ES2226825T3 - Medicion y utilizacion de las interacciones moleculares. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para separar un analito diana de una composición, que comprende las siguientes etapas: (i) poner en contacto la composición con un componente específico de enlace para el analito, siendo inmovilizado el componente específico de enlace en la superficie; y (ii)hacer oscilar la superficie de modo que la amplitud aumenta hasta un valor al cual el analito, u otro componente de la composición, es eliminado de la superficie.

Description

Medición y utilización de las interacciones moleculares.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con los procedimientos utilizados para medir las interacciones moleculares y para separar, ordenar y medir el tamaño de las partículas. En particular, la presente invención está relacionada con la medición de la afinidad entre diferentes componentes específicos de enlace, por ejemplo, en la interacción anticuerpo-antígeno.

Antecedentes de la invención

El reconocimiento molecular específico es un proceso fundamental, siendo la base de las interacciones enzima-ligando, anticuerpo-antígeno y el enlace de las moléculas a los receptores. El reconocimiento molecular se consigue gracias a interacciones no covalentes tales como la interacción electrostática (puentes de hidrógeno) e interacciones hidrofóbicas. Las mediciones termodinámicas de constantes de enlace y energía libre, y cambios de entalpía y entropía, ofrecen los elementos para la base molecular del reconocimiento, especialmente cuando se asocian con información obtenida por difracción de rayos X y, cuando es posible, mutagénesis dirigida.

La medición directa de la fuerza de interacción se ha realizado con microscopía de fuerza atómica (AFM) además del aparato de fuerza superficial. Aunque la AFM puede medir fuerzas de ruptura de enlace, la técnica adolece del inconveniente de que solamente puede realizarse una única medición cada vez. Hasta la fecha, la AFM ha sido empleada en interacciones avidina-biotina (Florin et al, Science, 1995; 264:415), en hibridación de ADN (Boland et al, PNAS, 1995; 92:5291), en interacciones anticuerpo-antígeno (Dammer et al, Biophys. J., 1996; 70:2437) y en glucoproteínas de adhesión (Dammer et al, Science, 1995; 267:1173).

La separación de las moléculas biológicas basándose en sus afinidades relativas para ligandos es una técnica bien conocida. Por ejemplo, en cromatografía de afinidad, los componentes a separar se introducen en una columna que contiene un ligando específico. El componente de interés se adhiere preferentemente y con fuerza a la columna y se ve retenido en dicha columna mientras los otros componentes son eliminados. El material que ha quedado unido puede ser extraído de la columna en una etapa posterior.

Las tecnologías de separación son un parte importante de muchos experimentos de investigación. Se pretende poder aumentar la sensibilidad o selectividad de dichas técnicas.

Kolomenskii et al, J. Appl. Phys., 1998; 84(4):2404-10 dan a conocer estudios de limpieza y adhesión en superficies realizados empleando impulsos acústicos superficiales generados con láser. Dichos impulsos se generaron con un ritmo de repetición bajo (20 Hz) y energía constante. El procedimiento se efectuó en vacío y, por lo tanto, no resulta apto para su explotación comercial. Un microscopio óptico fue empleado para detectar la eliminación de partículas y resultó imposible distinguir entre las partículas de diferente tamaño.

El documento WO-A-98/45692 da a conocer la utilización de un sensor de cristal piezoeléctrico para determinar la formación/disociación de hidratos de clatrato. Kurosawa et al, Chem. Pharm. Bull, 1990; 38(5):1117-20, informa de que usaron dicho sensor para la detección de aglutinación de látex con recubrimiento de anticuerpo. El documento WO-A-98/40739 también da a conocer dicho sensor, comprendiendo una placa en la que las entidades específicas de enlace son inmovilizadas, con el fin de usarla para indicar la presencia de células en un medio. Dichos sensores son utilizados para medir un cambio en la frecuencia de resonancia a voltaje constante.

Actualmente, cuando es posible, la mayoría de virus son detectados cultivando el espécimen en células, ya que dicho procedimiento es sensible a pesar de ser lento. La detección directa de ADN o ARN víricos en muestras clínicas se puede conseguir utilizando la PCR y cebadores específicos diseñados para el virus de interés. Dado que la PCR implica una etapa de amplificación, la contaminación cruzada es un problema importante y resulta difícil poder establecer procedimiento s cuantitativos fiables. Otros procedimientos directos comprenden la microscopía electrónica, la microscopía electrónica inmune, y procedimiento basados en la detección del antígeno con anticuerpos enlazados con enzimas. Dichos procedimiento s resultan a menudo relativamente insensibles y, por consiguiente, requieren cantidades relativamente grandes de partículas víricas.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en darse cuenta de que los enlaces entre una molécula diana, o una molécula diana unida a una partícula, y una superficie, pueden ser separados mediante la oscilación mecánica de dicha superficie a una amplitud creciente, produciendo el desprendimiento de la molécula o partícula diana de la superficie. La aceleración requerida y, por lo tanto la fuerza, dependerán de múltiples factores, comprendiendo la masa de la molécula o partícula, la naturaleza del enlace a la superficie y la forma geométrica o tamaño de la molécula o partícula diana. Por lo tanto, la presente invención puede utilizarse para separar o medir diferentes moléculas diana, o detectar su presencia.

Según un primer aspecto de la presente invención, un procedimiento para separar el analito a determinar de una composición comprende las siguientes etapas:

(i)

poner en contacto la composición con el componente específico de enlace para el analito, encontrándose inmovilizado dicho componente específico de enlace en la superficie; y

(ii)

hacer oscilar la superficie de tal modo que la amplitud aumente hasta un valor en que el analito, u otros componentes de la composición, sea eliminado de la superficie

La presente invención puede ser utilizada para determinar la presencia o tamaño de partículas, o la afinidad entre componentes específicos de enlace.

La presente invención puede ser aplicada a una variedad de enlaces físicos y químicos, comprendiendo desde interacciones relativamente débiles tales como los puentes de hidrógeno hasta los enlaces covalentes.

