ES2227698T3

ES2227698T3 - Formulacion de lipidos inmunoestimuladores.

Info

Publication number: ES2227698T3
Application number: ES97927561T
Authority: ES
Inventors: Ulf Schroder
Original assignee: Eurocine AB
Current assignee: Eurocine AB
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2017-06-09
Also published as: SE9602280D0; NZ333226A; WO1997047320A1; AU724655B2; DE69730434T2; CA2258017C; CA2258017A1; JP2000512292A; AU3199897A; US20020012673A1; US20070020282A1; JP4147328B2; US20080187553A1; EP0918541B9; DE69730434D1; US7128909B2; EP0918541B1; EP0918541A1

Abstract

SE EXPONE UNA FORMULACION FARMACEUTICA PARA ADMINISTRACION PARENTERAL O MUCOSA DE ANTIGENOS Y/O VACUNAS A HUMANOS Y ANIMALES, QUE COMPRENDE PREPARACIONES DE MONOGLICERIDOS QUE TIENEN AL MENOS UN CONTENIDO DE MONOGLICERIDOS DEL 80%, EN LAS QUE EL GRUPO ACILO CONTIENE DE 6 A 24 ATOMOS DE CARBONO, JUNTO CON ACIDOS GRASOS EN LOS QUE EL NUMERO DE ATOMOS DE CARBONO PUEDE VARIAR ENTRE 4 Y 22.

Description

Formulación de lípidos inmunoestimuladora.

La presente invención se refiere a una nueva formulación farmacéutica para la administración de antígenos y/o vacunas. La vía de administración preferida es a través de las membranas mucosas, sin embargo, también puede usarse la administración parenteral. La invención también se refiere al uso de ciertos compuestos (como se definen más adelante) como adyuvantes o vehículos en tal formulación.

Antecedentes

Durante los últimos años se han producido un número creciente de antígenos específicos a partir de diferentes tipos de organismos (por ejemplo, células tumorales, bacterias, virus y parásitos) usando técnicas de clonación. Sin embargo, estos antígenos a menudo son inmunógenos débiles a pesar de su alta especificidad.

Para obtener una buena protección después de la vacunación, se necesitan sistemas estimuladores inmunes que puedan potenciar y activar el sistema inmune contra esos antígenos débiles. Tales sistemas estimuladores inmunes se denominan adyuvantes.

Los adyuvantes, usados principalmente en el momento actual en experimentos animales, incluyen un grupo muy heterogéneo de substancias; substancias inorgánicas, emulsiones de aceite, polímeros cargados, substancias neutras o substancias procedentes de bacterias.

En el momento actual se están realizando grandes esfuerzos en investigación y desarrollo para obtener un adyuvante seguro con alta eficacia para usarse en seres humanos. Sin embargo, actualmente no hay ningún adyuvante general para este fin.

Los hidróxidos de alumbre y los fosfatos de alumbre fueron las dos primeras substancias inorgánicas que se usaron en seres humanos. La respuesta inmune obtenida es el resultado de una lenta desorción del antígeno precipitado en la superficie de la partícula. Posteriormente se demostró que estas sales de alumbre atraían células fagocíticas, ocasionando una potenciación adicional de la respuesta inmune. Sin embargo, estas sales no son seguras, ya que se ha notificado la formación de granulomas (Slater et al, Br. J. Dermatol. (1982) Vol. 107, pág. 103-108). Además, las sales de alumbre no se pueden usar para todos los antígenos, ya que todos los antígenos no se adsorben en la superficie.

En 1944, Freund introdujo su adyuvante que constaba de una mezcla de aceite vegetal, aceite mineral, detergentes y bacterias inactivadas. La potenciación obtenida se debía parcialmente a la lenta liberación del antígeno desde la emulsión de aceite. Sin embargo, el adyuvante de Freund no puede usarse en seres humanos debido a la formación de granulomas, a la inducción de reacciones autoinmunes y a la falta de biodegradabilidad del aceite mineral. Además, el efecto es difícil de controlar. Se ha aislado la substancia activa del adyuvante de Freund, se ha determinado su estructura y se ha demostrado que es N-acetil muramil-L-alaninisoglutamato, denominado a menudo muramil-dipéptido (MDP).

