ES2234152T3

ES2234152T3 - Vectores de antigenos en forma de vesiculas multilamelares.

Info

Publication number: ES2234152T3
Application number: ES98944010T
Authority: ES
Inventors: Patrick Mahy; Brigitte Delord; Joelle Amedee; Olivier Freund; Didier Roux; Rene Laversanne; Sophie Gaubert; Dominique Kaiserlian
Original assignee: Capsulis SA
Current assignee: Capsulis SA
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2018-09-17
Also published as: FR2769022B1; EP1024830A1; AU744308B2; DE69827837T2; CA2304824A1; EP1024830B1; FR2769022A1; JP2001518452A; DE69827837D1; AU9169798A; WO1999016468A1

Abstract

Vector de antígeno, caracterizado por estar constituido por una dispersión de vesículas multilamelares en el seno de las cuales dicho antígeno se encuentra al menos parcialmente encapsulado, estando constituidas dichas vesículas, desde su centro hasta su periferia, por una sucesión de bicapas concéntricas que contienen al menos un agente tensoactivo y que están separadas por un medio líquido.

Description

Vectores de antígenos en forma de vesículas multilamelares.

La presente invención se relaciona con vectores de antígenos en forma de vesículas multilamelares y con composiciones que contienen antígenos encapsulados en estas vesículas.

Más de 100 años después del descubrimiento de los agentes infecciosos por Louis Pasteur, la cuestión siguiente está siempre de actualidad: ¿cómo preparar al sistema inmunitario para ser duraderamente eficaz contra una infección en condiciones de seguridad total?. La apuesta de las investigaciones es no sólo poner a punto nuevas vacunas, sino también mejorar las ya existentes, reduciendo el número de inyecciones.

En nuestros días, la mayoría de las vacunas víricas son de virus vivos atenuados. Esta estrategia ha resultado menos fructuosa contra las bacterias, ya que se utiliza una sola vacuna bacteriana atenuada al día de la fecha: la BCG. La evolución de la atenuación de los microorganismos ha hecho enormes progresos gracias a las técnicas de Biología Molecular, que hacen posible modificar la función de virulencia de estos agentes patógenos. No obstante, es difícil conciliar la atenuación de esta virulencia y una estimulación eficaz de las defensas inmunitarias. Las vacunas llamadas moleculares, a base de antígenos purificados, exigen el concurso de adyuvantes a propósito de los cuales queda aún por desarrollar toda una investigación. A modo de ejemplo, la primera vacuna de este tipo fue puesta a punto contra la hepatitis B en 1987 a partir de una proteína de la envuelta vírica (antígeno HBs) producida por las células animales. Estas vacunas moleculares son aún poco numerosas, ya que los antígenos purificados son rápidamente eliminados por el organismo. Además, los antígenos purificados, inyectados solos, son poco eficaces y necesitan el empleo de substancias que favorezcan su reconocimiento por el sistema inmunitario y que ralenticen su degradación: los adyuvantes. Actualmente, el hidróxido de aluminio, Al(OH)_{3}, descubierto en 1926, es un adyuvante autorizado en el hombre. Se han descubierto nuevas substancias en el curso de los últimos años: derivados sintéticos de la pared de las micobacterias (dipéptido de muramilo y sus derivados).

Sin embargo, la demostración de la inocuidad de estos nuevos agentesnecesita una multitud de pruebas antes de que puedan ser utilizados en vacunas para uso humano. Finalmente, se plantea el problema del número de inyecciones, ya que, en ausencia de recuerdos, la memoria inmunitaria se vuelve entonces insuficiente.

La vacunación moderna, en particular la que utiliza proteínas recombinantes, se basa en la respuesta inmunitaria ligada a la administración de un antígeno por diferentes vías (intramuscular, oral). Sin embargo, ésta puede estar mal estimulada, ya sea por la biodisponibilidad insuficiente del antígeno (duración de vida demasiado corta, proteolisis y dilución en los fluidos biológicos), ya sea por la ausencia de una captura y de una presentación eficaz por las células presentadoras de antígenos (accesibilidad de las células dendríticas al sitio de inmunización, conformación del antígeno que no permite a la vez asociación a las moléculas de clase I y de clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad), ya sea por un reconocimiento imperfecto de los determinantes antigénicos por las células inmunitarias, incluso cuando la secuencia proteica es conocida de forma óptima (por ejemplo, las glicoproteínas asociadas al virus HIV o los marcadores tumorales).

Existe, pues, un gran interés en vectorizar estas moléculas con el fin de intentar paliar las limitaciones descritas anteriormente.

Clásicamente, la vacunación se dirige a una respuesta inmunitaria humoral. Este sistema protege al individuo vacunado de una exposición eventual al agente patógeno, previniendo de este modo la diseminación de una infección extracelular. Sin embargo, es ineficaz frente a una infección intracelular. La respuesta inmunitaria celular es, pues, el complemento indispensable para la eliminación de la célula infectada. Por consiguiente, una vacunación ideal debería favorecer los dos tipos de inmunidad, la celular y la humoral. La respuesta inmunitaria celular permite la eliminación de agentes patógenos intracelulares, tales como los virus, o la destrucción de las células cancerosas. En el momento actual, la obtención de una respuesta inmunitaria adecuada por administración de un antígeno se enfrenta aún a numerosas dificultades. Es por ello aún imposible obtener una vacunación contra los antígenos tumorales específicos (por ejemplo, cáncer de mama) o contra antígenos débilmente inmunogénicos (por ejemplo, glicoproteínas asociadas al VIH).