El aparato apto para ser utilizado en la presente invención comprende una superficie que presenta un componente específico de enlace inmovilizado en la misma; unos medios para hacer oscilar la superficie con una amplitud creciente; y unos medios para detectar un fenómeno de disociación.

En particular, el aparato puede comprender un dispositivo transductor acústico (ATD), por ejemplo, una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) o un dispositivo de onda acústica superficial, o cualquier material piezoeléctrico que pueda hacerse oscilar, por ejemplo, aplicando un voltaje alterno o un campo magnético. Dichos dispositivos son baratos en comparación con un AFM y pueden ser empleados en multitarea. Otra ventaja de utilizar dicho aparato consiste en que la mayoría de los enlaces se rompen simultáneamente, dando lugar a un sonido detectable y picos de sonido agudos a aceleraciones específicas (voltaje aplicado al ATD). Otra ventaja consiste en que el ATD puede ser empleado como micrófono sensible, para detectar la emisión acústica que se produce cuando tiene lugar la disociación.

En la mayoría de experimentos previos utilizando un ATD, se midieron cambios en la frecuencia o fase de resonancia cuando el ATD es accionado a voltaje constante. En cambio, la presente invención implica aumentar el voltaje de funcionamiento y por lo tanto la amplitud de oscilación del ATD.

La presente invención presenta amplias aplicaciones para la separación, ordenación y medición. Los Ejemplos ilustran que, en el aire, las esferas marcadas con estreptavidina pueden ser separadas de las esferas de látex normal empleando una QCM con una superficie biotinilada y con un voltaje de funcionamiento superior a 0,1 V pero inferior a 6 V. Las esferas de látex normal son eliminadas de la superficie, dejando únicamente las esferas de estreptavidina adheridas a la superficie (debido a un enlace más fuerte estreptavidina-biotina). Esto abre un nuevo tipo de ciencia de separación basado en la fuerza variable que se aplica durante una cierto tiempo, con aplicación, por ejemplo, en la medición y ordenación de partículas, ordenación de células, filtrado de fagos así como el diseño de nuevos biosensores. Dicho procedimiento de separación es de bajo coste y puede ser empleado fácilmente en multitarea y automatizado. Por ejemplo, es posible depositar diferentes dianas en diferentes posiciones en la misma microbalanza y seleccionar una genoteca de ligandos contra múltiples dianas simultáneamente. La detección y el análisis de partículas víricas, las cuales presentan un tamaño fijo, es otra área de aplicación. De manera igualmente importante, la presente invención proporciona una nueva herramienta, sensible y potencialmente cuantitativa, para investigar las fuerzas implicadas en el reconocimiento molecular.

Descripción de la invención

La presente invención emplea un aparato sensor que puede hacerse oscilar. Se puede hacer oscilar dicho sensor de diferentes maneras, por ejemplo, utilizando dispositivos de onda acústica superficial, dispositivos de resonancia con cristal de cuarzo, dispositivos de modo de placa acústica y de placa flexible de membrana fina.

Muchos sensores diferentes, adecuados para ser utilizados en la presente invención, se encuentran disponibles a partir de diferentes proveedores. Una descripción de sensores que pueden ser utilizados en la presente invención se encuentra en Acoustic Wave Sensors, Ballantine et al., (1997) Academic Press. El sensor es preferentemente un dispositivo de onda acústica superficial, o de un modo más preferente, una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM).

La QCM es típicamente un disco de cuarzo cristalino con electrodos de oro en las superficies superior e inferior. Experimenta una oscilación de cizalladura cuando se aplica a los electrodos un voltaje alterno, debido al efecto piezoeléctrico contrario. El aumento del voltaje hace aumentar la amplitud de oscilación de la QCM.

El cristal de cuarzo también es un micrófono sensible y puede ser utilizado para detectar una emisión acústica cuando tiene lugar la ruptura. Técnicamente es más fácil provocar oscilaciones a una frecuencia correspondiente a una mayor frecuencia de resonancia, y detectar la emisión acústica cercana a otro modo. A título de ejemplo, la QCM se hace funcionar a su frecuencia de resonancia, y la emisión acústica se detecta a su tercer armónico.

A título ilustrativo, el término "analito" puede ser empleado para describir la molécula o componente que se enlaza y que entra en contacto con el componente específico de enlace inmovilizado en la superficie. Una vez se ha producido el contacto, el analito se ve unido al sensor debido a una interacción molecular y sometido a aceleración y, por lo tanto, se ejerce una fuerza sobre el analito. A medición que aumenta la amplitud de oscilación, y cuando se llega a una fuerza crítica en particular, tiene lugar la ruptura del enlace. De este modo, una partícula analito previamente enlazada se libera y puede moverse en la superficie.

El analito puede ser cualquier entidad microscópica capaz de ser retenida en el sensor mediante la interacción molecular. El analito puede ser una proteína, anticuerpo, antígeno, enzima, inhibidor enzimático o polinucleótido. El analito puede ser también una partícula mayor, tal como una bacteria, célula, virus, prión o fago. Ejemplos posteriores de partículas especialmente adecuadas para su utilización en la presente invención comprenden microesferas de cualquier materia, por ejemplo sílice, oro o látex, o moléculas mayores tales como los plásmidos. Los componentes específicos de enlace inmovilizados en la superficie pueden ser del mismo tipo y pueden ser escogidos en consecuencia, y en función del enlace físico o químico adecuado.

La disociación de analitos menores se detecta preferentemente con la emisión acústica. Las partículas mayores pueden ser también detectadas con los medios ópticos, por ejemplo, con un microscopio.

Según el primer aspecto de esta invención, la separación se realiza inmovilizando la molécula diana a una superficie sensora mediante la interacción con el componente específico de enlace. Entonces, puede hacerse oscilar la superficie para desorganizar las moléculas que se encuentran en la superficie del sensor. La oscilación se realiza aumentando de manera constante la amplitud y, por lo tanto, la aceleración, y puede ser seleccionada tanto para eliminar la molécula diana de la superficie como para eliminar otros componentes de la composición de la superficie, dejando la molécula diana enlazada a dicha superficie. En una forma de realización preferida, la superficie sensora se hace oscilar utilizando un dispositivo piezoeléctrico de onda acústica, por ejemplo, una QCM. El mismo dispositivo piezoeléctrico puede utilizarse como micrófono para detectar ruido acústico producido cuando tiene lugar ruptura.

