\beta y en los últimos siete restos de aminoácidos de la porción C-terminal de EGF-\alpha (o \beta177-221/\alpha222-228 que corresponden a la numeración de aminoácidos de NDF/heregulina extracelular de longitud completa). Mientras EGF-\alpha/\beta presenta una actividad mitógena significativa en las células de colon LIM1215, EGF-\beta/\alpha no presentó ningún efecto detectable en las mismas condiciones (véase la Figura 2). Estos resultados demuestran muy claramente que la actividad mitógena de los péptidos reside en el extremo C-terminal del péptido. Más específicamente, el mayor grado de actividad es atribuible a los últimos siete restos de aminoácidos del dominio semejante a EGF de la forma \beta.

c) Tinción de las células humanas de colon LIM 1215 con marcador fluorescente

Las células LIM 1215 se crecieron en medio RPMI-1640 suplementado con 5% FBS, 1 \mug/ml de insulina bovina, 10 \muM de alfa tioglicerol, y 1X PSG. En el momento del ensayo, las células estaban por encima del 30% de confluencia y estaban proliferando rápidamente. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a 25.000 células/pocillo en medio sin suero (McCoy-5A, suplementado con 4 \mu/ml de transferrina, 10 \mug/ml de insulina, 10 mM de ácido selénico, 4 mM de triyodotironina, y 0,03% BSA). Los péptidos a ensayar se añadieron a una concentración de 420 picomolar inmediatamente en el día cero; el volumen total fue 1,0 ml. Los controles incluyeron sin tratamiento y diluciones seriadas de FBS. Las placas de 24 pocillos se incubaron entonces durante tres días a 37ºC y con 5% CO_{2}, después de lo cual se eliminó el medio por aspiración y las células se lavaron con 1,0 ml de PBS con 0,5% de BSA. Todos los lavados posteriores se llevaron a cabo con este tampón. Las células se fijaron entonces en Orthopermeafix (Ortho Chemicals Co.) durante treinta minutos a temperatura ambiente, y se lavaron dos veces. Se añadieron entonces 200 \mul de una disolución 10 nM de marcador fluorescente NBD faloidina en PBS y las células se incubaron en oscuridad (envueltas en papel de aluminio) durante treinta minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces, y se observaron utilizando un microscopio confocal.

d) Actividad morfogénica de los péptidos en células epiteliales de colon

Después del tratamiento de las células LIM 1215 con el péptido EGF-\beta, resultó evidente que la morfología de las células cambiaba dramáticamente. La Figura 3 muestra la tinción de los filamentos de actina de las células (véase más arriba el procedimiento) después de no recibir tratamiento (panel superior) y después del tratamiento con 5% FBS (panel inferior). En ausencia de tratamiento, las células aparecían pequeñas y redondeadas. En presencia de FBS, las células cambiaron en apariencia, volviéndose sólo un poco más grandes pero permaneciendo redondeadas. Por el contrario, en presencia de EGF-\beta (Figura 4, panel inferior) las células sufrieron un cambio importante en su morfología, volviéndose más grandes y con una apariencia semejante a guijarros. Por otra parte, EGF-\alpha (Figura 4, panel superior) no produjo los mismos cambios morfogénicos. Al estar las células proliferando rápidamente en medio que contenía 5% de suero (Figura 3), la morfología causada por el péptido EGF-\beta no podía deberse únicamente a su capacidad de estimular la proliferación. Más aún, la diferencia en las actividades morfogénicas entre EGF-\beta y EGF-\alpha debía haberse originado en los últimos dieciséis aminoácidos del extremo C-terminal, al ser ésta la única diferencia en la secuencia de los dos péptidos.

Se obtuvo una localización adicional de la actividad morfogénica mediante la utilización de los péptidos quiméricos, EGF-\alpha/\beta y EGF-\beta/\alpha. Como se observa en la Figura 5, EGF-\alpha/\beta produjo cambios morfogénicos aparentes en las células LIM 1215 (panel inferior), mientras EGF-\beta/\alpha, no produjo ningún cambio apreciable (panel superior). De nuevo, la única diferencia en la secuencia de estos dos péptidos es los últimos siete aminoácidos de la porción C-terminal.