El efecto adyuvante dependiente del tamaño de las partículas de polimetacrilato y poliestireno se examinó en ratones (Kreuter et al, Vaccine, (1986) vol 4, 125-129) por medio del uso de ovoalbúmina (adsorbida en las partículas) como antígeno modelo con un ensayo posterior de la respuesta inmune. El tamaño de las partículas se varió entre 62 y 306 nm. El resultado fue que las partículas más pequeñas potenciaban la respuesta inmune mejor que las de mayor tamaño. Las partículas más pequeñas proporcionaron un efecto mejor que el Al(OH)_{3} al 0,2%. Todas las preparaciones indujeron una respuesta mayor en comparación con preparaciones fluidas. En la bibliografía científica se conocen experimentos similares en los que sistemas de partículas con menor tamaño dan como resultado una mayor respuesta inmune en comparación con partículas de mayor tamaño.

Casi todos los sistemas usados actualmente para potenciar la respuesta inmune contra antígenos son partículas o forman partículas junto con el antígeno. En el libro "Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach" (Ed: Powell & Newman, Plenum Press, 1995) se describen todos los adyuvantes conocidos tanto con respecto a su actividad inmunológica como con respecto a sus características químicas. Como se describe en el libro, más del 80% de los adyuvantes ensayados actualmente son partículas o polímeros que conjuntamente con los antígenos (en la mayoría de los casos proteínas) forman partículas. El tipo de adyuvantes que no forman partículas constituyen un grupo de substancias que actúan como substancias señal inmunológicas y que en condiciones normales constan de las substancias que se forman por el sistema inmune como consecuencia de la activación inmunológica después de la administración de sistemas adyuvantes particulados.

Usando sistemas particulados como adyuvantes, los antígenos se asocian o se mezclan con una matriz que tiene la característica de biodegradarse lentamente. Cuando se usan tales sistemas de matriz, es de gran importancia que la matriz no forme metabolitos tóxicos. Realizando la selección desde este punto de vista, el tipo principal de matrices que pueden usarse son principalmente substancias que proceden de un cuerpo. Con estos antecedentes, sólo hay unos pocos sistemas disponibles que cumplen estas demandas: polímeros de ácido láctico, poli-aminoácidos (proteínas), carbohidratos, lípidos y polímeros biocompatibles con baja toxicidad. También pueden usarse combinaciones de estos grupos de substancias procedentes de un cuerpo o combinaciones de substancias procedentes de un cuerpo y polímeros biocompatibles. Las substancias preferidas son lípidos, ya que presentan estructuras que hacen que sean biodegradables y además son la parte más importante en todas las membranas biológicas.

Los lípidos se caracterizan como polares o no polares. Los lípidos que tienen mayor importancia en la presente invención son los lípidos polares, ya que tienen la capacidad de formar sistemas de partículas en agua. Otra forma de definir estos lípidos es como anfífilos, debido a su estructura química con una parte hidrófoba y una parte hidrófila en la molécula, siendo útiles de esta manera como substancias tensioactivas. Son ejemplos de grupos principales de lípidos polares monoglicéridos, ácidos grasos, fosfolípidos y glicoesfingolípidos. Estos grupos principales pueden caracterizarse adicionalmente dependiendo de la longitud de la cadena acilo y el grado de saturación de la cadena acilo. Como el número de átomos de carbono en la cadena acilo puede estar en el intervalo de 6 a 24 y el número de enlaces insaturados puede variar, hay un número casi infinito de combinaciones en relación con la composición química del lípido.

Los sistemas lipídicos particulados pueden dividirse adicionalmente en los diferentes grupos descritos en la bibliografía científica, tales como liposomas, emulsiones, cubosomas, cocleatos y micelas.

En varios sistemas, los lípidos pueden formarse espontáneamente, o pueden forzarse para formar sistemas estables. Sin embargo, en ciertas circunstancias, tienen que introducirse otras substancias tensioactivas para conseguir estabilidad. Tales sistemas tensioactivos pueden ser de carácter no lipídico, pero poseen las características de los lípidos polares que tienen partes hidrófobas e hidrófilas en su estructura molecular.

Otro factor que se ha demostrado que tiene importancia es que los lípidos presentan diferentes fases físico-químicas, habiéndose demostrado en diferentes sistemas de ensayo que estas fases potencian la captación de substancias biológicas después de la administración a las membranas mucosas.