Existe, pues, una necesidad evidente de un método que permita vectorizar los antígenos con el fin de inducir una respuesta celular excluyendo eventuales choques anafilácticos o una proteolisis en el suero.

Una multitud de enfermedades podrían beneficiarse de la administración de proteínas o de péptidos antigénicos terapéuticos vectorizados. Esto permitiría reducir los efectos secundarios indeseables ligados a la cantidad demasiado grande de antígenos que se han de administrar con el fin de "suscitar" la respuesta inmunitaria (por ejemplo, vacunación anticancerosa).

Se ha propuesto en la literatura utilizar liposomas a la vez como vector de antígeno y como inmunoadyuvante para la obtención de vacunas. La solicitud internacional WO 95/22961 muestra una selección particular de los fosfolípidos que entran en la composición de tales liposomas, estando destinada esta selección a mejorar la respuesta inmunitaria, y ello tanto si los antígenos son simplemente utilizados en presencia de los liposomas como si están encapsulados en estos liposomas.

Los inventores de la presente invención han puesto a punto, para diferentes aplicaciones en campos totalmente diferentes de los de la presente invención, vesículas multilamelares que presentan una estructura llamada en "cebolla" y que están constituidas, desde su centro hasta su periferia, por una sucesión de capas lamelares separadas por un medio líquido. Estas vesículas pueden ser obtenidas por un procedimiento que consiste en la preparación de una fase lamelar cristal-líquido y su transformación por aplicación de un corte. Tal procedimiento está, en particular, descrito en la patente WO 93/19735, procedente de la patente francesa FR-2.689.418, o en WO 95/18601, aquí incorporadas como referencia.

Según la patente francesa FR-2.689.418, esta transformación puede hacerse por una etapa de corte homogéneo de la fase cristal-líquido, lo que conduce a vesículas también llamadas microcápsulas de tamaño controlado. Sin embargo, actuando sobre la formulación de la fase lamelar cristal-líquido, en particular sobre la naturaleza de los tensoactivos que entran a formar parte de su composición, la transformación de esta fase cristal-líquido en vesículas puede ser obtenida por simple solicitación mecánica, en particular por mezcla de los constituyentes.

Las investigaciones conducidas por los inventores les han llevado a descubrir que la utilización de las tecnologías antes descritas permitía poner a punto nuevos vectores multilamelares de pequeño tamaño, que presentan una gran eficacia de encapsulación y una gran facilidad de preparación y que pueden ser utilizados para vectorizar antígenos, con el resultado de aumentar la respuesta inmunitaria del organismo contra el antígeno encapsulado.

Tal vector presenta en muchos sentidos las ventajas buscadas para un adyuvante de vacunación.

Otra ventaja es que todas las moléculas que entran a formar parte de la preparación de las composiciones de la invención tienen disponibilidad comercial.

Otras ventajas están ligadas al procedimiento de preparación particularmente simple de las vesículas multilamelares útiles según la invención, que permite utilizar una gran variedad de tensoactivos.

Otra ventaja, también ligada al procedimiento de preparación, de las vesículas multilamelares útiles según la invención es que permite, como se deduce de la exposición que se dará a continuación, coencapsular varios antígenos en la misma vesícula, permitiendo así el acceso eventualmente a vacunas plurivalentes, o coencapsular con uno o varios antígenos aditivos que permitan funcionalizar las vesículas, permitiendo, por ejemplo, mejorar el abordaje de la composición o influir sobre la orientación (humoral o celular) de la respuesta inmunitaria.

Otra ventaja, también ligada esencialmente al procedimiento utilizado para preparar las vesículas con estructura en cebolla utilizadas según la invención, reside en el hecho de que se incorporan los principios activos y los aditivos previamente a la formación de las vesículas, lo que permite un excelente rendimiento de encapsulación y por ello una mayor eficacia y una economía muy importante para moléculas extremadamente costosas.

Además, otra ventaja también ligada al procedimiento utilizado para la preparación de las vesículas utilizadas según la invención es que se pueden incorporar indiferentemente principios activos o aditivos, ya sean hidrosolubles o liposolubles.

Más concretamente, la presente invención propone un nuevo medio de vectorización de antígenos con objeto de aumentar la respuesta inmunitaria del organismo contra este o estos antígenos. La presente invención contempla más concretamente un método para administrar un antígeno que permite mejorar significativamente la respuesta inmunitaria, tanto celular como humoral.

Así, según una de sus características esenciales, la invención se relaciona con un nuevo vector de antígeno, constituido por una dispersión de vesículas multilamelares en el seno de las cuales dicho antígeno se encuentra al menos parcialmente encapsulado, estando constituidas dichas vesículas por bicapas que tienen al menos un agente tensoactivo, siendo dichas bicapas concéntricas y confiriendo a dichas vesículas una estructura en cebolla.

Por antígeno, se entiende cualquier substancia que induce una respuesta del sistema inmunitario y/o la producción de anticuerpos. Una substancia antigénica incluye al menos un determinante antigénico o epitopo, compuesto por unidades moleculares reconocidas por anticuerpos específicos y/o por las células del sistema inmunitario.

