ES2224655T3 - Vacuna antiviral recombinante de la encefalitis equina venezolana. - Google Patents

Vacuna antiviral recombinante de la encefalitis equina venezolana.

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ES2224655T3 ES99920967T ES99920967T ES2224655T3 ES 2224655 T3 ES2224655 T3 ES 2224655T3 ES 99920967 T ES99920967 T ES 99920967T ES 99920967 T ES99920967 T ES 99920967T ES 2224655 T3 ES2224655 T3 ES 2224655T3
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Abstract

Una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica frente al virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), comprendiendo dicha vacuna un vector que incluye una secuencia que codifica una forma atenuada del mencionado virus que es capaz de producir una respuesta inmune protectora, donde la mencionada secuencia comprende al menos los 19 aminoácidos N-terminales de la glicoproteína E2 y donde el aminoácido de la posición 7 en la proteína E2 de VEE es lisina.

Description

Vacuna antiviral recombinante de la encefalitis equina Venezolana.
La presente invención se refiere a una vacuna vírica, específicamente a una vacuna contra el virus de la encefalomielitis equina Venezolana (VEE), a su preparación y a formulaciones aceptables desde un punto de vista farmacéutico y a métodos profilácticos y terapéuticos de tratamiento utilizando la mencionada vacuna.
El virus VEE es un alfavirus transportado por mosquitos que es una causa importante de enfermedad epidémica en seres humanos y de epizoosis en caballos, burros y mulas en determinadas partes del mundo, en particular en Sudamérica.
La vacuna VEE existente, TC-83, se produjo inicialmente mediante la atenuación de la cepa burro Trinidad (TRD) de VEE mediante una propagación secuencial en cultivos de células de corazón de cobaya. Sin embargo, esta vacuna se considera, de manera general, inadecuada para la vacunación de seres humanos. Esto se debe principalmente a la alta incidencia de efectos secundarios en los individuos vacunados y a la gran proporción de individuos vacunados que no desarrollan anticuerpos neutralizantes (Monath et al., 1992, Vaccine Research, 1, 55-68).
Se ha construido una vacuna contra VEE basada en vaccinia (Kinney et al., J. Gen. Virol. 1988, 69, 3005-3013). En este recombinante, se insertaron genes estructurales de VEE que codifican ARN 26S en la cepa NYCBH de vaccinia. El virus recombinante protegió frente a un pulso subcutáneo con VEE pero tuvo una eficacia limitada frente a un pulso con VEE en forma de aerosol.
Se ha clonado y secuenciado tanto la cepa virulenta de VEE burro Trinidad como la cepa atenuada TC-83 (R.M. Kinney et al., Virology (1989) 170, 19-30) y el sistema de numeración de aminoácidos y nucleótidos utilizados en esta referencia son los que se utilizarán en la presente memoria. Este trabajo ha revelado que existen varios cambios en los aminoácidos entre TRD y TC-83. La mayoría (cinco) de estos cambios ocurren dentro del gen que codifica la glicoproteína E2.
Los cambios se han resumido como sigue:
TABLA 1
1
También se ha demostrado que los primeros 25 aminoácidos de la glicoproteína E2 representan un epítopo protector. Esta región incluye un único cambio de aminoácido (lys \rightarrow asp) en el aminoácido 7 en la construcción TC-83 comparado con la cepa TRD. Un péptido sintético de 25pb basado en la secuencia de TRD VE2pep01 (TRD), protegió a más ratones del pulso con el virus TRD que un péptido correspondiente basado en TC-83 (A.R. Hunt et al., Virology, 1990, 179, 701-711). Se ha llevado a cabo un mapeo más preciso de este epítopo (A.R. Hunt et al., Vaccine, 1995, 13, 3, 281-288).
Los solicitantes han descubierto medios para incrementar la protección de una vacuna y, en particular, una vacuna basada en vaccinia.
En particular, los solicitantes han descubierto que la protección de la vacuna puede incrementarse bien (a) restaurando el resto de lisina en el aminoácido 7 de la proteína E2 y/o (b) modificando el promotor para aumentar la expresión de la construcción protectora.
De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica frente al virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), dicha vacuna comprende un vector que incluye una secuencia que codifica una forma atenuada del mencionado virus que es capaz de producir una respuesta inmune protectora, donde la mencionada secuencia es tal que el aminoácido en la posición 7 en la proteína E2 de VEE es lisina.