La técnica de separación puede ser aplicada para seleccionar moléculas que interaccionan fuertemente con un componente específico de enlace en particular. Por ejemplo, la técnica puede ser aplicada para seleccionar células con moléculas receptoras particulares expresadas en la superficie celular, o para seleccionar anticuerpos con una fuerte afinidad hacia un ligando en particular.

Los ligandos diferentes pueden ser localizados en diferentes posiciones de la superficie mediante, por ejemplo, impresión por contacto o empleando máscaras o fotolitografía. Entonces es posible seleccionar una composición de múltiples componentes específicos de enlace fuertemente unidos con distintos ligandos simultáneamente. En particular, la presente invención puede ser utilizada con chips que presenten distintos materiales tales como receptores inmovilizados encima. De un modo más general, los chips pueden mostrar materiales que permiten hacer pruebas para diferentes infecciones, patógenos, priones, alérgenos alimentarios, virus, bacterias, etc., por ejemplo en pruebas clínicas con humanos y animales, y para un control sanitario de alimentos y agua. Posteriormente, la presente invención puede utilizarse para funciones de selección en una genoteca, poner de manifiesto a fagos, etc.

El segundo aspecto de la presente invención es un procedimiento para determinar la presencia o tamaño de partículas, o los niveles de afinidad entre las moléculas. Preferentemente, una molécula es inmovilizada en la superficie sensora y la otra es inmovilizada en una partícula, por ejemplo, una microesfera. Entonces, la partícula se une al sensor por medio de la interacción molecular que interesa. A continuación, se hacen oscilar las partículas funcionalizadas aplicando un voltaje al sensor. A medición que la amplitud de oscilación aumenta, la fuerza alcanza un valor crítico en el que tiene lugar la rotura del enlace. En este punto, un ruido característico puede ser detectado utilizando un amplificador sensible y se puede observar el movimiento de las partículas, por ejemplo empleando un microscopio óptico. La magnitud de la señal depende del número de partículas unidas a la superficie del sensor. Típicamente, si la QCM se utiliza tal como se describe posteriormente, en el Ejemplo 1, con microesferas fisisorbidas, el ruido se detecta a 0,1 - 1 V, dependiendo del tamaño de las microesferas, apareciendo cuando se observa al microscopio cómo las microesferas se liberan y se deslizan. Puede realizarse un diagrama del ruido generado con relación a la amplitud (o voltaje aplicado), al que nos referiremos como espectro de fuerza de ruptura. En el punto en el que las roturas de los enlaces serán aparentes en el diagrama, habrá un pico de ruido. Por lo tanto, puede determinarse el voltaje crítico en el que tiene lugar la rotura del enlace. Experimentos adecuados de calibrado, empleando partículas de las que se conoce las densidades y fuerzas de enlace, permiten que dicho procedimiento sea cuantitativo. Más adelante, la altura del pico de emisión acústica es una medición del número de partículas enlazadas.

La presente invención puede ser utilizada para estudiar cualquier interacción molecular, pero resulta particularmente adecuada para el estudio de las interacciones enzima/ligando, interacciones anitcuerpo/antígeno e interacciones receptor/ligando o una interacción entre una macromolécula grande y su componente específico de enlace natural. El procedimiento también puede ser aplicado al estudio de fenómenos de hibridación entre polinucleótidos. De este modo, en el primer aspecto de la presente invención, el ligando puede ser, por ejemplo, una proteína, un anticuerpo o antígeno, un enzima, un enzima inhibidor, un polinucleótido, o una macromolécula grande tal como un plásmido grande o un virus. Cualquiera de dichos materiales puede unirse a la superficie o partícula, en el segundo aspecto de la presente invención.

Los siguientes Ejemplos ilustran la presente invención.

En los Ejemplos, para medir las fuerzas de adhesión entre la superficie y una partícula pequeña se emplea la espectroscopia de fuerza de ruptura. El efecto se basa en hacer oscilar una superficie, con micropartículas sobre la misma, a una amplitud uniformemente creciente y, por lo tanto, aceleración creciente. Esto se consigue accionar la superficie con un dispositivo piezoeléctrico de onda acústica, en este caso una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM). A medición que aumenta la amplitud, la aceleración hace lo mismo y, por lo tanto, la fuerza ejercida sobre la partícula. La ruptura de todos los enlaces que unen la partícula a la superficie ocasiona un ruido y el mismo dispositivo piezoeléctrico puede ser utilizado como micrófono sensible para detectar dicho ruido, producido cuando tiene lugar la ruptura. Una representación esquemática del aparato empleado en los ejemplos del 1 al 5 se ilustra en la Figura 1; una representación esquemática más general del aparato preferente se ilustra en la Figura 8.

Más específicamente, la Figura 1 ilustra un circuito que comprende un transductor piezoeléctrico, 10; un generador f sinusoidal puro, 11; un generador 3f + \Deltaf, 12; un filtro 3f + \Deltaf, 13; un amplificador y convertidor analógico a digital Lock-in, 14; y un ordenador, 15, con dispositivo de entrada de datos y salida de control señalados con las flechas. En los Ejemplos del 1 al 5, f = 14,2 MHz y \Deltaf es 82 kHz. Las partículas, 16, se sitúan en la superficie del sustrato.

La Figura 8 ilustra un transductor piezoeléctrico 21 (del tipo QCM, dispositivo SAW, etc.), y un amplificador de ganancia variable 22, con entrada 23, y salida 24, capaz de producir un aumento suave de la amplitud de salida bajo el control de una señal 25. El circuito también comprende un receptor paso-banda, 26 (por ejemplo similar a un receptor de radio SSB), y un convertidor o convertidores de analógico a digital 27, suministrando datos por medio de una conexión, 28. Además, el circuito comprende un dispositivo controlador, grabador y procesador señal de datos 29 (por ejemplo un ordenador o un procesador DSP dedicado). El contacto indicado con una línea discontinua 30, puede ser remplazado por medios más optimizados de filtrado y acoplamiento, por ejemplo, puede ser una red L, C, R pasiva.