Los antígenos utilizados según la invención son ventajosamente antígenos de tipo proteico. Podrá tratarse, en particular, de antígenos constituidos por proteínas naturales o recombinantes o por péptidos.

Se podrán utilizar también las vesículas de la invención como vectores de antígenos de tipo glicoproteínas o polisacáridos.

Las vesículas de la invención podrán contener un antígeno o una mezcla de antígenos. A modo de mezcla de antígenos, se citarán, en particular, las mezclas obtenidas por síntesis o por biotecnología, o por extracción a partir de los microorganismos en cuestión.

Por estructura en "cebolla", se entiende, como se ha expuesto anteriormente, una estructura multilamelar en la cual las vesículas de forma sensiblemente esférica están constituidas por una sucesión de bicapas concéntricas y ello desde el centro hasta la periferia, de donde viene el nombre de estructura en cebolla utilizado, por analogía, para calificar dichas estructuras.

Tales estructuras son ventajosamente obtenidas por incorporación de al menos un antígeno en una fase lamelar cristal-líquido que contiene al menos un agente tensoactivo y transformación después de esta fase cristal-líquido lamelar en una fase densa de vesículas multilamelares de pequeño tamaño.

Así, según otra característica esencial de la invención, ésta se relaciona con un procedimiento de preparación de una composición que contiene al menos un antígeno, según el cual se prepara una fase cristal-líquido lamelar que incorpora dicho antígeno y se provoca la reorganización de dicha fase cristal-líquido en vesículas multilamelares por aplicación de un corte.

Este corte podrá ser un corte homogéneo, lo que presenta la ventaja de conducir a vesículas de tamaño perfectamente homogéneo. Sin embargo, una simple agitación mecánica podrá revelarse como suficiente para dar lugar a la formación de las vesículas multilamelares de la invención.

Según otra característica más, la invención se relaciona con los productos susceptibles de ser obtenidos por este procedimiento.

Según la patente francesa FR-2.689.418, esta transformación puede hacerse por una etapa de corte homogéneo de la fase cristal-líquido, lo que conduce a vesículas o microcápsulas de tamaño controlado. Sin embargo, actuando sobre la formulación de la fase lamelar cristal-líquido, en particular sobre la naturaleza de los tensoactivos que entran a formar parte de su composición, se puede obtener la transformación de esta fase cristal-líquido en vesículas por simple solicitación mecánica, en particular por mezcla de los constituyentes.

La formulación hace intervenir ventajosamente a una mezcla de moléculas tensoactivas. Se utilizan generalmente dos tensoactivos diferentes que tienen equilibrios hidrófilo-lipófilo diferentes, lo que permite regular de forma continua las propiedades de las bicapas y controlar así la aparición de la inestabilidad que gobierna la formación de las vesículas multilamelares.

Parece que esta estructura sea responsable de los resultados particularmente ventajosos obtenidos y que las vesículas multilamelares de la invención permitan al antígeno llegar intacto hasta las células presentadoras del antígeno (CPA) y favorecer su captura por estas células. Parece, pues, que la función de las vesículas de la invención es vectorizar, proteger y mejorar la captura del antígeno por el sistema inmunitario.

Según una variante ventajosa, las vesículas que constituyen las composiciones de la presente invención tienen diámetros inferiores a 20 \mum, preferiblemente inferiores a 10 \mum, preferiblemente aún inferiores a 1 \mum, preferiblemente aún comprendidos entre 0,1 y 1 \mum.

Según una variante ventajosa, las membranas de las vesículas contenidas en las composiciones de la invención contienen al menos un agente tensoactivo seleccionado entre el grupo constituido por:

-: fosfolípidos hidrogenados o no hidrogenados;

-: ácidos grasos C_{6} a C_{18}, saturados o mono- o poliinsaturados, lineales o ramificados, en forma de ácido o de sal de un metal alcalino o alcalinotérreo o de una amina;

-: ésteres, etoxilados o no, de estos mismos ácidos grasos y de

\bullet: sacarosa,

\bullet: sorbitán,

\bullet: manitol,

\bullet: glicerol o poliglicerol o

\bullet: glicol;

-: mono-, di- o triglicéridos o mezclas de glicéridos de estos mismos ácidos grasos;

-: alcoholes grasos C_{6} a C_{18}, saturados o mono- o poliinsaturados, lineales o ramificados, etoxilados o no;

-: éteres, etoxilados o no, de estos mismos alcoholes grasos y de

\bullet: sacarosa,

\bullet: sorbitán,

\bullet: manitol,

\bullet: glicerol o poliglicerol o

\bullet: glicol;

-: aceites vegetales polietoxilados, hidrogenados o no hidrogenados;

-: polímeros secuenciados de polioxietileno y de polioxipropileno (poloxámeros);

-: hidroxiestearato de polietilenglicol, y

-: alcoholes con esqueleto de esterol, tales como el colesterol y el sitosterol.

Los tensoactivos seleccionados, en particular los tensoactivos antes citados, son ventajosamente seleccionados entre la categoría de los tensoactivos permitidos por la legislación para utilización farmacéutica en función de la vía de administración.

Se seleccionarán ventajosamente entre los tensoactivos anteriores dos tensoactivos que presenten propiedades relativamente diferentes, en particular un equilibrio hidrófilo-lipófilo ("HLB") diferente. El primer tensoactivo presentará ventajosamente un equilibrio hidrófilo-lipófilo comprendido entre 1 y 6, preferiblemente entre 1 y 4, mientras que el segundo tensoactivo tendrá un equilibrio hidrófilo-lipófilo comprendido entre 3 y 15, preferiblemente comprendido entre 5 y 15.

