ES2225103T3

ES2225103T3 - Nuevos antagonistas de la lhrh con propiedades de disolucion mejoradas.

Info

Publication number: ES2225103T3
Application number: ES00910816T
Authority: ES
Inventors: Michael Bernd; Bernhard Kutscher; Eckhard Gunther; Peter Romeis; Thomas Reissmann; Thomas Beckers
Original assignee: Zentaris AG
Current assignee: Aeterna Zentaris GmbH
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-11
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-03-11
Also published as: SK13232001A3; US20040266695A1; DK1163264T3; ZA200107753B; US7148195B2; KR100569623B1; EP1163264B1; TWI243179B; RU2227145C2; IL145484A0; US7732412B2; SK287880B6; BR0009472A; YU68702A; NO20014486D0; IL145484A; CZ301696B6; HUP0200363A2; DE19911771A1; PL200647B1

Abstract

Compuestos de la fórmula general 1 A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10- NH2 en la cual significan A un grupo acetilo o un grupo 3-(4-fluorofenil)- propionilo Xxx1 D-Nal(1) o D-Nal(2), Xxx2-Xxx3D-Cpa-D-Pal(3) o un enlace sencillo, Xxx4 Ser, Xxx5 N-Me-Tyr, Xxx6 D-Hci, Xxx7 Nle, Xxx8 Arg o Lys(iPr), Xxx9 Pro, y Xxx10 Ala o Sar y sus sales con ácidos farmacéuticamente aceptables.

Description

Nuevos antagonistas de la LHRH con propiedades de disolución mejoradas.

La invención se refiere a antagonistas de la LHRH con mejores propiedades de disolución, a procedimientos para la preparación de estos compuestos, a medicamentos que contienen estos compuestos, así como al uso de los medicamentos para el tratamiento de tumores hormono-dependientes y enfermedades no malignas sobre las que se puede influir con hormonas, tales como la hiperplasia prostática benigna (HPB) y la endometriosis.

La nomenclatura utilizada para definir péptidos coincide con la nomenclatura establecida por la Comisión de la IUPAC-IUB para la Nomenclatura Bioquímica (European J. Biochem. 1984, 138, 9-37), en la cual, en concordancia con la representación actual, los grupos amino en el extremo N aparecen hacia la izquierda y los grupos carboxilo del extremo C lo hacen hacia la derecha. Los antagonistas de LH-RH tales como los péptidos según la invención comprenden aminoácidos de origen natural y sintético, en los que los primeros comprenden Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp y His. Las abreviaturas de los correspondientes restos aminoácidos se basan en los nombres comunes de los aminoácidos, y son: Ala = alanina, Arg = arginina, Gly = glicina, Leu = leucina, Lys = lisina, Pal(3) = 3-(3-piridil)-alanina, Na(2) = 3-(2-naftil)-alanina, Phe = fenilalanina, Cpa = 4-cloro-fenilalanina, Pro = prolina, Ser = serina, Thr = treonina, Trp = triptófano, Tyr = tirosina y Sar = sarcosina. Todos los aminoácidos descritos en este documento proceden de la serie L, mientras no se indique lo contrario. Por ejemplo, D-Nal(2) es la abreviatura de 3-(2-naftil)-D-alanina y Ser la abreviatura de L-serina. Las sustituciones en el grupo \varepsilon-amino en la cadena lateral de lisina se representan por una expresión situada entre paréntesis detrás de Lys, eventualmente en forma de una abreviatura.

Otras abreviaturas utilizadas son:

Ac: acetilo

Atz: 3-amino-1,2,4-triazol-5-carbonilo

B: 4-(4-amidino-fenil)-amino-1,4-dioxo-butilo

Boc: terc-butiloxi-carbonilo

Bop: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio

DCC: diciclohexil-carbodiimida

DCM: diclorometano

Ddz: dimetoxifenil-dimetil-metilenoxi-carbonilo (dimetoxi-dimetil-Z)

DIC: diisopropil-carbodiimida

DIPEA: N,N-diisopropil-etilamina

DMF: dimetilformamida

Fmoc: fluorenil-metiloxi-carbonilo

HF: ácido fluorhídrico

HOBt: 1-hidroxi-benzotriazol

HPLC: cromatografía líquida de alta presión

Me: metilo

TFA: ácido trifluoro-acético

Z: benciloxi-carbonilo

Hci: Homocitrulina

Cpa: 4-cloro-fenilalanina

Los péptidos según la invención son análogos de la hormona liberadora de la ormona luteinizante (LH-RH), que posee la siguiente estructura:

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2}, [LH-RH, gonadorelina].

