ES2225043T3 - Diluyente para crioconservacion de espermatozoides de bovinos. - Google Patents
Diluyente para crioconservacion de espermatozoides de bovinos.Info
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Abstract
Diluyente para la crioconservación de espermatozoides de bovinos que comprende por lo menos un fosfolípido, vitamina A acompañada de un emulsionante, por lo menos un agente antioxidante y por lo menos un poliol, no conteniendo dicho diluyente ninguna sustancia de origen animal.
Description
Diluyente para la crioconservación de
espermatozoides de bovinos.
La invención se refiere a un diluyente para la
crioconservación de espermatozoides de bovinos. Más particularmente,
la invención se refiere a un medio diluyente acuoso que no contiene
sustancias de origen animal y susceptible de ser conservado listo
para el empleo durante unos periodos de tiempo prolongados.
Se conocen unos diluyentes para la
crioconservación de espermatozoides de bovinos. El documento
FR-B-
2.720.407 a nombre del solicitante describe un diluyente tal que contiene unos agentes de nutrición, unos tampones y unas sales minerales así como un producto protector constituido por lecitina de soja.
2.720.407 a nombre del solicitante describe un diluyente tal que contiene unos agentes de nutrición, unos tampones y unas sales minerales así como un producto protector constituido por lecitina de soja.
Se conoce asimismo según Al-hanak
et al., 1989, Zhirotnou'dni Nank, 26(5):
80-83, que la adición de productos de origen animal,
que contienen vitamina A, en particular la yema de huevo, ejerce una
influencia favorable sobre los índices de calidad de los
espermatozoides.
El diluyente descrito en la patente citada
anteriormente está destinada a diluir el semen bovino y para
congelarlo para una utilización posterior. Es un enfoque
esencialmente "sanitario". Dicho diluyente proporciona una
satisfacción relativa.
Resulta fácil de preparar y es muy claro. La
ausencia de productos de origen animal garantiza la ausencia de
cualquier agente de infección.
Sin embargo, no se había planteado la cuestión de
la eficacia biológica del producto. La eficacia en las gamas de
concentración utilizadas anteriormente no permitía trabajar con la
flexibilidad necesaria en un centro de inseminación.
En efecto, ahora se desea optimizar la producción
de semen, es decir, se desea producir un número importante de dosis
con una concentración mínima de espermatozoides en una pajuela.
En unos ensayos in vivo, con una
concentración muy baja de espermatozoides en la pajuela, el
comportamiento del diluyente del documento
FR-B-2 720 407 no ha sido
excelente.
El artículo de L.G.
Sánchez-Partida et al., Reprod Fertil. Dev.,
1997, 9, 689-96, describe unos diluyentes para los
espermatozoides de carnero, a base de tris que contienen unas
concentraciones variables de glicerol a las que se ha añadido
taurina, hipotaurina e inositol epididimales, así como carnosina y
ácido ascórbico.
El artículo de M. Ollero et al., en
Cryobiology 37, 1-2, 1998, describe el efecto sobre
los espermatozoides de carnero que han sufrido un ciclo de
enfriamiento, congelación, descongelación, de diversos diluyentes,
entre los que se encuentra el medio de Fiser al que se han añadido
diferentes componentes tales como la lactoalbúmina y la albúmina
sérica bovina, la vitamina E, el ditiotreitol, el plasma seminal de
toro, la glicina betaína, la prolina, la fosfatidilcolina y el
colesterol.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un diluyente para la crioconservación de
espermatozoides de bovinos que presentan in vivo unos
resultados mejorados.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un
diluyente tal que conduzca a una supervivencia de los
espermatozoides satisfactoria a baja concentración.
La presente invención proporciona un diluyente
que satisface los objetivos anteriores.
El diluyente para la crioconservación de los
espermatozoides de bovinos de la presente invención comprende por lo
menos un fosfolípido, vitamina A, acompañada de un emulsionante, por
lo menos un agente antioxidante y por lo menos un poliol.
La vitamina está acompañada de un emulsionante,
por ejemplo el monooletato de sorbitano comercializado bajo el
nombre de Tween 80.
El agente antioxidante puede ser un aminoácido
que presenta unas propiedades antioxidantes, por ejemplo, la taurina
y la glicina.
El agente antioxidante puede ser asimismo un
péptido antioxidante, por ejemplo glutation reducido.
El diluyente de la presente invención puede
contener además un esterol, principalmente colesterol.
En el caso en que un esterol esté presente en el
diluyente, dicho diluyente contendrá ventajosamente unas
ciclodextrinas que lo solubilizan en un medio acuoso.
