ES2226797T3 - Procedimiento para determinar la avidez de anticuerpos. - Google Patents
Procedimiento para determinar la avidez de anticuerpos.Info
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Abstract
Procedimiento para determinar la avidez de anticuerpos, que abarca los siguientes pasos: a) disposición de al menos dos fases sólidas, en donde en cada fase sólida están inmovilizados del mismo modo y en la misma cantidad al menos dos antígenos distintos, y en cada fase sólida los distintos antígenos están espacialmente separados entre sí, b) incubación de las fases sólidas de a) con una solución que contiene anticuerpos, c) incubación de una de las fases sólidas en una solución que no reduce esencialmente la combinación de anticuerpos con baja avidez con los antígenos, d) incubación de al menos otra fase sólida en una solución, en donde esta solución presenta un agente que reduce la combinación de anticuerpos con baja avidez con los antígenos, y e) detección de los anticuerpos combinados en las fases sólidas.
Description
Procedimiento para determinar la avidez de
anticuerpos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento con el cual, en una tanda de ensayo, se pueden
determinar las avideces de los anticuerpos contra varios
antígenos.
Una misión importante del diagnóstico serológico
consiste en constatar si en un caso concreto existe o no una
infección aguda. Por lo regular, una infección primaria se
caracteriza por una respuesta de IgM que aparece de forma
transitoria, mientras que la respuesta de IgG permanece largo
tiempo. En estas observaciones se basa la serología clásica de la
infección, según la cual se determinan la IgG y la IgM específicas
de agentes patógenos. Así, sobre la base de un hallazgo de IgM, se
obtiene una indicación de infección aguda, mientras que un hallazgo
de IgG sin IgM paralelo indica una infección más antigua. Sin
embargo, debido a la variabilidad de la respuesta inmunológica y a
la aparición de decursos serológicos aberrantes, este modo de
proceder clásico puede conducir a conclusiones erróneas en no pocos
casos.
Así, debido a una respuesta de IgM persistente o
reactivada puede simularse una infección primaria. Del mismo modo,
por ejemplo, una infección por virus Epstein-Barr
(EBV) puede conducir a una estimulación policlonal de células B, a
continuación de la cual se sintetizan moléculas de IgM según el
principio aleatorio sin que el organismo haya tenido contacto con el
agente patógeno correspondiente. Sin embargo, debido a la alta
variabilidad de la respuesta de IgM también se pueden obtener
resultados negativos erróneos.
Al formarse la respuesta de IgG se produce un
aumento subsiguiente de la afinidad de la IgG formada para el
antígeno correspondiente. Esta maduración de la afinidad es un
proceso inmunológico que se produce con extremada regularidad. Por
eso, en el caso de una infección aguda siempre existe una IgG de
baja afinidad, y en el caso de una infección pasada una IgG de alta
afinidad.
Por este motivo, para solucionar los problemas
arriba mencionados, durante los últimos años se ha introducido en el
diagnóstico otro marcador de gran valor informativo: la avidez de la
IgG. La avidez es una medida de la intensidad de la combinación
entre un anticuerpo y "su" antígeno. Con ayuda del diagnóstico
EBV se ha demostrado de forma ejemplar el gran valor informativo de
este procedimiento, que supera con mucho al de la serología clásica
(Andersson et al. (1994) J. Med. Virol. 43,
238-244; Vetter et al. (1994) Clin. Diag.
Virol. 2, 29-39; Bauer (1994) Therapeutische Umschau
51, 558-562; Bauer (1995) Clin. Lab. 41,
623-634; Wolters et al. (1997) Clin. Lab. 43,
125-135). No obstante, la maduración de la avidez de
IgGs de distintos antígenos no avanza de forma necesariamente
sincrónica. Así, por ejemplo, se demostró que la maduración de la
avidez de la IgG contra antígenos de la cápsida del virus (ACV) ya
está terminada cuando todavía está aumentando la avidez de la IgG
contra los componentes del complejo "antígeno temprano" (AE).
