JPH11503321A

JPH11503321A - Ｎｄｆペプチド

Info

Publication number: JPH11503321A
Application number: JP8530376A
Authority: JP
Inventors: クラナハン，ジヨゼツト・フランソワーズ; ハラ，シンイチ; ルー，シエン・セン; メイヤー，ジヨン・フイリツプ; ヨシナガ，ステイーブル・キヨシ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1995-04-06
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 1999-03-26
Also published as: CA2216165C; ES2224162T3; EP0820507B1; US5849705A; US5929032A; PT820507E; WO1996031599A1; EP0820507A1; AU5377196A; EP0820507B8; CA2216165A1; DE69633172D1; DK0820507T3; US5686415A; ATE274054T1; US5670342A; DE69633172T2

Abstract

(57)【要約】ＮＤＦ／ヘレグリン類のＥＧＦ様ドメインの生物学的に活性な誘導体であり、結腸上皮細胞の増殖および分化を促進し、シュワン細胞の生存および成長を支持する新規なペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＮＤＦペプチド発明の分野本発明は、いわゆるＮＤＦ／ヘレグリン族のポリペプチドから誘導される新規なペプチドに関する。これらのペプチドは、結腸上皮細胞では有糸分裂誘起／分化因子として並びにシュワン細胞では栄養／有糸分裂誘起因子としての生物学的特性を示す。発明の背景ｎｅｕ分化因子即ちＮＤＦと呼ばれる蛋白質は、上皮細胞の成長または分化を誘導することが示されてきたラット線維芽細胞から初めて単離された４４キロダルトンのポリペプチドである；Peles等，Cell，69巻，205-216ページ(1992)。ヘレグリンと呼ばれる、この熱に安定な齧歯動物蛋白質及びそのヒト相同体の両者は、培養癌細胞の培地からヘパリン結合クロマトグラフィーにより初めて精製された分泌蛋白質である；Peles等，Cell，上記，および Holmes 等，Science，25 6 巻，1205-1210ページ(1992)。ウシ脳組織から単離されたいくつかのグリア細胞成長因子（ＧＧＦ）は、これらのいわゆるＮＤＦ／ヘレグリン類と関係があることが分かっている；Marchionni 等，Nature，362 巻，312 -318ページ(1993)。同様に、分子量３３から４４キロダルトンの範囲でありそのアセチルコリン受容体誘導活性に基づいてニワトリの脳組織から精製されたＡＲＩＡと呼ばれる蛋白質の群は、ＮＤＦ／ヘレグリン類と構造的に関係があることが示されてきた；Falls 等，Cell，72巻，801-815ページ(1993)。ＮＤＦ／ヘレグリン族の蛋白質は、今日では、少なくとも１２の異なる分子を有することが公知である。この族のヒト相同体構成員は、その正確なゲノム構成は決定されていない少なくとも１３のエクソンを有するヒト染色体８ｐ¹²−ｐ²¹に位置する単一の遺伝子によりコードされていることが報告されている；Orr-Urtreger 等，Pro ceedings of the National Academy of Science，USA，90巻，1867-1871ページ( 1993)。これらの蛋白質の細胞膜に結合した前駆体型（本明細書では゛ｐｒｏＮＤＦ／ヘレグリン類゛と称する）は、認識可能な構造モチーフのモザイクである。これらは、Ｎ−末端疎水性シグナルペプチドに続いて、いわゆる゛クリングル゛ドメイン（約２５０のアミノ酸残基から成る）またはＮ−末端非疎水性配列（約４０のアミノ酸残基から成る）のいずれかを含む。他の領域としては、免役グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（約７０のアミノ酸残基）、Ｎ−およびＯ−結合型グリコシル化用の多数の結合部位を含有するいわゆる゛スペーサー゛ドメイン、６個のシステイン残基を含む約６０−７５のアミノ酸残基の上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、膜貫通ドメインとして機能する約２５のアミノ酸残基の疎水性領域、並びに鎖長を変えることのできる゛細胞質ティル゛が含まれる。これらの膜貫通性前駆体型のいくつかは、Ｎ−末端および、ＥＧＦ様ドメインと膜貫通ドメインとを接続する短い配列［膜近傍(juxtamembrane)］の両方の位置で、細胞内で蛋白質分解切断を受ける。この膜近傍領域のアミノ酸配列に依存して、ＮＤＦ／ヘレグリン類は、サブタイプ１、サブタイプ２、サブタイプ３等と命名されている。更なる変形例は、この領域のアミノ酸配列に依存してアルファ（α）およびベータ（β）と呼ばれる、ＥＧＦ様ドメインの２つの型のＣ−末端ループを含む；Wen 等，Molecular and Cellular Biology，14巻，３号，1909-1919ページ( 1994)。