En la inmunología clásica y en combinación con la vacunación contra diferentes tipos de agentes infecciosos, por ejemplo bacterias, virus o parásitos, el dogma prevalente ha sido administrar la vacuna por vía subcutánea o intramuscular. Sin embargo, la investigación ha demostrado durante los últimos años que el cuerpo tiene un sistema inmunológico muy eficaz que reside en la mucosa. Se ha demostrado que se pueden administrar vacunas por vía oral, nasal, rectal y vaginal. De la misma forma que para la inmunización clásica, se ha demostrado que en el caso de la vacunación en la mucosa también se necesita potenciar la respuesta inmunológica por medio de la adición de adyuvantes.

De la misma manera que dentro de la inmunología clásica en la que se administran vacunas (antígenos) por vía parenteral, dentro de la inmunización en la mucosa hay una gran interés en dirigir la respuesta inmunológica hacia el desarrollo de una respuesta humoral y/o celular. Si se obtiene una respuesta humoral, sería importante la dirigir la respuesta de tal forma que se obtuviera una cierta clase de anticuerpos. Para conseguir tal objetivo, pueden añadirse agentes estimuladores inmunes específicos a la formulación de antígenos y adyuvantes.

Se dispone de diferentes tipos de substancias estimuladoras inmunes. Un tipo se representa por proteínas, por ejemplo, fitohemaglutinina [PHA], concanavalina A (Con A), enterotoxina A de staphylococcus (SEA) o diferentes tipos de interferones o interleuquinas. Otro tipo de substancias se representa por MDP, como se ha mencionado anteriormente. Otros grupos pueden caracterizarse como derivados de lípidos, ya que muestran estructuras moleculares que son anfífilas. Un ejemplo de tal substancia se denomina monofosforil lípido (MPL). Otra substancias similar es la saponina Quil A. En el libro "Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach", como se ha descrito anteriormente, se describen varias substancias que pueden clasificarse dentro de estas categorías.

Sería extremadamente valioso poder realizar los procedimientos de inmunización de manera más eficaz dirigiendo la respuesta inmunológica hacia una cierta clase o subclase de anticuerpos y/o poder inducir una respuesta fuerte de células T contra los antígenos.

Descripción de la invención

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la administración parenteral o en la mucosa de una composición de vacuna que contiene el siguiente adyuvante con antígenos mezclados mejora la respuesta inmune contra los antígenos mezclados. Dicho adyuvante para administración parenteral o en la mucosa de antígenos y/o vacunas a un animal comprende

i) un monoglicérido que tiene una pureza de al menos un 80% p/p, teniendo el monoglicérido la fórmula

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}

H_{2} ---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}

H ---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}

H_{2}

en la que R se selecciona entre H y un grupo acilo que contiene de 6 a 24 átomos de carbono, con la condición de que dos de los grupos R sean H, y

ii) un ácido graso con 6 a 24 átomos de carbono, siendo la cadena acilo del ácido graso saturada o insaturada, y

iii) agua,

y donde la concentración de i) es de 0,1 g a 50 g por 100 ml de agua, y la concentración de ii) es de 1 g a 50 g por 100 ml de agua, y donde la administración del adyuvante a un ser humano o animal induce una respuesta inmune en el ser humano o animal a un antígeno administrado al ser humano o animal.

En una realización preferida el grupo acilo del monoglicérido puede contener de 8 a 20 átomos de carbono y, en una realización más preferida, el grupo acilo puede contener de 14 a 20 átomos de carbono. El grupo acilo también puede contener enlaces insaturados.

El grupo acilo normalmente se pone en la primera o tercera posición R, es decir, el primer o tercer grupo -C(=O)- del esqueleto de glicerol. Sin embargo, normalmente hay una migración de acilo entre la primera o tercera posición y la segunda posición, obteniéndose aproximadamente un 90% en la primera o tercera posición y aproximadamente un 10% en la segunda posición.

En la presente invención, se usa 1-monoglicérido destilado de Danisco Ingredients (Dinamarca) con una pureza mayor del 80%, preferiblemente mayor del 90% y más preferiblemente mayor del 95%. El contenido de diglicérido es de un 3% como máximo y el contenido de triglicéridos y de ácidos grasos es menor que el 1,0%. Los monoglicéridos de acuerdo con la invención normalmente contienen más de un 80% de un ácido graso específico, preferiblemente más de un 90%.

En una realización de la invención la cadena acilo del ácido graso puede contener de 8 a 20 átomos de carbono, y en otra realización la cadena acilo puede contener entre 14 y 20 átomos de carbono.

