KR20020002482A - 개선된 용해도 특성을 가진 신규의 ｌｈｒｈ 길항제 - Google Patents

개선된 용해도 특성을 가진 신규의 ｌｈｒｈ 길항제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 N-메틸화 아미노산 구성 성분을 포함하고 개선된 수용성을 가진 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드가 포함되어 있는 약제는 호르몬에 의존하는 종양 및 호르몬에 영향 받는 비 악성 질환의 치료에 사용될 수 있다.

Description

개선된 용해도 특성을 가진 신규의 ＬＨＲＨ 길항제{Novel LHRH antagonists with improved solubility characteristics}
본 발명은 개선된 용해도 특성을 가진 LHRH 길항제, 이 화합물의 제조 방법, 이 화합물이 함유된 약제 및 호르몬 기인 종양 및 양성 전립선 비대증(BHP)과 자궁내막증식증과 같은 호르몬 영향의 비 악성 질환을 치료하기 위한 상기 약제의 용도에 관한 것이다.
펩타이드를 정의하는데 사용되는 명명법은 생화학 명명법에 관한 IUPAC-IUB-위원회에 의해 기재된 명명법(문헌 참조: European J.Biochem. 1984, 138, 9-37)에 따르는 통상적 표시법에 따라 N-말단의 아미노기는 좌측에 나타내고 C 말단의 카복실기는 우측에 나타낸다. 본 발명에 의한 펩타이드와 같은 LH-RH 길항제는 천연 및 합성 아미노기를 포괄하는데, 천연 아미노기는 Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His를 포함한다. 각 아미노산 잔기에 대한 약어는 아미노산의 통상적인 명칭을 기준으로 하여 Ala=알라닌, Arg=아르기닌, Gly=글리신, Leu=류신, Lys=라이신, Pal(3)=3-(3-피리딜)알라닌, Nal(2)=3-(2-나프틸)알라닌, Phe=페닐알라닌, Cpa=4-클로르페닐알라닌, Pro=프롤린, Ser=세린, Thr=트레오닌, Trp=트립토판, Tyr=티로신 및 Sar=사르코신이다. 여기 기재된 모든 아미노산은, 달리 언급하지 않을 때에는, L-계열에서 유래한다.예를 들어, D-Nal(2)는 3-(2-나프틸)-D-알라닌의 약어이고 Ser은 L-세린의 약어이다. 라이신의 측쇄에 있는 ε-아미노 기에서의 치환기는, 경우에 따라서는 약어 형의, Lys 후의 괄호 내에 설정된 표현에 의해 표시된다.
사용되는 다른 약어는 다음과 같다:
Ac 아세틸
Atz 3-아미노-1,2,4-트리아졸-5-카보닐
B 4-(4-아미디노-페닐)-아미노-1,4-디옥소-부틸
Boc 3급 부틸옥시카보닐
Bop 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄-헥사플루오로포스페이트
DCC 디사이클로헥실카보디이미드
DCM 디클로르메탄
Ddz 디메톡시페닐-디메틸메틸렌옥시-카보닐(디메톡시-디메틸-Z)
DIC 디이소프로필카보디이미드
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMF 디메틸포름아미드
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카보닐
HF 플루오르화수소산
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
Me 메틸
TFA 트리플루오로아세트산
Z 벤질옥시카보닐
본 발명에 의한 펩타이드는 황체화 호르몬을 방출하는 다음 구조식을 가진 호르몬(LH-RH)의 동족체를 나타낸다:
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, [LH-RH, 고나도렐린]
20 년 이상 동안 연구가들은 LH-RH-데카펩타이드의 선택적인 강력한 길항제를 탐색해왔다[문헌 참조: M.Karten und J.E.Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66 (1986)]. 그런 길항제에 대한 높은 관심은 내분비학, 부인과학, 피임 및 암종 분야에서의 그 이용성에 근거하고 있다. 많은 수의 화합물이 강력한 LH-RH 길항제로서 제조되었다. 현재까지 발견된 것 중 가장 흥미있는 화합물들은 그 구조가 LH-RH 구조의 변형된 구조인 화합물들이다.
제 1 계열의 강력한 길항제는 방향족 아미노산 잔기를 위치 1,2,3 및 6 또는 2,3 및 6에 도입함에 의해 얻어졌다. 화합물의 통상적 표기법은 다음과 같다: LH-RH의 펩타이드 쇄 내에 원래 있던 아미노산 자리에 도입된 아미노산이 먼저 표기되며 이때 치환된 위치는 윗 첨자로 표기된다. 그리고 치환된 LH-RH 동족체에 관한 것은 뒤에 위치하는 표기 "LH-RH"에 의해 표현된다.
알려진 동족체들은 다음의 것이 있다:
[Ac-D-Cpa1,2, D-Trp3,6]LH-RH [문헌참조: D.H.Coy et al., In: Gross,E. undMeienhofer,J. (Eds) Peptides; Proceedings of the 6th American Peptide Symposium, S. 775-779, Pierce Chem.Co., Rockville Ⅲ(1979)];
[Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Nal(2)3,6]LH-RH [문헌참조: 미국 특허 제4,419,347호] 및
[Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Trp(2)3,6]LH-RH [문헌참조: J.L.Pineda, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56,420, 1983].