De manera adecuada, la forma atenuada del virus VEE comprende un derivado o una variante de la construcción TC-83 o un fragmento inmunogénico de ésta.
Se pueden producir otras formas atenuadas por una persona especializada en el tema, por ejemplo, utilizando técnicas conocidas como propagación seriada a través de otro organismo, o mediante tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, por inactivación de genes asociados con la replicación o la virulencia del virus. El gen estructural que codifica la glicoproteína E2 o un fragmento que codifica al menos los 19 aminoácidos N-terminales debe retenerse con el fin de retener la inmunogenicidad de la construcción.
Los fragmentos adecuados de la construcción son aquellos que incluyen sólo algunos de los genes estructurales del péptido VEE o los que codifican sólo parte de las proteínas codificadas por los mencionados genes, siempre que la construcción codifique determinantes antigénicos suficientes para asegurar que es capaz de producir una respuesta inmune protectora en un mamífero al que se le administra la construcción.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "variante" significa que la construcción es diferente a la cepa original pero que codifica proteínas y/o péptidos que son iguales o similares a los del VEE de tipo salvaje o fragmentos inmunogénicos de éstos. De esta manera, los cambios en la secuencia de nucleótidos pueden ser silenciosos si no producen cambios en los aminoácidos comparado con la cepa original, o pueden producir cambios de aminoácidos siempre que éstos no alteren la función de la construcción en términos de su capacidad para producir una respuesta inmune protectora frente a VEE. Por ejemplo, la construcción puede codificar péptidos o proteínas que son homólogos en un 60% a las proteínas o péptidos de tipo salvaje, de manera apropiada homólogos en más de un 80%, y preferiblemente, homólogos en más de un 90% respecto a la secuencia de la proteína nativa, y siempre que produzcan anticuerpos que reaccionen de manera cruzada con el tipo salvaje de VEE, se retendrán los efectos protectores de la construcción.
"Derivados" pueden ser estructuras similares pero se derivan mediante manipulación de las construcciones originales utilizando tecnología de ADN recombinante o modificación química si se considera apropiado.
El vector puede contener las funciones habituales de control de la expresión, como promotores, amplificadores y secuencias señal, así como un marcador de selección con el fin de permitir la detección de los transformantes que se han producido con éxito. La selección de éstos dependerá de la naturaleza precisa del vector elegido y resultará conocida o será fácilmente determinada por una persona especializada en el tema.
Un vector adecuado es un vector vírico, por ejemplo, un vector derivado de vaccinia, adenovirus, o virus del hepes simplex (HSV). Resulta adecuado que esté atenuado, para minimizar cualquier efecto perjudicial en el anfitrión asociado con el virus.
Preferiblemente, el vector se deriva del virus vaccinia, por tener muchas propiedades que le hacen un vector adecuado para la vacunación, incluyendo su capacidad para estimular de manera eficaz respuestas inmunes humorales y mediadas por células. Vaccinia ha demostrado su utilidad como un vehículo de vacunación, siguiendo los programas de erradicación de la viruela. Proporciona el potencial para una construcción de vacunación multivalente o para administración oral. Actualmente existen numerosas cepas atenuadas disponibles.
Un marcador de selección adecuado para ser incluido en un vector de vaccinia es el gen marcador gpt.
En este trabajo se construyó una vacuna VEE utilizando una cepa WR de vaccinia. Preferiblemente, se emplea una cepa de vaccinia más atenuada que resultará más aceptable para ser utilizada en seres humanos. Estas cepas incluyen Lister, que se utilizó para la vacunación a gran escala frente a la viruela, NYVAC (Tartaglia et al., (1992). AIDS Research and Human Retroviruses 8, 1445-1447) que contiene deleciones específicas en el genoma, o MVA (Mayr et al., (1975) Infection 3, 6-14) que también está muy atenuada.