Durante más de 20 años, los investigadores han buscado antagonistas selectivos y potentes del decapéptido de LH-RH [M. Karten y J.E. Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66 (1986)]. El elevado interés de estos antagonistas radica en su utilización en el campo de la endocrinología, ginecología, prevención del embarazo y cáncer. Se ha preparado un alto número de compuestos como potenciales antagonistas de LH-RH. Los compuestos más interesantes hallados hasta la fecha son aquellos cuyas estructuras representan una modificación de la estructura de LH-RH.

La primera serie de antagonistas potentes se obtuvo por la introducción de restos aminoácidos aromáticos en las posiciones 1, 2, 3 y 6 ó 2, 3 y 6. La forma de representar estos compuestos es la siguiente: se indican, en primer lugar, los aminoácidos que, en la cadena peptídica de la LH-RH, aparecen en el lugar de los aminoácidos originalmente presentes, destacándose las posiciones en las que ha tenido lugar el intercambio mediante cifras en forma de superíndices. Adicionalmente, por medio de la designación "LH-RH" situada en última posición se expresa que se trata de análogos de la LH-RH en los que se ha producido un intercambio.

Antagonistas conocidos son:

[Ac-D-Cpa^{1,2},D-Trp^{3,6}] LH-RH (D.H. Coy et al., en: Gross E y Meienhofer, J. (compiladores) Peptides; Proceedings of the 6^{th} American Peptid Symposium, pág. 775-779, Pierce Chem. Co., Rockville III. (1979):

[Ac-Pro^{1}, D-Cpa^{2}, D-Nal(2)^{3,6}] LH-RH (Patente de EE.UU. nº 4.419.347), y

[Ac-Pro^{1}, D-Cpa^{2}, D-Trp^{3,6}] LH-RH (J.L. Pineda et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 420, 1983).

Para mejorar la acción de los antagonistas, se introdujeron más tarde aminoácidos básicos, por ejemplo, D-Arg, en la posición 6. Por ejemplo, [Ac-D-Cpa^{1,2}, D-Trp^{3}, D-Arg^{6}, D-Ala^{10}] LH-RH (ORG-30276) (D.J. Coy et al., Endocrinology 100, 1445, 1982); y

[Ac-D-Nal(2)^{1}, D-Phe(4-F)^{2}, D-Trp^{3}, D-Arg^{6}] LH-RH (ORF 1826.0) (J.E. Rivier et al., en: Vickery B.H. Nestor, Jr. J.J., Hafez, E.S-E. (compiladores). LHRH and its Analogs, pág. 11-22, MTP Press, Lancaster, RU 1984).

Se describen otros potentes antagonistas de LH-RH adicionales en los documentos WO 92/19651, WO 94/19370, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5.300.492, US-A 5.140.009, EP 0 413 209 A1 y DE 195 44 212 A1.

Compuestos dados a conocer recientemente, con un componente ornitina o lisina modificado en posición 6, corresponden a la siguiente fórmula:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Xxx^{6}-Leu^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}.

en la que D-Xxx representa un grupo aminoácido de la fórmula general (VI)

--- HN ---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{  \hskip-0.3cm 
(CH _{2} ) _{n} }{\delm{\para}{\delm{NH}{\delm{\para}{CO ---
R}}}}}}

H --- CO ---

Adicionalmente, se describen antagonistas de LH-RH en los documentos WO 97/19953 y EP-A2 0 328 090.

Otros antagonistas de LH-RH conocidos son Antarelix, Ganirelix y Cetrorelix.

Antarelix:

Ac-D-Nat(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Leu^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}D-Ala^{10}-NH_{2},

Ganirelix:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-hArg(Et)_{2}{}^{6}-Leu^{7}-hArg(Et)2^{8}-Pro^{9}D-Ala^{10}-NH_{2},

Cetrorelix:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-Tyr^{5}-D-Cit^{6}-Leu^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}D-Ala^{10}-NH_{2}.

Objeto de la invención es lograr nuevos antagonistas de LH-RH que muestren una estabilidad enzimática incrementada y una solubilidad en agua significativamente mejor.