길항제의 효험을 개선하기 위해 나중에 기본 아미노산, 예를 들어, D-Arg가 6번 위치에 도입되었다. 예를 들어,
[Ac-D-Cpa1,2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10]LH-RH(ORG-30276) [문헌참조: D.H.Coy, et al., Endocrinology, 100, 1445,(1982)]; 및
[Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6]LH-RH(ORF 18260)(문헌참조: J.E.Rivier et al., In: Vickery B.H. Nestor,Jr. J.J.Hafez, E.S.E(EDS) LHRH and its Analogs, S. 11-22 MTP Press, Lankaster, UK 1984).
부가적인 강력한 LHRH 길항제는 WO 92/19651, WO 94/19370, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5,300,492, US-A 5,140,009, EP 0 413 209 A1 및 DE 195 44 212 A1에 기재되어 있다.
상기한 맨 나중 것은 6번 위치에 변형된 오르니틴- 또는 라이신 성분을 가진 화합물을 공개하고 있는데 그것은 이하의 화학식에 해당한다:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Xxx6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2, 상기에서, D-xxx는 다음 화학식 Ⅵ의 아미노산기를 나타낸다:
추가의 공지된 LH-RH 길항제는 안타렐릭스, 가니렐릭스 및 세트로렐릭스이다:
안타렐릭스:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2
가니렐릭스:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-hArg(Et)2 6-Leu7-hArg(Et)2 6-Pro9-D-Ala10-NH2
세트로렐릭스:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
본 발명의 목적은 상승된 효소 안정성 및 현저히 개선된 수용성을 가진 신규 LH-RH 길항제를 제공하는 것이다.
상기 목적은, 하기 화학식 I의 화합물 및 이들 화합물의 약제학적으로 허용되는 산과의 염, 특히 아세테이트, 엠보네이트 및 트리플루오로아세테이트에 의해 성취된다:
A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10-NH2
상기식에서,
A는 아세틸- 또는 3-(4-플루오로페닐)-프로피오닐기이고,
Xxx1은 D-Nal(1) 또는 D-Nal(2)이고,
Xxx2-Xxx3은 D-Cpa-D-Pal(3) 또는 단일결합이고,
Xxx4는 Ser이고,
Xxx5는 N-Me-Tyr이고,
Xxx6은 D-Cit, D-Hci 또는 하기 화학식 Ⅱ의 D-아미노산기를 나타내고
[여기서, n은 3 또는 4이고, R1은 하기 화학식 Ⅲ의 기
-(CH2)p-CO-NR2R3
(여기서, p는 1 내지 4의 정수이고, R2는 수소 또는 알킬기이고, 또한 R3은 비치환 되거나 치환된 아릴기 또는 헤테로아릴기이다), 3-아미노-1,2,4-트리아졸-5-카보닐기 또는 하기 화학식 Ⅳ의 환을 나타낸다:
(여기서, q는 1 또는 2이고, R4는 수소 또는 알킬 기이고, R5는 수소 또는 알킬 기이고, X는 산소 또는 황을 의미한다)],
Xxx7은 Leu 또는 Nle이고,
Xxx8은 Arg 또는 Lys(iPr)이고,
Xxx9는 Pro이고,
Xxx10은 Ala 또는 Sar이다.
본 발명에 의한 화합물 중에서는 Xxx6이 D-[ε-N'-(이미다졸리딘-2-온-4- 일)-포르밀]-Lys, D-(3-아미노-1,2,4-트리아졸-3-카보닐)-Lys(약칭: D-Lys(Atz)) 또는 D-[ε-N'-4-(4-아미디노-페닐)-아미노-1,4-디옥소-부틸]-Lys(약칭: D-Lys(B))인 화합물이 특히 바람직하다.
추가의 특히 바람직한 본 발명 화합물들은 하기와 같다:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2,
3-(4-플루오로페닐)-프로피오닐-D-Nal(1)1-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2, 및
이의 상기한 약제학적으로 허용되는 산과의 염.
본 발명에 의한 화합물들은, 치료시 LH-RH 호르몬 억제가 요구되는, 호르몬에 의존하는 종양, 특히 전립선 암종 또는 유방암의 치료에, 및 비 악성 증상에 사용될 수 있다. 이를 위해 이들 화합물은 통상적 담체- 및 보조물질과 혼합되고 약제로서 제형화된다.
화학식 Ⅰ에 의한 화합물들의 합성은, 고전적 단편축합 또는 순차적으로 형성하는 메리필드에 의한 고상 합성에 의해 측쇄에서 이미 일반식 R1-COOH의 카복실 기에 의해 아실화된 D-라이신을 사용하여 수행될 수도 있고, 또한 D-라이신6의 측쇄에서 아미드 결합을 통해 데카펩타이드 성분을 대응하는 카복실 산과 반응시킴에 의해 수행될 수 있다. 그런 후 R1-CO-기를 이하와 같은 공정의 세 상이한 싯점에서 도입할 수 있다: 즉 각 성분을 펩타이드에 축합시키기 전, 라이신 또는 오르니틴을 펩타이드 쇄 내에 삽입한 후이면서 후속 성분의 축합 이전에, 또는 모든 성분의 축합 후.