Las vacunas basadas en vectores víricos se formulan adecuadamente para administración parenteral como se ha descrito más arriba. Sin embargo, es posible formular estas vacunas para administración oral, por ejemplo, mediante la incorporación del vector en un microorganismo que coloniza el intestino como Salmonella y, particularmente, S. typhimurium.
pTC-5A es un plásmido de un clon de ADNc que codifica los genes estructurales de la cepa TC-83 del virus VEE (Kinney et al., J. Gen. Virol. (1988) 69, 3005-3013). El ADNc de VEE se sitúa por debajo del promotor 7,5K de vaccinia que dirige la expresión de las proteínas estructurales de VEE cuando el plásmido se utiliza para construir virus vaccinia recombinantes. Previamente se han preparado promotores 7,5K modificados de vaccinia (Davison y Moss, J. Mol. Biol. 210, (1989) 749-769). Se ha visto que determinadas mutaciones por sustitución incrementan la fuerza del promotor. Mediante la utilización de promotores sintéticos que incluyen mutaciones por sustitución, se incrementó la cantidad de proteínas VEE producidas por el virus recombinante.
De esta manera, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica frente al virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), dicha vacuna comprende un vector del virus vaccinia que codifica una forma atenuada del virus VEE o una variante o fragmento de éste que es capaz de producir una respuesta inmune protectora frente al virus VEE, estando la expresión del mencionado virus VEE atenuado bajo el control de un promotor 7,5K sintético de vaccinia que ha sido sometido a una mutación que incrementa el nivel de la producción de proteína del virus VEE respecto al promotor 7,5K de tipo salvaje.
En particular, se ha visto que las mutaciones por sustitución en el promotor 7,5Kd pueden ser eficaces. Éstas pueden ilustrarse mediante la Tabla siguiente:
Promotor 7,5K de tipo salvaje
TAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCAC 
\hskip0.5cm
(SEC ID No 1) Mutaciones por sustitución (en negrita)
TAAAAATTGAAAATACATTCTAATTTATTGCAC 
\hskip0.5cm
(SEC ID No 2)
TAAAAATTGAAAATATATTCTAATTTATTGCAC 
\hskip0.5cm
(SEC ID No 3)
Se ha visto que la inclusión de un promotor 7,5K sintético de vaccinia en WR103 aumenta la expresión del ADNc de VEE situado más abajo, dando lugar a un incremento en la producción de proteína de 3,59 veces.
La vacuna puede comprender el vector en si mismo pero se formula adecuadamente como una composición farmacéutica en combinación con un vehículo o excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Estas composiciones forman un aspecto adicional de la invención. Las composiciones pueden estar en una forma adecuada para aplicación oral o parenteral.
Los vehículos apropiados son muy conocidos en el campo e incluyen diluyentes sólidos y líquidos, por ejemplo, agua, disolución salina o etanol acuoso. El vehículo líquido adecuado es estéril y sin pirógenos.
Las composiciones pueden estar en la forma de líquidos adecuados para infusión o inyección, o jarabes, suspensiones o disoluciones, así como formas sólidas como cápsulas, comprimidos, o polvos para reconstituir.
Las construcciones para utilizarse en las vacunas de la invención pueden prepararse por diferentes medios como se entenderá en el campo, que van desde modificación de construcciones disponibles como el virus de tipo salvaje utilizando tecnología de ADN recombinante o mediante medios sintéticos. Las técnicas de ADN recombinante incluyen mutagénesis dirigida, que implica opcionalmente amplificación mediante PCR como se ilustra en la presente
memoria.
Como se ilustra en la presente memoria, el virus vaccinia recombinante que se construyó expresó los genes estructurales de VEE como se producen por una forma modificada de TC-83. Se investigó la capacidad del virus recombinante para producir respuestas inmunes protectoras frente a la enfermedad producida por VEE virulento.
En otra realización, la vacuna comprende además una citoquina o un fragmento activo o una variante de ésta. La citoquina puede incorporarse por sí misma en la formulación de la vacuna o, de manera más adecuada, el vector puede incluir una secuencia codificadora lo que significa que la citoquina se coexpresa por el vector. Ejemplos de citoquinas adecuadas incluyen interleuquina 2 (IL-2) e interleuquina 6 (IL-6).
Una citoquina particularmente adecuada es la interleuquina 2 (IL-2), que puede expresarse, por ejemplo, a partir de un virus vaccinia recombinante. Se sabe que IL-2 es responsable de la expansión de clones de células T activadas por antígeno (Smith, (1984) Reviews in Immunology 2, 319-333).