La composición de vacuna de acuerdo con la invención puede comprender excipientes farmacéuticos adicionales seleccionados entre uno o varios de los siguientes grupos: conservantes y agentes para controlar la presión osmótica, agentes de control del pH, disolventes orgánicos, agentes hidrófobos, inhibidores de enzimas, polímeros de absorción de agua, tensioactivos y promotores de la absorción, agentes antioxidantes y similares.

La composición de vacuna de acuerdo con la invención puede comprender cualquier antígeno seleccionado entre todos los antígenos relevantes para los seres humanos o animales, incluyendo animales marinos. Son ejemplos antígenos de bacterias patógenas y no patógenas, virus, parásitos y células tumorales.

Esta solicitud describe lípidos que, cuando se mezclan con antígenos, potencian la actividad inmune contra los antígenos funcionando de esta manera como un adyuvante en diversas formulaciones de vacuna. Especialmente, la invención comprende el uso de una formulación para la vacunación de la mucosa que puede activarse inmunológicamente por medio de la administración nasal, oral, vaginal o rectal. La invención también comprende el uso del sistema lipídico para administración parenteral. El uso de un adyuvante tal como el descrito en la presente invención, que puede usarse tanto para administración parenteral como para administración en la mucosa, no se limita a los seres humanos. Es igualmente importante el uso dentro del campo veterinario para la inmunización de, por ejemplo, vacas, cerdos y pollos. Además, hay un interés grande y creciente en la aplicación de vacunas tanto parenterales como mucosas en el campo de la cría de peces. En este área, la administración puede realizarse por medio de la incorporación de la formulación en el alimento. Además, puede dejarse que los peces naden durante un periodo de tiempo limitado en la formulación de vacuna que contiene los antígenos y los adyuvantes, inmunizándose de esta manera por la vía mucosa a través de las branquias.

En la bibliografía científica hay informes que muestran cómo potenciar la captación de una substancia biológicamente activa después de la administración en la mucosa junto con ciertos lípidos. Como ejemplo, Li & Mitra (Pharm.Res. vol 13:1, 1996) describen la administración de insulina mezclada con fosfolípidos en forma de liposomas en el pulmón. Demuestran que el efecto depende de la longitud de la cadena acilo y la carga de la partícula. La longitud óptima era de 10 átomos de carbono y la carga preferiblemente positiva. Eran eficaces incluso las partículas cargadas negativamente, pero los sistemas neutros eran inferiores.

De la misma forma, de Haan et al (Vaccine, 13:2, 155-62, 1995) describen una mezcla de liposomas y el antígeno hemaglutinina. La mezcla se administró por vía nasal a ratas, y posteriormente pudo detectarse una respuesta inmunológica positiva. Gupta et al (Vaccine, 14:23, 219-25, 1995) describen que una mezcla de toxoide diftérico junto con un sistema de liposomas no basado en fosfolípidos administrado por vía parenteral a conejos produce una respuesta inmune que estaba al mismo nivel que el producto comercializado que era toxoide diftérico adsorbido en alumbre.

Varios informes científicos también demuestran que se obtienen buenas respuestas inmunológicas después de la administración a la mucosa de liposomas en los que está incluido o adsorbido el antígeno.

Ciertos estudios in vitro realizados sobre una línea celular humana obtenida a partir de un cáncer de colon (Caco-2), demuestran que puede observarse el mejor efecto de penetración, ensayado con la substancia modelo manitol, con una longitud de cadena de 10 átomos de carbono. En este caso, los lípidos constaban de las sales de ácidos grasos. La mezcla obtenida de estos lípidos forma micelas con agua (Lindmark et al, J. Pharm. Exp. Ther. 275, 958-65, 1995).

Los liposomas constan de fosfolípidos y se formulan por un proceso relativamente largo y engorroso que, entre otras cosas, implica disolventes orgánicos. Además, los fosfolípidos son caros.

Como se describe más adelante en la presente invención, puede obtenerse una respuesta inmunológica similar mezclando sólo el antígeno con una formulación de lípidos que contiene lípidos menos complicados que tienen un precio substancialmente menor y que pueden formularse en una base comercial de una manera muy sencilla.