화학식 Ⅰ의 화합물들은 예를 들어, 순수 고상 기법, 부분 고상 기법(소위 단편축합)에 의해 또는 고전적 용액결합과 같은 공지의 합성법에 의해 합성된다(문헌 참조: M.Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984).
예를 들어, 고상 합성법은 교과서 [문헌참조:"Solid Phase Peptide Synthesis" J.M.Stewart and J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, Ⅲ, 1984, und in G.Barany and R.B.Merrifield "The Peptide", Ch 1, S. 1-285, 1979, Academic Press Inc.]에 기재되어 있다. 용액 합성법은 처리법 "유기화학적 방법(Houben-Weyl), 펩타이드의 합성"이 있고 문헌[참조: E.Wunsch(Herausgeber) 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD]에 기재되어 있다.
단계적 형성(합성)이 예를 들어, 행해지는 것으로, 먼저 그의 α-불변 아미노기가 보호되어 있는 카복시 말단 아미노산이 이를 위한 통상적 불용성 담체에 공유결합되고 이 아미노산의 α-아미노 보호기가 분리되고, 그렇게 하여 얻어진 유리 아미노기에 다음의 보호된 아미노산이 카복시 기를 통해 결합되고, 이 방법으로 한단계 한단계씩 합성하려는 펩타이드의 잔여 아미노산들이 올바른 순서로 결합되며, 모든 아미노 산의 결합 후 유리 펩타이드는 담체로부터 분리되고 경우에 따라서는 존재하는 추가의 부기능적 보호기들이 분리된다. 단계적 축합은, 통상적 방법으로 통상법으로 보호된 상응 아미노산의 합성에 의해 수행된다.
각 아미노산 상호간의 결합은 그런 통상적 방법에 따라 행해지고, 특히 다음이 고려될 수 있다:
* 디사이클로헥실카보디이미드 또는 디이소프로필카보디이미드(DCC,DIC)의 존재 하 대칭 무수물의 방법
* 일반적인 카보디이미드 방법
* 카보디이미드-하이드록시벤조트리아졸 방법
(참조:The Peptide, Volume 2, ED. E.Gross and J.Meienhofer).
단편 결합에서는 라세미화 없이 진행하는 아지드 결합 또는 DCC-1-하이드록시벤조트리아졸- 및 DCC-3-하이드록시-4-옥소-3,4-디하이드로-1,2,3-벤조트리아진-방법이 이용된다. 단편들의 활성화된 에스테르도 또한 사용된다.
아미노산의 단계적 축합을 위해서는 예를 들어, N-하이드록시석신이미드에스테르 또는 2,4,5-트리클로로페닐에스테르와 같은 N-보호된 아미노산의 특히 양호하게 활성화된 에스테르가 적합하다. 아미노 분해는, 예를 들어, 1-하이드록시벤조트리아졸과 같은, 대체로 아세트산의 산도를 가진 N-하이드록시 화합물에 의해 특히양호하게 촉진될 수 있다.
중간 아미노 보호기로서는 예를 들어, 벤질옥시카보닐 잔기(Z-잔기)와 같은 탈수소기 또는 약산성의 분리 가능한 기가 사용된다. α-불변 아미노기를 위한 보호기로서는 예를 들어, 이하의 것들이 고려된다:
3급 부틸옥시카보닐기, 플루오레닐메틸옥시카보닐기, 카보벤즈옥시기와 카보벤즈티오기(경우에 따라서는 p-브롬 또는 p-니트로벤질 잔기를 가진), 트리플루오로아세틸기, 프탈일 잔기, o-니트로펜옥시아세틸기, 트리틸기, p-톨루엔설포닐기, 벤질기, 벤젠 핵에서 치환된 벤질 잔기(p-브롬 또는 p-니트로벤질 잔기) 및 α-페닐에틸 잔기. 이것에 대해서는, 또한 문헌[참조:Jesse P. Greenstein und Milton Winitz, Chemistry of Amino Acids, New York 1961, John Wiley and Sons,Inc., Volume 2, S. 883 and "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984, "Solid Phase Peptide Synthesis" J.M.Stewart and J.D.Young, Pierce Chem.Company, Rockford, Ⅲ, 1984, G.Barany and R.B.Merrifield "The Peptide", Ch 1, S. 1-285, 1979, Academic Press Inc. Sowie The Peptide, Volume 2, ED. E. Gross and J.Maienhofer, Academic Press, New York]을 참조한다. 이들 보호기는 원칙적으로 해당하는 아미노산의 추가의 기능성 측방 기(OH 기, NH2기)를 보호하기 위한 데에도 고려해 볼 수 있다.
존재하는 하이드록시기(세린, 트레오닌)는 바람직하게는 벤질기 및 유사기에 의해 보호된다. 비 α-불변적인 추가의 아미노 기들(예를 들어, ω-위치의 아미노기, 아르기닌의 구아니디노 기)은 바람직하게는 직교 보호된다.