De manera alternativa, los niveles de anticuerpos pueden incrementarse utilizando otras citoquinas. Por ejemplo, se ha visto que la expresión de IL-6 por vectores de vaccinia induce un alto nivel de IgG_{1} (Ruby et al., 1992 Vaccine Research 1, (4), 347-356), y que las respuestas mucosales de IgA inducidas por IL-5 e IL-6 coexpresan HA de influenza (Ramsay et al., (1994) Reproduction, Fertility and Development 6, 389-392).
La vacuna de la presente invención puede utilizarse para tratar seres humanos o animales. En particular puede administrarse a caballos, como una vacuna veterinaria, para prevenir infección, o como una vacuna profiláctica o terapéutica para seres humanos.
La vacuna de la invención puede incorporarse en una vacuna multivalente con el fin de incrementar la proporción beneficio-riesgo de la vacunación.
La dosificación de las vacunas de la invención dependerá de la naturaleza del mamífero que se va a inmunizar así como de la naturaleza precisa y de la forma de la vacuna. Esto se determinará por el médico responsable. Sin embargo, en general, cuando se utiliza un vector vírico, como un vector del virus vaccinia, las dosificaciones del vector pueden estar en el intervalo de 10^{4}-10^{12} pfu (pfu= unidades formadoras de partículas).
Las vacunas de la invención producirán una respuesta inmune en los animales de ensayo incluyendo la producción de anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser útiles en programas de vacunación pasiva o en el diagnóstico de enfermedades asociadas al virus VEE. Para fines diagnósticos, los anticuerpos pueden formar parte de un kit como es convencional en este campo.
La invención se ilustrará ahora mediante Ejemplos con referencia a los dibujos adjuntos en los que
La Figura 1 muestra la construcción de plásmidos quiméricos utilizados para la generación de virus vaccinia recombinantes;
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de inmunofluorescencia utilizando antisuero policlonal frente a TC-80;
La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento para cuantificar mediante ELISA la cantidad de proteína VEE expresada por las cepas; y
La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento para encontrar el nivel de IgG antiVEE en animales vacunados con varias cepas de la invención.
En los Ejemplos, los niveles relativos de proteína se calcularon a partir de datos de ELISA utilizando análisis de regresión que se llevaron a cabo mediante el programa de ordenador Minitab para análisis estadístico (Minitab Inc., State College, PA, EEUU). Se compararon los niveles de anticuerpo en el suero mediante el ensayo t de dos muestras. Se analizaron las tablas de contingencia mediante el ensayo exacto de Fisher. Los valores P <0,05 se consideraron significativos.
Ejemplo 1 Alteración de la secuencia de la proteína E2
pTC-5A, un plásmido de un clon de ADNc que codifica los genes estructurales de la cepa TC-83 del virus de la Encefalitis Equina Venezolana, se obtuvo del Dr. R. Kinney (Kinney et al., 1988, Journal of General Virology 69, 3005-3103). Se eliminó de pTC-5A un fragmento Eco RI que contenía el ADNc de VEE y se insertó en p1113 (Carroll, 1993, Tesis Doctoral, Facultad de Medicina, Universidad de Manchester; Fig 1a) que es un vector lanzadera utilizado para la inserción de genes en el locus de la timidina quinasa de vaccinia estando basada la selección dominante de virus recombinantes en la resistencia al ácido micofenólico (Falkner y Moss, 1988, Journal of Virology 62, 1849-1854). El plásmido resultante, pAB100, se mezcló con Lipofectin™ (Life Technologies) y se utilizó para transfectar células CV-1 infectadas con la cepa WR del virus vaccinia. Los virus recombinantes se designaron WR100 y se sometieron a tres rondas de purificación de placa antes de la preparación de stocks como se ha descrito anteriormente (Mackett et al., 1985 DNA cloning (Volumen II): a practical approach).
La secuencia de E2 de la cepa TC-83 de VEE, situada en pTC-5A, se alteró mediante la sustitución de un nucleótido de T a G en la posición 1053 respecto al tipo salvaje TRD VEE (Johnson et al., J. Gen. Virol. 1986, 67, 1951-1960). Esto resultó en el cambio de un aminoácido de asparagina a lisina en la proteína E2 cuando se expresó a partir del virus vaccinia.