ｅｒｂＢ２／Ｈｅｒ２プロトオンコジーン発現生成物のチロシン残基のリン酸化を誘導する分子族として初めて単離されたＮＤＦ／ヘレグリン類は、最初、多分その受容体のリガンドであろうと考えられた；Peles等，Cell，上記；Wen等，Cell，69巻，559-572ページ（1992）；Holme s等，Science，上記およびBacus 等，Cancer Research，53巻，5251-5261ページ (1993)。しかしながら、更に最近では、ＮＤＦ／ヘレグリン類は、ｅｒｂＢ３／Ｈｅｒ３およびｅｒｂＢ４／Ｈｅｒ４として知られている遺伝子によりコードされる受容体蛋白質と結合し、その蛋白質を刺激することが示されている；Plowma n 等，366 巻，473-475ページ(1993);Kita等，FEBS Letters，349巻，139-143ページ（1994）；Carraway 等，The Journal of Biological Chemistry，269巻，1 9号，14303-14306ページ（1994）；および Carraway等，Cell，78巻，5-8ページ (1994)。種々のＮＤＦ／ヘレグリン類のＥＧＦ様ドメインは、受容体認識に関与すると考えられ、他の構造モチーフから独立して作用する；Holmes 等，Scicenc e，上記,参照。インビトロで、ＮＤＦ／ヘレグリン類は、乳房、肺および胃の上皮細胞を含む種々の上皮細胞において弱く有糸分裂を誘起することが分かっている；Holmes 等，Science，上記。しかしながら、ある種の乳癌細胞は、明らかに、ＮＤＦ又はそのヒト相同体に応答して成長阻止を受ける；Peles 等，Cell，上記；および Bacus 等，Cell Growth and Differentiation，3 巻，401-411ページ(1992)。処理した細胞は、扁平形態、細胞内の細胞接着分子ＩＣＡＭ−１の合成、および乳房細胞の場合、乳成分の分泌を含む成熟表現型を示す;Bacus等，Cell Growth and Differ entiation，上記；およびBacus 等，Cancer Research，上記。組み換え法により生成したグリア細胞成長因子（ＧＧＦ）は、さもなくば公知の有糸分裂誘起因子の存在下においてさえ非常に緩慢に分裂する培養シュワン細胞に対し有糸分裂誘起性であることが観察されている；Marchionni 等，Nature，上記，参照。運動ニューロンが誘導するＡＲＩＡとして知られるＮＤＦ／ヘレグリン族構成員は、後シナプス筋肉細胞によりアセチルコリン受容体、及びおそらくは他の分子類、の合成を誘導すると考えられる；Falls，Cell，上記,参照。発明の概要膜結合ＮＤＦ／ヘレグリンポリペプチドの細胞外可溶性゛)部分のＮ−およびＣ −末端の位置に関して行われた研究に基づき、推定上のＣ−末端プロセシング部位は、これらのポリペプチドに帰属されてきた。このＣ−末端は、特にＥＧＦ様ドメインに関わるポリペプチドの２つのより短鎖型の設計に組み入れられてきた。生物学的に活性であり本発明の一態様を成すこれらのペプチドは、それぞれ、以下のアミノ酸配列を有する：ＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＱＰＧＦＴＧＡＲＣＱＮＹＶＭＡＳ（配列番号：１）、およびＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳ（配列番号：２）本発明は、更に、これらのペプチドをコードするＤＮＡ分子、宿主細胞中でのコードされたペプチドの発現を指令する発現ベクター、これらのペプチドの生産に有用な形質転換した又はトランスフェクションした真核および原核宿主細胞、これらのペプチドの組み換えによる生産方法、細胞のエクスビボ（exvivo）治療およびヒトの治療におけるこれらのペプチドの使用方法、ならびに生物学的に活性な成分としてこれらのペプチドを含有する組成物を含んで成る。本発明は、細胞外ＮＤＦ−ヘレグリン類の公知のＥＧＦ様ドメイン内の重要な亜領域（subregion）の発見に基づいており、この亜領域は、Ｃ−末端近くにあり、細胞外ＮＤＦ／ヘレグリンのアミノ酸残基２２２からアミノ酸残基２２８まで伸びている（更に下記で詳細を説明するように、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／２８１３３号のアミノ酸配列番号付けに対応する）。更に詳しくは、細胞外ＮＤＦ／ヘレグリン類のβ型中の２２２から２２８までの７個のアミノ酸残基は、細胞外ＮＤＦ／ヘレグリン類のα型由来の対応する配列と比較して、分子の残りの配列の同一性にも拘わらず、ここで示すアッセイ法で、より高い生物学的活性を付与することが認められている。この認識は、より長い鎖長のＮＤＦ／ヘレグリン類の生理学的作用を二倍にすることのできる生物学的に活性なペプチドの設計および構築を可能にし、一方、その小さいサイズのため、特定の治療目的投与における非常に容易な送達を潜在的に可能にする。更に、下記に更に示した生物学的結果から分かるように、本発明のペプチドは、ヒト結腸上皮およびシュワン細胞成長因子として、このような細胞の増殖および成熟を促進する能力を有することから、適切で効果的な量で有用である。