Esta misión se soluciona por medio de compuestos de la siguiente fórmula (I):

(I)A-Xxx^{1}-Xxx^{2}-Xxx^{3}-Xxx^{4}-Xxx^{5}-Xxx^{6}-Xxx^{7}-Xxx^{8}-Xxx^{9}-Xxx^{10}-NH_{2}

en la cual significan:

A: un grupo acetilo o 3-(4-fluorofenil)-propionilo,

Xxx^{1}: D-Nal(1) o D-Nal(2),

Xxx^{2}-Xxx^{3}: D-Cpa-D-Pal(3) o un enlace sencillo,

Xxx^{4}: Ser,

Xxx^{5}: N-Me-Tyr,

Xxx^{6}: D-Hci,

Xxx^{7}: Nle,

Xxx^{8}: Arg o Lys(iPr),

Xxx^{9}: Pro, y

Xxx^{10}: Ala o Sar,

y sus sales con ácidos farmacéuticamente aceptables, en especial los acetatos, embonatos y trifluoroacetatos.

Compuestos según la invención especialmente preferidos son:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5} -D-Hci^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2},

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5} -D-Hci^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-Ala^{10}-NH_{2},

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5} -D-Hci^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-Sar^{10}-NH_{2},

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5} -D-Hci^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-Sar^{10}-NH_{2}, así como sus sales con los ácidos farmacéuticamente aceptables anteriormente mencionados.

Los compuestos según la invención se pueden utilizar para el tratamiento de tumores hormono-dependientes, en especial carcinoma de próstata o cáncer de mama, así como en indicaciones no malignas cuyo tratamiento requiere una supresión hormonal de LH-RH. Para esto, se mezclan con los vehículos y coadyuvantes habituales y se formulan como medicamentos.

La síntesis de compuestos según la fórmula (I) puede llevarse a cabo tanto por condensación de fragmentación clásica, como por síntesis de fase sólida según Merrifield, con síntesis consecutiva, utilizando la D-lisina que se encuentra ya acilada en la cadena lateral con los ácidos carboxílicos de la fórmula general R^{1}-COOH, así como por reacción de un componente decapeptídico con los correspondientes ácidos carboxílicos por acoplamiento de amida en la cadena lateral de D-lisina^{6}. De acuerdo con ello, la introducción del grupo R^{1}-CO puede efectuarse en tres etapas diferentes del procedimiento: antes de la condensación del componente individual en péptido, tras la incorporación de lisina u ornitina en la cadena peptídica, pero antes de la condensación del componente inmediatamente consecutivo, o tras la condensación de todos los componentes.

Los compuestos de la fórmula (I) se sintetizan según métodos conocidos tales como, por ejemplo, la técnica de fase sólida pura, técnica parcial de fase sólida (la llamada condensación de fragmentación), o por medio de los acoplamientos de soluciones clásicos (véase M. Bodaszky, "Principles of Peptide Synthesis", Editorial Springer, 1984).

Por ejemplo, los métodos de síntesis de fase sólida se describen en el libro de texto "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart y J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, Ill, 1984, y en G. Barany y R.B. Merrifield "The Peptides", Cap. 1, págs. 1-285, 9979, Academic Press, Inc. La síntesis de soluciones clásica se describe exhaustivamente en el tratado "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl); Synthese von Peptiden", E. Wünsch (compilador), 1974, Editorial Georg Thieme, Stuttgart, RFA.

La síntesis por etapas tiene lugar, por ejemplo, uniendo de forma covalente, en primer lugar, los aminoácidos carboxi-terminales, cuyo grupo amino en posición \alpha está protegido, a un vehículo insoluble habitual para esta tarea, se separa el grupo protector \alpha-amino de este aminoácido, el siguiente aminoácido protegido se une al grupo amino libre, obtenido de esta forma, a través de su grupo carboxi y, de este modo, se acoplan, paso a paso, los restantes aminoácidos del péptido a sintetizar en su orden correcto y, tras el acoplamiento de todos los aminoácidos, se separa el péptido terminado del vehículo y se separan otros grupos protectores de las funciones laterales eventualmente presentes. La condensación por etapas se lleva a cabo por la síntesis usual de los correspondientes aminoácidos, protegidos de manera habitual.