Cuando se utiliza el circuito ilustrado en la Figura 8, el amplificador 22, con el transductor, 21, en combinación con los medios opcionales de filtrado/acoplamiento 30, proporcionan una red de oscilador simple, oscilando preferentemente a una frecuencia en la que el transductor es eficaz; para la QCM puede ser fundamental una frecuencia de resonancia en serie. Dicha frecuencia de oscilación (F) es, por ejemplo, 14 MHz. La amplitud del voltaje de funcionamiento en la salida, 24, aumenta suavemente bajo el control del controlador, 29, mediante la conexión del control, 25. La señal resultante de la emisión acústica en el punto, 30, puede ser purificada mediante un filtro/acoplador opcional y entonces transmitirse a la entrada del receptor paso-banda, 26. La banda de frecuencia del receptor que funciona puede ser seleccionada siguiendo un criterio de correspondencia entre la máxima señal y el ruido, por ejemplo, el modo de resonancia localizado cerca del tercer armónico (3F + \DeltaF), por ejemplo, 42,082 MHz.

Las señales de salida simple o en cuadratura son convertidas por un conversor o conversores de analógico a digital 27, de alto rango dinámico. Entonces los datos son procesados digitalmente en el 29, a fin de obtener la señal útil, y posteriormente grabarla y/o proporcionarla al observador. El amplificador 22 puede ser equipado adicionalmente con uno o más filtros de entrada y/o salida, mejorando la señal hasta un índice de ruido, y también garantizando que el oscilador funcione en las correctas frecuencia y cambio de fase de corriente a voltaje a través del transductor.

La Figura 9 ilustra un sensor preferente basado en el SAW para ser empleado en la presente invención. Comprende unos medios 31, para generar voltaje RF en la salida, 32, aumentando la amplitud que hace funcionar los electrodos del transductor, 33. La disposición de los electrodos 33 se optimiza para generar una alta amplitud SAW en el piezosustrato 34. La disposición de los electrodos, 37, se optimiza para la mejor transducción de la emisión acústica a una señal eléctrica. El diseño puede ser complejo, comprendiendo uno o más pares de electrodos. El dispositivo comprende, además, de una unidad de control, 35, para controlar el generador, 31, mediante una conexión, 36, y para recibir las señales generadas en una o más entradas, 38, y realizar el proceso de la señal de los datos, por ejemplo, un análisis de correlación.

Cuando se utiliza el sensor basado en el SAW, el generador, 31, genera un voltaje RF que es adecuado para proporcionar una frecuencia de transducción eficaz en la salida, 32, y éste se transmite a los electrodos transductores generados, 33, dispuestos en el piezosustrato, 34 (línea punteada). La amplitud del voltaje RF aumenta con el tiempo bajo el control del controlador, 35, mediante la conexión de control, 36. Los electrodos receptores, 37, transducen la emisión acústica que surge del área activa hacia la señal eléctrica que se transmite al controlador/receptor, 35, y la(s) entrada(s), 38. Los datos obtenidos una vez se ha realizado la conversión de analógico a digital experimentan un procesamiento de señal con el objetivo de extraer las señales útiles. Entonces los resultados son finalmente grabados y/o proporcionados al operador.

Ciertos resultados de los Ejemplos se ilustran en las Figuras de la 2 a la 7 y en la 10. Las Figuras 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 4C, 4D, 6B, 7 y 10 son diagramas que relacionan el ruido de señal (S; unidades arbitrarias) con la amplitud (A; voltios). Las Figuras 5A, 5B, 6A y 6C son diagramas que relacionan el ruido de señal con el número de partículas (N).

Se emplean las siguientes abreviaciones:

BSA: Albúmina de suero bovino

LB: Caldo de cultivo Luria

DIC: Cloruro de dimetilaminoisopropil

DMAP: Dimetilaminopiridina

EDC: 1,3-dimetilaminopropil-3-etilcarbodiimida

NHS: N-hidroxisuccinimida

PBS: tampón fosfato salino

Ejemplo 1

Las esferas de látex, de 5 \mum de diámetro, se sujetaron a la superficie del sensor de la QCM mediante un número importante de enlaces que nos interesan. La cobertura de la esfera que se empleó fue un 1% del área de la superficie de la QCM. Las esferas presentaban solamente un 1% de variación en su diámetro.

El sensor de la QCM comprendía de placas de cuarzo pulido, de corte transversal acústico a 35º y 8,25 mm de diámetro. Se depositaron capas de cromo (con un espesor de 20 a 30 nm) y a continuación oro (con un espesor de 100 a 120 nm).

Se estudiaron tres enlaces diferentes en experimentos realizados en aire: un enlace físico (látex-oro), un enlace estreptavidina-biotina y un enlace covalente (enlace realizado mediante una amida). El enlace físico se realizó disponiendo las esferas de látex directamente en la superficie del sensor y secándola en nitrógeno. El enlace estreptavidina-biotina se realizó aplicando BSA biotinilada a la superficie y secándola en nitrógeno. El enlace químico se realizó formando una monocapa de tiol empleando un tiol de terminación ácida (ácido 12-mercaptododecanoico) disuelto en etanol; a continuación éste fue activado empleando EDC-NHS, y las esferas con una terminación de amina fueron añadidas para formar el enlace amida.

Los experimentos se realizaron en una cámara equipada con dos ventanas ópticas: una para proporcionar la iluminación láser de la muestra, y la otra para permitir la observación de la luz láser dispersa mediante un microscopio óptico. La QCM fue dispuesta en la cámara. Un generador de señal, Modelo DS345 (Standford Research Systems), fue empleado para accionar la QCM. El movimiento y desprendimiento de partículas fue observado empleando un microscopio óptico Olympus BH-2 equipado con una vídeo cámara CCD Panasonic WL-SL300. El principal dispositivo de medición fue un amplificador Lock-in, SR 844 (Standford Research Systems). La señal de referencia se envió al Lock-in empleando un segundo generador sincronizado con el primero. Todos los dispositivos estaban conectados a un ordenador para el control del experimento y recopilación de los datos.