よって、これらのペプチドは、培養中のこのような細胞の生存および研究のための栄養素として、ならびに潜在的に、体内のこのような細胞の欠落、悪化または異常に起因する疾患または症状の治療用治療薬として利用可能である。図面の簡単な説明図１．この図は、（細胞膜に結合した末端から遠位に）推定上のＮ−末端゛ヘパリン結合゛領域、免役グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、炭水化物（または゛スペーサー゛）ドメイン、およびＣ−末端に近いＥＧＦ様ドメインを含むヒトＮＤＦ／ヘレグリンの細胞外構造の模式図（比例した尺度ではない）である。スペーサードメイン内の白丸は、Ｏ−結合型糖を表し、枝分かれした黒丸は、Ｎ−結合型糖を表す。１つはＩｇ様ドメイン内にあり、他の３つはＥＧＦ様ドメイン内にある４つのジスルフィド結合も示す。番号は、ポリペプチド鎖に沿って選択した個所でのアミノ酸残基の位置を示しており、Ｎ−末端から連続的に開始しＣ−末端の方に移動する。ＥＧＦ様ドメインは、ほぼアミノ酸残基位置１７７（印を付けた）で始まり、ほぼアミノ酸残基位置２２８（印を付けなかった）で終わる。図２．この図は、インビトロでのヒト結腸上皮細胞に対する本発明のペプチドの増殖効果をグラフ表示したものである。これらのペプチドは、この図では、黒丸により表されるＥＧＦ− β（配列番号：２、上記）、および白丸により表されるＥＧＦ−α／β（配列番号：１、上記）と呼ぶ。比較のために、それぞれ黒四角および白四角により表されるＥＧＦ−αおよびＥＧＦ−β／αと命名した、同じ鎖長の２つの他のペプチドを含めた。後者の２つは、細胞外ＮＤＦ−ヘレグリン類のＥＧＦドメインに基づく相同体であり、本文の更に下記で示すアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：３および４）から成る。増殖は、細胞蛋白を染色し、細胞数を示しうるクリスタルバイオレット染料を用いて測定している。結果は、縦軸に未処理の細胞の吸光度で割ったペプチド処理した細胞の吸光度である促進倍数の単位で示す。細胞を処理するために用いたペプチドのピコモル（ｐＭ）濃度を、横軸に示す。細胞増殖のための最良の結果が、本発明によるＥＧＦ−βおよびＥＧＦ−α／βで見られる。明らかにＥＧＦ−βおよびＥＧＦ−α／βより劣っているが、いくらかの増殖がＥＧＦ−αで得られた。ＥＧＦ−β／αでは何の効果も見られなかった。図３．この図は、非処理（上方のパネル）または５％ウシ胎児血清と一緒に３日間インキュベーションした（ＦＢＳ、下方のパネル）のいずれかのＬＩＭ１２１５ヒト結腸上皮細胞中の蛍光標識したアクチンの顕微鏡写真から成る。非処理（上方パネル）では、細胞は、小さく丸く見えた。ＦＢＳ処理した細胞は、いくらかの変化を示し、僅かに大きく見える。図４．この図は、ＥＧＦ−α（比較、上方のパネル）およびＥＧＦ−β（本発明、下方のパネル）と一緒に３日間のインキュベーション後のＬＩＭ１２１５ヒト結腸上皮細胞中の蛍光標識したアクチンの顕微鏡写真から成る。細胞の形態学的変化の証拠が、ＥＧＦ−βで処理した細胞では見られるが、ＥＧＦ−αで処理した細胞では見られない。全てのペプチドは、４２０ピコモル濃度で加えた。図５．この図は、ＥＧＦ−β／α（比較、上方のパネル）およびＥＧＦ−α／ β（本発明、下方のパネル）と一緒に３日間のインキュベーション後のＬＩＭ１２１５ヒト結腸上皮細胞中の蛍光標識したアクチンの顕微鏡写真から成る。ＥＧＦ−β（図４、上記）と同様に、細胞の発達および成熟の証拠が、ＥＧＦ−α ／βで処理した細胞で見られる。対照的に、ＥＧＦ−β／αで処理した細胞は、変化していないように見える。全てのペプチドは、４２０ピコモル濃度で加えた。発明の詳細な説明チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現した、細胞外ＮＤＦ／ヘレグリンのαおよびβ型に対するｃＤＮＡに関して行った研究は、蛋白質分解切断の第一の部位としてアミノ酸残基２２８の位置にＣ−末端を位置づけることに成功した。α２およびβ１として公知である特定のＮＤＦ／ヘレグリン類を用い、これらの蛋白質内のＥＧＦ様ドメインとの同一性または相同性に基づいて、いくつかのペプチドを設計した。本明細書で用いたような゛α２゛および゛β１゛と呼ばれる蛋白質は、１９９４年１２月８日に公表されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／２８１３３号で開示されたものである。α２の配列（アミノ酸残基１からアミノ酸残基４６２まで）は、該ＰＣＴ出願の図３２（その中の配列番号：８も参照のこと）に示されている。β１の配列は、公表されたＰＣＴ出願の図３５（その中の配列番号１４も参照のこと）に部分的に（アミノ酸残基９５からアミノ酸残基６４５まで）示されている。ＰＣＴの図３５に示されていない、β１の初めの９４個のアミノ酸残基（Ｎ−末端）は、ＰＣＴの図３２に示されたα２の初めの９４個のアミノ酸残基と同じである。ＮＤＦ／ヘレグリンのαおよびβ型の細胞外（゛可溶性゛）部分の描写を、本説明の図１に示す。本明細書で参照した初めの研究は、ＮＤＦ／ヘレグリンの前述のα２およびβ １型のＥＧＦ様ドメインの配列、即ち、アミノ酸残基１７７からアミノ酸残基２２８までの細胞外蛋白質のその部分（本明細書の図１参照）にのみ基づくペプチドを用いた。