De este hecho resulta la necesidad de ensayar varios antígenos de un
agente patógeno para obtener una información fiable sobre la
situación de una infección.
Procedimientos conocidos para determinar la
avidez son el ELISA o el ensayo de inmnunofluorescencia. Sin
embargo, en la prueba de inmunofluorescencia sólo se puede estudiar
un antígeno, y en el ELISA habría que medir todos los antígenos en
ensayos comparativos individuales. En una tanda conjunta con varios
antígenos, en el ensayo de inmunofluorescencia o ELISA siempre se
obtendría un valor medio de la reducción de la avidez tras el
tratamiento con urea. El documento EP 0 875 761 da a conocer un
procedimiento para determinar la avidez de un anticuerpo, en el que
se emplea peróxido de hidrógeno-urea. Söderlund
et al. [J. of Inf. Dis. (1995), págs.
710-713] describen la utilización de antígenos de
parvovirus recombinantes para medir la avidez en tandas
individuales.
Una misión de la presente invención consiste en
poner a disposición un procedimiento con el que en una única tanda
de ensayo se puedan determinar las avideces de los anticuerpos
frente a varios antígenos definidos.
La misión se solucionó con el procedimiento según
la invención. Para ello se inmovilizan uno o varios antígenos
distintos en una fase sólida, en donde los distintos antígenos están
separados espacialmente entre sí. En total se preparan al menos dos
fases sólidas, en las que las proteínas están distribuidas del mismo
modo y en la misma cantidad. Estas fases sólidas se incuban entonces
con una solución que contiene anticuerpos. A continuación, se incuba
la primera fase sólida en una solución que no perjudica la mayoría
de las interacciones antígeno-anticuerpo (solución
no rigurosa). Sin embargo, las demás fases sólidas se incuban en una
solución que contiene un medio que desprende los anticuerpos de baja
avidez de sus antígenos (solución rigurosa). Finalmente, tras el
lavado se identifican los anticuerpos que todavía están combinados
con las fases sólidas. Mediante comparación de las fases sólidas,
que se incubaron en solución no rigurosa con las fases sólidas que
se incubaron en solución rigurosa, se puede determinar la avidez
para cada antígeno. En cada fase sólida se inmovilizan
preferentemente al menos dos antígenos distintos definidos,
preferentemente al menos tres antígenos distintos definidos, y de
forma más preferente al menos cuatro antígenos distintos definidos.
Sin embargo, también es imaginable inmovilizar en cada fase sólida
cinco, seis o más antígenos distintos. La ventaja del procedimiento
descrito consiste en que en un experimento se pueden determinar las
avideces de numerosos anticuerpos. Con ello, se pueden obtener
"perfiles de avidez" que son característicos de la duración de
la infección. Esto permite obtener una información más precisa que
la que era posible hasta ahora. Cuando se emplean más de dos fases
sólidas, las demás fases sólidas se pueden incubar en soluciones de
rigurosidad creciente, de modo que se puede obtener un cuadro
diferenciado sobre la avidez de numerosos anticuerpos. Esto
constituye otra ventaja del procedimiento según la invención.
Las composiciones de la solución rigurosa y de la
no rigurosa no están limitados de forma especial. Sin embargo, son
tales, que en la fase sólida que se incubó con la solución no
rigurosa, tras la incubación hay más anticuerpos combinados que en
la fase sólida que se incubó con la solución rigurosa. La solución
no rigurosa, así como las soluciones de lavado, pueden contener una
sustancia tampón tal como fosfato o Tris-HCl o
Hepes. Además, estas soluciones contienen preferentemente hasta 500
mM, más preferentemente hasta 250 mM, y de forma más preferente
aproximadamente 150 mM de sal. Como sales se pueden considerar sales
inorgánicas tales como NaCl, KCl, MgCl_{2} o sales similares. Una
solución no rigurosa preferida es PBS o TBS, eventualmente con otros
aditivos. La solución rigurosa puede abarcar los componentes de la
solución no rigurosa, en donde al menos está contenido otro producto
que debilita la combinación de anticuerpos de baja avidez con los
antígenos. En una forma de realización preferida del procedimiento,
la solución rigurosa contiene una sustancia desnaturalizante en una
concentración adecuada para debilitar esencialmente la combinación
de anticuerpos con antígenos.