각 아미노산 성분들은 R1-CO-기에 의해 변형된 라이신 또는 오르니틴을 제외하고는 도입해 수득될 수 있다. 상기한 나중 화합물들을 제조하기 위한 공정의 가능한 절차는 다음과 같다:
1.α 카복실산기를 아미드화 한다.
2.ε아미노기를 Z 기로 보호한다.
3.α아미노기를 Boc 기로 보호하여 나중 아미노 보호기를 선택적으로 분리한다.
4. ε아미노기에 있는 Z 기를 분리한다.
5. ε아미노기에 목적하는 기 R4-CO를 도입한다.
6. α아미노기에 있는 Boc 기를 분리한다.
7. α아미노기에 Z 기를 배치시킨다.
라이신의 아미노 기를 대응하는 카복실 기와 반응시킴에 의한 R1-CO 기의 도입을 위해서는 원칙적으로 상기한 아미노산의 결합에 관해 기재한 것과 같은 방법이 고려될 수 있다. 그러나 카보디이미드, 예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드, 및 1-하이드록시벤조트리아졸을 이용하는 축합이 특히 바람직하다.
아미노산의 결합을 위한 반응은 통상적으로는 중성인 용제 또는 현탁제(예를 들어, 디클로로메탄) 중에서 행해지는데, 경우에 따라서는 용해도를 개선시키기 위해 디메틸포름아미드가 첨가될 수 있다.
합성 담체물질로서는 통상적 중합체, 예를 들어, 유기 용제 중에서 유동화 될 수 있는 구슬 형의 폴리스티렌 수지(예를 들어, 폴리스티렌과 1% 디비닐벤젠으로부터의 공중합체)가 고려될 수 있다. 담체의 HF 분리 후 목적하는 펩타이드의 C 말단 아미드 기능부를 발생시키는, 메틸-벤즈하이드릴아미드 수지(MBHA-수지)에서의 보호된 데카펩타이드아미드의 형성(구축)은 다음 플로 다이어그램(flow diagram)에 따라 수행될 수 있다.
플로다이어그램
펩타이드 합성절차
단계 작용 용제/시약(v/v) 시간
1 세척 메탄올 2×2분
2 세척 DCM 3×3분
3 분리 DCM/TFA(1:1) 1×30분
4 세척 이소프로판올 2×2분
5 세척 메탄올 2×2분
6 세척 DCM 2×3분
7 중화 DCM/DIPEA(9:1) 3×5분
8 세척 메탄올 2×2분
9 세척 DCM 3×3분
10 중지 DCM+DIC+HOBt에 Boc-As를 첨가
11 결합 DCM 또는 DCM/DCF 약 90분
12 세척 메탄올 3×2분
13 세척 DCM 2×3분
Na-Noc-보호된 아미노산은 CH2Cl2/DMF 중에서 디이소프로필카보디이미드 (DIC) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)의 존재하에 보통 3 배 몰 과량으로 90분간 결합되고 Boc-보호기는 CH2Cl2중에서 50% 트리플루오로아세트산(TFA)의 반시간 작용에 의해 분리된다. 완전 전환을 제어하는 데에는 크리스텐센 씨에 의한 클로라닐 시험 및 카이저의 닌히드린 시험이 이용된다. 유리 아미노 기능부의 잔기는 CH2Cl2중 아세틸이미다졸의 5 배 과량으로 아세틸화함에 의해 봉지된다. 수지에 대한 펩타이드 형성의 반응 단계 순서는 플로다이어그램에서 알 수 있다. 수지에 결합된 펩타이드를 분리하기 위해서는, 고상 합성의 각 최종 생성물이 진공 중 P2O5를 통해 건조되고 HF/아니솔 10:1(v/v)의 500 배 과량 중에서 60 분간 0℃에서 처리된다.
진공 중에서 HF 및 아니솔에 의한 증류 제거 후 펩타이드아미드가 백색 고체의 무수 에틸에테르와 함께 교반함에 의해 침전하고 침전하는 고분자 담체의 분리는 50% 수성 아세트산에 의해 세척함에 의해 행해진다. 진공 중에서 아세트산 용액을 충분히 농축함에 의해 펩타이드가 각각 고 점성 오일로서 얻어질 수 있는데, 이 오일은 저온에서 무수 에테르의 첨가 후 백색 고체로 전환된다.
그 이상의 정제는 예비 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)의 통상적 방법에 의해 행해진다.
펩타이드의 그의 산부가염으로의 전이는 펩타이드를 그 자체 공지의 방법으로 산으로 반응시킴에 의해 수행될 수 있다. 역으로 유리 펩타이드는 그의 산부가염을 염기로 반응시킴에 의해 얻어질 수 있다. 펩타이드 엠보네이트는 펩타이드의 트리플루오로아세트산 염(TFA 염)을 유리 엠본산(파모아산) 또는 엠본산의 대응 2 나트륨 염과 반응시킴에 의해 합성될 수 있다. 이를 위해 펩타이드-TFA-염은 수용액 중에서 극성 비양성자 매질 중의 디나트륨 엠보네이트의 용액과, 바람직하게는디메틸아세트아미드와 접촉 혼합되게 하고 그렇게 하여 형성되는 담황색 침전물을 분리한다.