La figura 2A ilustra el espectro de fuerza de rotura para la estreptavidina-biotina (1) y el enlace químico (2); la figura 2B es el espectro para el enlace físico.

Es posible determinar experimentalmente la fuerza o el voltaje requerido para romper los enlaces mediante la grabación de los espectros de fuerza de ruptura. Esto puede ser utilizado para la separación. Tal como se ilustra en la Figura 2A, si hay una mezcla de esferas de 5 \mum, alguna de las cuales presenta estreptavidina en la superficie aunque otras no, entonces aplicando un voltaje por encima de los 0,1 V pero por debajo de los 6 V, por ejemplo 1 V, a una QCM con biotina en la superficie, es posible separar los dos conjuntos de esferas para proporcionar solamente las esferas marcadas con estreptavidina, en la superficie. Esta técnica puede emplearse también para detectar esferas marcadas con estreptavidina ya que solamente dichas esferas se unirían a la superficie si se la hace oscilar a 1 V.

Para realizar la medición de tipo cuantitativo, la amplitud de oscilación de la QCM ha sido calculada a diferentes voltajes, basándose en datos experimentales, permitiendo la estimación de la fuerza en la microesfera. Dicho cálculo se realizó midiendo el consumo de energía de la QCM y su factor Q (o factor de mérito - ancho de banda de la resonancia relativa recíproca = f/\Deltaf_{resonancia}). La amplitud A viene dada por:

A = [QP/2\pi^{3}f^{3}M]^{1/2}

en la que Q representa a Q o factor de mérito, P es la energía eléctrica consumida por la QCM, f es la frecuencia de resonancia del cristal de cuarzo y M es la masa efectiva de la placa de cuarzo de la QCM implicada en el movimiento. Se determinó que el factor Q era de aproximadamente 15.000 a 6 V, lo que proporciona una estimación de la amplitud vibracional de la QCM de 60 nm. Por lo tanto la fuerza en la esfera es de 9 \muN. Se debería comparar dicho valor con la fuerza necesitada para romper un enlace simple de estreptavidina-biotina de 160 pN^{2} e indica que aproximadamente 60.000 enlaces se rompen simultáneamente. La estimación indica que esto corresponde al 50% o más de los enlaces de la estreptavidina-biotina inicial entre la esfera y la superficie. Esto significa que la mayoría de los enlaces que unen las esferas a la superficie se rompen simultáneamente. Esto origina los picos agudos observados en el espectro de fuerza de ruptura y el ruido detectable cuando se rompe el enlace.

Ejemplo 2

El presente ejemplo ilustra que los procedimientos de la presente invención también pueden realizarse en solución. El factor Q de la QCM disminuirá debido a la carga líquida, reduciendo así la amplitud de oscilación a un voltaje en particular cuando se compara con el aire. Habrá fuerzas de viscosidad actuando en la microesfera y su masa efectiva aumentará, debido a la capa asociada de agua, aumentando la fuerza en la esfera.

La Figura 3 ilustra el espectro de fuerza de ruptura para esferas de 5 \mum unidas a la superficie mediante la estreptavidina-biotina (Fig. 3A) y un enlace químico (Fig. 3B). La ruptura tiene lugar a 1 V y 10 V respectivamente.

Una reducción en el voltaje crítico para el enlace de la estreptavidina-biotina, por un factor de seis, de 6 V a 1 V al pasar del aire al agua, y la ruptura del enlace químico en el agua, indica que este último efecto es dominante. De este modo, este Ejemplo demuestra claramente que la ruptura de enlaces y, por lo tanto, la separación y biodetección, son posibles en agua o en otro líquido.

Suponiendo que la densidad de enlace para los enlaces de tipo físico, estreptavidina-biotina y químico es la misma ya que se han utilizado en estos experimentos microesferas del mismo tamaño, se puede obtener una escala relativa de fuerza de ruptura. Esta escala es 1:60:600 para los enlaces de tipo físico: estreptavidina - biotina: químico. Esta escala parece razonable y demuestra el rango dinámico de este método. Realizando experimentos adecuados de calibración con densidades de enlace conocidas, debería ser posible hacer que estas mediciones fueran cuantitativas.

Ejemplo 3

El presente ejemplo demuestra que es posible la detección de virus y, en particular, bacteriófagos modificados genéticamente que presentan una proteína que se enlaza específicamente con la maltosa unida a la cubierta proteica del fago pIII, ya que tanto el fago como la interacción con la proteína que se enlaza específicamente con la maltosa, son bien conocidas y están disponibles de inmediato. El fago es un virus largo, delgado y filamentoso que consiste en un cilindro flexible de 1 \mum de largo y 6 nm de diámetro. El fago modificado genéticamente presenta además hasta 5 proteínas que se enlazan específicamente con la maltosa en un extremo del virus y que sirven para la fusión a la cubierta proteica del fago pIII; ver McCafferty et al, Nature, 1990, 348:552. Estos fagos pueden ser purificados específicamente en resina de amilosa.

Una fusión de la proteína que se enlaza específicamente con la maltosa al extremo amino de la indol glicerol fosfato sintasa se presentó en la superficie del fago fd como fusión al extremo amino de la proteína de la cubierta codificada por el gen III. Con este propósito, un vector del fago fd, pJB113, fue construido; dicho vector codificaba una fusión genética entre MalE (E. Coli), trpC (E. Coli) y el gen III. Dicho vector del fago llevaba un marcador de la resistencia a la tetraciclina. El fago competidor inmodificado era el fago helper VCS M13 K07 (Stratagene) llevando un marcador de resistencia a la kanamicina.

