ES2225876T3 - Derivados de la toxina botulinica capaces de modificar las funciones de los aferentes sensitivos perifericos. - Google Patents

Derivados de la toxina botulinica capaces de modificar las funciones de los aferentes sensitivos perifericos.

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ES2225876T3 ES96910091T ES96910091T ES2225876T3 ES 2225876 T3 ES2225876 T3 ES 2225876T3 ES 96910091 T ES96910091 T ES 96910091T ES 96910091 T ES96910091 T ES 96910091T ES 2225876 T3 ES2225876 T3 ES 2225876T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN AGENTE ESPECIFICO PARA AFERENTES SENSORIALES PERIFERICOS. EL AGENTE PUEDE INHIBIR LA TRANSMISION DE SEÑALES ENTRE UN AFERENTE SENSORIAL PRIMARIO Y UNA NEURONA PROYECTADA CONTROLANDO LA LIBERACION DE AL MENOS UN NEUROTRANSMISOR O NEUROMODULADOR DEL AFERENTE SENSORIAL PRIMARIO. EL AGENTE PUEDE UTILIZARSE EN, O COMO UN, MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DEL DOLOR, EN PARTICULAR EL DOLOR CRONICO.

Description

Derivados de la toxina botulínica capaces de modificar las funciones de los aferentes sensitivos periféricos.
Campo técnico
Esta invención se refiere a un nuevo agente que es capaz de modificar la función aferente periférica. El agente puede inhibir la liberación de neurotransmisores en poblaciones discretas de neuronas, y reducir de este modo, o preferentemente impedir, las señales aferentes de dolor desde las fibras del dolor periférico hasta las del central. El agente se puede utilizar en o como un agente farmacéutico para el tratamiento del dolor, particularmente del dolor crónico.
Antecedentes
El sentido del tacto se ha considerado tradicionalmente uno de los cinco sentidos clásicos, pero en realidad es muy complejo, al transformar un número de sensaciones diferentes. Estas sensaciones son detectadas en la periferia por una diversidad de terminaciones nerviosas y estructuras relacionadas. Algunas de éstas son específicas de los estímulos mecánicos de varias clases tales como el tacto, la presión, la vibración y la deformación de los cabellos o de la barba. Otra clase de nervios es capaz de detectar temperaturas, siendo diferentes fibras activadas por el calor y el frío. Otra población de terminaciones nerviosas no se excita normalmente por estímulos suaves, sino solamente por estímulos fuertes. Los nervios sensitivos de esta categoría responden con frecuencia a más de un estímulo y son conocidos como fibras polimodales de umbral elevado. Éstas se pueden utilizar para sentir situaciones u objetos potencialmente dañinos. Las fibras polimodales también transforman señales químicas, tal como la sensación de "quemadadura" provocada por un ácido. De este modo, el sentido del tacto puede transmitir una descripción detallada de objetos y servir tanto para informar como para prevenir de sucesos.
La transformación de señales sensitivas desde la periferia hasta la propia sensación se consigue mediante una vía multineuronal y los centros del cerebro que procesan la información. Las primeras células nerviosas de la vía implicadas en la transmisión de los estímulos sensitivos se denominan aferentes sensitivos primarios. Los cuerpos celulares para los aferentes sensitivos primarios desde la cabeza y algunos de los órganos internos residen en algunos de los ganglios asociados con los nervios craneales, particularmente en el núcleo trigémino y en el núcleo del tubo solitario. Los cuerpos celulares para los aferentes sensitivos primarios para el resto del cuerpo se unen en los ganglios de la raíz dorsal de la columna vertebral. Los aferentes sensitivos primarios y sus procesos se han clasificado histológicamente: los cuerpos celulares están comprendidos en dos clases: los de tipo A son grandes (de 60 a 120 \mum de diámetro) mientras que los de tipo B son más pequeños (14 a 30 \mum) y más numerosos. Igualmente los procesos están comprendidos en dos categorías: las fibras C carecen de la cubierta de mielina que poseen las fibras A. Las fibras A se pueden subdividir además en fibras A\beta, que son de diámetro mayor con la mielina bien desarrollada y las fibras A\delta, que son más finas con la mielina menos desarrollada. Se cree generalmente que las fibras A\beta provienen de los cuerpos celulares de tipo A y que las fibras A\delta y C provienen de los cuerpos celulares de tipo B. Estas clasificaciones se pueden además extender y subdividir estudiando la expresión selectiva de una gama de marcadores moleculares.
El análisis funcional indica que en circunstancias normales las fibras A\beta transmiten los sentidos del tacto y la discriminación de temperaturas moderadas, mientras que las fibras C son principalmente equivalentes a las fibras polimodales de elevado umbral mencionadas anteriormente. El papel de las fibras A\delta es menos claro ya que parece que tienen una variedad de modos sensibles, tanto en los umbrales altos como en los bajos.
Después de la activación de los aferentes sensitivos primarios la siguiente etapa en la transformación de las señales sensitivas es la activación de las neuronas de proyección, que llevan la señal a las partes superiores del sistema nervioso central, tal como el núcleo talámico. Los cuerpos celulares de estas neuronas (aparte de las relacionadas con los nervios craneales) se localizan en el asta dorsal de la columna vertebral. Esto sucede también cuando están localizadas las sinapsis entre los aferentes primarios y las neuronas de proyección. El asta dorsal está organizado en una serie de láminas que están agrupadas, siendo la lámina I la más dorsal seguida de la lámina II, etc. Las diferentes clases de aferentes primarios realizan las sinapsis en láminas diferentes. Para los aferentes primarios cutáneos, las fibras C realizan las sinapsis en las láminas I y II, las fibras A\delta en las láminas I, II y V y las fibras A\beta en las láminas III, IV y V. Las láminas más profundas (V-VII, X) se cree que están implicadas en las vías sensitivas que llegan de los tejidos más profundos, tales como los músculos y las vísceras.
El neurotransmisor predominante en las sinapsis entre los aferentes primarios y las neuronas de proyección es el glutamato, aunque de forma importante las fibras C contienen varios neuropéptidos tal como la sustancia P y el péptido relacionado con el gen de la calcitolina (CGRP). Las fibras A pueden también expresar neuropéptidos, tal como el neuropéptido Y en algunas circunstancias.
La eficacia de la transmisión de estas sinapsis se puede alterar descendiendo las vías y por las interneuronas locales en la columna vertebral. Estas neuronas modulatorias liberan numerosos mediadores que son inhibidores (p.ej. péptidos opioides, glicina) o excitantes (p.ej. óxido nítrico, colecistocinina), para proporcionar un mecanismo para aumentar o reducir la conciencia de sensaciones.