El acoplamiento de los distintos aminoácidos entre sí se produce mediante métodos habituales para esto, teniéndose especialmente en consideración:

\bullet: método del anhídrido simétrico en presencia de diciclohexil-carbodiimida o diisopropil-carbodiimida (DCC, DIC)

\bullet: método de carbodiimida en general,

\bullet: método de carbodiimida-hidroxibenzotriazol

(véase "The Peptides", Vol. 2, compiladores E. Gross y J. Meienhofer).

En el acoplamiento de fragmentos se utiliza, preferentemente, el acoplamiento azídico que transcurre sin racemización, o el método de DCC-1-hidroxibenzotriazol o de DCC-3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina. Asimismo, se pueden utilizar ésteres activados de fragmentos.

Para la condensación por etapas de aminoácidos son especialmente adecuados los ésteres activados de aminoácidos N-protegidos tales como, por ejemplo, el éster de N-hidroxi-succinimida o el éster de 2,4,5-triclorofenilo. La aminólisis se puede catalizar muy bien por compuestos N-hidroxi, que poseen la acidez aproximada del ácido acético, tales como, por ejemplo, 1-hidroxibenzotriazol.

Como grupos amino-protectores intermedios se pueden utilizar grupos deshidrogenantes tales como, por ejemplo, el resto bencil-oxi-carbonilo (= resto Z), o grupos que se pueden separar bajo condiciones ácidas débiles. Como grupos protectores de los grupos amino en posición \alpha se toman en consideración, por ejemplo:

: grupos terc-butiloxi-carbonilo, grupos fluorenil-metiloxi-carbonilo, grupos carbobenzoxi o grupos carbobenzotio (eventualmente, con correspondientes restos p-bromo o p-nitro-bencilo), grupos trifluoroacetilo, el resto ftalilo, el grupo o-nitrofenoxi-acetilo, el grupo tritilo, el grupo p-toluen-sulfonilo, el grupo bencilo, restos bencilo sustituidos en el núcleo benceno (resto de p-bromo o p-nitro-bencilo) y el resto \alpha-feniletilo. Asimismo, se hace referencia, en este contexto, a Jesse P. Greenstein y Milton Winitz, Chemistry of Amino Acids, Nueva York 1961, John Wiley and Sons, Inc., Volumen 2, por ejemplo, páginas 883 y siguientes, "Principles of Peptide Synthesis", Editorial Springer 1984, "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart y J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford Ill, 1984, G. Barany y R.B. Merrifield, "The Peptides", Cap. 1, pág. 1-285, 1979, Academic Press, Inc., así como The Peptides, Volumen 2, compiladores E. Gross y J. Meienhofer, Academic Press, Nueva York. Estos grupos protectores se toman también en consideración para la protección de otros grupos laterales funcionales (grupos OH, grupos NH_{2}) de los correspondientes aminoácidos.

Los grupos hidroxi presentes (serina, treonina) se protegen, preferentemente, por medio de grupos bencilo y grupos similares. Otros grupos amino que no se encuentran en posición \alpha (por ejemplo, grupos amino en posición \omega, grupos guanidino de la arginina) se protegen, preferentemente, de forma ortogonal.

Los distintos componentes aminoácidos se pueden adquirir en el comercio, con la excepción de la lisina u ornitina modificada por el grupo R^{1}-CO. Una evolución posible del procedimiento para la preparación de estos últimos compuestos es la siguiente:

1.: Se amida el grupo ácido \alpha-carboxílico.

2.: El grupo \varepsilon-amino se protege con el grupo Z.

3.: El grupo \alpha-amino se protege con el grupo Boc, de forma que se obtiene una selectividad con respecto a la posterior separación de los grupos amino-protectores.

4.: Se separa el grupo Z en el grupo \varepsilon-amino.

5.: Se introduce en el grupo \varepsilon-amino el grupo R^{4}-CO deseado.

6.: Se separa el grupo Boc en el grupo \alpha-amino.

7.: Se dota al grupo \alpha-amino con el grupo Z.

Para la introducción del grupo R^{1}-CO por medio de la reacción del grupo amino de la lisina con el correspondiente ácido carboxílico, se emplea básicamente el mismo procedimiento que se ha citado anteriormente para el acoplamiento de los aminoácidos. No obstante, se prefiere de manera especial la condensación usando carbodiimida, por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida, y 1-hidroxibenzotriazol.

La reacción para el acoplamiento de aminoácidos tiene lugar en un agente de disolución o suspensión indiferente habitual (por ejemplo, diclorometano), en donde se puede agregar, eventualmente, dimetilformamida para mejorar la solubilidad.