Se obtuvieron concentraciones de bacteriófagos de 1 x 10^{12} cfu/ml infectando 3 ml a media fase logarítmica cultivo LB de la cepa de Escherichia coli TG1 con un stock de 10 \mul de fago. Tras 2 horas de agitación (250 rpm) a 37ºC, 1 ml del cultivo fue inoculado en 100 ml LB y agitado a 350 rpm 37ºC durante una hora. Se añadió tetraciclina (10 \mug/ml) o kanamicina (50 \mug/ml) al cultivo de pJB113 o al de VCS, respectivamente, los cuales se hacían crecer por la noche a 30ºC a 250 rpm. Se hizo sedimentar las bacterias (15 min., 4,1 krpm) y los fagos precipitados del sobrenadante mediante la adición de NaCl y PEG6000 hasta concentraciones finales de 0,5 M y 4% (v/v) respectivamente. Después de permanecer durante 1 hora en hielo, los fagos fueron recuperados por centrifugación (30 min., 4,1 kprm) y el sedimento de los fagos fue resuspendido en 1 ml de H_{2}O y conservado a 4ºC.

Se disolvió almidón soluble (500 mg, 0,01 mmol, 1 eq.) en DMF (10 ml) y se agitó durante 5 minutos (parcialmente soluble). Se añadió DIC (7,8 \mul, 6,3 mg, 0,05 mmol, 5 eq.) y DMAP (cat.) al ácido 11-mercaptododecanoico (11,5 mg, 0,05 mmol, 5 eq.) en DMF (0,5 ml) y esta solución se añadió a la solución de almidón. Se dejó que se desarrollase la reacción en el agitador a temperatura ambiente durante la noche. Entonces la reacción se purificó empleando una célula de agitación con una membrana de 10.000 MW como máximo, aclarando la solución con agua milliQ (6 veces 50 ml) y un proceso de concentración; a continuación se liofilizó durante la noche.

La superficie estaba preparada empleando el almidón modificado que contenía un grupo tiol de modo que podía adherirse químicamente a la superficie. La QCM (preparada del mismo modo del Ejemplo 1) se colocó en una solución de almidón en metanol (1 \mug por ml) durante 12 horas. Entonces se lavaron y secaron las muestras con un chorro de nitrógeno. Los virus de la solución se depositaron en la superficie y se secaron a temperatura ambiente para los experimentos en el aire. Se prepararon diferentes concentraciones de virus mediante dilución. Para realizar los experimentos con la maltosa bloqueando la proteína que se enlaza específicamente con la maltosa, se añadieron 10 nM de maltosa a la solución fagos.

De este modo la superficie de la QCM fue revestida con una capa de almidón soluble de patata (que contenía polímeros ramificados de maltosa), químicamente unido a la superficie de oro mediante un enlace sulfuro-oro. Se realizaron experimentos tanto en aire como en agua.

La Figura 4A ilustra el espectro de fuerza de ruptura obtenido en agua para una mezcla equitativa de fagos que se enlazan específicamente con la maltosa (-) y fagos inmodificados (...) obteniéndose la lectura después de 500 segundos. Hay aproximadamente 500 millones da cada tipo de fago en la superficie del electrodo de oro. Para los fagos inmodificados y, por lo tanto, enlazados de un modo no específico, se detectó un pico de rotura a 12 V. Los picos de rotura correspondiente a los fagos que se enlazan específicamente con la maltosa fueron detectados alrededor de 9 V y además, con mayor intensidad que los fagos con enlaces no específicos debido a la mayor cantidad de energía liberada en la rotura del enlace. En el aire, a 10 V no se observaron picos producidos por los fagos que se enlazan específicamente con la maltosa enlazados de modo específico; la Figura 4B ilustra los datos en aire para solamente los fagos enlazados de modo no específico. El pico tiene lugar a 7,5 V, un aumento de aproximadamente 6 respecto el pico obtenido en agua. Una segunda lectura (...) no presenta prácticamente picos, indicando esto que los fagos han sido eliminados de la superficie. Dicho comportamiento nos confirma que las fuerzas adicionales de fricción viscosa y el aumento en masa efectiva de la partícula hacen más fácil la ruptura de los enlaces entre las partículas de fago y la superficie en agua que en aire.

La agudeza de los picos en el espectro de fuerza de ruptura está aparentemente relacionada con la observación de que la ruptura de los enlaces tiene lugar a un voltaje límite; esto ocasiona la producción del ruido acústico en un periodo corto de tiempo y, por lo tanto, convierte el procedimiento en muy sensible. Además, la señal que proviene de los fagos que se enlazan específicamente está bien separada de la que proviene de los fagos que se enlazan no específicamente y se presenta con una mayor amplitud, lo cual significa que la adsorción no específica no afecta la medición de la adsorción específica. Se requiere una fuerza mucho mayor para romper la interacción específica entre las proteínas que se enlazan específicamente con la maltosa que presenta el fago y la superficie revestida con almidón si se compara con la requerida para romper las interacciones no específicas entre el fago inmodificado y la superficie.

La Figura 4C ilustra el resultado de un experimento de control realizado en aire con los fagos que se enlazan específicamente con la maltosa cuando se bloquea con maltosa la zona de enlace y entonces los fagos se depositan en la QCM en el centro (diagrama superior) o sobre la superficie entera (diagrama inferior); se trata de un comportamiento similar al del de los fagos inmodificados, confirmando que la diferencia es debida a dichas interacciones específicas. La Figura 4D ilustra el espectro de fuerza de ruptura en agua solamente con 1.000 fagos en la superficie, e indica que el suceso de la ruptura es aún detectable. Se produce un pequeño cambio en la posición del pico debido a cambios menores en la Q o factor de calidad de la QCM, como resultado del cambio en la carga.

Los datos también sugieren que debería ser posible separar los fagos enlazados no específicamente de los fagos que se enlazan específicamente a la maltosa accionando la QCM a un voltaje superior al necesario para romper los enlaces de los fagos no específicos pero inferior al necesario para los fagos que se enlazan específicamente con la maltosa. Esto sugiere una manera alternativa de seleccionar genotecas de fagos para enlaces, en la que la afinidad de enlace del fago que permanece en la superficie está controlada mediante el control del valor del voltaje aplicado y el tiempo durante el cual es aplicado, siempre y cuando el fago permanezca viable.