Una categoría de sensación que requiere dicha modulación fisiológica es el dolor. El dolor es una sensación que puede prevenir de lesiones o de enfermedad, y como tal es esencial en la vida diaria. Existen momentos, sin embargo, cuando existe una necesidad de ser capaz de ignorarlo y fisiológicamente esta es una función, por ejemplo, de los péptidos opioides. Desgraciadamente, a pesar de estos mecanismos fisiológicos, el dolor puede continuar experimentándose durante la enfermedad o después de las lesiones mucho tiempo después que haya pasado su utilidad. En estas circunstancias el dolor se convierte en un síntoma de enfermedad que sería mejor aliviarlo.
Clínicamente, el dolor se puede dividir en tres categorías: (1) Dolor agudo, que proviene normalmente de lesión o cirugía que es de esperar que desaparezca cuando esta lesión cicatrice. (2) Dolor crónico que proviene de cáncer; la mayoría de gente con cáncer metastásico ha moderado hasta dolor grave y esto se resuelve bien por el tratamiento con éxito de la enfermedad o mediante la muerte del paciente. (3) Dolor crónico no producido por cáncer; esta es una dolencia heterogénea, producida por una variedad de enfermedades, incluyendo la artritis y las neuropatías periféricas, que normalmente no ponen en riesgo la vida pero que pueden durar décadas aumentando los niveles de dolor.
La fisiología del dolor que procede de la lesión del tejido se comprende mejor que la que se produce por defectos del sistema nervioso central. En circunstancias normales las sensaciones que conducen al dolor son transformadas en primer lugar por las fibras A\delta y C que llevan las señales de umbral elevado. Por lo tanto las sinapsis en las láminas I y II están implicadas en la transmisión de las señales del dolor, utilizando el glutamato y los péptidos liberados por las fibras C para producir la activación de las neuronas de proyección apropiadas. Existen, sin embargo, pruebas de que en algunos estados de dolor crónico distintos de las fibras A (incluyendo las fibras A\beta) pueden llevar señales de dolor y de este modo actuar como aferentes nocirreceptivos primarios, por ejemplo en la hiperalgesia y en la alodinia asociada con el dolor neuropático. Estos cambios se han asociado con la expresión de los péptidos, tal como el neuropéptido Y en las fibras A. Durante varias enfermedades de dolor crónico la sinapsis de los diversos aferentes sensitivos con neuronas de proyección se puede modificar de varias maneras: pueden existir cambios en la morfología que conduzcan a un aumento en el número de sinapsis, los niveles y proporciones de los diferentes péptidos puede cambiar y la sensibilidad de la neurona de proyección puede cambiar.
Dada la enormidad del problema clínico presentado por el dolor, se han dedicado considerables esfuerzos en hallar métodos para su alivio. Los productos farmacéuticos más utilizados normalmente para el alivio del dolor están comprendidos en dos categorías: (1) Fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (NSAID), incluyendo la aspirina y el ibuprofeno; (2) Opioides, incluyendo la morfina.
Los NSAID presentan su principal acción analgésica en la periferia inhibiendo la producción de prostaglandinas por los tejidos lesionados. Las prostaglandinas han demostrados ser mediadores periféricos del dolor y de la inflamación y una reducción en su concentración proporciona alivio a los pacientes. Este es especialmente el caso en la enfermedad artrítica leve, donde la inflamación es la principal causa del dolor. Se ha sugerido que las prostaglandinas están implicadas en la mediación del dolor en la columna vertebral y en el cerebro; esto puede explicar por qué los NSAID presentan efectos analgésicos en algunos estados de dolor que no implican inflamación o daño del tejido periférico. Como las prostaglandinas, sin embargo, son únicamente uno de los diversos mediadores de los NSAID para el dolor solos son únicamente eficaces para reducir algunos tipos de dolor leve a niveles aceptables. Se considera que tienen un límite de actividad superior cuyo aumento de la dosis no da un aumento del alivio del dolor. Además tienen efectos secundarios que limitan su utilidad en las dolencias crónicas. La utilización de NSAID está asociada a la irritación del tubo digestivo y la utilización prolongada puede conducir al desarrollo de la ulceración generalizada del intestino. Esto es particularmente cierto en los pacientes más jóvenes que forman el conjunto mayor de pacientes, por ejemplo, con artritis.
Los opioides actúan al nivel de la columna vertebral para inhibir la eficacia de la neurotransmisión entre las fibras nocirreceptivas primarias (principalmente las fibras C) y las neuronas de protección. Consiguen esto produciendo una hiperpolarización elevada de ambos elementos de estas sinapsis. La utilización de opioides es eficaz para aliviar la mayoría de los tipos de dolor agudo y de dolor crónico por cáncer. Existen, sin embargo, numerosas enfermedades de dolor crónico por cáncer que son en parte o completamente resistentes a la anelgesia opioide, particularmente las que implican la compresión nerviosa, p.ej., por formación tumoral. Desgraciadamente los opioides también tienen efectos secundarios generalizados indeseables, incluyendo: (1) depresión del sistema respiratorio al nivel de los centros respiratorios en el tronco encefálico; (2) la inducción del estreñimiento por varios efectos en la musculatura lisa del tubo digestivo; y (3) los efectos cicoactivos incluyendo la sedación y la inducción de euforia. Estos efectos secundarios tienen lugar a dosis similares a las que produce la analgesia y por lo tanto limitan la dosis que se puede dar a los pacientes.
La administración de opioides al nivel vertebral puede reducir el perfil de efecto secundario, pero requiere ya sea inyecciones vertebrales repetidas frecuentemente o la instalación de un catéter, los cuales ocasionan aumento de riesgo para el paciente. La instalación de un catéter requiere que el paciente esté esencialmente confinado en cama limitando de este modo además su calidad de vida.
La utilización de opioides para el tratamiento de algunos otros tipos de dolor crónico generalmente es ineficaz o indeseable. Los ejemplos incluyen el dolor asociado a la artritis reumatoide y los neuromas que se desarrollan después de la lesión nerviosa. La naturaleza indeseable del tratamiento opioide en estos pacientes está relacionada no solamente con los efectos secundarios ya mencionados y con la duración probable de la enfermedad sino también con el cuarto efecto secundario principal de los opioides: la dependencia. Los opioides, tales como la morfina y la heroína son fármacos bien conocidos de toxicomanía que conducen a la dependencia física, este último efecto secundario implica el desarrollo de tolerancia: dosis de fármaco requerida para producir los mismos aumentos de efecto analgésico con el tiempo. Esto puede conducir a una enfermedad en la cual la dosis requerida para aliviar el dolor ponga en riesgo al vida debido a los primeros tres efectos secundarios.