이하의 실시예들은 본 발명을 한정하지 않으면서 발명을 상세히 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
합성은, 3.3 g MBHA 수지(장입 밀도 1.08 mmol/g)로부터 출발하여 DIC/HOBt 결합을 갖는 고상 플로다이어그램(전술한 펩타이드 합성 절차)에 따라 수행한다. 고분자 담체의 HF 분리 후 3.4 g의 조 펩타이드가 침전하는데, 이것을 예비 HPLC의 표준 공정에 의해 정제한다. 후속의 동결 건조 후, 정정 FAB-MS: 1458.7(M+H+)(보고치:1457.7) 및 해당하는1H NMR 스펙트럼을 가진 전체 화학식 C72, H96, N17, O14, Cl의 HPLC 표준 생성물 1.43 g을 수득한다.
1H NMR (500 MHz, D2O/DMSO-d6, ppm의 δ):
8.7 내지 7.2, 다수의 m, 방향족 H 및 불완전 교환된 NH: 6.92 및 6.58, 2d, 2×2H, 방향족 H p-Cl-Phe; 5.2 내지 3.5, 다수의 m, Cα-H 및 지방족 H; 3.2 내지 2.6, 다수의 m, 방향족 Cβ-H, 2.1 내지 0.7, 다수의 m, 나머지 지방족 H; 1.70, s, 3H, 아세틸; 1.20, d, 3H, Cβ-H Ala; 0.8, m, Cδ-H Leu.
실시예 2
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2
합성은, 4.0 g MBHA 수지(장입 밀도 1.11 mmol/g)로부터 출발하여 DIC/HOBt 결합을 갖는 플로다이어그램(전술한 펩타이드 합성 절차)에 따라 수행한다. 고분자 담체의 HF 분리 후 4.87 g의 조 펩타이드가 침전하는데, 이것을 예비 HPLC의 표준 공정에 의해 정제한다. 후속의 동결 건조 후 HPLC 표준 생성물 0.93 g을 수득하고, 이것을 결합 시약으로서의 BOP 존재 하에 4-아미디노페닐아미노-4-옥소부테르 산에 의해 목적하는 화합물로 반응 전환시킨다. 새로운 HPLC 정제 후, 정정 ESI-MS: 1647.6(M+H+)(보고치:1645.8) 및 해당하는1H NMR 스펙트럼을 가진 전체 화학식 C85, H112, N17, O15, Cl의 목적 화합물 148mg을 수득한다.
1H NMR (500 MHz, D2O/DMSO-d6, ppm의 δ):
10.4, s, 1H 및 9.13, s, 2H, 및 8.94, s, 2H, 4-아미디노아닐린의 NH들; 8.6 내지 7.35, 다수의 m, 방향족 H 및 NH; 7.22 및 7.18, 2d, 4H, 방향족 H(pCl)Phe; 6.95 및 6.58, 2d, 4H, 방향족 H Tyr; 5.2 내지 3.5, 다수의 m, Cα-H 및 지방족 H; 3.3 내지 2.4, 다수의 m, Cβ-H, 및 N-CH3, 2.1 내지 1.1,다수의 m, 나머지 지방족 H, 1.68, s, 3H, 아세틸; 1.20, d, 3H, Cβ-H Ala; 0.83, dd, 6H, Cδ-H Leu.
실시예 3
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
합성은, 4.0 g MBHA 수지(장입 밀도 0.97 mmol/g)로부터 출발하여 DIC/HOBt 결합을 갖는 고상 플로다이어그램(전술한 펩타이드 합성 절차)에 따라 수행한다. 고분자 담체의 HF 분리 후 4.0 g의 조 펩타이드가 침전하는데, 이것을 예비 HPLC의 표준 공정에 의해 정제한다. 후속의 동결 건조 후 HPLC 표준 생성물 1.39 g을 수득하고, 이것을 결합 시약으로서의 BOP 존재 하에 4-아미디노페닐아미노-4-옥소부테르산에 의해 목적하는 화합물로 반응 전환시킨다. 새로운 HPLC 정제 후, 정정 ESI-MS: 1632.7(M+H+)(보고치:1631.7) 및 해당하는1H NMR 스펙트럼을 가진 전체 화학식 C82, H106, N19, O15, Cl의 목표 화합물 440mg을 수득한다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm의 δ):
10.4, s, 1H 및 9.15, s, 2H, 및 9.0, s, 2H, 4-아미디노아닐린의 NH들; 8.60, m, 2H, 방향족 H; 8.3 내지 7.2, 다수의 m, 방향족 H 및 NH; 7.27 내지 7.20, 2d, 4H, 방향족 H(pCl)Phe; 6.96 및 6.60, 2d, 4H, 방향족 H Tyr; 5.2 내지 3.5, 다수의 m, Cα-H 및 지방족 H; 3.2 내지 2.4, 다수의 m, Cβ-H, 및 N-CH3, 2.1내지 1.1, 다수의 m, 나머지 지방족 H; 1.70, s, 3H, 아세틸; 1.20, d, 3H, Cβ-H Ala; 0.85, dd, 6H, Cδ-H Leu.