Para determinar la sensibilidad del procedimiento, se realizó un experimento de dilución, con el fago que se enlaza específicamente en agua. La Figura 5A ilustra (para los picos de ruido más intensos cercanos a 9 V) que la energía de la señal se comporta de modo lineal respecto el número de fagos por encima de al menos cinco órdenes de magnitud y que la presencia de aproximadamente 200 fagos en la QCM puede ser detectada con un 99% de probabilidad. La Figura 5B ilustra una curva similar para los fagos que se enlazan de modo no específico en el aire, indicando una sensibilidad de detección de 100 fagos con el 99% de probabilidad. El número de fagos que se enlazan específicamente con la maltosa en la superficie a baja dilución fue confirmado mediante la formación de imágenes directas utilizando una AFM.

El presente ejemplo ilustra que el número de fagos en la superficie de la QCM puede ser detectado. A diferencia de cuando se utiliza la PCR, el número de copias de ADN vírico es detectado en la solución. Si se supone que todas las partículas víricas en la muestra de la solución se unirán a la superficie, lo cual ocurrirá si hay tanto una interacción fuerte virus-superficie como si se permite que la solución se evapore dejando los virus en la superficie, entonces es posible una comparación directa de sensibilidad. La sensibilidad de la PCR es de alrededor de 100 copias de ADN vírico por ml. Esto es comparable a la sensibilidad de detección para el fago, mediante el presente Ejemplo (el cual no está optimizado). Puede mejorarse el sistema electrónico y hoy se puede mejorar aún más la sensibilidad, posiblemente en un orden de magnitud como mínimo. Por ejemplo, en dichos experimentos, los fagos fueron depositados uniformemente sobre la superficie de la QCM. No obstante, tanto la amplitud como la sensibilidad de la QCM presentan una dependencia espacial lo cual significa que la señal dominante proviene del centro de la QCM (tal como se representa en la Figura 4C). Esto significa que si los fagos son depositados en el centro de la QCM, podrán registrarse un número menor de picos y, por lo tanto, más intensos, obteniendo una mejora en la sensibilidad.

El presente procedimiento puede ser desarrollado directamente para la detección de virus humanos mediante el uso de anticuerpos específicos contra los virus unidos a la superficie de la QCM. Dichos anticuerpos forman interacciones específicas entre los virus unidos a la superficie QCM. Dichos anticuerpos forman interacciones específicas entre los virus a la superficie que pueden ser separadas a una aceleración de la superficie en particular. La adsorción no específica de partículas de tamaño similar o más grandes presentes en la muestra ocasionará la aparición de picos a bajo voltaje, tal como ha sido presentado ahora, y esto no debería afectar el análisis a pesar de que la adsorción por macromoléculas en la superficie puede reducir el número de anticuerpos disponible para enlazar con el virus. Los virus más comunes presentan una mayor masa efectiva que los fagos empleados en este Ejemplo aunque el número y fuerza de las interacciones específicas con la superficie serán distintos. Esto significa que el voltaje requerido debería ser de una magnitud similar o menor.

El presente Ejemplo ilustra cómo la espectroscopia de fuerza de ruptura no requiere ninguna etapa de amplificación, es cuantitativa, y tiene el potencial de ser inmediata y de bajo coste. Esto podría permitir un diagnóstico rápido de infecciones víricas en muchas situaciones incluyendo el caso de pacientes en un ambiente hospitalario o el de plantas y animales en agricultura.

Ejemplo 4

El presente Ejemplo ilustra un experimento de enlace para virus. Para dicho experimento, se desarrollaron chips de cristal de cuarzo para la microbalanza a partir de placas de cuarzo pulido AT, cortadas en un ángulo de 35º (HyQ, Cambridge, R.U.) y fueron revestidos en un depositador de vapor Edwards con una capa de adhesión de cromo de 30 nm de espesor y posteriormente una capa de oro de 200 nm como se determinó a partir del calibrado de la conductancia eléctrica. A continuación, dichos chips fueron sumergidos en una solución de 1 mM de ácido mercaptododecanoico en etanol de grado espectroscópico durante 18 h, lavado exhaustivamente con etanol y a continuación con agua, y posteriormente secado con un chorro de nitrógeno. A continuación, dichos chips fueron sumergidos en una mezcla de NHS (100 mM) y EDC (400 mM) durante 20 minutos. Se lavaron exhaustivamente con agua y entonces fueron sumergidos durante 1 h en una solución de 50 \mug/ml de anticuerpos IgG monoclonales de ratón que actúan contra la glucoproteína D del HSV I en 10 mM PBS a pH 7,0. A continuación fueron lavados con agua y sumergidos durante 10 minutos en una solución 1M de etanolamina a pH 8,5. Entonces fueron lavados exhaustivamente con agua y conservados a 4ºC en 1 ml de PBS.

El número de partículas víricas/ml en una solución Ficoll-purificada de una reserva de virus fue determinado empleando un microscopio electrónico con estándar interno de esferas de látex. Se prepararon soluciones seriadas decuplicadas de una solución de una reserva de HSV gD^{+} a una concentración de 5 x 10^{10} partículas víricas/ml en PBS (10 mM Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4}, 2,7 mM KCl, 120 mM NaCl, pH 7,4) conteniendo BSA (0,1 mg/ml) y conservadas a 4ºC. Entonces se montaron los chips de la QCM en el instrumento con contactos sin soldadura y tanto 1 \mul como 40 \mul de cada una de dichas diluciones se colocó encima de la superficie del chip revestida con el anticuerpo IgG anti-gD. Después de 40 minutos la superficie fue lavada a fondo con agua y posteriormente cubierta con 40 \mul de PBS y la QCM sometida a un voltaje de 0 a 10 V.