Aunque los NSAID y los opioides tienen utilidad en el tratamiento de dolor existe un acuerdo general de que con frecuencia no son apropiados para el tratamiento adecuado del dolor, particularmente de los dolores crónico y grave.
Se utilizan también otros tratamientos, en particular para el tratamiento del dolor grave crónico incluyendo las lesiones quirúrgicas de las vías del dolor a varios niveles de los nervios periféricos a través de la sección de la raíz dorsal y la cordotomía para la destrucción pituitaria. Existen, sin embargo, operaciones mucho más graves que están todas asociadas a un riesgo importante para el paciente.
Se puede observar, sin embargo, que continua existiendo una necesidad importante de desarrollo de nuevas clases de productos farmacéuticos para el tratamiento del dolor de muchos tipos. Las propiedades deseadas de dichas nuevas terapias se pueden expresar brevemente de la forma siguiente: (1) la capacidad para proporcionar alivio significativo del dolor incluyendo el dolor grave; (2) la falta de efectos secundarios generalizados que afectan la calidad de vida del paciente; (3) acciones de larga duración que no requieren inyecciones frecuentes o cateterización a largo plazo de los pacientes; (4) aporte de agentes que no conduzcan a tolerancia y dependencia asociadas.
Exposición de la invención
La presente invención se refiere a un agente que puede reducir y preferentemente impedir la transmisión de señales de dolor desde la periferia hasta el sistema nervioso central, aliviando de este modo la sensación de dolor. De forma específica, la invención puede proporcionar un agente que puede reducir e impedir preferentemente la transmisión de las señales de dolor desde los aferentes nocirreceptivos a las neuronas de proyección. De forma más específica, la invención puede proporcionar un agente que puede inhibir la exocitosis de al menos una sustancia neurotransmisora o neuromoduladora desde al menos una categoría de aferentes nocirreceptivos.
En un primer aspecto de la invención, se proporciona un agente que se puede administrar de forma generalizada y puede dirigirse de forma específica a poblaciones definidas de aferentes nocirreceptivos para inhibir la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador de las terminales sinápticas de los nervios.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un agente que se puede administrar localmente en la periferia y que es capaz de inhibir la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador de los terminales sinápticos de los aferentes nocirreceptivos que transmiten la señal de dolor desde la periferia.
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un agente que se puede administrar a la columna vertebral y que puede inhibir la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador de las terminales sinópticas de los aferente nocirreceptivos que terminan en la zona de la columna vertebral.
En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un agente que se puede dirigir de forma específica a poblaciones definidas de neuronas aferentes, de forma que el efecto del agente está limitado a este tipo de célula.
En un quinto aspecto de la invención, se proporciona la utilización de un agente para la preparación de un medicamento para el tratamiento del dolor.
En un sexto aspecto de la invención, el agente se puede expresar de forma recombinante como una proteína de fusión que incluye los componentes del agente requeridos.
Un agente no citotóxico que presenta especificidad para los aferentes sensitivos periféricos que comprende un grupo de direccionamiento (TM) acoplado a una neurotoxina de clostridio modificada en la que el TM comprende un ligando a un punto de unión de la superficie celular en un aferente sensitivo primario y es capaz de interactuar operativamente con un punto de unión que produce una asociación física entre el agente y la superficie de un aferente sensitivo primario; y la cadena pesada (cadena H) de la neurotoxina de costridrio se elimina o modifica mediante modificación química, mutación o proteolisis para reducir o eliminar su afinidad de unión natural a las neuronas motrices; y la cadena ligera (cadena L) de una neurotoxina de clostridio o un fragmento de ésta conserva una actividad específica de proteasa para los componentes del sistema neurosecretor; formando el agente una molécula que introduce la cadena L o un fragmento de ésta en el citosol de un aferente sensitivo primario, e inhibe de este modo la transmisión de señales entre el aferente sensitivo primario y una neurona de proyección controlando la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador desde el aferente sensitivo primario.
Definiciones
Sin querer estar limitado por las definiciones indicadas a continuación, se pretende en esta descripción que los términos siguientes tengan los significados siguientes:
Cadena ligera significa las cadenas más pequeñas de los dos polipéptidos que forman las neurotoxinas de costridrio; y tienen una masa molecular de aproximadamente 50 kDa y se denominan generalmente cadena L o simplemente L.
Cadena pesada significa la mayor de las dos cadenas de polipéptido que forman las neurotoxinas de clostridio; tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa y se denomina generalmente cadena H o simplemente H.
Fragmento H_{C} significa un fragmento procedente de la cadena H de una neurotoxina de clostridio, equivalente aproximadamente al medio terminal carboxi de la cadena H o al dominio correspondiente a este fragmento en la cadena H íntegra. Contiene el dominio de la toxina natural implicada en la unión a las neuronas motrices.
Fragmento H_{M} significa un fragmento procedente de la cadena H de una neurotoxina de clostridio, equivalente aproximadamente al medio terminal amino de la cadena H o al dominio correspondiente a este fragmento en la cadena H íntegra. Contiene el dominio implicado en la transposición de la cadena L a través de membranas endosómicas.
LH_{N} significa un fragmento procedente de una neurotoxina de clostridio que contiene la cadena L o un fragmento funcional de ésta acoplado al fragmento H_{N}. Procede generalmente de la neurotoxina íntegra por proteolisis.
Grupo de direccionamiento (TM) significa una estructura química de un agente que interactúa operativamente con un punto de unión produciendo una asociación física entre el agente y la superficie de un aferente sensitivo primario.
Punto de unión (BS) significa una estructura en la superficie de una célula con la que las moléculas exógenas son capaces de interactuar de tal modo que producen una asociación física con la célula.
Aferente sensitivo primario es una célula nerviosa que puede llevar información sensitiva desde la periferia hacia el sistema nervioso central.
Aferente nocirreceptivo primario es una célula nerviosa que puede llevar información sensitiva desde la periferia hacia el sistema nervioso central, en la que la información puede producir una sensación de dolor.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 presenta una cepa Coomassie de un análisis SDS-PAGE de las fracciones de una cromatografía de exclusión por tamaño de los productos de la reacción de acoplamiento entre en factor de crecimiento de nervios (MGF) modificado y LH_{N} modificado de BoNP/A.
La Figura 2 presenta una cepa Coomassie de un análisis SDS-PAGE del conjugado de MGF y de LH_{N} en condiciones reductoras y no reductoras.