Como se ha visto anteriormente, se podrá obtener un mejor control del tamaño de las vesículas multicapa procediendo según la patente FR 2.689.418.

La preparación obtenida tras la transformación de la fase lamelar cristal-líquido en vesículas multilamelares puede ser luego diluida, en particular con un solvente acuoso, tal como, por ejemplo, una solución tampón, una solución salina o una solución fisiológica, para obtener así una suspensión acuosa de vesículas.

La técnica de encapsulación utilizada según la presente invención permite alcanzar fácilmente rendimientos de encapsulación muy elevados, incluso próximos al 100%. Sin embargo, tales rendimientos no son siempre indispensables en función de las aplicaciones contempladas.

Así, el rendimiento de encapsulación del (o de los) antígeno(s) en las composiciones de la invención es ventajosamente superior al 50%, preferiblemente superior al 80%.

Otra ventaja ligada a la técnica de encapsulación de la invención es que permite coencapsular varios antígenos en el seno de las mismas vesículas, pero también uno o varios antígenos con aditivos que permitan funcionalizar estas vesículas; esto permite, en particular, mejorar el abordaje. Se podrán, por ejemplo, coencapsular citokinas, que van a permitir influir sobre la orientación (humoral o celular) de la respuesta inmunitaria.

La invención proporciona un medio de vectorización de antígenos, en particular de antígenos de tipo proteico, pudiendo realizar esta vectorización in vivo tras inyección por vía intravenosa o intraperitoneal.

Según otra de sus características esenciales, la invención se relaciona con una composición que contiene al menos un antígeno contra el cual se desea producir anticuerpos específicos o una respuesta celular específica, donde dicho (dichos) antígeno(s) se encuentra(n) al menos perfectamente encapsulado(s) en las vesículas multilamelares de un vector tal como se ha definido anteriormente.

Las composiciones que contienen al menos un antígeno encapsulado en las vesículas multilamelares previamente descritas pueden ser tanto composiciones farmacéuticas destinadas a ser utilizadas como vacunas como composiciones destinadas a la producción de anticuerpos monoclonales.

Finalmente, según otra de sus características esenciales, la invención se relaciona con un procedimiento de preparación de las composiciones definidas anteriormente.

Este procedimiento comprende las etapas siguientes de:

-: preparación de una fase lamelar cristal-líquido que incluye al menos un agente tensoactivo y que incorpora el(los) antígeno(s);

-: transformación de la fase cristal-líquido en vesículas multilamelares con estructura en cebolla por corte, y

-: dispersión en una solución acuosa para obtener la concentración deseada de antígeno(s).

Más concretamente, según este procedimiento, se prepara en una primera etapa una fase cristal-líquido constituida por una mezcla de moléculas anfífilas y de una solución acuosa que contiene el (o los) antígeno(s). La fase acuosa puede contener, en particular, un tampón PBS o cualquier otra solución fisiológica. Se entiende que el modo operativo será adaptado para tener en cuenta la falta eventual de solubilidad de determinados antígenos. Se incorporarán entonces ventajosamente en la fase acuosa diferentes aditivos o cosolventes susceptibles de favorecer la solución del antígeno, tales como glicerol, polietilenglicol, propilenglicol o urea. El experto en la técnica seleccionará la naturaleza de los tensoactivos y sus proporciones para tener una transformación ulterior facilitada de la fase cristal-líquido en vesículas multilamelares con estructura en cebolla. Podrá seleccionar, sin que ello sea obligatorio, para estos tensoactivos al menos una molécula anfífila más bien hidrofóbica que presente un HLB preferiblemente inferior a 4 y otra molécula anfifílica más bien hidrofílica que presente un HLB preferiblemente superior a 5. Tal elección permitirá una más fácil transformación de la fase cristal-líquido.

En una segunda etapa, le mezcla homogénea constituida por la fase cristal-líquido formada es cortada según uno de los procedimientos antes descritos. Se aplicará ventajosamente un corte homogéneo para obtener un tamaño regular de las vesículas. Sin embargo, la utilización de dicho corte homogéneo no siempre se revela como necesaria y, a condición de actuar sobre la formulación de la fase cristal-líquido, una simple mezcla en un mezclador industrial puede permitir transformar la fase lamelar cristal-líquido en vesículas multilamelares según la invención.

En una tercera etapa, la mezcla constituida por las vesículas multilamelares según la invención es dispersada en un exceso de solución acuosa, por ejemplo de suero fisiológico, para llevar esta mezcla a la concentración de antígeno deseada.

La invención es ilustrada por los ejemplos que se dan a continuación, que muestran que es posible contemplar la utilización de las microvesículas multilamelares de tensoactivos para la vacunación humana y animal con las ventajas siguientes:

1): Es posible vectorizar uno o varios antígenos, por separado o conjuntamente, en vesículas multilamelares de pequeño tamaño.

2): Se puede contemplar, teniendo en cuenta el aumento de la respuesta inmunitaria, la utilización de una cantidad menor de antígeno. Esto puede ser importante cuando se pretende recurrir a antígenos recombinantes y/o costosos.