Se obtuvo una confirmación adicional de la importancia de esta secuencia de siete aminoácidos por puntuación de diferentes proteínas marcadoras en las células LIM 1215. Se utilizó un citómetro ACAS de imagen confocal para detectar un número de marcadores en las células sin despegar las células de la placa de cultivo, como se hace habitualmente en el análisis de separación de células activada por fluorescencia (FACS). Los datos presentados en la Tabla 1, más abajo, muestran que EGF-\beta produjo una expresión incrementada (+) del antígeno carcinoembrionario (CEA) y de integrina \beta4. Por el contrario, la expresión de vilina se redujo (-) por EGF-\beta. La expresión de otros marcadores no cambió (0) por tratamiento con EGF-\beta. De manera análoga a los resultados previos en la caracterización de cambios morfológicos observables, ni EGF-\alpha ni EGF-\beta/\alpha cambiaron los niveles de estas proteínas marcadoras, mientras que EGF-\alpha/\beta cambió la expresión de las proteínas marcadoras de manera similar a la observada con EGF-\beta.

TABLA 1 Expresión de las proteínas marcadoras

Proteína marcadora	EGF-\alpha	EGF-\beta	EGF-\alpha/\beta	EGF-\beta/\alpha
CEA	0	+	+	0
Integrina \beta4	0	+	+	0
Vilina	0	-	-	0

Los tratamientos para el cáncer implican terapia química o de radiación que resulta en una destrucción grave de la capa epitelial del colon. Los resultados precedentes indican que los péptidos de la invención pueden promover la reepitelización del colon y aliviar los efectos negativos causados por el daño al epitelio intestinal.

Supervivencia y proliferación de células de Schwann

También se evaluó la actividad neurobiológica de los péptidos mediante el estudio de sus efectos en la supervivencia y el crecimiento de células de Schwann, como se describe más adelante.

Se utilizó el nervio ciático de ratas neonatales para generar un cultivo primario de células de Schwann. Las células se sembraron durante toda la noche en 10% de suero sin exposición a ningún factor de crecimiento. Al día siguiente, se añadieron EGF-\beta, EGF-\alpha/\beta y EGF-\beta/\alpha a las concentraciones en nanogramos por mililitro (ng/ml) mostradas en la Tabla 2, más adelante. Veinticuatro horas después, se añadió BrdU a cada muestra de ensayo durante seis horas. BrdU es un análogo de timidina que se incorpora en el ADN de células en división y que puede detectarse mediante procedimientos estándar de inmunoquímica. Este agente proporciona, por lo tanto, un medio para determinar la expansión de la cantidad total de ADN en una muestra de ensayo y es una medida de si la proliferación celular se ha producido. Después de terminar el periodo de ensayo, las células de Schwann se fijaron y se analizaron por medios inmunohistoquímicos. Las células se tiñeron primero para el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), que es un marcador conocido de las células de Schwann en cultivo, seguido de tinción con BrdU. El contaje celular se llevó a cabo como sigue: en una campo de visión dado del microscopio, se contaron todas las células de Schwann reconocibles, después se contó el número de células que presentaban una tinción positiva con BrdU. Para cada muestra de ensayo (o pocillo) se contaron dos o tres campos, lo que supuso aproximadamente 200 a 300 células de Schwann en total. El resultado se expresa en la Tabla 2 como el porcentaje de células de Schwann que estaban proliferando.

TABLA 2 Proliferación de células de Schwann

Concentración del Péptido,	EGF-\beta	EGF-\alpha/\beta	EGF-\beta/\alpha
ng/ml
0	1	1	1
0,1	7,5	1	1
1	13	10	2
10	14	10	5
100	19	17	10

Como se puede deducir de estos resultados, tanto EGF-\beta como EGF-\alpha/\beta estimularon la proliferación de las células de Schwann en una medida significativamente mayor que EGF-\beta/\alpha.

Los resultados del ensayo presentados más arriba respecto a EGF-\beta y EGF-\alpha/\beta indican la utilidad de estos péptidos como agentes para la supervivencia, crecimiento y proliferación de células epiteliales de colon y de células de Schwann. Como mínimo, estos péptidos serán útiles para crecer estas células en cultivo para estudio e investigación, y además, para la producción de tejido para ser utilizado en terapias de implantación en pacientes que lo necesiten. Serán especialmente interesantes los pacientes que sufran condiciones o enfermedades que implican deficiencias en, o pérdidas de, estas células. En el caso particular de las células epiteliales de colon, estas condiciones incluyen úlceras y colitis, que implican déficits, o deterioro, de las células epiteliales de colon. Los péptidos de esta invención son prometedores como factores de crecimiento para el tratamiento terapéutico de estas condiciones, bien empleados ex vivo para el crecimiento de tejido para reemplazar o utilizados in vivo para la producción in situ de estas células y tejidos.