La Figura 3 presenta una transferencia Western de extractos de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal tratadas con el conjugado de MGF y de LH_{N}, sondados con un anticuerpo que reconoce el producto de la proteolisis de SNAP-25 por la cadena L de BoNP/A.
Descripción detallada de la invención
Se puede apreciar que, un agente para reducir o impedir la transmisión de señales de dolor desde las neuronas aferentes nocirreceptoras, periféricas a las neuronas de proyección tiene muchas aplicaciones potenciales en la reducción de la sensación de dolor, particularmente del dolor crónico, grave.
Según la invención, se proporciona un agente que puede inhibir la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador o ambos de las terminales sinápticas de los aferentes nocirreceptores.
El agente posee numerosas funciones discretas:
1)
Se une a una estructura superficial (el punto de unión [BS]) que se caracteriza por, y posee un grado de especificidad para, las neuronas aferentes nocirreceptivas.
2)
Se introduce en la neurona. La introducción de moléculas en una célula puede suceder mediante un proceso de endocitosis. Únicamente determinados BS de la superficie celular experimentan endocitosis y preferentemente el BS al que se une el agente es uno de éstos. En un aspecto de esta invención, el BS está presente en las fibras sensitivas, periféricas de la neurona aferente nocirreceptiva y, después de la interiorización, experimenta transporte retrógrado al cuerpo celular y los procesos centrales de la neurona, de tal manera que el agente se administra también a estas zonas de la neurona. En otro aspecto de esta invención, el BS al que se une el agente está presente en los procesos centrales o en el cuerpo celular de la neurona aferente nocirreceptiva.
3)
El agente se introduce en el citosol.
4)
El agente modifica los componentes del sistema exocitócico presente en las terminales sinápticas de los procesos centrales de estas neuronas, de modo que la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador de la terminal sináptica se reduce o se evita preferentemente.
Sorprendentemente, un agente de la presente invención se puede producir modificando una neurotoxina de clostridio o un fragmento de ésta.
Las neurotoxinas de clostridio son proteínas con masas moleculares del orden de 150 kDa. Son producidas por varias especies del género Clostridium, la más importante C. tetan y diversas cepas de C. botulinum. Éstas son actualmente ocho clases diferentes de neurotoxinas conocidas: toxina del tétanos y neurotoxina botulinum en sus serotipos A, B, C1, D, E, F y G y todas comparten estructuras similares y modos de acción. Las neurotoxinas de clostridio son sintetizadas por la bacteria como un solo polipéptido que se modifica de modo post-traductivo para formar dos cadenas de polipéptido unidas conjuntamente por un enlace disulfuro. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (H) que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa y la cadena ligera (L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. Las neurotoxinas de clostridio se unen a un punto del aceptor en la membrana celular de la neurona motriz en la unión neuromuscular y son interiorizadas mediante un mecanismo endocitócico. Las neurotoxinas de clostridio interiorizadas poseen una actividad de endopeptidasa específica dependiente del cinc que hidroliza un enlace de péptido específico en al menos una de las tres proteínas, sinaptobevrina, sintaxina o SNAP-25, que son componentes cruciales del sistema neurosecretor y esta actividad de las toxinas de clostridio produce una parálisis muscular prolongada. La actividad de la endopeptidasa dependiente de cinc de las neurotoxinas de clostridio se observa que reside en la cadena L. Las neurotoxinas de clostridio son muy selectivas para las neuronas motrices debido a la naturaleza específica del punto del aceptor en estas neuronas. A actividad de unión a la zona de unión neuromuscular específica de las neurotoxinas de clostridio se sabe que reside en la parte del terminal carboxi del componente de cadena pesada de la molécula de neurotoxina de doble cadena, una zona conocida como H_{C}.
Sorprendentemente, mediante el enlace covalente una neurotoxina de clostridio o un híbrido de las dos neurotoxinas de clostridio, en las que la zona H_{C} de la cadena H se ha eliminado o modificado, en una nueva molécula o grupo, grupo de direccionamiento (TM), que se une a un BS de la superficie de las neuronas sensitivas, se produce un nuevo agente capaz de inhibir la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador de los aferentes nocirreceptivos. Un aspecto sorprendente además de la presente invención es que la cadena L de una neurotoxina de clostridio, o un fragmento de la cadena L que contiene la actividad de endopeptidasa, se une por enlace covalente a un TM que puede también efectuar la interiorización de la cadena L, o de su fragmento, en el citoplasma de una neurona sensitiva, que produce también un nuevo agente capaz de inhibir la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador. Los enlaces covalentes utilizados para acoplar las partes componentes del agente pueden incluir zonas intercaladoras apropiadas.
El TM proporciona especificidad para el BS de la neurona aferente nocirreceptiva. El componente TM del agente puede comprender una de las muchas moléculas que se unen a la célula, incluyendo pero sin limitarse a, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo (Fab, F(ab)'_{2}, Fv, FcFv, etc.), lecitinas y ligandos para los receptores para hormonas, citocinas, factores de crecimiento o neuropéptidos. Una lista de los posibles TM se da en la Tabla 1, esta lista es ilustrativa y no pretende limitar el alcance de los TM que podrían completar los requisitos de esta invención. En una realización de la invención, el TM se une a un BS que experimenta transporte retrógrado.
Es sabido en la técnica que la parte H_{C} de la molécula de neurotoxina se puede eliminar de la otra parte de la cadena pesada, conocida como H_{N}, de modo que el fragmento H_{N} conserva el disulfuro unido a la cadena ligera (cadena L) de la molécula de neurotoxina para proporcionar un fragmento conocido como LH_{N}. De este modo, en una realización de la presente invención el fragmento LH_{N} de una neurotoxina de clostridio se une por enlace covalente, utilizando enlaces que pueden incluir una o más zonas intercaladoras, a un TM.
En otra realización de la invención, el dominio H_{C} de la neurotoxina de clostridio está mutado o modificado, p.ej., mediante modificación química, para reducir o incapacitar preferentemente su capacidad para unir la neurotoxina a receptores en la zona de unión neuromuscular. Esta neurotoxina de clostridio modificada se une a continuación por enlace covalente, utilizando enlaces que pueden incluir una o más zonas intercaladoras, a un TM.
En otra realización de la invención, la cadena pesada de una neurotoxina de clostridio, en la que el dominio H_{C} está mutado o modificado, p.ej. por modificación química, para reducir o incapacitar preferentemente su capacidad para unir la neurotoxina a los receptores en la zona de unión neuromuscular se combina con la cadena L de una neurotoxina de clostridio diferente. La neurotoxina de clostridio híbrida, modificada se une a continuación de forma covalente, utilizando enlaces que pueden incluir una o más zonas de intercalado, a un TM.