Otros sistemas que son similares en alguna medida a la presente invención son formulaciones basadas en triglicéridos. Sin embargo, estos sistemas se definen científicamente como emulsiones de triglicéridos en las que se usan tensioactivos para la estabilización. Como estabilizadores normalmente se usan fosfolípidos o cualquier otro tipo de molécula anfífila tal como Tween®. Además, el aspecto de tales emulsiones normalmente es blanquecino, indicando un tamaño de las gotitas de aceite de aproximadamente 1 \mum. Es bien conocido para la persona especialista en la técnica que estos tensioactivos son excelentes adyuvantes. De esta manera, las propiedades adyuvantes de las emulsiones de aceite se deben principalmente a las características del tensioactivo y no a las características de la composición de triglicéridos.

En el documento PCT/DK94/00062 se describe una formulación para la administración tópica de antígenos y/o vacunas a mamíferos a través de las membranas mucosas. Dicha solicitud describe en los ejemplos que la única formulación que mejora la respuesta inmune es una combinación de glicéridos de ácido caprílico/cáprico con monoéster de polioxietileno sorbitano (Tween 20®).

Como se ilustra en la presente invención, se demuestra que una combinación entre un monoglicérido y un ácido graso puede estimular al sistema inmune para que produzca anticuerpos e induzca inmunidad protectora. Además, la presente invención demuestra que la formulación descrita puede producir altas titulaciones de anticuerpo por administración parenteral.

De esta manera, fue sorprendente descubrir que la administración de antígenos y/o vacunas a un animal a través de la vía mucosa o por vía parenteral usando una formulación que comprende monoglicéridos y/o ácidos grasos como sistema lipídico particulado puede mejorar la respuesta inmunológica hacia los antígenos y/o vacunas administradas. Los monoglicéridos se seleccionan entre el grupo con la fórmula general de 1-acil-glicérido, donde el número de carbonos en la cadena acilo puede variar entre 6 y 24, preferiblemente entre 8 y 20. La cadena acilo puede ser saturada o insaturada. La concentración del monoglicérido puede estar en el intervalo de 0,1 a 50 g por 100 ml de agua, preferiblemente en el intervalo de 1 a 20 gramos por 100 ml de agua. La concentración de ácidos grasos puede estar en el intervalo de 0,1 - 50 gramos por 100 ml de formulación, preferiblemente en el intervalo de 1 a 20 g por 100 ml de agua. Cuando se formulan conjuntamente monoglicéridos y ácidos grasos, la relación en porcentaje del monoglicérido en el ácido graso puede variar entre un 1 y un 99%, preferiblemente entre un 10 y un 90%.

La invención también se refiere a una composición de vacuna que contiene, en 100 g de la composición final:

de 0,1 a 50 g de un monoglicérido i)

de 1 a 50 g de un ácido graso ii)

de 0,01 a 90 g del componente de antígeno

de 0,01 a 99 g de agua

de 0,01 a 99 g de PBS o solución salina

La composición de vacuna de acuerdo con la invención también puede comprender otros adyuvantes.

En ninguna parte de la técnica anterior se ha sugerido una potenciación de la respuesta inmunológica después de la administración de monoglicéridos y/o ácidos grasos junto con antígenos y/o vacunas.

La presente invención describe que mezclas de antígenos con lípidos relevantes estimulan al cuerpo para que genere inmunidad protectora. Otra ventaja de la presente invención es el sencillo proceso de formulación y, en comparación con la inclusión, en el proceso no se pierde nada de material (antígeno). Como ejemplo, puede mencionarse que en el proceso de inclusión en liposomas, la recuperación normalmente es del 10 al 20%. El resto se pierde en el proceso.

Ciertos informes bibliográficos como los descritos anteriormente demuestran que mezclando liposomas y antígeno, se detecta una respuesta inmune después de la administración en la mucosa.

Sin embargo, los ejemplos de esta invención descritos más adelante demuestran que el sistema puede simplificarse incluso por más por medio del uso de lípidos que son más estables, más baratos y que pueden formularse en partículas de una forma más conveniente y simplificada.

La invención se ejemplifica por los siguientes ejemplos que demuestran que el principio de co-administración de antígenos, la administración de substancias estimuladoras inmunes asociadas o en combinación con partículas, funciona como un adyuvante.

Ejemplo 1

Se produjo una suspensión de mono-oleína añadiendo 3 g de mono-oleína a 50 ml de una solución de Pluronic-127® al 0,6% en solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4, después de lo cual la mezcla se sonicó con un sonicador con sonda durante 4 minutos. La suspensión blanquecina obtenida contenía partículas con un tamaño máximo de aproximadamente 2 \mum, determinado por microscopía óptica.