En el sistema nervioso periférico, las células de Schwann, que constituyen una clase de células gliales, son responsables de la formación de la cubierta de mielina que rodea y aisla los axones en los vertebrados. La importancia funcional de la mielina se ha recalcado por los graves deterioros en la función motora observados en las enfermedades llamadas desmielinizantes, que incluyen esclerosis múltiple y esclerosis amiotrófica lateral, que están asociadas a una degeneración extensa de la cubierta de mielina en el sistema nervioso central. El daño traumático del sistema nervioso periférico implica habitualmente la destrucción de la mielina que debe ser reparada para una cicatrización apropiada. Como demuestran los resultados mostrados, los péptidos de esta invención resultan útiles para mantener la supervivencia, crecimiento y proliferación de las células de Schwann en cultivo, suponiendo, por lo tanto, una fuente de estas células para la implantación en sitios desmielinizados que resultan de daño nervioso periférico. También es posible que la administración in vivo de estos péptidos, formulados apropiadamente, resulte en la regeneración y proliferación de las células de Schwann utilizadas en el reemplazo, dando lugar a remielinización y cicatrización de heridas.

La utilización de los péptidos de esta invención de acuerdo con los métodos de aplicación mencionados anteriormente, se encuentra dentro de la capacidad de un médico preparado. La cantidad eficaz de péptido para el tratamiento de una enfermedad o condición particular in vivo dependerá de la naturaleza específica de la enfermedad o condición, y dichas cantidades pueden ser determinadas por técnicas clínicas estándar. Cuando sea posible, es deseable determinar la curva de dosis-respuesta y las composiciones farmacéuticas de la invención primero in vitro, en sistemas de bioensayo conocidos, y después en sistemas de animales útiles antes de ensayarse en seres humanos. Los métodos de administración in vivo incluyen, pero no están necesariamente limitados a, administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, oral o intradermal.

Aún más, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesite el tratamiento. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante una infusión local durante una operación, inyección, catéter, o implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, como membranas sialásticas, o fibras.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos administrados a través de liposomas, micropartículas, o microcápsulas. En varias realizaciones de la invención, puede resultar útil utilizar dichas composiciones para alcanzar una liberación constante. Los péptidos de la invención pueden administrarse en cualquier vehículo estéril compatible biológicamente, incluyendo, pero no limitándose a, disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa y agua, como tales, o, si se desea, junto con cualquier aditivo adecuado.

Aunque la producción de los péptidos se ha ilustrado específicamente respecto a la síntesis química, los métodos convencionales de producción recombinante proporcionan una alternativa adecuada para su preparación. A modo de ilustración, una secuencia de nucleótido que codifica el péptido puede insertarse en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traslación de la secuencia insertada que codifica el péptido. Se pueden utilizar varios sistemas anfitrión-vector para expresar la secuencia que codifica el péptido. Estos sistemas incluyen, pero no están limitados a, sistemas celulares de mamífero infectados con virus (por ejemplo, virus de la vacuna, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos como levaduras que contengan vectores de levaduras, o bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN de plásmido, o ADN de cósmido. Los elementos de expresión de estos vectores varían en cuanto a su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema anfitrión-vector utilizado, puede utilizarse uno cualquiera de un número de elementos de transcripción y traslación adecuados.

Cualquiera de los métodos descritos previamente para la inserción de fragmentos de ADN en un vector puede utilizarse para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que consista en señales de control apropiadas y en secuencias que codifiquen péptidos. Estos métodos pueden incluir técnicas recombinantes de ADN in vitro y técnicas sintéticas y recombinaciones in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de manera que el péptido se exprese en un anfitrión transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión puede controlarse por cualquier elemento promotor/amplificador conocido en el campo.

Una vez que se ha establecido un sistema anfitrión y unas condiciones de crecimiento apropiadas, los vectores recombinantes de expresión pueden propagarse y prepararse en cantidad. Como se ha explicado previamente, los vectores de expresión que pueden utilizarse incluyen, pero no están limitados a, los vectores siguientes o sus derivados: virus humanos o animales, como virus de la vacuna o adenovirus; virus de insectos como baculovirus; vectores de levadura; vectores bacteriófagos (por ejemplo, lambda), y vectores de ADN de plásmidos y cósmidos, por nombrar algunos.

El péptido expresado resultante puede aislarse y purificarse por métodos estándar, incluyendo cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, o de exclusión), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la mencionada purificación.