3): La amplificación de la respuesta inmune por la microencapsulación permite contemplar la utilización de moléculas débilmente inmunógenas que por sí solas no conducen a una respuesta inmunitaria suficiente.

4): La rapidez del desarrollo de la respuesta inmunitaria permite contemplar una disminución de los cambios entre la realización de los recuerdos sucesivos. En efecto, en el último recuerdo, sólo se presenta un 30% de las personas tratadas y, por lo tanto, un 70% de los individuos, aunque hayan sufrido una primera inyección, no están inmunizados eficazmente. Un retraso más breve entre los recuerdos debería asegurar una mejor vacunación de la población.

5): El aumento de la respuesta inmune celular es la garantía de una mejor vacunación.

6): El hecho de que el efecto de amplificación de la respuesta inmunitaria de un antígeno encapsulado sea aún más neto con la presencia de un adyuvante, tal como el QS21, permite contemplar (sin obligación) copulaciones tecnológicas.

En conclusión, los resultados demuestran un efecto amplificador de la respuesta inmunitaria que es muy general y puede ser potencialmente aplicado en numerosas vacunas humanas y animales o para la producción de composiciones que contienen antígenos.

Los ejemplos siguientes son dados a modo puramente ilustrativo y no limitativo de la invención.

El ejemplo 3 es ilustrado mediante las figuras 1 a 4, que dan, respectivamente:

- figura 1: los resultados concernientes a la producción de IgG séricas anti-HSA tras inmunización según el protocolo IP/IV, definido en el ejemplo 3, a D=19, D=35 y D=50 para cuatro tipos de tratamientos realizados con HSA encapsulada (1), HSA libre en PBS (2) y HSA libre en mezcla con vesículas vacías (3) y vesículas llenas
(4);

- figura 2: la respuesta isotípica anti-HSA tras inmunización según el protocolo IP/IV definido en el ejemplo 3, expresada por los títulos medios de isotipos IgG después de los cuatro tipos de tratamientos antes definidos (1, 2, 3 y 4);

- figura 3: los resultados concernientes a la producción de IgG séricas anti-HSA tras inmunización según el protocolo SC definido en el ejemplo 3 a D=19, D=35 y D=50 para tres tipos de tratamientos denominados respectivamente como 1 (con HSA encapsulada), 2 (con HSA libre en PBS) y 3 (con vesículas vacías);

- figura 4: la respuesta isotípica anti-HSA después de tres inmunizaciones según el protocolo SC definido en el ejemplo 3 en el caso de tres tratamientos denominados como 1, 2 y 3 con HSA encapsulada (1), HSA libre en PBS (2) y vesículas vacías (3).

Las figuras 5 y 6 son dadas en relación al ejemplo 4 y dan, respectivamente, los resultados de dosificación de las células linfocíticas B productoras de anticuerpos anti-NP de isotipos IgG con respecto a las células esplénicas totales tras aplicación de los dos protocolos de inmunización definidos en el ejemplo 4, consistentes, respectivamente, en una inmunización IP (figura 5) y tres inmunizaciones IP (figura 6).

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación y caracterización de una composición que contiene antígenos encapsulados

Se prepara una composición que contiene vesículas multilamelares y que presenta la composición siguiente, en la cual las proporciones están expresadas en porcentaje en peso:

fosfatidilcolina (PC90 de Natterman)	45,5
oleato de potasio	5
colesterol	5
sulfato de colesterol	2,5
laureth 4 (Lauropal 4 de Witco)	2
solución acuosa a 10 mg/ml de albúmina sérica humana (HSA)	40

procediendo como se expone a continuación.

Se mezclan previamente el oleato de potasio, el colesterol, el sulfato de colesterol y el laureth 4 con agitación magnética a 55ºC durante 1 h. Se añaden lentamente a la pasta obtenida, enfriada a temperatura ambiente, con agitación suave la solución acuosa de HSA (o de agua pura para las microvesículas vacías) y luego la fosfatidilcolina. Se introduce entonces la mezcla en una célula de corte constituida por dos cilindros coaxiales, uno de los cuales está fijo y el otro en rotación. Este tipo de dispositivo está descrito en la patente WO93/19735. Se mantiene un corte de alrededor de 10 s^{-1} durante 1 h. Se dispersa luego la muestra en agua estéril, a razón de 250 mg de pasta por 1 ml de agua.

Se efectúa una segunda dilución antes de la inyección, a razón de 0,5 ml de la solución anterior en 2 ml de agua estéril. Para las muestras que contienen un adyuvante, éste es previamente incorporado en el agua de dispersión a razón de 5 \mul de solución acuosa de adyuvante (a 20 \mug/\mul) en 1,995 ml de agua. Se obtiene, pues, en la solución inyectada una concentración de 20 \mug de antígeno por 100 \mul de volumen inyectable y, en caso de utilizar un adyuvante, su concentración final es de 4 \mug por 100 \mul.

La razón de encapsulación es estimada por dosificación tras la separación de las vesículas del sobrenadante y liberación después del antígeno. Se ultracentrifuga la dispersión de vesículas (40.000 rpm, 1 h). Se diluye la pella de vesículas 10 veces con una solución al 10% en sal de desoxicolato de sodio. Se somete la suspensión de vesículas destruidas por la sal de desoxicolato a un efecto vorticial intenso y se ultracentrifuga después (50.000 rpm, 60 minutos). Se realiza la dosificación del antígeno por espectrofotometría sobre la pella por la técnica de Bradford (Analytical Biochemistry, 1976, 72, p. 248) recurriendo a la dosificación del "ensayo de proteínas Bio-Rad" según el protocolo proporcionado (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.).