실시예 4
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2
합성은, 2.5 g MBHA 수지(장입 밀도 1.08 mmol/g)로부터 출발하여 DIC/HOBt 결합을 갖는 고상 플로다이어그램(전술한 펩타이드 합성 절차)에 따라 수행한다. 고분자 담체의 HF 분리 후 2.78 g의 조 펩타이드가 침전하는데, 이것을 예비 HPLC의 표준 공정에 의해 정제한다. 후속의 동결 건조 후, 정정 ESI-MS: 1472.6(M+H+)(보고치:1471.7) 및 해당하는1H NMR 스펙트럼을 가진 전체 화학식 C75, H102, N15, O14, Cl의 HPLC 적인 생성물 400 mg을 수득한다.
1H NMR (500 MHz, D2O/DMSO-d6, ppm의 δ):
8.62, m, 2H, 8.30, m, 2H, 7.80, m, 4H, 7.66, s, 1H, 7.47, m, 2H, 7.36, d, 1H, 방향족 H; 7.25 및 7.20, 2d, 4H, 방향족 H(pCl)Phe; 6.96 및 6.63, 2d, 4H, 방향족 H Tyr; 5.10 내지 4.0, 다수의 m, Cα-H 및 지방족 H; 3.75 내지 2.65, 다수의 m, Cβ-H 및 N-CH3; 2.1 내지 1.05, 다수의 m, 나머지 지방족 H; 1.74, s, 3H, 아세틸; 1.23, d, 3H, Cβ-H Ala; 1.20, m, CH3이소프로프.; 0.8, m, 3H, Cδ-H Nle.
실시예 5
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2
합성은, 2.5 g MBHA 수지(장입 밀도 1.08 mmol/g)로부터 출발하여 DIC/HOBt 결합을 갖는 고상 플로다이어그램(전술한 펩타이드 합성 절차)에 따라 수행한다. 고분자 담체의 HF 분리 후 2.74 g의 조 펩타이드가 침전하는데, 이것을 예비 HPLC의 표준 공정에 의해 정제한다. 후속의 동결 건조 후, 정정 ESI-MS: 1472.6(M+H+)(보고치:1471.7) 및 해당하는1H NMR 스펙트럼을 가진 전체 화학식 C75, H102, N15, O14, Cl의 HPLC적인 생성물 840 mg을 수득한다.
1H NMR (500 MHz, D2O/DMSO-d6, ppm의 δ):
8.6, m, 2H, 8.3, m, 2H, 7.85, m, 2H, 7.8, m, 2H, 7.65, s, 1H, 7.46, m, 2H, 7.35, d, 1H, 방향족 H; 7.23 및 7.17, 2d, 4H, 방향족 H(p-Cl)Phe; 7.0 및 6.6, 2d, 4H, 방향족 H Tyr; 5.10 내지 3.8, 다수의 m, Cα-H 및 지방족 H; 3.75 내지 2.6, 다수의 m, Cβ-H 및 N-CH3; 2.2 내지 1.05, 다수의 m, 나머지 지방족 H; 1.70, s, 3H, 아세틸; 1.23, d, 3H, Cβ Ala; 1.20, m, CH3이소프로프.; 0.8, m, 3H, Cδ Nle.
실시예 6
3-(4-플루오로페닐)-프로피오닐-D-Nal(1)1-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
합성은, 9.20 g MBHA 수지(장입 밀도 1.08 mmol/g)로부터 출발하여 DIC/HOBt 결합을 갖는 고상 플로다이어그램(전술한 펩타이드 합성 절차)에 따라 수행한다. 고분자 담체의 HF 분리 후 5.8 g의 조 펩타이드가 침전하는데, 이것을 예비 HPLC의 표준 공정에 의해 정제한다. 후속의 동결 건조 후 HPLC적인 비 치환 옥타펩타이드 2.0 g을 수득하고, 이것의 0.4 mmol을 결합 시약으로서의 PyBOP 존재 하에 0.5 mmol의 3-아미노-1,2,4-트리아졸-5-카복실 산에 의해 목적하는 화합물의 조 생성물 790 mg으로 반응 전환시킨다. 새로운 HPLC 정제 후, 정정 FAB-MS: 1304.6(M+H+)(보고치:1303.6)을 가진 전체 화학식 C64, H86, N17, O12, F의 목적 화합물 200mg을 수득한다.
1H NMR (500 MHz, D2O/DMSO-d6, ppm의 δ):
8.14, m, 1H, 7.90, m, 1H, 7.80, m, 1H, 7.50, m, 2H, 7.35, m, 2H, 7.0, m, 6H, 7.63, m, 2H, 방향족 H; 5.0, m, 1H, 4.83, m, 2H, 4.41, m, 1H, 4.30-4.05, 다수의 m, 4H, Cα-H; 3.66 내지 2.25, 다수의 m, 지방족 및 방향족 측쇄 H; 2.95,s, 및 2.75, s, N-Me; 2.05 내지 1.1, 다수의 m, 나머지 지방족 H; 1.20, d, Cβ-H Ala; 0.75, m, 6H, Cδ-H Leu.