Ejemplo 2

Se produjo una suspensión de micelas cargadas negativamente de mono-oleato mezclando 0,5 g de ácido oleico con 5 ml de NaOH 0,35 M y se sonicó con un sonicador con sonda durante 5 segundos. Posteriormente, se añadieron 3 g de mono-oleína y 50 ml de NaCl al 0,9%, después de lo cual la mezcla se sonicó con sonda durante 4 minutos. El contenido de monoéster del mono-oleato fue mayor del 95%, conteniendo la cadena acilo un 92% de oleato y un 6% de ácido linoleico. El pH se ajustó a 8,3. La solución homogénea completamente transparente obtenida contenía partículas con un tamaño inferior de aproximadamente 0,2 \mum, determinado por inspección visual. Se sabe que si se obtiene una solución transparente, el tamaño de las partículas está por debajo de aproximadamente 0,2 \mum, indicando un aspecto azulado ligeramente opalescente un tamaño de aproximadamente 0,2 - 0,5 \mum e indicando un aspecto blanquecino un tamaño superior a aproximadamente 0,8 \mum.

Ejemplo 3

Se produjo una suspensión de micelas cargadas positivamente de mono-oleína mezclando 0,5 g de lauril-amina y 3,5 ml de HCl 0,5 M seguido de sonicación durante 5 segundos. Posteriormente, se añadieron 3 g de mono-oleína y 50 ml de agua y después la mezcla se sonicó con sonda durante 4 minutos. El pH se ajustó a un valor comprendido entre 4 y 5 usando HCl 0,5 M. La solución homogénea completamente transparente obtenida contenía partículas con un tamaño inferior a aproximadamente 0,2 \mum.

Ejemplo 4

Una mezcla de partículas de acuerdo con el ejemplo 1 y toxoide diftérico se administró por vía subcutánea a ratones seguido de un refuerzo después de 21 días. Después de 30 días, se obtuvieron muestras de sangre que se ensayaron con respecto a los anticuerpos IgG contra la toxina diftérica así como con respecto a las titulaciones de neutralización (NT) usando células Vero. Se reunió el suero de los grupos de alumbre (n=5) y monooleína (n=5) y se analizó. Los ratones que recibieron un refuerzo nasal y respondieron (= 3 de 5) se ensayaron de manera individual. En la tabla 1 se muestran las titulaciones de IgG y las titulaciones de neutralización en unidades arbitrarias. Los resultados demostraron que tanto las titulaciones de IgG como las titulaciones de anticuerpo protector estaban al mismo nivel en comparación con el grupo de control que recibió el producto comercializado que comprendía toxoide diftérico adsorbido en alumbre (Al(PO_{4})_{3}). También se observa que las altas titulaciones de IgG siempre estaban acompañadas por altas titulaciones de neutralización, lo que indica que la formulación no destruye los sitios antigénicos que son importantes para la inmunidad protectora.

TABLA 1

1

Ejemplo 5

Se prepararon partículas de acuerdo con el ejemplo 2 con una concentración final de monoglicérido de 200 mM y de ácido graso de 200 mM. Se mezcló toxoide diftérico (2,9 \mul, 4,4 mg/ml) con 200 \mul de la suspensión de micelas y se administró por vía subcutánea a ratones seguido de un refuerzo subcutáneo después de 21 días. Tanto la dosis primaria como la dosis de refuerzo del toxoide fueron de 10 \mug. Después de 30 días, se obtuvieron muestras de sangre que se ensayaron con respecto a los anticuerpos IgG contra la toxina diftérica. El resultado demostró (tabla 2) que las titulaciones de IgG arbitrarias con respecto a la formulación con mono-oleína (MO) y ácido oleico (C18:1) estuvieron al mismo nivel en comparación con el grupo de control que recibió el producto comercializado actualmente que comprendía toxoide diftérico adsorbido en alumbre (Al(PO_{4})_{3}). Las otras combinaciones de monoglicéridos y ácidos grasos proporcionaron respuestas ligeramente decrecientes que se correlacionaban con la reducción de la longitud de la cadena acilo (M12 = lauril-1-glicerato; M10 = cáprico-1-glicerato; C12 = ácido láurico; C10 = ácido cáprico; C8 = ácido caprílico). N.D. = No realizado; indica que sólo había cinco ratones en estos grupos.