Con el fin de producir este cambio particular de aminoácido, se llevaron a cabo las manipulaciones siguientes.
Cerca del sitio de la sustitución del nucleótido requerido existe un sitio de rotura para la enzima de restricción Nsi I. Un segundo sitio Nsi I está situado aproximadamente 500 pb más arriba. Se utilizaron cebadores de oligonucleótidos para amplificar la secuencia de ADN entre los sitios Nsi I utilizando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El cebador situado más abajo contenía un emparejamiento erróneo de nucleótidos que corresponde a la secuencia TRD en ese punto.
Las secuencias de los cebadores se listan más abajo. Los sitios de rotura Nsi I y la posición del nucleótido sustituido están subrayadas.
Cebador 1 designado "Nsi 1"
5' 
\hskip0.75cm
GCC GAT GCA TGT GGA AGG C 
\hskip0.5cm
3' Cebador 2 designado "Nsi 2"
5' 
\hskip0.75cm
ATC TGA TGC ATC TGG CCA TGT AAG GGC GCG TTA GCT TAT ACT CCT TAA ACA GC 
\hskip0.5cm
3'
El producto de PCR se digirió con Nsi I y se utilizó para reemplazar el fragmento Nsi I correspondiente en pTC-5A, generando el plásmido pAB101. La secuencia de nucleótidos de la región relevante en pAB101 se obtuvo para verificar la alteración de la secuencia.
Después se digirió pAB101 con Eco R1 para eliminar la secuencia de VEE que codifica el ARN 26S que se transfirió al plásmido p1113, vector lanzadera de vaccinia. P1113 contiene el marcador de selección gpt que permite la selección de los virus vaccinia recombinantes. El plásmido que se construyó por la adición de la secuencia de VEE a p1113 se designó pAB102.
Ejemplo 2 Sustitución del promotor 7,5K por un promotor sintético en pAB102
Se diseñó un promotor 7,5K de vaccinia sintético, en base al trabajo de Davison y Moss (supra.). Se diseñaron oligonucleótidos complementarios con terminaciones 5' Bam H1 y 3' Eco RI. Los oligonucleótidos se alinearon y se ligaron en el plásmido pT7Blue (que se puede obtener de AMS Biotechnology (UK) Ltd). El plásmido del clon se digirió con Bam HI y Eco RI y el fragmento de ADN que contenía el promotor sintético se aisló y se clonó en el plásmido pAB102 que había sido cortado con las mismas enzimas. Esto resultó en la generación del plásmido pAB103 (Figura 1) que contiene el promotor sintético más arriba de la secuencia de VEE que codifica el ARN 26S. La cepa WR de vaccinia se transformó con pAB103 para producir el virus vaccinia recombinante WR103.
Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados aparecen más abajo. Las sustituciones en la secuencia del promotor 7,5K aparecen en negrita. Las inserciones están subrayadas. Las "colas" de oligonucleótido que contienen los sitios de rotura de las enzimas de restricción aparecen en itálica.
Oligo 1 designado "7,5KF2"
5' 
\hskip0.75cm
ACG CGG ATC CAA AAA TTG AAA AAC TAG CTT AAA AAT TGA AAA ACT ATT CTA ATT TAT TGC ACG AAT TCC G 
\hskip0.5cm
3' Oligo 2 designado "7,5KR2"
Éste es el complemento reverso de 7,5KF2.
La cantidad de las proteínas VEE producida por el virus recombinante WR103 se determinó utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).
Ejemplo 3 Análisis de la expresión de proteínas
Las proteínas víricas de VEE se visualizaron mediante inmunofluorescencia indirecta de células CV-1 infectadas. Las monocapas de CV-1 (25 cm^{2}) se infectaron con el virus con una multiplicidad de 2 p.f.u. por célula. A las 24 horas después de la infección, las células se rasparon en el medio de crecimiento y se lavaron una vez con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0,1% de albúmina de suero bovino. Las células se pusieron en portas, se secaron al aire y se fijaron en acetona. Se detectó la unión de antisuero policlonal de ratón frente a la cepa TC-80 de VEE (proporcionado por el Dr. A.D.T. Barrett, Universidad de Tejas) con IgG antiratón de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Amersham International plc).