El diluyente de la presente invención puede
asimismo contener además unas sales y unos carbohidratos.
Los carbohidratos son por ejemplo glucosa,
fructosa, lactosa.
Las sales son principalmente unos tampones, por
ejemplo la trimetilolmetilamina, dicho tampón se denomina
habitualmente Tampón Tris ó, simplemente, Tris.
El diluyente de la invención contiene una dosis
eficaz de por lo menos un poliol apto para inhibir la formación de
cristales de hielo. El poliol será ventajosamente glicerol.
Para la preparación de los diluyentes según la
invención, se llevan a cabo las etapas siguientes:
a) preparación de una dispersión de por lo menos
un fosfolípido en forma de partículas en por lo menos un poliol a
una temperatura suficiente;
b) agitación de la dispersión de la etapa a) de
forma que se micronizan dichas partículas de fosfolípido;
c) reposo de la dispersión obtenida en la etapa
b) durante un periodo de tiempo de por lo menos aproximadamente 12
horas de forma que se alcanza una estabilidad de la emulsión
obtenida, es decir sin separación de fases, que conduce a una
preparación, denominada preparación de la etapa c);
d) preparación de una fase acuosa que comprende
por lo menos un aminoácido que presenta unas propiedades
antioxidantes, por lo menos un péptido antioxidante de la vitamina
A, que conduce a una fase, denominada fase acuosa de la etapa
d);
e) reunión de la preparación de la etapa c) y de
la fase acuosa de la etapa d), que conduce a una preparación,
denominada preparación de la etapa e); y
f) esterilización de la preparación de la etapa
e).
Según una forma de realización preferida de la
invención, la esterilización de la etapa f) se realiza por radiación
ionizante en una horquilla de dosis de irradiación de
aproximadamente 5 a aproximadamente 20 Kgy, preferentemente
aproximadamente 15 a aproximadamente 20 kgy.
De entre las técnicas para obtener la dispersión
de la etapa a), se pueden utilizar unos dispersores mecánicos y unos
emulsionantes que actúan a través de la presión.
Para obtener una emulsión estable en la etapa c),
resulta necesario dejar reposar la dispersión durante por lo menos
12 horas.
Preferentemente, el diluyente de la invención se
formula con una cantidad de agua reducida, y se diluye mediante el
empleo de agua estéril.
En el momento de su utilización, el diluyente
contiene ventajosamente un agente antibiótico. Sin embargo, si el
agente antibiótico se añade al diluyente en el momento de su
preparación, se puede perder la eficacia en el momento de la
esterilización.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, el agente antibiótico se añade extemporáneamente
en el momento de la utilización.
En dicha forma de realización, el diluyente sin
antibiótico está contenido ventajosamente en un recipiente cerrado
con un tapón. Por ejemplo, el agente antibiótico en forma de polvo
está presente en el tampón y se libera en el diluyente ejerciendo
una presión sobre dicho tapón.
El agente antibiótico es por ejemplo gentamicina
en forma de sulfato.
Típicamente, el diluyente de la invención
contendrá los fosfolípidos siguientes en las proporciones ponderales
que se indican a continuación:
"Lecitina 100" que presenta las proporciones
ponderales indicadas de los fosfolípidos siguientes:
- fosfatidilcolina 20-24%
- fosfatidiletanolamina
18-22%
- fosfatidilinositol 12- 15%
"Lecitina 130" que presenta las proporciones
ponderales indicadas de los fosfolípidos siguientes:
- fosfatidiletanolamina
14-20%
- fosfatidilinositol 7- 13%
- fosfatidilcolina 30-35%
La Lecitina 130 es de hecho una lecitina
enriquecida en fosfatidilcolina.
Debe destacarse que el diluyente de la invención
se destina exclusivamente a la crioconservación de espermatozoides
de bovinos. No se ha adaptado para la crioconservación de
espermatozoides de otras especies animales o de la especie
humana.
Se ha propuesto un diluyente no ilustrativo de la
invención que comprende para 100 ml de agua:
Siguiendo el modo operativo descrito
anteriormente, se ha formulado un diluyente que presenta la
composición siguiente:
La fórmula anterior se prepara para obtener 100
ml de diluyente concentrado siendo diluido dicho último hasta 500 ml
para la utilización.
En dicho ejemplo, el diluyente del ejemplo 1 se
compara con un diluyente de la técnica anterior descrita en el
documento EP-A-685 556 en lo que se
refiere a las anomalías y la resistencia osmótica in
vitro.