Los valores asociados a la pella y correspondientes a la cantidad de antígeno encapsulado (HSA) son del 80% \pm 5%.

El tamaño medio de las vesículas multilamelares que contienen la HSA es medido por la técnica de difusión dinámica de la luz. Se encuentra un tamaño de 0,218 \mum con una polidispersidad del 20%, lo que muestra que se tiene una muestra homogénea en cuanto al tamaño de las vesículas.

Ejemplo 2 Dosificación de la respuesta inmunitaria a) Protocolo de vacunación

Se determina la respuesta inmunitaria de un antígeno microencapsulado administrado in vivo recurriendo a un modelo murino.

Se puso en marcha un protocolo de vacunación acelerado con el fin de estudiar la capacidad de los vectores para inducir rápidamente una respuesta inmunitaria. Se realizaron tres inyecciones en veinte días y se efectuaron luego dosificaciones de las inmunoglobulinas totales (IgG, IgM) a las dos y a las cuatro semanas.

Se estudiaron cuatro formulaciones diferentes (indicadas como 1 a 4) que contenían las mismas cantidades de antígenos y dos formulaciones control (indicadas como 5 y 6):

1): el antígeno solo,

2): el antígeno asociado a un adyuvante conocido (QS21 de AQUILA, EE.UU.),

3): el antígeno encapsulado en las microvesículas multilamelares de tensoactivos según el ejemplo 1,

4): el antígeno encapsulado en las microvesículas multilamelares de tensoactivos según el ejemplo 1 asociadas a QS21,

5): las microvesículas multilamelares de tensoactivos análogas a las obtenidas según el ejemplo 1 pero vacías y

6): las microvesículas multilamelares de tensoactivos análogas a las obtenidas según el ejemplo 1 pero vacías y asociadas al adyuvante QS21.

Todas las formulaciones fueron preparadas de forma que un volumen de inyección de 100 \mul contuviera 20 \mug de antígeno (libre o encapsulado) y, cuando está presente, 4 \mug de adyuvante QS21 (véase lo anterior).

El modelo murino es el de los ratones BALB/c hembras de 8 semanas de edad, con un peso medio de 20 g. Transcurren 10 días entre la primera y la segunda inyección intraperitoneal. La tercera y última administración es intravenosa 10 días después. El protocolo se espacia, pues, a lo largo de 20 días en total. Se sigue el mismo protocolo para las seis formulaciones correspondientes a los seis grupos de cuatro ratones numerados de 1 a 6. Cada grupo fue tratado con la formulación del mismo número.

Se mantienen los animales en condiciones "normales", con alimentación ad libitum y normalmente hidratados.

Se efectúan dos recogidas de sangre (recogida retroorbitaria) a las 2 y 4 semanas después de la última inyección, con el fin de dosificar las inmunoglobulinas totales (IgG, IgM) en el suero tras la centrifugación de la sangre total heparinizada.

b) Resultado: dosificación de la respuesta total de anticuerpos

Se hace la dosificación de la respuesta total de anticuerpos titulando las inmunoglobulinas mediante una prueba ELISA (Saunders G.C., "Immunoassays in the clinical laboratory", Ed. Nakamura y col., 1979) con ayuda de inmunoglobulinas de conejo anti-inmunoglobulinas de ratón (Institut Pasteur, París), marcadas con peroxidasa. Se revelan las inmunoglobulinas fijadas por adición del substrato de la enzima.

La medida efectuada en esta prueba es clásicamente una medida de absorbancia a 405 nm, absorbiendo el producto de la reacción enzimática formado en la prueba ELISA la luz en esta longitud de onda. El método de análisis utilizado da resultados idénticos a la medida de la absorbancia a media altura de la saturación, pero con más precisión para los valores débiles y procede por un método que permite acceder a una dimensión proporcional a la cantidad de antígenos presente en el suero por parametraje de las curvas que dan la absorbancia en función de la dilución. En efecto, la ley de dilución puede ser modelada de la forma siguiente:

I(D) = I_{o} + \frac{I_{s}}{(1 + C_{o}D)}

donde:

: I(D) es la absorbancia medida a la dilución D,

: I_{o} es el ruido de fondo de la medida,

: I_{s} es la medida a la saturación (meseta) y

: C_{o} es proporcional a la concentración de anticuerpos buscada (C_{o} tiene la dimensión de una concentración).

I_{o} es medido directamente, I_{s} es obtenido a partir de un experimento cuya respuesta es suficiente para alcanzar la saturación. El valor obtenido es entonces utilizado en el parametraje de las otras medidas de la misma serie de experimentos, incluso si para estas últimas no se consigue jamás la saturación.

El parametraje de las curvas permite deducir C_{o} para cada experimento y, por lo tanto, un número proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el suero estudiado.

Este método es más fino que la simple medida de la dilución para obtener la hemimeseta, ya que permite obtener una medida, incluso en ausencia de saturación. Está, pues, particularmente adaptado a las respuestas débiles.

Los resultados a las dos semanas y a las cuatro semanas (después de finalizar el protocolo de vacunación) para el conjunto de las preparaciones son dados en la tabla 1 siguiente.