Como vehículo sintético se toman en consideración polímeros insolubles, por ejemplo, una resina de poliestireno que se hincha en disolventes orgánicos (por ejemplo, un copolímero de poliestireno y 1% de divinil-benceno). La unión de una amida decapeptídica protegida a una resina de metil-benzo-hidril-amida (resina MBHA, es decir, una resina de poliestireno provista de grupos metil-benzo-hidril-amida), que proporciona la función amida C-terminal deseada del péptido tras la separación con HF del vehículo, se puede llevar a cabo de acuerdo con el siguiente flujo-
grama:

1

Los aminoácidos protegidos con N\alpha-Boc se acoplan habitualmente en exceso triple molar, en presencia de diisopropil-carbodiimida (DIC) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) en CH_{2}Cl_{2}/DMF en un plazo de 90 min y los grupos protectores Boc se separan mediante la acción de ácido trifluoroacético (TFA) al 50% en CH_{2}Cl_{2} durante media hora. Para el control de que la reacción se ha completado, se pueden usar el ensayo de cloranilo según Christensen y el ensayo de ninhidrina de Kaiser. Los restos de funciones amino libres se bloquean por acetilación en exceso quíntuple en acetil-imidazol en CH_{2}Cl_{2}. La secuencia de las etapas de reacción de la construcción de péptidos sobre resina aparece en el flujograma. Para la separación de los péptidos unidos a resina, el correspondiente producto final de la síntesis de fase sólida se seca al vacío sobre P_{2}O_{5} y se trata con un exceso de 500 veces en HF/anisol 10:1 v:v durante 60 min a 0ºC.

Tras la separación por destilación de HF y anisol al vacío, precipitan las amidas peptídicas por agitación con éter etílico anhidro en forma de sólidos blancos, tras lo que se produce la separación del polímero que co-precipita mediante lavado con ácido acético acuoso al 50%. Mediante una cuidadosa concentración de las soluciones de ácido acético al vacío se pueden obtener los correspondientes péptidos en forma de aceites altamente viscosos que se transforman en sólidos blancos tras la adición de éter abs. en frío.

La posterior purificación tiene lugar por métodos convencionales de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de preparación.

La conversión de los péptidos en sus sales por adición de ácido se puede llevar a cabo por reacción de los mismos con ácidos en una forma en sí conocida. A la inversa, se pueden obtener péptidos libres por reacción de sus sales de adición de ácido con bases. Los embonatos peptídicos se pueden obtener por la reacción de sales de ácido trifluoroacético (sales de TFA) del péptido con ácido embónico (ácido pamoico) libre, o de la correspondiente sal disódica del ácido embónico. A tal efecto, se mezcla la sal de TFA del péptido en solución acuosa con la solución de embonato disódico en un medio aprótico polar, preferentemente, dimetilacetamida, y se aísla el precipitado que se forma, de color amarillo claro.

Los siguientes Ejemplos sirven para explicar la invención, sin limitarla.

Ejemplo 1 Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}

La síntesis se llevó a cabo según el flujograma de fases sólidas (Protocolo de síntesis de péptidos, pág. 11) con acoplamiento de DIC/HOBt, a partir de 3,3 g de resina MBHA (densidad de carga, 1,08 mmol/g). Tras la separación por HF del vehículo polímero, precipitaron 3,4 g de péptido bruto, que se purificó por el procedimiento estándar de HPLC de preparación. Después de la consiguiente liofilización, se obtuvieron 1,43 g de producto homogéneo de la fórmula aditiva C72, H96, N17, O14, Cl, con una FAB-MS correcta: 1458,7 (M+H^{+}) (calc. 1457,7), y el correspondiente espectro de RMN-H^{1}.

RMN-H^{1} (500 MHz, D_{2}O/DMSO-D_{6}, \delta en ppm):

8,7 hasta 7,2, múltiples m, H arom. y NH incompletamente intercambiado; 6,92 y 6,58, 2d, 2x2H, H arom. p-Cl-Phe; 5,2 hasta 3,5, múltiples m, C\alpha-H y H alif.; 3,2 hasta 2,6, múltiples m, C\beta-H aromát., 2,1 hasta 0,7, múltiples m, H alifát. residual; 1,70, s, 3H, acetilo; 1,20, d, 3H, C\beta-H Ala; 0,8, m, C\delta-H Leu.