TABLA 2 Respuesta de IgG de ratones individuales (n = 5 ó 6) después de la administración sc/sc de diferentes formulaciones que contenían monoglicéridos y ácidos grasos

2

Ejemplo 6

Se repitió el mismo procedimiento que en el ejemplo 4, con la diferencia de que la dosis de refuerzo se administró por vía nasal en lugar de por vía subcutánea. La dosis de toxoide diftérico fue de 10 \mug tanto en la inmunización primaria como en la administración nasal de refuerzo. En el mismo experimento, se demostró que se obtenía una respuesta a la dosis cuando se administraron 3 cantidades diferentes de lípidos (véase la tabla 3). En la tabla 4 se observa la titulación arbitraria de IgG. Además del efecto de respuesta a la dosis en el que se ven menores titulaciones de IgG a menores concentraciones de lípidos, también se ve una mayor variabilidad con respecto a la respuesta en los grupos que reciben dosis menores. Esta variabilidad no se observa a mayores niveles de dosificación, lo que indica que no sólo se ve un efecto adyuvante con respecto a la obtención de altas titulaciones, sino también con respecto a la reducción de la variabilidad de la respuesta.

TABLA 3 Cantidad de lípidos en \mumol administrados a ratones por vía sc o nasal

3

TABLA 4 Titulaciones de IgG en ratones individuales (n=6) después de la administración de 2 x 10 \mug de toxoide diftérico a ratones por vía sc/sc o sc/nasal

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Ejemplo 7

Se ensayaron dos formulaciones de lípidos diferentes. Las composiciones se ven en la tabla 5.

TABLA 5

5

Las formulaciones se administraron a ratones por vía s.c. o por vía nasal con un refuerzo después de 3 semanas por vía s.c. o por vía nasal. Se tomaron muestras de sangre después de otra semana. En la tabla 6 se ven las titulaciones arbitrarias de IgG.

Los resultados de la tabla 6 demuestran que para conseguir una buena respuesta después de la administración primaria así como la administración de refuerzo por vía nasal, se prefieren las composiciones B.

TABLA 6

6

Ejemplo 8

Una mezcla de mono-oleína (200 mM) y ácido caprílico (200 mM) se mezcló con virus de la influenza inactivado con formalina (cepa SDA/94) y se administró por vía s.c. en la primera ocasión a ratones seguido de un refuerzo nasal tres semanas después. La dosis fue de 0,05 \mug de hemaglutinina (HA), se tomaron muestras de sangre tres semanas después de la dosis de refuerzo y se ensayaron con respecto a las titulaciones de aglutinación (HI) frente a HA. Los resultados (tabla 7) demostraron que las titulaciones de HI en el grupo que había recibido el virus junto con los adyuvantes estaban a un nivel mayor en comparación con el grupo que había recibido el virus en PBS.

TABLA 7 Titulaciones de HI en ratones que recibieron virus de la influenza inactivado con formalina después de la inyección primaria por vía s.c. y un refuerzo nasal

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Ejemplo 9

Se mezclaron micelas de acuerdo con el ejemplo 2 con partículas de rotavirus inactivadas con formalina y posteriormente se administraron a ratones hembra. Después de tres inmunizaciones, los ratones se preñaron y posteriormente los ratones recién nacidos se expusieron por vía nasal al rotavirus vivo. La cifras indican los animales que adquirieron protección después de la exposición en comparación con el número total de animales en ese grupo. Los resultados de esta exposición se ven en la tabla 8.

TABLA 8 Protección después de la exposición de rotavirus a ratones recién nacidos donde la madre se vacunó con una formulación de lípidos de acuerdo con la invención

8

Como puede verse por los resultados, hay una buena protección tanto después de tres administraciones intramusculares como después de una inmunización intramuscular primaria seguida de dos administraciones nasales.

Ejemplo 10

Para evaluar la toxicidad de las formulaciones de lípidos, éstas se administraron en la cavidad nasal de ratas, posteriormente las ratas se sacrificaron y la mucosa nasal se preparó para microscopía óptica, microscopia de fluorescencia y microscopia electrónica de barrido (SEM). Se ensayaron formulaciones de acuerdo con el ejemplo 1 y el ejemplo 2. Sólo la suspensión de mono-oleína/pluronic mostró cambios minoritarios en la superficie de la mucosa usando la SEM. No pudieron detectarse efectos con microscopia óptica ni con microscopía de fluorescencia. Las micelas que contenían mono-oleína y ácido oleico no pudieron provocar ningún cambio en las membranas mucosas.