Los métodos de producción recombinante descritos en la solicitud PCT WO 94/28133 mencionada previamente resultan particularmente apropiados para ser utilizados en la presente memoria.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: Amgen Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos NDF

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): NOMBRE: Amgen Inc.

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(B): CALLE: 1840 Dehavilland Drive

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(C): CIUDAD: Thousand Oaks

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: EEUU

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(F): CÓDIGO POSTAL: 91320

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(v): FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1,0, Versión #1,25

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(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE SOLICITUD:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Mazza, Richard J.

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/FACTURA: A-310

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn}

\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr}

\sac{Leu Cys Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Gln Asn Tyr}

\sac{Val Met Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn}

\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr}

\sac{Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr}

\sac{Val Met Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn}

\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr}

\sac{Leu Cys Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Thr Glu Asn}

\sac{Val Pro Met Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn}

\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr}

\sac{Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Thr Glu Asn}

\sac{Val Pro Met Lys}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe}

\sac{Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Gln}

\sac{Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys }

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe}

\sac{Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro}

\sac{Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys}

Claims

1. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:

SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARCQNYVMAS

(SEC ID NO:1), o

un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos siguiente:

SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMAS

(SEC ID NO:2).

2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que es el producto de una síntesis química.

3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que es el producto recombinante de la expresión eucariota o procariota de una secuencia de ADN exógena.

4. Una molécula de ADN que codifica un péptido de la reivindicación 1.

5. Una célula anfitriona procariota o eucariota transformada o transfectada de manera estable con una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un plásmido circular o un vector de ADN viral funcional desde un punto de vista biológico, que incluye una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 4.

7. Una célula anfitriona procariota o eucariota transformada o transfectada de manera estable con un vector de ADN de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula de E. coli transformada o transfectada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 7.

9. Un procedimiento para la producción de un péptido, que comprende cultivar, bajo condiciones adecuadas de nutrientes, una célula anfitriona procariota o eucariota transformada o transfectada con una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 4 o con un vector de ADN de acuerdo con la reivindicación 6, de manera que se permita a la célula anfitriona expresar el péptido, y, opcionalmente, aislar el péptido.

10. Una composición farmacéutica, que comprende un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y un diluyente, adyuvante o vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

11. Un método ex vivo para mantener la supervivencia de células de Schwann, que comprende poner dichas células en contacto con una cantidad eficaz de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

12. Un método ex vivo para producir la proliferación de células de Schwann, que comprende poner dichas células en contacto con una cantidad eficaz de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

13. Un método ex vivo para producir la proliferación, crecimiento y diferenciación de células epiteliales de colon, que comprende poner dichas células en contacto con una cantidad eficaz de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13, que se lleva a cabo en cultivo celular.

15. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para utilizarse en terapia humana.

16. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para utilizarse en el mantenimiento de la supervivencia de células de Schwann in vivo.

17. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para utilizarse para producir la proliferación de células de Schwann in vivo.

18. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para utilizarse para producir la proliferación, crecimiento y diferenciación de células epiteliales de colon in vivo.

19. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad o trastorno del colon.

20. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 19, donde la enfermedad o trastorno es colitis.

21. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 19, donde la enfermedad o trastorno es una úlcera.

22. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para promover la reepitelización del colon.

23. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para tratar una enfermedad o trastorno del sistema nervioso.

24. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 23, donde la enfermedad o trastorno implica deficiencias o anormalidades en, o deterioro o pérdida de, células de Schwann.

25. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 23, donde la enfermedad o trastorno comprende daño nervioso causado por un trauma.

26. Utilización de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para mantener la supervivencia de células de Schwann in vivo.

27. Utilización de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para producir la proliferación de células de Schwann in vivo.

28. Utilización de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para producir la proliferación, crecimiento y diferenciación de células epiteliales de colon in vivo.

29. Utilización de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno del colon.

30. Una utilización de acuerdo con la reivindicación 29, donde la enfermedad o trastorno es colitis.

31. Una utilización de acuerdo con la reivindicación 29, donde la enfermedad o trastorno es una úlcera.

32. Utilización de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para promover la reepitelización del colon.

33. Utilización de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno del sistema nervioso.

34. Una utilización de acuerdo con la reivindicación 33, donde la enfermedad o trastorno implica deficiencias o anormalidades en, o deterioro o pérdida de, células de Schwann.

35. Una utilización de acuerdo con la reivindicación 33, donde la enfermedad o trastorno comprende daño nervioso causado por un trauma.