Siguiendo el modo operativo descrito en el
documento EP-A-685 556, se ha
formulado un diluyente según la técnica anterior que presenta la
composición siguiente:
| Trimetilol-metilamina | 3,4 g a 4,2 g |
| Citrato trisódico dihidratado | 13,7 g a 16,75 g |
| Cloruro potásico | 0,55 g a 0,67 g |
| Fructosa | 1,65 g a 2,0 g |
| Glucosa | 0,68 g a 0,84 g |
| Lactosa | 0,41 g a 0,50 g |
| Lactato de calcio | 0,09 g a 0,11 g |
| Glicina | 5,15 g a 6,25 g |
| Glicerol | 64 ml a 78 ml |
| Lecitina de soja | 6,75 g a 8,25 g |
y dicho vehículo se diluye, para la utilización,
con 750 ml a 900 ml de agua.
La Tabla I siguiente proporciona los resultados
comparativos del diluyente de la técnica anterior, DILUYENTE A, y
del diluyente del ejemplo 1, DILUYENTE I, con diferentes toros:
NIZAGO, NOMEL, NORRIS, NOVAK, OCARINA y OKAVANGO.
HOST = ensayo de resistencia osmótica
Spz = espermatozoides
La Tabla 1 indica claramente la superioridad del
diluyente del ejemplo 1 sobre el diluyente de la técnica anterior
porque para 7x10^{6} espermatozoides por dosis, se obtiene un
porcentaje de resistencia osmótica in vitro muy superior para
el diluyente del ejemplo 1.
Aunque la invención se ha descrito respecto a
unas formas de realización particulares, se sobreentenderá que
abarca todas las variantes de ejecución que estén comprendidas en el
alcance de las reivindicaciones.
Claims (16)
1. Diluyente para la crioconservación de
espermatozoides de bovinos que comprende por lo menos un
fosfolípido, vitamina A acompañada de un emulsionante, por lo menos
un agente antioxidante y por lo menos un poliol, no conteniendo
dicho diluyente ninguna sustancia de origen animal.
2. Diluyente según la reivindicación 1,
caracterizado porque el agente antioxidante es un aminoácido
que presenta unas propiedades antioxidantes.
3. Diluyente según la reivindicación 1,
caracterizado porque el agente antioxidante es un péptido
antioxidante.
4. Diluyente según la reivindicación 2,
caracterizado porque el aminoácido que presenta unas
propiedades antioxidantes es la taurina.
5. Diluyente según la reivindicación 3,
caracterizado porque el péptido antioxidante es glutatión
reducido.
6. Diluyente según la reivindicación 1,
caracterizado porque contiene además un esterol.
7. Diluyente según la reivindicación 6,
caracterizado porque el esterol es el colesterol.
8. Diluyente según cualquiera de las
reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque contiene además
unas ciclodextrinas para solubilizar el esterol.
9. Diluyente según la reivindicación 1,
caracterizado porque el poliol es el glicerol.
10. Diluyente según la reivindicación 1,
caracterizado porque contiene además unas sales y unos
carbohidratos.
11. Procedimiento para la preparación del
diluyente según la reivindicación 1, caracterizado porque se
llevan a cabo las etapas siguientes:
a. preparación de una dispersión de por lo menos
un fosfolípido en forma de partículas en por lo menos un poliol a
una temperatura suficiente,
b. agitación de la dispersión de la etapa a) de
forma que se micronizan dichas partículas de fosfolípido,
c. reposo de la dispersión obtenida en la etapa
b) durante un periodo de tiempo de por lo menos 12 horas de forma
que se alcanza una estabilidad de la emulsión obtenida, es decir sin
separación de fases, que conduce a una preparación, denominada
preparación de la etapa c),
d. preparación de una fase acuosa que comprende
por lo menos un aminoácido que presenta unas propiedades
antioxidantes, por lo menos un péptido antioxidante y vitamina A,
que conduce a una fase, denominada fase acuosa de la etapa d),
e. combinación de la preparación de la etapa c) y
de la fase acuosa de la etapa d) que conduce a una preparación,
denominada preparación de la etapa e), y
f. esterilización de la preparación de la etapa
e).
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la esterilización de la etapa f) se
realiza mediante radiación ionizante en una horquilla de dosis de
irradiación comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20
Kgy.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la horquilla de dosis de irradiación
está comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20
Kgy.
14. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se añade un esterol a la preparación de
la etapa d).
15. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se añaden unos carbohidratos a la
preparación de la etapa d).
16. Utilización de un diluyente según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10 para la crioconservación de
espermatozoides de bovinos.
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