ES2076232T5

ES2076232T5 - Empleo de cationes divalentes en ensayos inmunoquimicos.

Info

Publication number: ES2076232T5
Application number: ES90100800T
Authority: ES
Inventors: Bernhard Dr. Giesendorf
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1989-01-19
Filing date: 1990-01-16
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2010-01-16
Also published as: DE59009452D1; ES2076232T3; DE3901458A1; EP0379133B1; EP0379133A2; EP0379133A3; US6242265B1; AU630410B2; EP0379133B2; CA2008060A1; JPH02228560A; ATE125948T1; JP3018364B2; AU4853590A; CA2008060C

Abstract

SE DESCRIBEN EL EMPLEO DE SALES DISOLUBLES EN AGUA CATIONES DE DOS O TRES VALORES EN PROCESOS INMUNOQUIMICOS PARA LA COMPROBACION DE UN ANALISIS EN UNA MUESTRA. SE MUESTRA, QUE ESTAS CALES ELEVAN LA ESPECIFIDAD DE TALES DESTINOS, PRINCIPALMENTE SE REBAJA EN PROCESOS INMUNOQUIMICOS DE FASES RIGIDAS, EN LOS QUE LA DEMOSTRACION DEL ANALISIS SE EFECTUA EN UNA FASE DETERMINADA, MEDIANTE INCREMENTO DE UNA DE LAS CITADAS CALES, LA SEÑAL DE FONDO

Description

Empleo de cationes divalentes en ensayos inmunoquímicos.

La invención se refiere al empleo de cationes divalentes en un ELISA en fase sólida para la detección y para la determinación inmunoquímicas de un analito en material biológico.

Conocidos sistemas de ensayo inmunoquímico utilizan aditivos de proteínas, polisacáridos y/o agentes tensioactivos, que no participan en la reacción inmunoquímica, pero que son adecuados para modificar favorablemente el resultado de una reacción de este tipo.

Para ELISAs en fase sólida, que representan una selección de tales sistemas de ensayo, los agentes de incubación necesarios (soluciones tampón, medios de incubación) que contienen el analito y que se reúnen con la fase sólida, deben estar compuestos de manera que se impida la unión inespecífica de sustancias acompañantes de la muestra y/o del conjugado a la fase sólida. Por ese motivo, en los medios de incubación se emplean los aditivos conocidos, tales como proteínas, p. ej. albúmina, IgG, caseína, gelatina hidrolizada y sus derivados y mezclas de proteínas o también sueros humanos o animales, así como agentes tensioactivos.

En el documento EP 0 152 847 se describen conjugados de enzima-antígeno y enzima-anticuerpo que contienen juntos sales de calcio y polioxietileno, y en donde la estabilidad de un conjugado en solución acuosa se aumenta mediante la adición de las dos sustancias, pero no mediante la de cada una de las sustancias.

En el documento DE 36 38 767 se describe un medio de incubación para ensayos inmunoquímicos en fase sólida, por ejemplo un ELISA, que contiene lactoferrina, suero de ternera fetal, monolaurato de polioxietileno-20-sorbitán (^{R}Tween 20) y sales tampón.

En el documento DE 38 07 478 se citan los aminóxidos como aditivo ventajoso en agentes inmunoquímicos, especialmente en el caso de medios de incubación contenidos en ellos.

En el documento US 4 362 531 se describe la mejora de la especificidad de inmunoensayos de aglutinación de partículas mediante agentes caótropos o similares a caótropos.

En el Resumen 86 - 159 165 de la solicitud de patente japonesa JP - 61 - 159 165 se muestra la estabilización de suspensiones de polímeros con pantotenato de calcio, sin indicar una concentración adecuada.

En MIDDELDORP et al., J. Clin. Microbiology, 1986, 405 - 413 se describen ensayos de inmunofluorescencia específicos para la detección de anticuerpos específicos de virus en presencia de Ca^{2+} 2,6 mM y Mg^{2+} 2,2 mM.

Se ha encontrado ahora, de modo sorprendente, que cationes divalentes como aditivo a agentes con los que se detecta o determina un analito en una muestra mediante una reacción inmunoquímica, especialmente en combinación con los aditivos antes citados, son apropiados para modificar favorablemente la reacción inmunoquímica, lo que determina una mayor especificidad de la detección y de la determinación del analito.