Ejemplo 2 Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-Ala^{10}-NH_{2}

La síntesis se llevó a cabo de acuerdo con el flujograma de fases sólidas (Protocolo de síntesis de péptidos, pág. 11) con acoplamiento de DIC/HOBt, a partir de 2,5 g de resina MBHA (densidad de carga, 1,08 mmol/g). Tras la separación por HF del vehículo polímero, precipitaron 2,78 g de péptido bruto, que se purificó por el procedimiento estándar de HPLC de preparación. Después de la consiguiente liofilización, se obtuvieron 400 mg de producto HPLC-uniforme con la fórmula aditiva C75, H102, N15, O14, Cl con una EMI-MS correcta; 1472,6 (M+H^{+}) (calc.: 1471,7) y el correspondiente espectro de RMN-H^{1}.

RMN-H^{1} (500 MHz, D_{2}O/DMSO-D_{6}, \delta en ppm):

8,62, m, 2H, 8,30, m, 2H, 7,80, m, 4H, 7,66, s, 1H, 7,47, m, 2H, 7,36, d, 1H, H aromát.; 7,25 y 7,20, 2d, 4H, H arom. (pCl)Phe; 6,96 y 6,63, 2d, 4H, H aromát. Tyr, 5,10 hasta 4,0, múltiples m, C\alpha-H y H alifát.; 3,75 hasta 2,65, múltiples m, C\beta-H y N-CH_{3}; 2,1 hasta 1,5, múltiples m, H alifát. residual; 1,74, s, 3H, acetilo; 1,23, d, 3H, C\beta-H Ala; 1,20, m, CH_{3} isoprop.; 0,8, m, 3H, C\delta-H Nle.

Ejemplo 3 Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-Sar^{10}-NH_{2}

La síntesis se llevó a cabo de acuerdo con el flujograma de fase sólidas (Protocolo de síntesis de péptidos, pág. 11) con acoplamiento de DCI/HOBt, a partir de 2,5 g de resina MBHA (densidad de carga, 1,08 mmol/g). Tras la separación con HF del vehículo polímero, precipitaron 2,74 g de péptido bruto, que se purificó por el procedimiento estándar de HPLC de preparación. Después de la liofilización subsiguiente, se obtuvieron 840 mg de producto HPLC-uniforme con la fórmula aditiva C75, H102, N15, O14, Cl con una ESI-MS correcta: 1472,6 (M+H^{+}) (calc.: 1471.7) y el correspondiente espectro de RMN-H^{1}.

RMN-H^{1} (500 MHz, D_{2}O/DMSO-D_{6}, \delta en ppm):

8,6, m, 2H, 8,3, m, 2H, 7,85, m, 2H, 7,8, m, 2H, 7,65, s, 1H, 7,46, m, 2H, 7,35, d, 1H, H aromát.; 7,23 y 7,17, 2d, 4H, H arom. (pCl)Phe; 7,0 y 6,6, 2d, 4H, H aromát. Tyr; 5,10 hasta 3,8, múltiples m, C\alpha-H y H alifát.; 3,75 hasta 2,6, múltiples m, C\beta-H y N-CH_{3}; 2,2 hasta 1,05, múltiples m, H alifát. residual; 1,70, s, 3H, acetilo; 1,23, d, 3H, C\beta Ala; 1,20, m, CH_{3} isoprop.; 0,8, m, 3H, C\delta Nle.

En los compuestos de la fórmula 1 según la invención se analizó su unión a receptores. El procedimiento se basó estrechamente en el procedimiento descrito por Beckers et al. en Eur. J. Biochem. 231, 535-543 (1995). Cetrorelix obtenido de acuerdo con la síntesis anteriormente indicada se yodó con [^{125}I] (Amersham; actividad específica 80,5 Bq/fmol), utilizando el reactivo IodoGen (Pieerce). La mezcla de reacción se purificó por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, obteniéndose Cetrorelix mono-yodado sin péptidos no marcados. En cada caso, aproximadamente 80% de [^{125}I]-Cetrorelix y el compuesto según la invención no marcado fueron adecuados para la asociación específica a receptores.

La actividad in vitro de los compuestos según la invención se puede analizar con los siguientes métodos 1 y 2, en los que se determinaron las afinidades de unión en el ensayo de fijación con [^{125}I]-Cetrorelix (Método 1) y las actividades funcionales con triptorelina como estímulo agonista (Método 2).