Los resultados se ilustran en la Figura 6. La Figura 6A es un diagrama de la señal (el pico de ruido cercano a los 7,5 V) en relación con el número de partículas de virus de herpes simplex gD^{+} para muestras de 1 \mul (o) y 40 \mul (\oblong). La pureza de la línea es buena. La Figura 6B es un diagrama del ruido en relación con la amplitud para el virus gD^{+} y el virus gD^{-}. El virus gD^{-}, que no tiene interacción específica con el anticuerpo en la superficie, no produce ningún pico; en cambio, el virus gD^{+} presenta un pico agudo cerca de los 7,5 V.

Ejemplo 5

Para el presente experimento de enlace bacteriano, los chips de la QCM fueron preparados del mismo modo que en el Ejemplo 4. Se cultivaron E. Coli y S. Aureus (cepas de laboratorio) en caldo de cultivo de cerebro y corazón/0,5% de extracto de levadura e incubado durante la noche a 37ºC. Una muestra de 1 ml de cada cultivo fue ajustada a una concentración de 10^{10} cfu/ml tal como se determinó por densidad óptica, y centrifugada a 12.000 g durante 2 minutos; el sedimento fue resuspendido en PBS estéril. 10 \mul de la suspensión bacteriana se colocó encima de un chip de la QCM revestido con anticuerpos IgG anti-E. Coli de un modo similar al que ha sido presentado en el Ejemplo 4 para el anticuerpo anti-HSV. Después de 40 minutos, la superficie se lavó a fondo con agua y posteriormente cubierta con 40 \mul de PBS y la QCM sometida a un voltaje de 0 a 10 V.

Los resultados se ilustran en la Figura 7. El diagrama de ruido/amplitud presenta una señal aguda hacia los 6 V para la E. Coli y ninguna para el S. Aureus.

Ejemplo 6

En el presente ejemplo, se empleó un dispositivo SAW, tal como se ilustra en la Figura 9. En este caso, se usó un único instrumento (HP8512a, Hewlett Packard) el cual combina un amplificador y receptor y controlador en un único instrumento. Dicho instrumento se pone en modo "Continous Wave and Power Sweep". El dispositivo SAW empleado fue el RF1171 de RF Monolitics, Inc., disponible comercialmente. Alrededor de 100,00 esferas de látex, de 1 \mum de diámetro, fueron depositadas en la superficie del dispositivo SAW. El espectro resultante se proporciona en la Figura 10. Se observa un número de picos que no se presentan en la superficie limpia. Esto demuestra que un dispositivo SAW puede ser utilizado para detectar las rupturas. Los diferentes picos probablemente corresponden a grupos de esferas en la superficie de diferentes tamaños y, por lo tanto, los picos se observan en posiciones distintas.

Claims (27)

1. Procedimiento para separar un analito diana de una composición, que comprende las siguientes etapas:

(i)

poner en contacto la composición con un componente específico de enlace para el analito, siendo inmovilizado el componente específico de enlace en la superficie; y

(ii)

hacer oscilar la superficie de modo que la amplitud aumenta hasta un valor al cual el analito, u otro componente de la composición, es eliminado de la superficie.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el analito u otro componente es selectivamente eliminado y separado.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se detecta la eliminación del analito de otro componente.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, para determinar la afinidad entre los componentes específicos de enlace, o la propiedad de uno de los componentes específicos de enlace dependiendo de la afinidad.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, para determinar la fuerza de enlace entre los componentes específicos de enlace.

6. Procedimiento según la reivindicación 3, para determinar la presencia del otro componente específico de enlace.

7. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el otro componente específico de enlace es una partícula o se encuentra inmovilizado a ella.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, para determinar el tamaño o presencia de la partícula.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 3 a 8, en el que el suceso de la disociación es detectado por medio de una emisión acústica.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que se hace oscilar la superficie a una frecuencia correspondiente a una mayor frecuencia de resonancia, y la emisión acústica es detectada en la proximidad de otra frecuencia de resonancia.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la superficie forma parte de una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), haciéndose oscilar la QCM accionándola a su frecuencia de resonancia fundamental y la QCM detecta la emisión acústica en un valor próximo al triple del fundamental.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto específico de enlace, o ambos, es una proteína, anticuerpo, antígeno, enzima, inhibidor enzimático o polinucleótido.

13. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 11, en el que el compuesto específico de enlace, o ambos, es una célula, bacteria, virus, prión o fago.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que diferentes compuestos específicos de enlace son inmovilizados en distintas posiciones en la superficie.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la superficie forma parte de un transductor piezoeléctrico o un transductor acústico.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el transductor es una microbalanza de cristal de cuarzo o un dispositivo de onda acústica superficial.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se desarrolla en un líquido.

18. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 16, que se desarrolla en el aire.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se hace oscilar la superficie en el plano de la superficie.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (ii) comprende la oscilación de la superficie a una amplitud que aumenta de manera monótona.

21. Aparato para detectar la disociación de compuestos específicos de enlace que comprende:

un dispositivo transductor acústico que incluye una superficie que presenta uno de los componentes específicos de enlace inmovilizado a la misma;

un oscilador, para oscilar la superficie a una amplitud creciente en el plano de la superficie; y

un detector, para detectar un cambio de amplitud de la otra oscilación simultánea, causada por el suceso de disociación.

22. Aparato según la reivindicación 21, en el que el detector detecta emisiones acústicas.

23. Aparato según las reivindicaciones 21 ó 22, en el que el componente específico de enlace inmovilizado es una proteína, anticuerpo, antígeno, enzima, inhibidor enzimático o polinucleótido.

24. Aparato según las reivindicaciones 21 ó 22, en el que el componente específico de enlace inmovilizado es una célula, bacteria, virus, prión o fago.

25. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que los diferentes componentes específicos de enlace son inmovilizados en distintas posiciones de la superficie.

26. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en el que los medios del oscilador y del detector comprenden un transductor piezoeléctrico y un transductor acústico.

27. Aparato según la reivindicación 26, en el que el transductor es una microbalanza de cristal de cuarzo o un dispositivo de onda acústica superficial.