En otra realización de la invención, la parte H_{N} de una neurotoxina de clostridio se combina con la cadena L de una neurotoxina de clostridio diferente. La NH_{N} híbrida se une por enlace covalente, utilizando enlaces que pueden incluir una o más zonas de intercalado, a un TM.
En otra realización de la invención la cadena ligera de una neurotoxina de clostridio, o un fragmento de la cadena ligera que contiene la actividad de endopeptidasa, está unida, utilizando enlaces que pueden incluir una o más zonas intercaladoras, a un TM que puede efectuar también la interiorización de la cadena ligera o de su fragmento que contiene la actividad de endopeptidasa, en el citoplasma de la célula.
En otra realización de la invención el agente se expresa de forma recombinante como una proteína de fusión que incluye un fragmento apropiado de un grupo de direccionamiento además de algunos dominios de intercalado deseados. El agente expresado de forma recombinante puede proceder completamente del gen que codifica un serotipo de neurotoxina o ser un derivado híbrido de los genes que codifican dos serotipos diferentes.
En otra realización de la invención la NH_{N} requerida, puede ser un híbrido o una L y H_{N} de tipos de toxina de clostridio diferentes, se expresa de forma recombinante como una proteína de fusión con el TM y puede también incluir una o más zonas de intercalado.
En otra realización de la invención la cadena ligera de una neurotoxina de clostridio, o un fragmento de la cadena ligera que contiene la actividad de endopeptidasa, se expresa de forma recombinante como una proteína de fusión con un TM que puede también afectar la interiorización de la cadena ligera, o de su fragmento que contiene la actividad de endopeptidasa, en el citoplasma de la célula. La proteína de fusión expresada puede también incluir una o más zonas de intercalado.
La base de esta exposición es la creación de nuevos agentes con actividades muy específicas y definidas frente a una clase limitada y definida de neuronas (aferentes sensitivos primarios) y de modo que se puede considerar que los agentes representan una forma de neurotoxina. La utilización terapéutica de las neurotoxinas de botulinum naturales es muy conocida en la técnica anterior. El modo de acción de las neurotoxinas de botulinum, tal como se describe en la técnica anterior, sin embargo, es mediante un mecanismo, inhibición de la secreción de acetilcolina y contra una categoría de neuronas diana, neuronas motrices eferentes, obviamente distintas de los agentes descritos en esta exposición. La técnica anterior no da a conocer la actividad ni la estructura química de los agentes descritos. Por lo tanto, aunque, tal como se expone en esta memoria, la técnica anterior da a conocer mucho acerca de las neurotoxinas de clostridio naturales no modificadas no son el objeto de esta exposición. El agente de esta invención requiere modificación de las neurotoxinas de clostridio de modo que la propiedad de direccionamiento dada a conocer en la técnica anterior se elimina. La neurotoxina modificada se acopla a continuación a una nueva función de direccionamiento (el TM), para dar un nuevo agente con nuevas propiedades biológicas distintas de las de las neurotoxinas de clostridio naturales y no dadas a conocer en la técnica anterior. Este nuevo agente con nuevas propiedades es el objeto de esta exposición.
Explotación industrial
El agente descrito en esta invención se puede utilizar in vivo, ya sea directamente o como una sal farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del dolor.
Por ejemplo se puede utilizar un agente según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento del dolor crónico grave y es adecuado para la aplicación generalizada. Un ejemplo específico de esto se utiliza para la preparación de un medicamento para el tratamiento del dolor por inyección local en una articulación afectada por el dolor inflamatorio.
En otro ejemplo, un agente según la invención se puede utilizar para la preparación de un medicamento para el tratamiento del dolor y se puede administrar mediante inyección vertebral (epidural o intratecal) en el nivel del segmento vertebral implicado en la enervación de un órgano afectado. Esto es, por ejemplo, aplicable al tratamiento del dolor del tejido profundo, tal como un dolor maligno crónico.
La presente invención se ilustrará a continuación en referencia a los siguientes ejemplos no limitativos:
Ejemplo 1 Síntesis de un conjugado de NGF y del fragmento LH_{N} de BoNP/A
Se disolvió NGF 2,5 S murino liofilizado mediante adición de agua y se dializó en tampón MEF (MEF 0,1 M, cloruro de sodio 0,1 M, pH 5,0). A esta solución (a una concentración de aproximadamente 0,3 mg/ml) se añadió PDPH (100 mg/ml) en DMF hasta la concentración final de mg/ml. Después de mezclar, se añadió el sólido EBAC para producir una concentración final de aproximadamente 0,2 mg/ml. Se dejó continuar la reacción durante al menos 30 min a temperatura ambiente. A continuación se eliminó el exceso de PDPH desalando sobre una columna PD-10 (Pharmacia) equilibrada previamente con tampón MES.
El fragmento LH_{N} de BoNP/A se produjo esencialmente por el método de Shone C.C., Hambleton, P. y Melling, J. 1987, Eur. J. Biochem. 167, 175-180. Se disolvió una cantidad de LH_{N} equivalente a la mitad del peso de NGF en tampón de trietanolamina (trietanolamina 0,02 M/HCl, cloruro de sodio 0,1 M, pH 7,8) a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, se hizo reaccionar con reactivo de Traut (solución madre 100 mM en trietanolamina 1 N/HCl, pH 8,0) a una concentración final de 2 mM. Después de una hora se desaló la LH_{N} en PDSE (solución salina tamponada con fosfato con EDPA1 mM) utilizando una columna PD-10 (Pharmacia). Se concentró el pico de proteína procedente del eluido de la columna utilizando una Microcon 50 (Amicon) hasta una concentración de aproximadamente 2 mg/ml.
Se sometió el MGF modificado a una etapa de concentración final produciendo una reducción de volumen menor del 10% del volumen de partida y a continuación se mezcló con la LH_{N} modificada toda la noche a temperatura ambiente. Los productos de la reacción se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).
El conjugado resultante de la reacción anterior se purificó en parte por cromatografía de exclusión de tamaño sobre Bio-Gel P-100 (Bio-Rad). Se siguió el perfil de elusión midiendo la densidad óptica a 280 nm y análisis SDS-PAGE de las fracciones. Esto permitió la separación del conjugado del NGF libre y de los subproductos de la reacción.