Objeto de la invención es, pues, el empleo de cationes divalentes, preferentemente de sales de magnesio y/o calcio solubles en agua, en un ELISA en fase sólida para la detección inmunoquímica y para la determinación inmunoquímica de un analito contenido en un material biológico, caracterizado porque las sales correspondientes, al reunir el analito con un reaccionante no marcado se presentan en forma disuelta en una concentración de 5 a 500 milimoles/l.

Del grupo de las sales de magnesio o calcio solubles en agua, se prefieren las sales cuyos aniones no perturban la reacción inmunoquímica. Se prefieren como aniones acetato, cloruro y citrato, siendo especialmente preferido cloruro.

Procedimientos en el sentido de la invención son aquellos en los que tiene lugar la reacción inmunoquímica en una fase sólida.

Una fase sólida es en este caso un vehículo insoluble en agua al que están unidos uno o varios reaccionantes. El analito puede unirse a un reaccionante o, en el caso de la presencia de varios reaccionantes unidos al vehículo, pueden disolver uno de ellos por la propia unión y pasar a la fase acuosa.

En los procedimientos inmunoquímicos se emplean antígenos y anticuerpos, tanto como analitos, como también como reaccionantes, así como otros participantes en la unión bioafines para los reaccionantes o también para el analito, por ejemplo lecitina, complemento, proteína A o G, así como biotina y avidina derivatizadas.

Los cationes divalentes pueden estar contenidos en forma seca en un dispositivo para la toma de una muestra, por ejemplo en un recipiente para la toma de muestras o en una zona de toma, por ejemplo una matriz absorbente, para la muestra en un sistema de ensayos llamado "químico en seco"; o también en una solución acuosa, en la que están contenidos también sales tampón y un detergente y eventualmente aditivos estabilizadores, tales como proteínas o polisacáridos como igualmente sustancias estabilizadoras para el analito, estando contenidos los cationes divalentes en una concentración de 5 a 500 milimoles/l, preferentemente de 30 a 100 milimoles/l, de forma especialmente preferida de 50 a 60 milimoles/l.

Los materiales biológicos también designados como muestra, que contienen el analito, son por ejemplo tejidos de biopsias o autopsias, células sanguíneas, suero o plasma, secreciones, líquido, sangre de tejidos inflamados y no inflamados, los productos de desecho de tejidos y excreciones del metabolismo.

Se prefieren los procedimientos inmunoquímicos en los que uno de los reaccionantes se presenta en fase sólida, en donde la muestra se reúne, en presencia de cationes divalentes, con la fase sólida, eventualmente junto con otros reaccionantes inmunoquímicos, además de los de la fase sólida y reactivos para la detección del analito, y en donde acto seguido se separa la fase sólida de la fase líquida y se determina el analito unido a la fase sólida o el analito no unido.

En los siguientes ejemplos se expone lo ventajoso del empleo de cationes divalentes en procedimientos para la detección y para la determinación de anticuerpos, dirigidos contra el agente patógeno de la (1) rinotraqueítis bovina infecciosa (IBR), o la vulvovaginitis pustular infecciosa (IPV) y (2) leucemia bovina.

Ejemplos Ejemplo 1

ELISA para la detección de anticuerpos contra el agente patógeno de IBR y de IPV.

1.1 Soluciones tampón y de reactivos

Se prepararon las siguientes soluciones tampón y de reactivos:

1.1.1 PBS-^{R}Tween 20

Solución fisiológica de sal de cocina tamponada con fosfato, pH 7,2 (PBS), es decir, 10 milimoles/l de
Na_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, pH 7,2 en 140 milimoles/l de NaCl, con contenido en monolaurato de polioxietilen-20-sorbitán (^{R}Tween 20).

1.1.2 Tampón de dilución de la muestra (PT)

PBS con contenido de 40 g/l de ^{R}Tween 20.

1.1.3 Tampón de dilución de la muestra con contenido en MgCl_{2} de 50 milimoles/l (PT-Mg)

10 g/l de MgCl_{2} x 6H_{2}O se disolvieron en PT.

1.1.4 Tris/EDTA

50 milimoles/l de Tris, 50 milimoles/l de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético como solución acuosa, ajustada con HCl a pH 7,2.

1.1.5 Conjugado de AP

Se diluyó con PT a 1:70 el reactivo de Behringwerke AG designado como conjugado de anti-inmunoglobulina bovina-fosfatasa alcalina que puede obtenerse bajo el producto Nº OUDY 01.