Los valores obtenidos por este método están indicados en la tabla 1 siguiente y son, pues, proporcionales a las tasas de inmunoglobulinas presentes en la sangre.

TABLA 1

Grupo de ratones y Nº de formulación	1	2	3	4	5	6
Respuesta a las 2 semanas	-	-	145	335	-	-
Respuesta a las 4 semanas	-	7	467	894	-	-

El signo "-" corresponde a una respuesta inferior a 2, juzgada como no significativa.

Se ve, pues, que, desde las 2 semanas, se obtiene una respuesta inmunitaria significativa para las formulaciones encapsuladas (con o sin adyuvante). Al final de las cuatro semanas, las fórmulas encapsuladas dan una respuesta muy importante, más de 50 veces superior a la respuesta del antígeno asociado al adyuvante y más de 100 veces superior cuando se añade el adyuvante QS21 al antígeno encapsulado.

Ejemplo 3 Influencia de la vía de inmunización

Se realizaron otros ensayos de inmunización con HSA en ratones BALB/c según 2 protocolos de inmunización denominados a continuación IP/IV y SC, que consisten en los tratamientos siguientes:

-: protocolo IP/IV: 2 inyecciones intraperitoneales (IP) seguidas de una inyección intravenosa (IV) y

-: protocolo SC: 3 inyecciones subcutáneas (SC).

Las formulaciones de las vesículas eran idénticas a las del ejemplo 1. En todos los casos, la dosis de HSA era de 20 \mug por inyección de 100 \mul. Todas las inyecciones fueron espaciadas en 10 días, es decir, una inyección a D=0, D=10 y D=20. Las recogidas (retroorbitarias) tuvieron lugar a D=19, es decir, un día antes de la última inyección, y a D=35 y D=50.

Se sometieron grupos de 4 ratones cada uno a los tratamientos siguientes:

-: Para el protocolo IP/IV:

\ding{51}: HSA sola disuelta en tampón PBS (control);

\ding{51}: HSA encapsulada en las vesículas según la invención, a razón de 20 \mug de proteína en 5 mg de vesículas dispersas en tampón PBS hasta un volumen total de 100 \mul;

\ding{51}: HSA disuelta en tampón PBS a la que se han añadido vesículas vacías (20 \mug de proteína y 5 mg de vesículas vacías dispersas hasta 100 \mul en tampón PBS), y

\ding{51}: vesículas vacías (5 mg de vesículas dispersas hasta 100 \mul en tampón PBS).

-: Para el protocolo SC:

\ding{51}: HSA sola disuelta en tampón PBS (control);

\ding{51}: HSA encapsulada en las vesículas según la invención a razón de 20 \mug de proteína en 5 mg de vesículas dispersas en tampón PBS hasta un volumen total de 100 \mul, y

Las dosificaciones de los anticuerpos fueron realizadas por ELISA sobre las inmunoglobulinas totales (IgGH+L) a D=19, D=35 y D=50 y sobre los isotipos IgG_{1}, IgG_{2a} e IgG_{2b} e IgG_{3} a D=50.

En las figuras 1 a 4 se dan los resultados, en las cuales aparecen los títulos medios (media de las dosificaciones de los sueros individuales). Se observa:

1): Una respuesta nula de anticuerpos cuando se utiliza la HSA libre no encapsulada, así como con las vesículas vacías.

2): Una producción importante de inmunoglobulinas totales, en las dos vías de administración, cuando la HSA está encapsulada, con un máximo a D=35.

3): Una fuerte amplificación de la respuesta de IgG total (H+L) con la HSA encapsulada administrada por vía subcutánea.

: Los resultados figuran en la siguiente tabla 2.

TABLA 2

	D=19	D=35	D=50
Protocolo IP/IV	700	1.700	1.600
Protocolo SC	10.000	35.000	40.000

4): Ningún efecto adyuvante de las vesículas vacías, ya que la HSA libre en presencia de las vesículas vacías no conlleva más que una respuesta muy débil.

5): Una producción dominante de IgG_{1}, la presencia de IgG_{2a} en los dos protocolos con títulos mucho más importantes en el caso de administraciones subcutáneas, así como la presencia de IgG_{2b}. No se ha podido observar ninguna producción de IgG_{3} sea cual sea el protocolo de administración.

Este ejemplo completa los resultados del ejemplo 2 y demuestra que la encapsulación de un antígeno en las vesículas multilamelares según la invención amplifica la respuesta inmunitaria para diferentes tipos de inyección. Además, indican que el efecto de las vesículas no es un efecto adyuvante, ya que la adición de las vesículas vacías al antígeno no encapsulado no aporta ninguna amplificación de respuesta.

Ejemplo 4 Ensayos con la proteína NP del sarampión

Los ensayos de inmunización con la proteína NP del sarampión (proteína interna del virus del sarampión) fueron realizados con dos protocolos de inmunización por inyección intraperitoneal (IP):

\ding{51}: una sola inyección (los resultados están representados en la figura 5) y

\ding{51}: tres inyecciones a intervalos de 7 días (en la figura 6 se dan los resultados), cada una con una dosis de proteína NP de 30 \mug, en ratones BALB/c hembras.

Las vesículas fueron preparadas según la formulación y el modo operativo del ejemplo 1, con una dosis de 30 \mug de proteína en 75 mg de vesículas dispersas en tampón PBS (inyecciones de 300 \mul tituladas a 30 \mug de proteína).