화학식 Ⅰ에 의한 본 발명 화합물들을 그 수용기 결합에 관해 조사한다. 그 방법은 벡커(Beckers) 등의 문헌[참조: Eur.J.Biochem.231,535-543(1995)]에 기재되어 있는 방법과 밀접하게 관련된 것이다. 위에 공개된 합성법에 따라 얻어진 세트로렐릭스를 요도겐(IodoGen) 시약(Pierce)을 사용하여 [125I](Amersham: 비활성도 80.5Bq/fmol)로 요드화한다. 그 반응 혼합물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표지되지 않은 펩타이드가 없도록 모노-요드화된 세트로렐릭스를 수득한다. [125I]-세트로렐릭스 및 표지되지 않은 본 발명 화합물의 약 80%는 해당 특정 수용기에 연관시키기에 적합하다.
본 발명 화합물들을 다음 방법 1 및 2에 의해 그의 시험관내 작용에 관해 시험할 수 있는데, [125I]-세트로렐릭스를 가진 결합 분석물 내의 결합 친화력(방법 1) 및 길항 자극제로서의 기능 활성도(방법 2)를 구한다.
방법 1.
문헌[참조: Beckers,T., Marheineke, K., Reilander.H., Hilgard P, (1995) Selection and characterization of mammalian cell lines with stable overexpression of human pituitary receptors for gonadoliberin(GnRH)" Eur.J.Biochem.231, 535-543]에 의한 수용기 결합 분석.
수용기 결합을 조사하기 위해, 세트로렐릭스를 요도겐(IodoGen) 시약(Pierce)을 사용하여 [125I](Amersham: 비활성도 80.5Bq/fmol)로 요드화한다. 반응 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상을 교환하면서 농축하여 비표지된 펩타이드가 없는 모노-요드화 세트롤릭스를 수득한다. [125I]세트로렐릭스의 약 80%는 특정 수용기를 연관시키는데 사용될 수 있다.
수용기 결합력 분석은, 문헌에 기재된 것(Beckers 등, 1995)과 같은 생리학적 조건 하에서 무자 세포로 수행한다. 인간 LHRH-수용기를 발현하는 안정하게 변형된 LTK-세포의 준유착 배양물을, NaCl/Pi(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 11.47mM KH2PO4)/1mM EDTA 내에서 배양함에 의해 분리하고, 원심분리에 의해 수거한다. 세포 펠릿을 결합 완충액(H2CO3가 없는 DMEM, 4.5 g/l 글루코스, 10mM Hepes pH7.5, 0.5%(질량/체적)BSA, 1g/l 바시트라신, 0.1g/l SBTI, 0.1%(질량/체적) NaN3) 내에 재현탁시킨다. 배제 분석을 위해, [125I]세트로렐릭스(비활성도 5~10×105dpm/pmol)의 약 225pM 및 결합물로서 여러 농도의 비표지된 본 발명에 의한 화합물을 가진 0.25×106세포/100㎕를 배양한다. 100㎕ 결합 매질 내의 세포 현탁물을 400㎕ 분석관 내에 84 체적% 실리콘 오일(Merck 유형 550)/16 체적% 파리핀 오일 200㎕를 통해 적층(피복)시킨다. 천천히 계속하여 흔들면서 37℃에서 1 시간 배양 후 세포를 9000rpm(회전자 형식 HTA 13.8: Heraeus Sepatec. Osterode/Germany)에서 2 분간 원심분리에 의해 배양 매질로부터 분리한다. 세포 펠릿을 수용하고 있는 관의 선단부를 절단한다. 이어서 세포 펠릿 및 상층액을 γ선 계수에 의해 분석한다. 1μM 최종 농도에서 비표지된 세트로렐릭스를 포함하여 비 특이 결합된 물질의양을 구했는데 통상 전체 결합된 물질의 10% 이하이다. 결합 데이터의 평가분석은 EBDA/리간드 분석 프로그램(Biosoft V3.0)을 사용하여 수행한다.
방법 2.
길항제 효력을 구하기 위한 기능성 분석.
문헌[참조: Beckers,T., Reilander,H., Hilgard P. (1997) Characterization of gonadotropin-releasing hormone analog based on a sensitive cellular luciferase reporter gene assay", Analyt.Biochem.251, 17-23(Becker 등, 1997)]에 기재되어 있는 것과 같으나 약간 변형하여 분석을 수행한다. 사람 LHRH 수용기 및 루시페라제 레포터 유전자를 발현하는 수용 요부당 10,000 개의 세포를, 24 시간동안 첨가물 및 1% (v.v) FCS를 가진 DMEM을 사용하여 미세역가 플레이트 내에서 배양한다. 이어서 6 시간 1 nM [D-Trp6] LHRH로 세포들을 자극한다. 본 발명에 의한 길항제 화합물을 자극 전에 첨가하고 종국에는 세포 Luc-활성을 정량화 하기 위해 세포들을 용해시킨다. 투여량-효력-곡선으로부터의 IC50의 산출은 Hill 모델(C.Grunwald, Arzneimittelwerk Dresden의 프로그램 EDX 2.0)을 사용하여 비선형 회기 분석법으로 수행한다.