研究は、本明細書でＥＧＦ−βと称するβペプチドが、特定のアッセイでαペプチド（ＥＧＦ−α）より生物学的に活性であることを示した。この相違の理由は、初め明らかではなかった。しかしながら、ＮＤＦ／ヘレグリン類のＥＧＦ様ドメインのペプチドマッピング研究中、エンドプロテイナーゼＬｙｓ −Ｃによる消化に供した場合、αおよびβ型が異なる速度で切断（分解）されたことを見い出した。特に、β型は、この酵素に抵抗性であり、より遅い速度で切断される。更に、この現象は、２１１の位置のリシン残基に限定されているようである。ＥＧＦ様ドメインのＮ−末端内の他のリシン残基ではαおよびβ間の切断の速度に明白な相違はなかった。この観察は、リシン−２１１を含有する分子の領域の立体構造が、αおよびβ間で異なり、α型のより速い酵素的切断をもたらしているかもしれないことを示唆した。更に、αおよびβ型のＥＧＦ様ドメイン内のアミノ酸配列が、１７７の位置のアミノ酸残基から２１２の位置のアミノ酸残基まで同一であることを特記する。切断に対する感受性の相違は、アミノ酸残基２１２からアミノ酸残基２２８までの、ＥＧＦ様ドメインのＣ−末端における立体構造の相違に起因するに違いないことが推測された。この理論的解釈は、Ｃ−末端が生物学的活性のために重要であるかもしれないことを示唆し、この仮説の更なる調査および確認のための２つのキメラの合成を促した。詳しくは、これらの２つのキメラペプチドは、この配列の生物学的活性に対する影響を研究するための、ＥＧＦ−αおよびＥＧＦ−β の間での２２２−２２８のアミノ酸配列の゛スイッチング゛に基づいた。前述の２つのキメラペプチドを含め全部で４つのペプチドを合成した。４つのペプチドは、以下の配列を有する：（１）SHLVK（A）QNYVMAS、即ちEGF-α/β（配列番号：１）（２）SHLVK（B）QNYVMAS、即ちEGF-β（配列番号：２）（３）SHLVK（A）TENVPMK、即ちEGF-α（配列番号：３）（４）SHLVK（B）TENVPMK 、即ちEGF-β/α（配列番号：４）ここで、゛（Ａ）゛は、アミノ酸配列 CAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARC（配列番号：５）を表し、゛（Ｂ）゛は、アミノ酸配列 CAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRC（配列番号：６）を表す。比較的短い鎖長のこれらのペプチドは、以下の方法を用いた化学合成による調製に適していた。ペプチドの化学合成各ペプチドを、ペプチド合成のためのＦｍｏｃ（フルオレニル−メトキシカルボニル）／ｔ−ブチルに基づいた固相化学法により調製した。単一のカップリングプログラムをもつＡＢＩ−４３１装置（Applied Biosystems，Foster City，C A）を用いて、ヒドロキシメチル−フェニルアセチル（ＨＭＰ）で誘導体化した市販のポリスチレン樹脂で開始するペプチド鎖組立てを実施した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）が仲介するＣ−末端残基、ＦｍｏｃＬｙｓ（ｔ −Ｂｏｃ）ＯＨのカップリングは、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）が触媒した。続く残基の全ては、対称無水物またはヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステルのいずれかとして結合した。合成完了後、各ペプチド樹脂を、一晩真空乾燥し、次いで、それぞれ８０：５：５：５：５の比のトリフルオロ酢酸：チオアニソール：β− メルカプトエタノール：水：フェノールから成る２０ｍｌの混合物を用いた酸分解による脱保護および切断に供した。室温で４時間攪拌後、懸濁液を濾過し、濾液を（ロータリーエバポレーターを用いて）濃縮し、粗ペプチドを、冷ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。このペプチドを、直ちに、ｐＨ８に調整した１００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）および５０ｍＭのトリス(ＴＲＩＳ)を含有する５０ｍｌの８Ｍのグアニジン緩衝液に懸濁した。室温で数時間の攪拌後、溶液を、ＶｙｄａｃＣ４分取用逆相カラムにアプライし、Ｂｅｃｋｍａｎモデル１１４Ｍ溶媒供給システムを用い、１時間にわたり０−６０％勾配の０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルで溶出した。最良の分析プロフィールを有する画分をプールし、凍結乾燥した。活性な生成物を得るためのペプチド折り畳みの最適条件は、この直鎖状の物質（約１ｍｇ／ｍｌ）を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ（α型の場合）または０．５ｍＭ（β型の場合）のグルタチオン（酸化型）および１ｍＭのグルタチオン（還元型）から成る緩衝液に溶解し、室温で一晩攪拌することを含んだ。