En el caso de las inyecciones que contenían vesículas vacías, éstas eran dosificadas a 75 mg de vesículas para un volumen final de 300 \mul (tampón PBS).

Para cada protocolo y cada dosis, se trataban grupos de 4 ratones por:

\ding{51}: NP disuelta en tampón PBS (I),

\ding{51}: NP encapsulada en las vesículas según la invención (II),

\ding{51}: NP disuelta en tampón PBS al que se habían añadido vesículas vacías (III) y

\ding{51}: NP en tampón PBS, emulsionada con adyuvante completo de FREUND. Se realiza la mezcla extemporáneamente justo antes de la inyección a razón de 1 volumen de solución tampón que contiene la proteína con 1 volumen de adyuvante CFA (SIGMA, St. Louis, EE.UU.) (IV).

Las dosificaciones fueron realizadas por ELISPOT sobre IgG 7 días después de la última inmunización. Esta dosificación consiste en enumerar las células linfocíticas B productoras de anticuerpos anti-NP de isotipos IgG con respecto a las células esplénicas totales. El resultado es, pues, expresado como una razón r del número de células productoras de los anticuerpos específicos con respecto al número total de células observadas.

1): Protocolo de 1 inmunización

\ding{51}: Mejora muy ligera de la respuesta por NP encapsulada (r = 500 x 10^{-7}) con respecto a NP sola (r = 400 x 10^{-7}).

\ding{51}: Ningún efecto de amplificación con las vesículas vacías asociadas a NP no encapsulada (r = 400 x 10^{-7}).

2): Protocolo de 3 inmunizaciones

\ding{51}: NP encapsulada muy netamente superior (r = 900 x 10^{-7}) a NP sola (r = 250 x 10^{-7}) y comparable a NP con adyuvante completo de FREUND (r = 900 x 10^{-7}).

\ding{51}: NP libre asociada a las vesículas vacías similar a NP sola (r = 300 x 10^{-7}).

Este ejemplo confirma completamente, en otro modelo, los resultados del ejemplo 3 e indica que los valores de amplificación de la respuesta obtenida por encapsulación en las vesículas multilamelares según la invención son comparables a los obtenidos con los adyuvantes más potentes (el adyuvante de FREUND es particularmente eficaz, pero, debido a su toxicidad, no está autorizado en formulaciones con fines vacunales o terapéuticos).

Claims

1. Vector de antígeno, caracterizado por estar constituido por una dispersión de vesículas multilamelares en el seno de las cuales dicho antígeno se encuentra al menos parcialmente encapsulado, estando constituidas dichas vesículas, desde su centro hasta su periferia, por una sucesión de bicapas concéntricas que contienen al menos un agente tensoactivo y que están separadas por un medio líquido.

2. Vector según la reivindicación 1, caracterizado por tener dichas vesículas un diámetro inferior a 20 \mum y de al menos 0,1 \mum.

3. Vector según la reivindicación 2, caracterizado por seleccionar dichos agentes tensoactivos que constituyen dichas bicapas entre el grupo constituido por:

-: fosfolípidos hidrogenados o no hidrogenados;

-: ésteres, etoxilados o no, de estos mismos ácidos grasos y de

\bullet: sacarosa,

\bullet: sorbitán,

\bullet: manitol,

\bullet: glicerol o poliglicerol o

\bullet: glicol;

-: éteres, etoxilados o no, de estos mismos alcoholes grasos y de

\bullet: sacarosa,

\bullet: sorbitán,

\bullet: manitol,

\bullet: glicerol o poliglicerol o

\bullet: glicol;

-: aceites vegetales polietoxilados, hidrogenados o no hidrogenados;

-: polímeros secuenciados de polioxietileno y de polioxipropileno;

-: hidroxiestearato de polietilenglicol, y

4. Vector según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por contener las bicapas de dichas vesículas al menos dos agentes tensoactivos, uno de los cuales presenta un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) comprendido entre 1 y 6, preferiblemente comprendido entre 1 y 4, y el otro un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) comprendido entre 3 y 15, preferiblemente comprendido entre 5 y 15.

5. Vector según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por ser el rendimiento de encapsulación superior al 50%, preferiblemente superior al 80%.

6. Vector según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por ser dicho antígeno un antígeno proteico o peptídico.

7. Vector según la reivindicación 6, caracterizado por estar constituido dicho antígeno proteico por una proteína natural o recombinante.

8. Composición que contiene al menos un antígeno contra el cual se desea producir anticuerpos específicos o una respuesta celular específica, caracterizada por encontrarse dicho(s) antígeno(s) al menos parcialmente encapsulado(s)
en las vesículas multilamelares de un vector tal como se ha definido según una de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Composición según la reivindicación 8, caracterizada por tratarse de una composición farmacéutica, en particular de una vacuna.

10. Composición según la reivindicación 8, caracterizada por tratarse de una composición destinada a la producción de anticuerpos monoclonales.

11. Procedimiento de preparación de una composición según una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado por consistir en las siguientes etapas:

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado por ser dicho corte un corte homogéneo.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado por utilizar al menos 2 tensoactivos, uno de los cuales presenta un HLB comprendido entre 1 y 6, preferiblemente entre 1 y 4, y el otro un HLB comprendido entre 3 y 15, preferiblemente entre 5 y 15.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado por ser dicho antígeno un antígeno proteico o peptídico.