En una forma de realización preferida del
procedimiento según la invención, la solución rigurosa contiene
urea, preferentemente en una concentración de 4-9 M,
preferentemente en una concentración de 4,8 hasta 7,5 M y de forma
más preferente en una concentración de aproximadamente 5,5 M. Además
de la urea se puede utilizar cualquier agente desnaturalizante de
modo similar. Ejemplos de ello son dietilamina, guanidina o
tiocianato.
Las fases sólidas pueden ser superficies de
plástico tales como bolas de poliestireno o placas de
microtitulación, pero preferentemente son membranas. Las fases
sólidas también pueden estar configuradas en forma de
"biochips", o pueden utilizarse en plataformas para
determinaciones de parámetros múltiples.
De forma preferente, las membranas están formadas
por nitrocelulosa, nailon o poli(fluoruro de vinilideno)
(PFVD).
Los antígenos se pueden aplicar directamente
sobre las membranas. Sin embargo, las membranas se producen
preferentemente mediante electroforesis en gel de los antígenos y
trasferencia electroforética subsiguiente a las membranas. Así
surgen membranas en las que las proteínas están separadas según su
tamaño. Preferentemente, los antígenos se limpiaron antes de la
inmovilización en la fase sólida. En este caso se puede tratar de
proteínas "nativas" o fragmentos de proteína aislados del
agente patógeno, pero también se puede tratar de antígenos
producidos de forma recombinante. El experto sabe que un antígeno no
tiene que abarcar necesariamente la secuencia completa de
aminoácidos de la proteína "nativa".
El método de detección preferido se basa en la
combinación de anticuerpos secundarios acoplados a enzimas con los
anticuerpos primarios combinados con membrana y visualización
subsiguiente mediante la reacción enzimática de un sustrato.
Los procedimientos descritos se aplican
preferentemente en el diagnóstico. Por ejemplo, en un kit de ensayo
se podrían incluir tiras de membrana que contengan varios antígenos
del EBV. Además, se puede incluir una sustancia desnaturalizante,
preferentemente urea, que se utilice como agente en las soluciones
rigurosas. Además, en un kit de ensayo de este tipo se pueden
incluir reactivos para realizar una detección de transferencia
"Western" de proteínas.
Un kit de ensayo preferido puede contener varias
bandas de transferencia Western u otros soportes en los que estén
inmovilizados antígenos de un agente patógeno. Por ejemplo, los
agentes pueden proceder de EBV, de citomegalovirus humano (CMVH), de
agentes patógenos de la hepatitis, tal como hepatitis A, B, C o G, o
de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). También se pueden
emplear los antígenos de otros agentes patógenos, tales como
bacterias, hongos o protozoos. Además, habitualmente se incluye un
tampón de lavado que contiene proteína y, por lo tanto, también se
puede emplear para bloquear puntos de combinación no específicos en
las membranas. También se puede utilizar para diluir muestras. El
kit de ensayo también contiene habitualmente sueros que sirven como
control positivo o negativo. La solución rigurosa puede estar
contenida en forma de una solución ureica preparada. Finalmente, el
kit puede contener anticuerpos secundarios dirigidos contra la IgG
humana y que están conjugados con un enzima, por ejemplo peroxidasa
de rábano picante.
Además, un kit de ensayo puede contener tiras de
membranas o soportes que lleven antígenos de distintos agentes
patógenos. Así, en el diagnóstico se puede cubrir una anchura de
tira mayor. En este tipo de kits de ensayo se pueden aplicar, por
ejemplo, antígenos de diferentes agentes patógenos para, por un
lado, determinar el estado serológico en una tanda y,
simultáneamente, mediante un ensayo de avidez, diferenciar si en
este caso se trata de infecciones agudas, recientes, reactivación o
estimulación inespecífica.