El examen de las células infectadas con WR100 o WR103 mostró que las células infectadas con WR103 presentaban una fluorescencia más brillante que las células infectadas con WR100 (Figura 2).
La cuantificación de la expresión de proteínas víricas de VEE se llevó a cabo utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Las monocapas de CV-1 (150 cm^{2}) se infectaron con el virus a una multiplicidad de 10 p.f.u. por célula y se recogieron a las 24 horas después de la infección raspándolas en el medio de crecimiento. Las células se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en tampón T9 (10 mM Tris.HCl; 1 mM EDTA; pH 9,0). Las muestras se congelaron, se descongelaron y se sonicaron durante 1 minuto en un baño de sonicación. Los restos de células se precipitaron durante 5 minutos a 1.800 g y el sobrenadante se centrifugó durante 30 minutos a 10.000 x g. El sobrenadante se eliminó y se almacenó a -70ºC. La preparación del lisado celular se diluyó 1/30 en tampón bicarbonato (Sigma), se añadieron volúmenes de 100 l a los pocillos de una placa de microtitulación y se permitió al antígeno unirse durante 1 hora a 37ºC. Los lisados se reemplazaron con 200 l/pocillo de disolución salina que contenía 10% de formaldehído. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, después se lavaron 6 veces con PBS que contenía 0,1% Tween (PBST). El anti-TC80 policlonal de ratón se diluyó de manera seriada en disolución de bloqueo (0,5% leche en polvo/PBST), se añadió a los pocillos, y las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBST antes de la adición de anticuerpo específico de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (diluido 1:1000 en disolución de bloqueo) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron 3 veces antes de la adición de ABTS en tampón citrato y de una incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. El desarrollo del color se midió a A_{414}.
Este proceso de cuantificación reveló que las células infectadas con WR103 contenían 3,59 veces más de proteína VEE que las células infectadas con WR100 (Figura 3).
La cuantificación de la proteína de vaccinia en estas muestras demostró cantidades equivalentes en cada una (datos no mostrados), por lo que debe asumirse que la diferencia en el contenido de proteína VEE se debe a los diferentes niveles de expresión del ADNc de VEE codificado.
Ejemplo 4 Efecto protector de los recombinantes de Vaccinia
Se inocularon grupos (10) de ratones Balb/c hembra de 6-8 semanas de edad con PBS o con 10^{8} p.f.u. de virus vaccinia mediante inyección intramuscular, o con 10^{5} p.f.u. de TC-83 mediante inyección subcutánea. Se recogió suero para la determinación de inmunoglobulinas frente a las proteínas VEE.
Los ratones vacunados se ensayaron con dos dosis diferentes de la cepa TRD virulenta de VEE 35 días después de la inmunización. En la Tabla 2 se presentan las proporciones de supervivencia después de 14 días.
TABLA 2
3
Estos resultados muestran que la manipulación genética del virus recombinante mejora la protección proporcionada por la construcción. Se observó una mejora significativa de la protección en ratones después de un pulso subcutáneo con TRD cuando se utilizó WR103 para la vacunación, en comparación con WR100 (P<0,05, Tabla 2). WR100 protegió hasta un 20% de ratones mientras que WR103 protegió un 60% de ratones. No existió una diferencia significativa entre los números de los ratones protegidos cuando se utilizaron dosis de pulso de TRD de 10 p.f.u. ó 100 p.f.u. La dosis del pulso se había titulado para mostrar que 1 p.f.u. de TRD se aproxima a 2-3 dosis DL_{50} (datos no mostrados).
Ejemplo 5 Inmunoensayos
Se determinó la inmunoglobulina específica del virus VEE en suero mediante un inmunoensayo ligado a enzima como sigue. Se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulación con TC-83 purificado a 37ºC durante 1 hora. El suero se diluyó de manera seriada en disolución de bloqueo y se permitió que se uniera a los pocillos recubiertos con antígeno durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces y se incubaron con inmunoglobulina antiratón conjugada con peroxidasa de rábano a 37ºC durante 1 hora. Las placas se lavaron y se incubaron con sustrato TMB durante 20 minutos antes de medir el desarrollo de color a A_{450}.