酸化され折りたたまれた物質を、４０℃で平衡にしたサーモスタットジャケットを装備した分取用逆相カラム（YMC Co.,Ltd.,日本）を用い、緩やかな（shallow）０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出して単離した。最終生成物の均一性を、分析用ＨＰＬＣおよびＣＺＥにより評価した。完全な特徴が、アミノ酸分析、エレクトロスプレー質量分析、パーシャルプレビュー配列決定、および酵素的切断により提供された。結腸細胞増殖ａ）クリスタルバイオレット増殖アッセイヒト結腸上皮細胞系、ＬＩＭ１２１５（Whitehead，R.H.等，J．Natl．Canc er Inst．4:759-765，1985）を、５％ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１μｇ／ｍｌのウシインスリン、１０μＭのアルファチオグリセロール、および１ＸＰＳＧ（０．２９２ｍｇ／ｍｌの１−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン）を追加したＲＰＭＩ−１６４０培地で生育させた。アッセイの開始時には細胞は３０％集密であり、急速に増殖した。細胞をトリプシンにより遊離し、ＰＢＳで洗浄し、低血清（０．０５％）培地（４μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０ｍＭのセレン酸、４ｎＭのトリヨードチロニン、および０．０３％のＢＳＡを追加したＭｃＣｏｙ’ｓ−５Ａ）中の細胞を、９６ウェルのプレートに５０００細胞／ウェルで接種した。試験ペプチドの希釈物をゼロ日に直ちに加え、全容量を、１００μｌにした。対照は、非処理およびＦＢＳの連続希釈物を含んだ。９６ウェルのプレートを、次いで、５％ＣＯ₂雰囲気下３７℃で３日間インキュベートした。培地を吸引により除去し、メタノール中の２％クリスタルバイオレット（Difco）３０μｌを、１５分間の染色のために、細胞に加えた。過剰の染料を蒸留水で洗い流した。各ウェルにイソプロパノール中の０.０４ＮのＨＣｌ１００μｌを加え、混合により染料を再可溶化した。吸光度を５９５ｎｍで測定し、値を、バックグラウンド（または非処理）に対する促進倍数（fo ld-stimulation）としてプロットした。ｂ）結腸細胞増殖の促進ＬＩＭ１２１５細胞を上記のペプチドで処理し、結果を図２に示す。図に示すように、ＥＧＦ−βは、ＬＩＭ１２１５細胞の増殖を促進したが、一方、ＥＧＦ−αは、それほど効力ある有糸分裂促進剤ではなかった。これは、有糸分裂促進活性の強力な決定基が、上述の全長の細胞外ＮＤＦ／ヘレグリンの２１３−２２８のアミノ酸に相当するＥＧＦ−βのＣ−末端部分の最後の１６個のアミノ酸に存することを強く示唆する。キメラペプチドは、全長の細胞外ＮＤＦ／ヘレグリンの２２２−２２８のアミノ酸に相当する７個の残基にこの活性の決定基を正確に位置付けるのに役立った。詳しくは、ＥＧＦ−α／βは、ＥＧＦ−αのＮ−末端部分から最初の４５個のアミノ酸残基およびＥＧＦ−βのｃ−末端部分から最後の７個のアミノ酸残基（または全長の細胞外ＮＤＦ／ヘレグリンのアミノ酸番号付けに対応するα１７７−２２１／β２２２−２２８）から成る。逆に、ＥＧＦ−β／αは、ＥＧＦ− βのＮ−末端部分から最初の４５個のアミノ酸残基およびＥＧＦ−αのＣ−末端部分から最後の７個のアミノ酸残基（または全長の細胞外ＮＤＦ／ヘレグリンのアミノ酸番号付けに対応するβ１７７−２２１／α２２２−２２８）から成る。ＥＧＦ−α／βは、ＬＩＭ１２１５結腸細胞に対し著しい有糸分裂促進活性を示したが、ＥＧＦ−β／αは、同じ条件下で検出可能な作用を示さなかった（図２参照）。これらの結果は、ペプチドの有糸分裂促進活性が、ペプチドのＣ−末端に存することを非常に明瞭に示す。更に詳しくは、最大の活性は、β型のＥＧＦ様ドメインから最後の７個のアミノ酸残基に帰因する。ｃ）ＬＩＭ１２１５ヒト結腸細胞の蛍光染料を用いた染色ＬＩＭ１２１５細胞を、５％ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのウシインスリン、１０ μＭのアルファチオグリセロール、および１ＸＰＳＧを追加したＲＰＭＩ− １６４０培地で生育させた。アッセイ時には細胞は３０％以上集密であり、急速に増殖した。無血清培地（４μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０ｍＭのセレン酸、４ｍＭのトリヨードチロニン、および０．０３％のＢＳＡを追加したＭｃＣｏｙ’ｓ−５Ａ）中の細胞を、２４ウェルのプレートに２５，０００細胞／ウェルで接種した。試験ペプチドを４２０ピコモルの濃度でゼロ日に直ちに加え、全容量を１．０ｍｌにした。対照は、非処理およびＦＢＳの連続希釈物を含んだ。２４ウェルのプレートを、次いで、５％ＣＯ₂、３７℃で３日間インキュベートした後、培地を吸引により除去し、細胞を、０．５％ＢＳＡを含有する１．０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。続く全ての洗浄を、この緩衝液で行った。細胞を、次いで、室温で３０分間 Orthopermeafix(Ortho Chemicals Co.)