Método 1

Ensayo de fijación a receptores según Beckers, T., Marheineke, K., Reiländer, H., Hilgard, P. (1995), "Selection and characterization of mammalian cell lines with stable overexpression of human pituitary receptors for gonadoliberin (GnRH)", Eur. J. Biochem. 231, 535-543.

Para investigar la fijación a receptores, se yodó Cetrorelix utilizando el reactivo IodoGen (Pierce) con [^{125}I] (Amersham; 80,5 Bq/fmol de actividad específica). La mezcla de reacción se purificó por cromatografía líquida de alto rendimiento con fases inversas, obteniéndose Cetrorelix mono-yodado sin péptidos no marcados. Alrededor de 80% de [^{125}I]-Cetrorelix fue adecuado para la asociación específica a receptores.

El ensayo de fijación a receptores se llevó a cabo con células intactas, bajo condiciones fisiológicas, de la forma descrita (Beckers et al., 1995). Se separaron cultivos sub-confluentes de células LTK transfectadas de forma estable, que expresan el receptor de LHRH humano, por medio de incubación en NaCl/P_{l} (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4} 11,47 mM)/EDTA 1 mM, y se las combinó por centrifugación. El granulado celular se resuspendió en tampón de fijación (DMEM sin H_{2}CO_{3}, con 4,5 g/l de glucosa, HEPES 10 mM a pH 7,5, BSA al 0,5% (masa/volumen), 1g/l de bacitracina, 0,1 g/l de SBTI, NaN_{3} al 0,1% (masa/volumen). Para los ensayos de desplazamiento, se incubaron 0,25 x 10^{6} células/100 \mul con aproximadamente 225 pM de [^{125}I]-Cetrorelix (actividad específica 5-10 x 10^{5} dpm/pmol) y diferentes concentraciones del compuesto según la invención, no marcado, como competidor. La suspensión celular en 100 \mul de medio de fijación se dispuso en capas en tubos de ensayo de 400 \mul sobre 200 \mul de aceite de silicona al 84% en volumen (Merck tipo 550)/aceite de parafina al 16% en volumen. Después de incubar durante 1 h a 37ºC bajo agitación lenta y continua, se separaron las células del medio de incubación por centrifugación durante 2 min a 9000 rpm (tipo de rotor HTA 13.8; Heraeus Sepatec, Osterode/Alemania). Se cortaron los extremos de los tubos de ensayo que contuvieron el granulado celular. A continuación, el granulado celular y el sobrenadante se analizaron por recuento de la irradiación \gamma. La cantidad de elementos inespecíficamente fijados se determinó incluyendo Cetrorelix no marcado a una concentración final de 1 \muM y ascendió, típicamente, a \leq 10% de los elementos fijados totales. El análisis de los datos de fijación se llevó a cabo con el programa analítico EBDA/Ligand (Biosoft V3.0).

Método 2

Ensayo funcional para determinar la actividad antagonista

El ensayo se llevó a cabo, con algunas modificaciones, de la forma descrita en Beckers, T., Reiländer, H., Hilgard, P. (1997), "Characterization of gonatropin-releasing hormone analogs based on a sensitive cellular luciferase reporter gene essay", Analyt. Biochem. 251, 17-23 (Beckers et al., 1997). Durante 24 h se cultivaron 10.000 células por pocillo, que expresan el receptor de LHRH humana y un gen informador de luciferasa en placas de microtitulación, usando DMEM con suplementos de FSC_{l} al 1% (v:v). A continuación, las células se estimularon durante 6 h con [D-Trp^{6}]-LHRH 1 nM. Antes de la estimulación, se agregaron compuestos antagonistas según la invención y, por último, se lisaron las células para cuantificar la actividad de Luc celular. El cálculo de los valores de CI_{50} a partir de las curvas de dosis-efecto se llevó a efecto por análisis de regresión no lineal, utilizando el modelo de Hill (Programa EDX 2.0 de C. Grunwald, Arzneimittelwerk Dresden).