La Fig. 1 presenta el análisis SDE-PAGE de las fracciones de dicha columna Bio-Gel P-100. La LH_{N} libre y el conjugado (M_{f} 100 kDa y por encima) se separan claramente de la mayoría de NGF libre (M_{T} 13 kDa). Como NGF 2,5 S es un homodímero formado por interacciones no covalentes se disocia por tratamiento con SDS. De este modo las moléculas que han formado reticulaciones covalentes con LH_{N} a través de una sola subunidad se disociarán durante el análisis SDS-PAGE y darán lugar a la banda de MGF libre observada en las fracciones 4 a 6. Este resultado demuestra que la estructura homodimérica de MGF permanece intacta después de la modificación. La LH_{N} libre observada en estas fracciones representa un componente minoritario que no se ha acoplado a NGF. Las fracciones 4 a 6 se agrupan antes del análisis posterior.
La Fig. 2 presenta un análisis del conjugado por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. La banda 1 es LH_{N} libre en condiciones no reductoras, la banda 2 es la misma cantidad de LH_{N} reducida con bitiotreitol 50 mM. Las bandas 3 y 4 presentan el conjugado después de la cromatografía de exclusión por tamaño sin reducción (banda 3) o con reducción (banda 4) por ditiotreitol. Igualmente, las bandas 5 y 6 presentan NGF sin o con reducción respectivamente. Los resultados demuestran claramente que el material en la banda 5 con una masa molecular aparente mayor de 100 kDa produce, en la reducción, las bandas constituyentes de LH_{N} y de NGF únicamente. Además la intensidad de las bandas después de la reducción es tal que ellas deben proceder de otro material distinto de las pequeñas cantidades de LH_{N} libre y de NGF observado en la muestra no reducida. La única fuente disponible para el exceso es el material con peso molecular aparente > 100 kDa. El conjugado en las fracciones obtenido después de la cromatografía por exclusión de tamaño representa por lo tanto NGF y LH_{N} unido por enlace covalente por enlaces disulfuro reducibles.
Las fracciones que contienen conjugado se almacenaron a 4ºC hasta que se necesitaron.
Ejemplo 2 Actividades de un conjugado de NGF y de LH_{N} en células PC-12
Las células PC-12 son una línea celular de modificación neuroheptodérmica que se utilizan generalmente como un sistema modelo para el estudio de la función nerviosa. Como sistema modelo para probar la función de un conjugado de NGF y de LH_{N} tienen dos características necesarias: en primer lugar se sabe bien que poseen receptores de la superficie celular para NGF que han demostrado que están implicadas en un proceso de diferenciación en respuesta a las bajas concentraciones de NGF. En segundo lugar han demostrado que contienen el sistema hexocitócico para la liberación del neurotransmisor incluyendo, de forma importante en este ejemplo, SNAP-25.
Se colocaron en placas de 24 pocillos células PC-12 que se habían recubierto con matriz de membrana basal MATRIGEL (Collaborative Biomedical Products) a una densidad de aproximadamente 5 x 10^{5} células por pocillo. Después de unos pocos días en cultivo (RPMI 1640 con glutamina 2 mM, suero de caballo al 10% y suero de ternero fetal al 5%, 37ºC, CO_{2} al 5%) se sustituyó el medio por medio reciente conteniendo conjugado añadido (preparado según se describe en el Ejemplo 1) o LH_{N} o sin adición. Después de mantener en cultivo toda la noche se sustituyó el medio y se lavaron las células una vez con medio reciente. A continuación se lisaron las células mediante adición de 0,45 ml de hidróxido de sodio (0,2 M) durante 30 min. Después de este tiempo se neutralizaron las soluciones mediante la adición de 0,45 ml de ácido clorhídrico (0,2 M) seguido de 0,1 ml de Hepes/NaOH (1 M, pH 7,4). Para extraer las proteínas de la membrana de estas mezclas se añadió Triton-X-114 (10%, v/v) y se incubó a 4ºC durante 60 min, se eliminó el material insoluble por centrifugación y a continuación se calentaron los sobrenadantes a 37ºC durante 30 min. Se separaron las dos fases resultantes por centrifugación y se descartó la fase superior. Se precipitaron las proteínas de la fase inferior con cloroformo/metanol para análisis por transferencia Western.
Se separaron las muestras por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La proteolisis de SNAP-25, componente crucial de proceso neurosecretor y el sustrato para la actividad de BoNP/A de la endopeptidasa dependiente del cinc, se detectó a continuación sondando con un anticuerpo que reconoce el terminal carboxi recién revelado del SNAP-25 escindido (el anticuerpo se describe en la solicitud de patente PCT/GB95/01279). La Figura 3 presenta un ejemplo de dicha transferencia Western. No se observó inmunoreactividad significativa en las muestras de las células de referencia (bandas 1 y 2) mientras que una banda correspondiente a una masa molecular de 29 kDa se observó débilmente en las muestras incubadas con 10 mg/ml de LH_{N}(bandas 5 y 6) y de forma acusada en las muestras incubadas con 10 mg/ml de conjugado de NGF y de LH_{N} (bandas 3 y 4). Por lo tanto la incubación de las células PC-12 con el conjugado conduce a la proteolisis acusada de SNAP-25 lo que indica que el conjugado ha introducido la actividad proteolítica dependiente del cinc de la cadena L de BoNP/A en el citoplasma de las células. Se observó poca o ninguna actividad con los componentes constituyentes del conjugado.
La incubación de las células con el conjugado en presencia de un exceso de NGF libre dio como resultado una producción reducida del producto proteolítico de SNAP-25 que produjo la incubación con el conjugado solo. Esto indica que la acción del conjugado tiene lugar por medio del grupo de direccionamiento a NGF que interactúa con los receptores de la superficie de la célula para NGF.
Ejemplo 3 Actividad de un conjugado de NGF y de LH_{N} en los cultivos primarios de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal
Los ganglios de la raíz dorsal contienen los cuerpos celulares de los aferentes nocirreceptivos primarios. Se ha demostrado bien que en los cultivos in vitro de este tejido las neuronas conservan muchas de las características de los aferentes nocirreceptivos. Estas características incluyen la capacidad para liberar neuropéptidos, tal como una sustancia P en respuesta a los estímulos químicos que se sabe que producen dolor in vivo (p.ej. capsaicina). Además se sabe que las neuronas poseen receptores para NGF.