Esto es importante en determinadas enfermedades
virales (por ejemplo EBV, CMV), que producen una estimulación
inespecífica del sistema inmunológico y, con ello, con frecuencia
indican el cuadro serológico de una infección reciente para otros
parámetros - con la diferencia de que en ellos sólo hay entonces
anticuerpos altamente ávidos.
En especial en pacientes con disfunción del
sistema inmunológico o pacientes con tratamiento inmunosupresor,
esta tanda también resulta conveniente, porque aquí se puede
producir de muchos modos una reactivación de virus persistentes
(EBV, CMV, eventualmente parvovirus B19, y otros) con el cuadro
serológico de una infección reciente. Estas reactivaciones se pueden
distinguir con este ensayo de avidez en una tanda de infecciones
adicionales eventualmente presentes.
Los ejemplos siguientes explican con más detalle
el procedimiento según la invención:
Los antígenos de EBV recombinantes MA, p18, p23,
p54, p138 y EBNA-1 (p72) se separan mediante
electroforesis en gel y, a continuación, se trasfieren
electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa. Tras la
saturación de puntos de combinación no específicos en la membrana,
ésta se corta en tiras. Dos de estas tiras de membrana se incuban en
diferentes pocillos de incubación (tandas 1 y 2) con el mismo suero
(diluido en la relación 1:100 en tampón de lavado con contenido en
sal/proteína) durante tres horas a temperatura ambiente bajo ligero
sacudimiento. Los sueros diluidos se filtran a continuación con
succión y la tanda 1 se mezcla con tampón de lavado, mientras que a
la tanda 2 se añade urea 5,5 M (en PBS). Las tiras se incuban
durante 3 min y, a continuación, se lavan cuatro veces durante cinco
minutos con tampón de lavado bajo agitación. A continuación, ambas
tiras de membrana se incuban durante 1 hora con anticuerpos de
conejo-IgG antihumana (diluidos a 1:1000; conjugados
con peroxidasa). A continuación, se lava de nuevo cuatro veces y los
anticuerpos combinados se identifican por tinción enzimática
mediante TMB o DAB. La reacción se detiene lavando las tiras con
agua. Es importante que la reacción de tinción se realice para ambas
tiras bajo las mismas condiciones. Tras el secado de las membranas,
las tiras se analizan por densitometría. Se comparan las
intensidades que entonces se identifican de las bandas de tiras
tratadas con urea y las tiras de control. A partir de las diferentes
intensidades para los antígenos individuales se puede calcular un
índice de avidez (cociente de intensidad tras tratamiento con
urea/intensidad sin tratamiento con urea). Este índice permite una
información adicional sobre la cuestión de si existe una infección
reciente o una infección pasada. Las figuras 1 y 2 muestran los
resultados de experimentos en los que se utilizaron los sueros de
dos personas con infección EBV pasada. Todos los marcadores
reconocidos tienen anticuerpos muy ávidos, pues mediante el
tratamiento con urea no resulta ningún debilitamiento de las bandas.
Con ello se caracteriza la infección EBV pasada.
Se prepararon tiras de membrana como en el
Ejemplo 1, en donde se ensayaron sueros de pacientes con infección
por EBV reciente. Los ensayos se realizaron como se describe en el
Ejemplo 1. La figura 3 muestra el resultado de un suero con
anticuerpos de baja avidez frente a p54 y p138. Esto muestra una
infección reciente. La figura 4 muestra anticuerpos de baja avidez
frente a p23 y p138. Esto también muestra una infección reciente. En
la figura 5 se puede reconocer que ya han madurado anticuerpos
frente a p138 (muy ávidos), pero la baja avidez de los anticuerpos
frente a p54 y p23 permite reconocer la infección por EBV reciente.