1.1.6 Solución de substrato-AP

1,5 g/l de fosfato de p-nitrofenilo en 100 g/l de dietanolamina en agua, ajustada con HCl a pH 9,5.

1.2 Revestimiento de microplacas de ensayo con virus de herpes bovino I (BHVI)

Como microplacas de ensayo se emplearon inmunoplacas II 96 F con fondo redondo (razón social Nunc, Roskilde, Dinamarca, artículo nº 262162).

Cultivos de tejido de células de riñón de bovino Madin-Darby (células MDBK) en las que se habían multiplicado BHVI y cultivos de tejido que no contenían BHVI, se trataron, como se ha descrito por Nicolai-Scholten et al. 1980 en Med. Microbiol. Inmunol. 168, 81-90 para virus de parotiditis epidémica, para dar preparados que en adelante se designan como antígeno-BHVI (Ag) y como antígeno testigo (negativo) (KoAg).

Para el revestimiento se añadieron en cada caso 50 \mul de antígeno BHVI (Ag) y KoAg alternativamente en los pocillos de las microplacas de ensayo antes citadas y las placas se dejaron reposar durante 20 h a 20-25ºC. Acto seguido, se separó el contenido de los pocillos por filtración con succión y los pocillos se lavaron una vez con
PBS-Tween^{R} 20 y dos veces con Tris/EDTA mediante llenado y subsiguiente separación por filtración con succión.

1.3 Procedimiento para la determinación de IgM, anticuerpos de IgC dirigidos contra el agente patógeno de IBR/IPV

Sueros testigos positivos se diluyeron con los tampones PT y PT-Mg en una serie de diluciones desde 1:40 hasta 1:640.

Se diluyeron muestras de suero a 1:44 con los tampones antes citados.

De cada dilución se añadieron 150 \mul en pocillos de una microplaca de ensayo, revestida con Ag y KoAg. La placa de ensayo se mantuvo luego durante 1 h a 37ºC en aire saturado de humedad. Acto seguido se lavaron los pocillos tres veces con PBS-^{(R)}Tween por llenado de los pocillos y separación por filtración con succión del líquido. Luego se añadieron 50 \mul de conjugado de AP y otra vez se dejó reposar durante 1 h a 37ºC y acto seguido se lavó como se ha descrito antes. Para la determinación de la actividad de la AP unida en forma de conjugado en los pocillos se añadieron 100 \mul de solución de substrato-AP, la microplaca de ensayo se dejó reposar durante 45 min a 37ºC y se midió la extinción de las soluciones coloreadas de amarillo frente a un pocillo vacío a 405 nm.

Los sueros se valoraron como positivos si la diferencia de las extinciones de las soluciones coloreadas en los pocillos revestidos con Ag y de soluciones en pocillos revestidos con KoAg era superior a más 200 miliextinciones (mE), y como negativos, si la diferencia era menor que más 200 mE o negativa.

Como título de un suero testigo se consideró la dilución a la que esta diferencia se hizo menor que 200 mE. El valor de 200 mE se designa por eso como "corte".

1.4 Resultado

El resultado de la medición está representado en la Tabla. De ella se deduce que la adición de MgCl_{2} al tampón de dilución de la muestra PT en el caso de los dos sueros testigos diluidos a 1:640 no produce diferencia alguna en las extinciones, ni en los pocillos revestidos con Ag, ni en los revestidos con KoAg. Sin embargo es ventajosa la adición de MgCl_{2} en el caso de los sueros diluidos a 1:44 en tanto en cuanto los valores absolutos de las extinciones tanto en los pocillos revestidos con Ag como también en los revestidos con KoAg son inferiores a los valores absolutos de las extinciones al emplear el tampón sin los aditivos citados. La reducción de las extinciones, especialmente en los pocillos que están revestidos con KoAg, significa una disminución de las extinciones de fondo y, con ello, un aumento de la especificidad del ensayo.

Ejemplo 2

ELISA para detectar anticuerpos contra el agente patógeno de la leucemia bovina

2.1 Soluciones tampón

Se prepararon los siguientes tampones de dilución de muestras.

2.1.1 STD

10 ml/l de suero de ternera fetal, 18 milimoles/l de citrato trisódico x 2H_{2}O, 10 milimoles/l de KCl, 40 g/l de
3-N-óxido de 1-alcoil(C_{8} a C_{18})amino-3-dimetil-aminopropano en solución acuosa.