Los cultivos primarios de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal se crearon después de la disociación de los ganglios diseccionados del embrión de rata (edad embriológica de 12 a 15 días). Se colocaron en placas de 12 pocillos células a una densidad inicial de 3 x 10^{5} células/pocillo en un medio conteniendo NGF (100 mg/ml). Después de un día en el medio de cultivo reciente que contiene arabinosido de citosina, se eliminó después de 2 a 4 días. Después de varios días más en el medio de cultivo se sustituyó con medio reciente conteniendo conjugado de LH_{N}en ausencia de NGF. Después de incubación toda la noche a 37ºC se eliminó el medio, se lisaron las células y se extrajeron las proteínas hidrófobas utilizando Triton-X-114 tal como se describe en el Ejemplo 2.
Se analizaron las muestras por transferencia Western tal como se describe en el Ejemplo 2 con el anticuerpo que reconoce el producto de la proteolisis con BoNT/A de SNAP-25. No se observó inmunoreactividad en las muestras de las células de referencia (banda 4) en tanto que se observó tenuemente una banda correspondiente a una masa molecular de 29 kDa en las muestras incubadas con 10 mg/ml de LH_{N} (banda 3) y de forma acusada en las muestras incubadas con 10 mg/ml del conjugado de NGF y de LH_{N} (entradas 1 y 2).
Este resultado indica que el conjugado puede administrar la cadena L proteolíticamente activa de BoNP/A en el citoplasma de las células neuronales que forman, in vivo, los aferentes nocirreceptivos primarios.
Ejemplo 4 Producción de una LH_{N} híbrida cuya cadena L procede de BoNT/D y del fragmento H_{N} de BoNT/A
Se produce el fragmento H_{N} de BoNT/A según el método descrito por Shone C.C., Hambleton, P. y Melling, J. (1987, Eur. J. Biochem. 167, 175-180) y la cadena L de BoNT/B según el método de Sathyamoorthy, V. y DasGupta, B.R. (1985, J. Biol. Chem. 260, 10461-10466). Se modifica a continuación la cisteína libre en el fragmento H_{N} de BoNT/A mediante adición de un exceso molar de 10 veces de disulfuro de dipiridilo seguido de incubación a 4ºC toda la noche. Se eliminan a continuación el exceso de disulfuro de dipiridilo y la tiopiridona por producto desalando la proteína en una columna PD10 (Pharmacia) en PDS.
El H_{N} modificado se concentra a continuación hasta una concentración de proteína en exceso de 1 mg/ml antes de mezclarse con una parte equimolar de cadena L, procedente de BoNT/B (>1 mg/ml en PBS). Después de incubación toda la noche a temperatura ambiente se separa la mezcla por cromatografía de exclusión de tamaño sobre Superose 6 (Pharmacia) y se analizan las fracciones por SDS- PAGE. El LH_{N} híbrido está disponible a continuación para la modificación para producir un conjugado diana tal como se describe en el Ejemplo 1.
Los ejemplos descritos anteriormente son puramente ilustrativos de la invención. En la síntesis del agente el acoplamiento del TM a la neurotoxina de clostridio modificada o de su fragmento se consigue por acoplamiento químico utilizando reactivos y técnica conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, aunque los ejemplos dados utilizan exclusivamente la química de PDPH/EDAC y de reactivo de Traut cualquier otra química de acoplamiento capaz de unir por enlace covalente el componente TM del agente al componente derivado de la neurotoxina de clostridio y conocido por los expertos en la técnica está comprendido por el alcance de esta solicitud. Asimismo es evidente para los expertos en la técnica que el ADN que codifica el agente completo o los fragmentos del agente se podrían construir fácilmente y, cuando se expresan en un organismo apropiado se podrían utilizar para producir de forma recombinante el agente o los fragmentos del agente. Dichas construcciones genéticas del agente de la invención obtenidas por técnicas conocidas por los expertos en la técnica están también comprendidas en el alcance de esta invención.
Tabla 1
Grupos de direccionamiento posibles (TM) Factores de crecimiento
1.
Factor de crecimiento de nervios (NGF);
2.
Factor inhibidor de leucemia (NIF);
3.
Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF);
4.
Factor neurótropo obtenido del cerebro (BDNF);
5.
Neurotrofina-3 (NT-3);
6.
Péptido activador craneal Hidra (HHAP);
7.
Factor transformante del crecimiento 1 (TGF-1);
8.
Factor transformante del crecimiento 2 (TGF-2);
9.
Factor transformante del crecimiento (TGF- );
10.
Factor epidérmico del crecimiento (EGF);
11.
Factor neurótrofo ciliar (CNTEF).
Citocinas
1.
Factor de necrosis tumoral (TNF- );
2.
Interleucina-1 (IL-1);
3.
Interleucina-1 (IL-1);
4.
Interleucina-8 (IL-8).
Péptidos
1.
-Endorfina;
2.
Metionina-encefalina;
3.
B-Ala^{2}-B-Leu^{5}-Encefalina;
4.
Bradicinina.
Anticuerpos
1.
Anticuerpos contra los epítopos de carbohidrato de la serie lacto observados en la superficie de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal (p.ej. anticuerpos monoclonales 1B2 y LA4);
2.
Anticuerpos contra cualquiera de los receptores para los ligandos dados anteriormente.
3.
Anticuerpos contra el antígeno Thy 1 expresado en la superficie (p.ej. anticuerpo monoclonal MRC OX7).

Claims (46)

1. Un agente no citotóxico que presenta especificidad para los aferentes sensitivos periféricos que comprende un grupo de direccionamiento (TM) acoplado a una neurotoxina de clostridio modificada en la que el TM comprende un ligando a un punto de unión de la superficie celular en un aferente sensitivo primario y es capaz de interactuar operativamente con un punto de unión que produce una asociación física entre el agente y la superficie de un aferente sensitivo primario; y la cadena pesada (cadena H) de la neurotoxina de costridrio se elimina o modifica mediante modificación química, mutación o proteolisis para reducir o eliminar su afinidad de unión natural para las neuronas motrices; y la cadena ligera (cadena L) de una neurotoxina de clostridio o un fragmento de ésta conserva una actividad específica de proteasa para los componentes del sistema neurosecretor; formando el agente una molécula que introduce la cadena L o un fragmento de ésta en el citosol de un aferente sensitivo primario, e inhibe de este modo la transmisión de señales entre un aferente sensitivo primario y una neurona de proyección controlando la liberación de al menos un neurotransmisor o neuromodulador desde el aferente sensitivo primario.
2. Un agente según la reivindicación 1, que comprende un grupo de direccionamiento (TM) acoplado a una neurotoxina de clostridio en la que la parte H_{C} de la cadena H se elimina o modifica.
3. Un agente según la reivindicación 1 ó 2 en el que la cadena H modificada es el fragmento H_{N} de una neurotoxina de clostridio.
4. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que el componente de la neurotoxina de clostridio se obtiene a partir de la neurotoxina de botulinum.
5. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el componente de la neurotoxina de clostridio se obtiene a partir de la neurotoxina tipo A de botulinum.
6. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el componente de la neurotoxina de clostridio se obtiene a partir de la neurotoxina tipo B de botulinum.
7. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el componente de la neurotoxina de clostridio se obtiene a partir de la neurotoxina tipo C1 de botulinum.
8. Un agente según la reivindicación 5, que se forma por acoplamiento de un TM al fragmento LH_{N} de la neurotoxina tipo A de botulinum.
9. Un agente según la reivindicación 6, que se forma por acoplamiento de un TM al fragmento LH_{N} de la neurotoxina tipo B de botulinum.
10. Un agente según la reivindicación 7, que se forma por acoplamiento de un TM al fragmento LH_{N} de la neurotoxina tipo C1 de botulinum.
11. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cadena H se obtiene a partir de una neurotoxina de clostridio diferente de aquella de la que se obtiene la cadena L.
12. Un agente según la reivindicación 11, en el que la cadena H se obtiene a partir de la neurotoxina tipo A de botulinum y la cadena L a partir de la neurotoxina tipo B de botulinum.
13. Un agente según la reivindicación 12, que está compuesto de un TM unido al fragmento H_{N} de la neurotoxina tipo A de botulinum y la cadena L de la neurotoxina tipo B de botulinum.
14. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que la cadena L o un fragmento de la cadena L está unido a la cadena H por un enlace covalente directo.
15. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cadena L o un fragmento de la cadena L está unido a la cadena H por un enlace covalente que incluye una o más zonas del intercalador.
16. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que el TM es capaz de administrar la cadena L o un fragmento de la cadena L en el citosol de un aferente sensitivo primario sin ayuda.
17. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que la capacidad de administrar la cadena L o un fragmento de la cadena L en el citosol de un aferente sensitivo primario está contenida enteramente dentro del TM.
18. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que TM se une a un punto de unión que es característico de una población definida determinada de aferentes sensitivos primarios.
19. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que TM se une a un punto de unión que es característico de una población definida determinada de aferentes nocirreceptivos primarios.
20. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que TM se une a un punto de unión que experimenta transporte retrógrado dentro de un aferente sensitivo primario.
21. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que TM se une a un punto de unión que experimenta transporte retrógrado dentro de un aferente nocirreceptivo primario.
22. Un agente según cualquier reivindicación anterior en el que TM comprende un ligando a un receptor de la superficie celular en un aferente sensitivo primario.
23. Un agente según cualquier reivindicación anterior, en el que TM comprende un ligando a un receptor del factor de crecimiento en un aferente sensitivo primario.
24. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que TM comprende un ligando a un receptor de neuropéptido en un aferente sensitivo primario.
25. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que TM comprende un ligando a un receptor de citocina en un aferente sensitivo primario.
26. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que TM comprende un ligando a un receptor de hormona en un aferente sensitivo primario.
27. Un agente según cualquier reivindicación anterior, en el que TM comprende un anticuerpo monoclonal o procede de un anticuerpo monoclonal hasta un antígeno de superficie en un aferente sensitivo primario.
28. Un agente según la reivindicación 23, en el que el TM comprende un ligando a un receptor del factor de crecimiento de nervios.
29. Un agente según la reivindicación 28, en el que el TM comprende un factor de crecimiento de nervios.
30. Un agente según la reivindicación 29, que comprende un factor de crecimiento de nervios unido al fragmento LH_{N} de la neurotoxina tipo A de botulinum.
31. Un agente según cualquier reivindicación anterior, en el que TM está unido al componente derivado de neurotoxina de clostridio por un enlace covalente directo.
32. Un agente según cualquier reivindicación anterior, en el que TM está unido al componente derivado de neurotoxina de clostridio por un enlace covalente que incluye una o más zonas de intercalador.
33. Un agente según cualquier reivindicación anterior que impide la liberación de un neurotransmisor o de un neuromodulador procedente de un aferente sensitivo primario.
34. Un agente según cualquier reivindicación anterior que inhibe la liberación de un neurotransmisor o de un neuromodulador procedente de un aferente sensitivo primario.
35. Un método para obtener un agente según cualquier reivindicación anterior que comprende el enlace covalente de un TM a una neurotoxina de clostridio modificada o a un fragmento de una neurotoxina de clostridio.
36. Un método para obtener un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, que comprende el enlace covalente de un TM a una neurotoxina de clostridio modificada o a un fragmento de una neurotoxina de clostridio con la inclusión de una o más zonas de intercalador.
37. Un método para obtener un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, que comprende construir una construcción genética que codifica una neurotoxina de clostridio modificada o un fragmento de una neurotoxina de clostridio, incorporar dicha construcción en un organismo anfitrión, expresar la construcción para producir la neurotoxina de clostridio modificada o un fragmento de una neurotoxina de clostridio y el enlace covalente de la neurotoxina de clostridio modificada o de un fragmento de una neurotoxina de clostridio a un TM.
38. Un método para obtener un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, que comprende construir una construcción genética que codifica una neurotoxina de clostridio modificada o un fragmento de una neurotoxina de clostridio, incorporar dicha construcción en un organismo anfitrión, expresar la construcción para producir la neurotoxina de clostridio modificada o un fragmento de una neurotoxina de clostridio y el enlace covalente de la neurotoxina de clostridio modificada o de un fragmento de una neurotoxina de clostridio a un TM con la inclusión de una o más zonas de intercalador.
39. Un método para obtener un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, que comprende construir una construcción genética que codifica al agente, incorporar dicha construcción en un organismo anfitrión y expresar la construcción para producir el agente.
40. Utilización del agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, para la preparación de un medicamento para controlar la liberación de un neurotransmisor o de un neuromodulador desde un aferente sensitivo primario.
41. Utilización del agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, para la preparación de un medicamento para controlar la liberación de un neurotransmisor o de un neuromodulador desde un aferente nocirreceptivo primario.
42. Utilización del agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, para la preparación de un medicamento para controlar la transmisión de la información sensitiva desde un aferente sensitivo primario hasta una neurona de proyección.
43. Utilización del agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, para la preparación de un medicamento para controlar la transmisión de la información sensitiva desde un aferente nocirreceptivo primario hasta una neurona de proyección.
44. Utilización del agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, para la preparación de un medicamento para el alivio del dolor.
45. Utilización del agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, para la preparación de un medicamento para la prevención del dolor.
46. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en el que dicho agente es una proteína de fusión.
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