Ejemplo 11

Las células Caco-2, que son una línea celular humana procedente de cáncer de colon, pueden hacerse crecer como una monocapa epitelial. Estas células frecuentemente se usan para examinar la capacidad de diferentes substancias de influir sobre el transporte de substancias biológicas a través de células epiteliales y en varios sistemas experimentales se ha demostrado que proporcionan una buena correlación con los datos in vivo con respecto a la captación desde el intestino a la corriente sanguínea. Como substancias marcadoras para el transporte a través de las células se usa Na-fluoresceína o manitol. Los experimentos realizados con las formulaciones de lípidos de acuerdo con esta invención mostraron un transporte aumentado a través de las células Caco-2 a concentraciones no tóxicas.

Claims

1. Un adyuvante para uso en una vacuna, conteniendo el adyuvante

i): un monoglicérido que tiene una pureza de al menos un 80% p/p, teniendo el monoglicérido la fórmula

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}

H_{2} ---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}

H ---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}

H_{2}

: en la que R se selecciona entre H y un grupo acilo que contiene de 6 a 24 átomos de carbono, con la condición de que dos de los grupos R sean H, y

ii): un ácido graso con 6 a 24 átomos de carbono, siendo la cadena acilo del ácido graso saturada o insaturada, y

iii): agua,

2. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1, donde la vacuna contiene un componente antigénico.

3. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1, donde la pureza del monoglicérido i) es de al menos un 90%.

4. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1, donde la pureza del monoglicérido i) es de al menos un 95%.

5. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el grupo acilo del monoglicérido i) contiene de 8 a 20 átomos de carbono.

6. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el grupo acilo del monoglicérido i) contiene de 14 a 20 átomos de carbono.

7. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el grupo acilo del ácido graso ii) contiene de 8 a 20 átomos de carbono.

8. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el grupo acilo del ácido graso ii) contiene de 14 a 20 átomos de carbono.

9. Una composición de vacuna que comprende un adyuvante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y una cantidad inmunogénica de un componente antigénico.

10. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, donde el componente antigénico es capaz de causar la formación de una respuesta inmune en animales incluyendo seres humanos y animales marinos.

11. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, donde el componente antigénico se selecciona entre el grupo compuesto por antígenos de bacterias patógenas y no patógenas, virus, parásitos y células tumorales.

12. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que contiene, en 100 g de la composición final:

de 0,1 a 50 g de un monoglicérido i)

de 1 a 50 g de un ácido graso ii)

de 0,01 a 90 g del componente de antígeno

de 0,01 a 99 g de agua y

de 0,01 a 99 g de PBS o solución salina.

13. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la composición comprende excipientes farmacéuticos adicionales seleccionados entre el grupo compuesto por conservantes, agentes para controlar la presión osmótica, agentes de control del pH, disolventes orgánicos, inhibidores enzimáticos, polímeros de absorción de agua, promotores de la absorción y agentes antioxidantes.

14. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde la composición comprende adyuvantes adicionales.

15. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, donde la composición está en una forma adecuada para administración parenteral o en la mucosa.

16. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, donde la composición está en una forma adecuada para administración en la mucosa de la nariz, boca, vagina, recto o intestino.

17. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, donde la composición está en una forma adecuada para administración en la mucosa de la nariz.

18. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-17, donde el componente antigénico se selecciona entre el grupo compuesto por toxoide diftérico, virus de la influenza y rotavirus.

19. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-18, donde la pureza del monoglicérido i) del adyuvante es de al menos un 90%.

20. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-19, donde la pureza del monoglicérido i) del adyuvante es de al menos un 95%.

21. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-20, donde el grupo acilo del monoglicérido i) del adyuvante contiene de 8 a 20 átomos carbono.

22. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-21, donde el grupo acilo del monoglicérido i) del adyuvante contiene de 14 a 20 átomos carbono.

23. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-22, donde el grupo acilo del ácido graso ii) del adyuvante contiene de 8 a 20 átomos de carbono.

24. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-23, donde el grupo acilo del ácido graso ii) del adyuvante contiene de 14 a 20 átomos de carbono.

25. Uso de un adyuvante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para la producción de una composición farmacéutica para potenciar una respuesta inmune contra un antígeno en un animal incluyendo un ser humano.

26. Uso de una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-24 para la producción de una composición farmacéutica para inmunizar a un ser humano o un animal.