Aquí se puede reconocer especialmente el valor de este
procedimiento: si se ensayara sólo la avidez de p138, se habría
obtenido una exclusión errónea de una infección reciente. En la
figura 6, la reducción de la banda de p54 y la banda de p138 por la
urea permite deducir una infección reciente. La maduración de la
avidez ya ha comenzado, pero todavía no ha terminado. Finalmente, en
la figura 7 la IgG frente a p54 ya ha madurado en gran medida,
mientras que la baja avidez de los anticuerpos frente a p23 y p18
permite reconocer la infección por EBV reciente.
Claims (17)
1. Procedimiento para determinar la avidez de
anticuerpos, que abarca los siguientes pasos:
- a)
- disposición de al menos dos fases sólidas, en donde en cada fase sólida están inmovilizados del mismo modo y en la misma cantidad al menos dos antígenos distintos, y en cada fase sólida los distintos antígenos están espacialmente separados entre sí,
- b)
- incubación de las fases sólidas de a) con una solución que contiene anticuerpos,
- c)
- incubación de una de las fases sólidas en una solución que no reduce esencialmente la combinación de anticuerpos con baja avidez con los antígenos,
- d)
- incubación de al menos otra fase sólida en una solución, en donde esta solución presenta un agente que reduce la combinación de anticuerpos con baja avidez con los antígenos, y
- e)
- detección de los anticuerpos combinados en las fases sólidas.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el agente utilizado en el paso d)
contiene al menos una sustancia desnaturalizadora de proteínas.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el agente contiene urea.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque la urea se utiliza en una concentración
de 4 a 9 M.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las fases
sólidas son membranas.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque las membranas están constituidas por un
material seleccionado de un grupo que contiene nitrocelulosa, nailon
y poli(fluoruro de vinilideno).
7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6,
caracterizado porque las membranas se preparan mediante
electroforesis en gel y subsiguiente transferencia electroforética
de los antígenos a las membranas.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la detección de
los anticuerpos en el paso e) se realiza mediante incubación con
anticuerpos secundarios acoplados a enzimas y subsiguiente reacción
enzimática de identificación.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
determina la avidez de anticuerpos frente al virus
Epstein-Bar.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en las
fases sólidas hay proteínas purificadas inmovilizadas.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
preparan por recombinación los antígenos inmovilizados en las fases
sólidas.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la fase
sólida, que se incubó según c), tras la incubación hay más
anticuerpos combinados que en la fase sólida que se incubó según
d).
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
solución para la incubación según c) contiene al menos una sustancia
tampón y hasta 500 mM de sal, preferentemente hasta 250 mM de
sal.
14. Kit de ensayo para la realización de un
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13,
caracterizado porque contiene varias tiras de transferencia
Werstern u otros soportes en los que hay antígenos inmovilizados de
un agente patógeno, en donde en cada soporte hay al menos dos
antígenos distintos inmovilizados del mismo modo y en igual
cantidad, y en cada soporte los distintos antígenos están
espacialmente separados entre sí.
15. Kit de ensayo según la reivindicación 14,
caracterizado porque contiene un agente desnaturalizante.
16. Kit de ensayo según la reivindicación 15,
caracterizado porque contiene urea como agente
desnaturalizante.
17. Uso de antígenos preparados de forma
recombinante para determinar las avideces de anticuerpos frente a
antígenos, en donde
- a)
- se disponen al menos dos fases sólidas, en cada fase sólida hay inmovilizados al menos dos antígenos distintos del mismo modo y en la misma cantidad, y en cada fase sólida los distintos antígenos están espacialmente separados entre sí,
- b)
- las fases sólidas de a) se incuban con una solución que contiene anticuerpos,
- c)
- una de las fases sólidas se incuba en una solución que no reduce esencialmente la combinación de anticuerpos con baja avidez con los antígenos,
- d)
- al menos se incuba otra fase sólida en una solución, en donde esta solución presenta un agente que reduce la combinación de anticuerpos con baja avidez con los antígenos, y
- e)
- se detectan los anticuerpos combinados en las fases sólidas.
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