中で固定し、２回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中の１０ｎＭのＮＢＤファロイジン蛍光染料２００μｌを加え、細胞を、暗所（アルミホイルで包む）で３０分間室温でインキュベートした。細胞を、２回洗浄し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。ｄ）結腸上皮細胞に対するペプチドの形態形成活性ＬＩＭ１２１５細胞のＥＧＦ−βペプチドでの処理により、細胞の形態が劇的に変化したことは明白であった。図３は、非処理後（上方パネル）および５％ＦＢＳで処理後（下方パネル）の細胞のアクチンフィラメントの染色（手法については上記参照）を示す。非処理では、細胞は、小さく丸く見える。ＦＢＳの存在下では、細胞は、外観が変化し、丸みは残っているが僅かに大きくなった。対照的に、ＥＧＦ−βの存在下では（図４、下方パネル）、細胞は、形態学的に注目すべき変化をし、大きくなり丸石様の外観を呈した。一方、ＥＧＦ−α（図４、下方パネル）は、同じ形態学的変化をしなかった。細胞が５％ＦＢＳ血清含有培地で急速に増殖した（図３）ことから、ＥＧＦ−βペプチドにより引き起こされたユニークな形態学は、増殖を促進するその能力のみに起因するはずがなかった。更に、ＥＧＦ−βおよびＥＧＦ−α間の形態形成活性の相違は、それが２つのペプチド間の配列の相違のみであることから、ｃ−末端の最後の１６個のアミノ酸に帰因したに違いなかった。形態形成活性の更なる局在が、キメラペプチドＥＧＦ−β／αおよびＥＧＦ− α／βの使用により得られた。図５から分かるように、ＥＧＦ−α／βは、ＬＩＭ１２１５細胞の明白な形態学的変化を起こし（下方パネル）、一方、ＥＧＦ −β／αは、注目すべき変化を起こさなかった（上方パネル）。再度、これら２つのペプチド間の配列の相違は、Ｃ−末端部分の最後の７個のアミノ酸である。この７個のアミノ酸配列の重要性の更なる確認が、ＬＩＭ１２１５細胞に対する種々のマーカー蛋白質を評価することにより得られた。ＡＣＡＳ共焦点画像血球計算器を用い、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析では通常行われているように、培養皿から細胞を脱着することなく細胞上の多数のマーカーを検出した。下記の表１に示したデータは、ＥＧＦ−βが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびインテグリンβ４の増加した発現（＋）を引き起こしたことを示す。逆に、ビリン発現は、ＥＧＦ−βによりダウンレギュレート（−）された。いくつかの他のマーカーの発現は、ＥＧＦ−βでの処理により変化しなかった（０）。全体的な観察可能な形態学的変化を特徴づける前述の結果と同様に、ＥＧＦ−αまたはＥＧＦ−β／αのいずれも、これらのマーカー蛋白質のレベルを変化させず、一方、ＥＧＦ−α／βは、マーカー蛋白質の発現をＥＧＦ−βで観察されたものと同様の様式で変化させた。化学療法または放射線療法を含む癌治療は、結腸の上皮層の重篤な破壊に帰する。前述の結果は、本発明のペプチドが、結腸の再上皮形成を促進し、腸上皮に対する損傷により引き起こされた悪影響を緩和することができることを示す。シュワン細胞生存および増殖また、本ペプチドの神経生物学的活性を、下記のように、シュワン細胞の生存および成長に対するその影響を調査する事により評価した。新生児ラット由来の坐骨神経を用いてシュワン細胞の一次培養物を得た。この細胞を、いずれの成長因子にも露出することなく１０％血清中で一晩平板培養した。翌日、下記の表２に示したミリリットル当たりナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）の濃度でＥＧＦ−β、ＥＧＦ−α／βおよびＥＧＦ−β／αを加えた。２４時間後、ＢｒｄＵを、６時間各供試試料に加えた。ＢｒｄＵは、分裂している細胞のＤＮＡ中に取り込まれるチミジン類似体であり、標準免役化学手法により検出することができる。従って、この物質は、供試試料中のＤＮＡの全量の増加を測定する手段を提供し、細胞増殖が起こったかどうかの尺度である。試験期間終了後、シュワン細胞を固定し、免役組織化学的に分析した。細胞を、まず、培養中のシュワン細胞の公知のマーカーである神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）を染色し、続いてＢｒｄＵを染色した。細胞カウントを以下のように行った：所定の顕微鏡視野で、全ての認識可能なシュワン細胞をカウントし、次いで、ＢｒｄＵ染色で陽性を示す細胞の数もカウントした。各供試試料（またはウェル）について２または３視野でカウントし、全部で約２００から３００のシュワン細胞数とした。結果を、シュワン細胞増殖のパーセントとして表２に示す。これらの結果から分かるように、ＥＧＦ−βおよびＥＧＦ−α／βの両方が、ＥＧＦ−β／αと比較して著しく大きくシュワン細胞の増殖を促進した。ＥＧＦ−βおよびＥＧＦ−α／βに関して上記で示した試験結果は、結腸上皮細胞およびシュワン細胞の生存、成長および増殖のための物質としてのこれらのペプチドの有用性を示している。最低でも、これらのペプチドは、調査研究のために、および更には移植治療を必要とする患者にその治療に使用する組織の生産のために、培養でこのような細胞を生育するのに利用可能である。