Luc-활성의 정량화는 각 루시페라제 분석 시스템(Promega E4030)을 사용하여 실질적으로 문헌(Promega Technical Bulletins #101/161)에 기재된 바와 같이 중복하여 수행한다. 조효소 A (CoA)를 첨가함에 의해 루시페릴-Co A의 산화는 유리한 동력학(속도)로 일어난다. 미세역가 플레이트로부터 배지를 제거한 후 세포는 100㎕ 루시페라제(25mM 트리스 포스페이트 pH7.8, 2mM 디티오트레이올, 2mM 1,2-디아미노사이클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산(CDTA), 10%(v:v) 글리세린, 1%(v:v) 트리톤 X-100)의 첨가에 의해 용해시킨다. 실온에서 15 분 배양 후, 10㎕의 세포 용해물을 광도측정 검출에 적합한 흰 미세역가 플레이트(Dynatech)에 옮긴다. 효소 반응은 50㎕ 분석 완충액(20mM 트리신 pH7.8, 1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2, 2.67mM MgSO4, 0.1mM 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA), 33.3mM 디티오트레이톨, 270μM 조효소 A, 470μM 반디불(Photinus pyralis)-루시페린, 530 μM rATPNa2)의 첨가에 의해 개시시한다. 1분 후 완전 일초 동안 신호 반치 시간이 5 분을 가진 냉광을 EG&G Berthold Micorolumat LB 96P를 이용하여 구한다.
이 방법으로 이하의 시험관 내 데이터를 얻었는데 여기서 KD는 결합 친화도를 또한 IC50은 기능 활성도를 나타내고 pM은 리터 당 피코 몰을 의미한다:
화합물 KD[pM] IC50[pM]
세트로렐릭스 170(21) 198(5)
실시예 1(아세테이트 염) n.b. 242(3)
실시예 2 181(1) 684(2)
실시예 3 154(1) 492(2)
실시예 6 n.b. 221(2)
n.b = 계산 불가.
() = 서로 독립적인 시험의 수.

Claims (15)

  1. 화학식 Ⅰ의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 산과의 염.
    화학식 I
    A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10-NH2(Ⅰ)
    상기식에서,
    A는 아세틸- 또는 3-(4-플루오로페닐)-프로피오닐기이고,
    Xxx1은 D-Nal(1) 또는 D-Nal(2)이고,
    Xxx2-Xxx3은 D-Cpa-D-Pal(3) 또는 단일결합이고,
    Xxx4는 Ser이고,
    Xxx5는 N-Me-Tyr이고,
    Xxx6은 D-Cit, D-Hci 또는 하기 화학식 Ⅱ의 D-아미노산기를 나타내고
    화학식 II
    [여기서, n은 3 또는 4이고, R1은 하기 화학식 Ⅲ의 기
    화학식 III
    -(CH2)p-CO-NR2R3
    (여기서, p는 1 내지 4의 정수이고, R2는 수소 또는 알킬기이고, 또한 R3은 비치환 되거나 치환된 아릴기 또는 헤테로아릴기이다), 3-아미노-1,2,4-트리아졸-5-카보닐기 또는 하기 화학식 Ⅳ의 환을 나타낸다:
    화학식 IV
    (여기서, q는 1 또는 2이고, R4는 수소 또는 알킬 기이고, R5는 수소 또는 알킬 기이고, X는 산소 또는 황을 의미한다)],
    Xxx7은 Leu 또는 Nle이고,
    Xxx8은 Arg 또는 Lys(iPr)이고,
    Xxx9는 Pro이고,
    Xxx10은 Ala 또는 Sar이다.
  2. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 산과의 화학식 I의 화합물의 염이 아세테이트, 트리플루오로아세테이트 또는 엠보네이트인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Xxx6이 D-[ε-N'-(이미다졸리딘-2-온-4-일)-포르밀]-Lys, D-(3-아미노-1,2,4-트리아졸-3-카보닐)-Lys(D-Lys(Atz)) 또는 D-[ε-N'-4-(4-아미디노-페닐)-아미노-1,4-디옥소-부틸]-Lys(D-Lys(B))인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 화학식 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2의 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 화학식 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2의 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 화학식 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2의 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 화학식 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-Ala10-NH2의 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 화학식 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Ala10-NH2의 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 화학식 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2의 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 화학식 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2의 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 화학식 3-(4-플루오르페닐)-프로피오닐-D-Nal(1)1-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2의 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 한 항에 따르는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 고상에서 또는 용액 내에서 통상적인 방법에 따라 적당한 보호기를 가진 성분 Xxxm(여기서 m은 1 내지 10의 정수이고 Xxx1은 아세틸화되어 있다)로부터의 단편들을 합성하고, 이어서 그 단편들을 분절 결합에 의해 고상에 결합시키고, 결합의 종결 후 성분 Xxx10을 아미드화하여 통상적인 방법으로 화학식 Ⅰ의 화합물을 고상으로부터 분리함을 포함하는, 제1항에 따르는 화학식 Ⅰ의 화합물의 제조 방법.
  14. 호르몬에 의존하는 종양, 특히 전립선 암종 또는 유방암의 치료 및 LH-RH 호르몬 억제가 요구되는 비 악성 증후 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 화합물의 용도.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 화합물을 통상적 담체 및 보조제와 혼합하여 약제로서 제형화함을 포함하는 약제의 제조 방법.
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