Todos los ratones inoculados con vaccinia respondieron a la vacunación que se determinó mediante la detección de inmunoglobulina frente al virus vaccinia en el suero (datos no mostrados). El inmunoensayo para medir anticuerpo TC-83 no detectó IgG antiVEE en las muestras WR100. Las muestras WR103 contenían un nivel detectable de anticuerpo antiVEE aunque resultó sustancialmente menor que la cantidad encontrada en el suero de los ratones vacunados con TC-83 (Figura 4).
Se midió anticuerpo neutralizante mediante un ensayo de reducción de la placa. Se incubó suero (10 \mul) con TC-83 (50 \mul) y con medio de mantenimiento (140 \mul) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió medio de mantenimiento (800 \mul) y la suspensión se utilizó para infectar monocapas confluentes de células BHK-21 que se crecieron en placas de 6 pocillos. Las placas se incubaron a 37ºC durante 3 días. Una reducción del 50% en el número de placas por pocillo, comparado con los pocillos control, se consideró indicativa de la presencia de anticuerpo neutralizante.
El anticuerpo neutralizante frente a TC-83 se encontró en el suero de los ratones vacunados con TC-83 pero no se detectó en el suero de ratones vacunados con WR100 o con WR103 (datos no mostrados). Aunque el anticuerpo neutralizante se encuentra habitualmente en ratones que están protegidos frente a un pulso con VEE, previamente se ha publicado la aparición de protección en ausencia de cantidades detectables de anticuerpo neutralizante (Kinney et al., 1988a, Journal of Virology 62, 4697-4702).
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<210> 1
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Virus de la encefalomielitis equina venezolana
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
taaaagtaga aaatatattc taatttattg cac 
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<210> 2
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Mutación por Sustitución
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<400> 2
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Mutación por Sustitución
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<400> 3
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 4
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gccgatgcat gtggaaggc 
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<211> 53
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 5
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atctgatgca tctggccatg taagggcgcg ttagcttata ctccttaaac agc 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido
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<400> 6
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acgcggatcc aaaaattgaa aaactagctt aaaaattgaa aaactattct aatttattgc acgaattccg 
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Claims (17)

1. Una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica frente al virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), comprendiendo dicha vacuna un vector que incluye una secuencia que codifica una forma atenuada del mencionado virus que es capaz de producir una respuesta inmune protectora, donde la mencionada secuencia comprende al menos los 19 aminoácidos N-terminales de la glicoproteína E2 y donde el aminoácido de la posición 7 en la proteína E2 de VEE es lisina.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, donde la forma atenuada del mencionado virus comprende un derivado de la construcción TC-83.
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, donde el vector comprende un vector vírico.
4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 3, donde el virus se selecciona de un virus atenuado.
5. Una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, donde el virus se selecciona de vaccinia, adenovirus o HSV.
6. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende un virus vaccinia atenuado.
7. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, donde la expresión del mencionado virus VEE atenuado está bajo el control de un promotor 7,5k de vaccinia sintético que ha sido sometido a una mutación que incrementa el nivel de la producción de proteína del virus VEE respecto al promotor 7,5k de tipo salvaje.
8. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, donde el mencionado promotor 7,5k comprende una secuencia seleccionada de
TAAAAATTGAAAATACATTCTAATTTATTGCAC 
\hskip0.5cm
(SEC ID No 2)
o
TAAAAATTGAAAATATATTCTAATTTATTGCAC 
\hskip0.5cm
(SEC ID No 3)
9. Una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un vector que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido inmunogénico adicional, y que es capaz de expresar dicha secuencia cuando se administra a un mamífero.
10. Una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una citoquina o un fragmento activo o una variante de ésta, o un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina o un fragmento activo o una variante de ésta.
11. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina o un fragmento activo o una variante de ésta.
12. Una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde la citoquina es una interleuquina.
13. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, donde la interleuquina se selecciona de IL-2 humana o IL-6 humana.
14. Una composición farmacéutica que comprende una vacuna como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo o excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
15. Una vacuna multivalente que comprende una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y una vacuna adicional.
16. Un vector que incluye una secuencia que codifica una forma atenuada del virus VEE como se define en la reivindicación 1, para utilizarse como una vacuna frente a VEE.
17. Utilización de un vector que comprende una secuencia que codifica una forma atenuada del virus VEE como se define en la reivindicación 1 en la preparación de una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica frente al virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE).
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