特別な興味があるのは、このような細胞の欠落または喪失に関連した症状または疾患を患っている患者である。特に結腸上皮細胞の場合、このような症状としては、潰瘍および大腸炎（colitis）が挙げられ、その両方が、結腸上皮細胞の欠損または悪化を含む。本発明のペプチドは、置換組織を生育するためにエクスビボで用いようと又はこのような細胞および組織のその場での産生にインビボで用いようと、このような症状の治療的処置のための成長因子としての有用性を確約する。末梢神経系において、グリア細胞種を構成するシュワン細胞は、脊椎動物において軸索を取り囲み絶縁する髄鞘の形成に関与する。ミエリンの機能的重要性は、中枢神経系の髄鞘の広範囲にわたる変性と関係ある多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症を含むいわゆる脱髄疾患で観察される運動機能の重篤な欠陥により強調されてきた。末梢神経系に対する外傷性損傷は、しばしば、適切に治癒するよう修復する必要のあるミエリンの破壊を含む。結果が示すように、本発明のペプチドは、培養におけるシュワン細胞の生存、生育および増殖を支持するのに有用であり、従って、末梢神経損傷の脱髄部位中への移植のためのこのような細胞源を可能にする。また、適切に処方されたこれらのペプチドのインビボ投与により、再髄鞘形成および損傷治癒をもたらす置換シュワン細胞の再生および増殖をもたらすことも可能である。前述の適用法による本発明のペプチドの利用は、十分、熟練した医師の能力の範囲内にある。特定の疾患または症状のインビボ治療に有効なペプチドの量は、疾患または症状の特異的性質に依存しており、このような量は、標準臨床技法により決定することができる。可能な場合、ヒトで検査する前に、まず公知のバイオアッセイシステムのようなインビトロで、次いで、有用な動物モデル系で、用量−応答曲線および本発明の医薬組成物を決定するのが望ましい。インビボ投与の方法としては、静脈、筋肉内、腹腔内、経口または皮内が挙げられるが必ずしもこれらに制限されるわけではない。更に、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部分に局部的に投与するのが望ましい場合もある。これは、例えば、手術、注射、カテーテル、または移植中に局部的注入により達成することができ、移植物は、シアラスチック（sialasti c）メンブランのような膜または繊維を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン様物質である。また、本発明は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを介して投与されるペプチドを含有する医薬組成物を提供する。本発明の種々の実施態様において、徐放を達成するためのこのような組成物を用いるのが有用であり得る。本発明のペプチドは、それらに限定される訳ではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含むいずれかの滅菌した生物適合性担体それ自体中に、または所望であれば、いずれかの適切な添加物と共に加えて投与することができる。本ペプチドの製造を、化学的合成に関して特に説明したが、組み換え体生産の従来法は、それらの調製のための適切な代替手段を提供する。具体的説明により、本ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、即ち、ペプチドをコードする挿入配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター、中に挿入することができる。種々の宿主−ベクター系を用いて本ペプチドをコードする配列を発現させることができる。このような系としては、ウィルス（例えば、ワクチンウィルス、アデノウィルス等）に感染した哺乳類細胞系；ウィルス（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌のような微生物が挙げられるがこれらに制限されない。これらのベクターの発現要素は、それらの強度および特異性で変化する。用いた宿主−ベクター系に依存して、多数の好適な転写および翻訳要素のいずれか１つを用いることができる。ＤＮＡ断片のベクター中への挿入について前述した方法のいずれかを用いて、適切な調節シグナルおよびペプチドをコードする配列から成るキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡおよび合成技法ならびにインビボ組み換え（遺伝的組み換え）を挙げることができる。本ペプチドをコードする核酸配列の発現は、ペプチドが、組み換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように第二の核酸配列により調節することができる。例えば、発現は、当業界で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサー要素により調節することができる。一旦適切な宿主系および生育条件が確立されたならば、組み換え発現ベクターを増殖して大量に調製することができる。