La cuantificación de la actividad de Luc se llevó a cabo esencialmente de la forma descrita (Promega Technical Bulletins nº 101/161), utilizando el correspondiente sistema de ensayo de luciferasa (Promega E4030), por duplicado. Mediante la adición de Coenzima A (CoA) se produce una oxidación de luciferilo-CoA con una cinética ventajosa. Tras la separación del medio de cultivo de las placas de microtitulación, se lisaron las células por medio de la adición de 100 \mul de tampón de lisis (tris-fosfato 25 mM a pH 7,8, ditiotreitol 8,2 mM, ácido 1,2-diaminociclohexan-N,N,N',N'-tetraacético (CDTA) 2 mM, glicerina al 10% (v:v), Triton X-100 al 1% (v:v). Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, se transfirieron 10 \mul de lisado celular a una placa de microtitulación blanca, adecuada para la detección luminométrica (Dynatech). La reacción enzimática se inició mediante la adición de 50 \mul de tampón de ensayo (tricina 20 mM a pH 7,8, (MgCO_{3})_{4}Mg(OH)_{2} 1,07 mM, MgSO_{4} 2,67 mM, ácido etilendiamin-tetraacético (EDTA) 0,1 mM, ditiotreitol 33,3 mM, coenzima A 270 \muM, luciferina de luciérnaga (Photinus pyralis) 470 \muM, rATPNa_{2} 530 \muM). Después de un minuto, se determinó durante un tiempo total de un segundo la luminiscencia con un tiempo de semivida de señal de cinco minutos, utilizando el dispositivo EG&G de Berthold LicroLumat LB 96 P.

De esta forma, se obtuvieron los siguientes datos in vitro, en los que K_{D} representa la afinidad de fijación y CI_{50} representa la actividad funcional y pM significa picomol por litro.

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Compuesto	K_{D} [pM]	CI_{50} [pM]
Cetrorelix	170 (21)	198 (5)
Ejemplo 1 (sal acetato)	nd	242 (3)
nd = no determinado
() = número de ensayos independientes entre sí

Claims

1. Compuestos de la fórmula general 1

A-Xxx^{1}-Xxx^{2}-Xxx^{3}-Xxx^{4}-Xxx^{5}-Xxx^{6}-Xxx^{7}-Xxx^{8}-Xxx^{9} -Xxx^{10}-NH_{2}

en la cual significan

A: un grupo acetilo o un grupo 3-(4-fluorofenil)-propionilo

Xxx^{1}: D-Nal(1) o D-Nal(2),

Xxx^{2}-Xxx^{3}: D-Cpa-D-Pal(3) o un enlace sencillo,

Xxx^{4}: Ser,

Xxx^{5}: N-Me-Tyr,

Xxx^{6}: D-Hci,

Xxx^{7}: Nle,

Xxx^{8}: Arg o Lys(iPr),

Xxx^{9}: Pro, y

Xxx^{10}: Ala o Sar

y sus sales con ácidos farmacéuticamente aceptables.

2. Compuestos según la reivindicación 1, en los que la sal es acetato, trifluoroacetato o embonato.

3. Compuesto según la reivindicación 1 con la fórmula:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}.

4. Compuesto según la reivindicación 1 con la fórmula:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-D-Ala^{10}-NH_{2}.

5. Compuesto según la reivindicación 1 con la fórmula:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Nle^{7}-Lys(iPr)^{8}-Pro^{9}-Sar^{10}-NH_{2}.

6. Compuesto según la reivindicación 1 con la fórmula:

Ac-D-Nal(2)^{1}-D-Cpa^{2}-D-Pal(3)^{3}-Ser^{4}-N-Me-Tyr^{5}-D-Hci^{6}-Nle^{7}-Arg^{8}-Pro^{9}-Sar^{10}-NH_{2}.

7. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Procedimiento para la preparación de compuestos de la fórmula general 1 según la reivindicación 1, en el que se generan fragmentos de componentes Xxx^{m}, provistos de grupos protectores adecuados, en los que m significa un número entero de 1 a 10 y Xxx^{1} está acetilado, sobre una fase sólida o en solución, de acuerdo con procedimientos habituales; a continuación, los fragmentos se unen entre sí en una fase sólida por acoplamiento de segmentos y, tras finalizar el acoplamiento, se separan de la fase sólida los compuestos de la fórmula general 1 por procedimientos habituales, con la amidación del componente Xxx^{10}.

9. Uso de las sustancias según las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de tumores hormono-dependientes, en especial, carcinoma de próstata o cáncer de mama, así como de indicaciones no malignas cuyo tratamiento requiere una supresión hormonal de LH-RH.

10. Procedimiento para la preparación de medicamentos, en el que se mezclan compuestos según las reivindicaciones 1 a 6 con vehículos y coadyuvantes habituales, y se formulan como medicamentos.