2.1.2 STD-Mg

En el tampón de dilución de muestras descrito en 2.1 se disolvieron 50 milimoles/l de MgCl_{2}, es decir 10 g/l de MgCl_{2} x 6H_{2}O.

2.1.3 STD-Ca

En el tampón de dilución de muestras descrito en 2.1 se disolvieron 68 milimoles/l de CaCl_{2}, es decir, 10 g/l de CaCl_{2} x 2H_{2}O.

2.2 Revestimiento de microplacas de ensayo con virus de leucemia bovina (BLV)

Se emplearon las mismas microplacas de ensayo que en el Ejemplo 1.2.

BLV se multiplicó sobre una célula permanente de riñón de oveja fetal y se elaboró para dar preparados de antígeno-BLV tal como se describe por Nicolai-Scholten et al. en 1980 en Med. Microbiol. Immunol. 168, 81-90 para virus de parotiditis epidémica.

Para el revestimiento se añadieron en cada caso 50 \mul de antígeno-BLV en los pocillos. Se renunció a un revestimiento con un preparado a base de células de riñón de oveja libres de virus. Acto seguido se separó el contenido de los pocillos por filtración con succión y se lavaron los pocillos una vez con PBS-^{(R)}Tween y dos veces con Tris/EDTA por llenado y subsiguiente separación por filtración con succión.

2.3 Procedimiento para la determinación de anticuerpos de IgM e IgG, dirigidos contra BLV

A partir de sueros bovinos BLV-positivos se prepararon diluciones de 1:20 con los tampones STD, STD-MgCl_{2} y STD-CaCl_{2}.

De estas diluciones se pipetearon 150 \mul en los pocillos revestidos con antígeno-BLV de la microplaca de ensayo descrita en el Ejemplo 2.2. La microplaca de ensayo se continuó tratando tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.3.

2.4 Resultado

Se demostró que los dos sueros analito-negativos producían en STD una extinción de 0,46 E o 0,48 E. En STD-Mg o STD-Ca se reducía este valor a 0,14 E o 0,22 E, es decir, alrededor de 69,9% o 54,2%. Frente a esto, un suero bovino que contiene anticuerpos específicos de BLV alcanzaba en STD una extinción de 1,28 E, en STD-Mg de 1,06 E, y en STD-Ca de 1,02 E; el valor alcanzado en STD se reducía aquí por tanto solamente alrededor de 17,2% o 20,3%.

Si se consideran los resultados relacionados, entonces se demuestra que, bajo la influencia de MgCl_{2} o CaCl_{2} en el medio de dilución de muestras, la diferencia entre las extinciones de sueros analito-positivos y analito-negativos se hace mayor, es decir, la especificidad del sistema de ensayo se mejora decisivamente.

	Tampón de dilución de muestras
	PT	PT-Mg
	DO_{Ag}	DO_{KoAg}	DO_{Ag}	DO_{KoAg}
	(mE)	(mE)	(mE)	(mE)
Suero testigo IBR/IPV,
pos., (Dilución 1:640)
Carga 16 32 08	181	43	172	45
Carga 16 32 09	124	36	119	43

Sueros bovinos negativos	559	517	333	365
(Dilución 1:44)	472	485	324	262
	432	429	309	348
	703	722	529	537
	681	713	395	452
	198	161	142	97
	333	256	184	152
	861	867	675	674
	581	636	474	470
	493	503	374	387
	450	496	357	397
	768	819	501	583
	311	274	226	176
	893	978	758	781

Claims

1. Procedimiento para la detección inmunoquímica y para la determinación inmunoquímica de un analito contenido en un material biológico para mejorar la especificidad de la reacción inmunoquímica, caracterizado porque cationes divalentes, preferentemente una sal de calcio y/o de magnesio se presentan en forma disuelta al reunir el analito con un reaccionante no marcado en una concentración de 5 a 500 milimoles/l, siendo dicho procedimiento un ELISA en fase sólida.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la sal es el cloruro.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el analito es un antígeno.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el analito es un anticuerpo.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se presenta un reaccionante como fase sólida.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la sal está contenida en forma seca en una matriz absorbente y en el procedimiento inmunoquímico se lleva a solución mediante la muestra líquida u otro líquido.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la sal se añade a una solución en la que se encuentra el analito y con la que eventualmente se diluye el analito.

8. Procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los cationes divalentes se presentan en una concentración de 30 a 100 milimoles/l.

9. Procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los cationes divalentes se presentan en una concentración de 50 a 60 milimoles/l.