既に説明したように、用いることのできるベクターとしては、ほんの僅かの例ではあるが、以下のベクター又はその誘導体：ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなヒトまたは動物ウィルス；バキュロウィルスのような昆虫ウィルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターが挙げられるがこれらに制限されない。その結果発現されたペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、またはサイジングクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差を含む標準法により、又はこのような精製のための他の標準技法により単離精製することができる。前述のＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／２８１３３号に記載の組み換え体生産法は、ここでの使用に特に好適である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＪ 5/10 ＡＣＤＣ１２Ｐ 21/02 ＡＤＳＣ１２Ｑ 1/02 ＡＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハラ，シンイチアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、リツカード・ドライブ・2918 (72)発明者ルー，シエン・センアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、シヤンセリー・プレイス・3072 (72)発明者メイヤー，ジヨン・フイリツプアメリカ合衆国、コロラド・80302、ブルダー、ブルツク・ロード・868 (72)発明者ヨシナガ，ステイーブル・キヨシアメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、サウザンド・オークス、リンウツド・ストリート・644

Claims

【特許請求の範囲】１．ＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＱＰＧＦＴＧＡＲＣＱＮＹＶＭＡＳ（配列番号：１）、およびＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳ（配列番号：２）から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド。２．化学合成の生成物である、請求項１に記載のペプチド。３．外因性ＤＮＡ配列の真核または原核発現の組み換え生成物である、請求項１に記載のペプチド。４．ＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＱＰＧＦＴＧＡＲＣＱＮＹＶＭＡＳ（配列番号：１）、およびＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳ（配列番号：２）から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ分子。５．請求項４に記載のＤＮＡ分子で安定に形質転換又はトランスフェクトされた原核または真核宿主細胞。６．請求項５に記載の形質転換またはトランスフェクトされた大腸菌。７．請求項４に記載のＤＮＡ配列を含有する、生物学的に機能的な環状プラスミドまたはウィルス性ＤＮＡベクター。８．請求項７に記載のＤＮＡベクターで安定に形質転換又はトランスフェクトされた原核または真核宿主細胞。９．ペプチドの製造方法であって、宿主細胞がペプチドを発現するのを可能にするように請求項４に記載のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核宿細胞を適切な栄養条件下で培養し、必要に応じてペプチドを単離することを含む前記方法。１０．請求項１に記載のペプチドおよび医薬的に許容され得る希釈剤、アジュバントまたは担体を含む医薬組成物。１１．シュワン細胞の生存を維持する方法であって、このような細胞と請求項１に記載の有効量のペプチドとを接触させることを含む前記方法。１２．シュワン細胞の増殖を引き起こす方法であって、このような細胞と請求項１に記載の有効量のペプチドとを接触させることを含む前記方法。１３．結腸上皮細胞の増殖、成長および分化を引き起こす方法であって、このような細胞と請求項１に記載の有効量のペプチドとを接触させることを含む前記方法。１４．細胞培養で実施する、請求項１１、１２または１３に記載の方法。１５．インビボで実施する、請求項１１、１２または１３に記載の方法。１６．結腸の疾患または障害を治療する方法であって、請求項１に記載の治療上有効量のペプチドを投与することを含む前記方法。１７．疾患または障害が大腸炎である、請求項１６に記載の方法。１８．疾患または障害が潰瘍である、請求項１６に記載の方法。１９．結腸の再上皮形成を促進する方法であって、請求項１に記載の有効量のペプチドを投与することを含む前記方法。２０．神経系の疾患または障害を治療する方法であって、請求項１に記載の治療上有効量のペプチドを投与することを含む前記方法。２１．疾患または障害が、外傷により引き起こされた神経損傷を含む、請求項２０に記載の方法。