ES2228007T3

ES2228007T3 - Procedimiento para determinar infecciones protesicas.

Info

Publication number: ES2228007T3
Application number: ES99904832T
Authority: ES
Inventors: Maria Cristina Thaller; Gianmaria Rossolini; Laura Selan; Claudio Passariello
Original assignee: Bracco SpA
Current assignee: Bracco SpA
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-02-01
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2019-02-01
Also published as: AU2520299A; DE69919512T2; IT1298539B1; CA2319575C; NO20003919L; EP1053474A1; DK1053474T3; IL137439A0; NO20003919D0; DE69919512D1; JP2002502978A; CA2319575A1; JP2010145416A; ITMI980197A1; US7807395B2; US20020197280A1; WO1999040440A1; NO325631B1; EP1053474B1; JP4934729B2

Abstract

Un procedimiento para la determinación de infecciones protésicas en las que participa al menos una cepa de Staphylococcus, que comprende la detección en muestras de sangre o muestras de otros fluidos biológicos de anticuerpos que reaccionan con un polisacárido obtenido a través de las siguientes etapas: a) cultivo de una cepa virulenta de Staphylococcus epidermidis o aureus productora de mucílago en un medio con una composición HHW durante un período de 4-6 días; b) homogeneización de las células bacterianas en un tampón fisiológico; c) centrifugación a 13.000 g durante 15 minutos y separación de los sobrenadantes; d) desalinización del sobrenadante por diálisis usando membranas con un valor discriminante de 12 kDa; e) congelación y liofilización de la solución obtenida en (d); f) suspensión del material liofilizado en una solución desproteinizante; g) centrifugación a 30.000 g de la solución obtenida en (f) y separación del sobrenadante con adición de etanol; h) centrifugación del sobrenadante de la etapa (g) a 20.000 g para obtener el polisacárido; i) lavado del polisacárido precipitado con etanol absoluto, deshidratación en vacío y suspensión en H2O estéril.

Description

Procedimiento para determinar infecciones protésicas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la existencia de infecciones protésicas en las cuales participa al menos una cepa de Staphylococcus. El procedimiento se basa en la detección de anticuerpos que reaccionan con un polisacárido del mucílago producido por cepas estafilocócicas virulentas, en muestras de sangre o de otros fluidos biológicos.

La invención también proporciona un proceso para la preparación de un polisacárido destinado a su uso en el procedimiento anterior, a partir de cultivos de cepas virulentas de estafilococos, así como el propio polisacárido obtenido por el citado proceso.

Las infecciones protésicas representan un grave problema en cirugía general, cirugía cardiovascular, ortopedia, oftalmología y odontología, todas ellas especialidades en las que se ha convertido en rutina la adición de biomateriales. Los dispositivos protésicos se utilizan también ampliamente en oncología para la nutrición artificial y la quimioterapia.

Los aspectos más importantes de las infecciones protésicas son los siguientes:

-: se describe una incidencia general del 2 al 6% de los casos, a partir de la primera adición del biomaterial;

-: cuando se reemplaza un material por uno nuevo, como consecuencia de una infección, la incidencia de reinfecciones es aproximadamente del 60%;

-: las infecciones pueden causar la pérdida funcional de órganos o de partes de los mismos o incluso la muerte del paciente en el 25 al 45% de los casos, aunque en algunos casos particulares, como sucede en la cirugía cardiaca, la mortalidad es muy superior, y en ciertos campos de la medicina, por ejemplo la odontología, no suelen producirse casos de muerte asociados a infecciones protésicas;

-: la hospitalización de los pacientes es a menudo muy prolongada y costosa;

-: el diagnóstico de estas infecciones resulta difícil por la casi completa ausencia de signos clínicos específicos;

-: la causa de la mayor parte de estas infecciones (más del 85%) son estafilococos coagulasa negativos (y en menor medida estafilococos coagulasa positivos), aunque en diversos casos se pueden aislar otros microorganismos, como enterobacterias, pseudomonas y enterococos (a menudo asociados por lo menos a una cepa estafilocócica).

A la vez que causan estas infecciones las bacterias están fuertemente adheridas a la superficie de los biomateriales, formando colonias que evolucionan con el paso del tiempo a biopelículas (biofilms) que pueden cubrir casi por completo la superficie del biomaterial, oponiéndose a la integración tisular.

Después de la adherencia las bacterias experimentan importantes modificaciones metabólicas, disminuyendo su tasa de multiplicación, aunque mantienen una elevada actividad biosintética. Los principales productos de esta actividad son polisacáridos extracelulares (generalmente denominados mucílago) que forman una gruesa capa fibrosa que protege a las células bacterianas contra los productos químicos, las radiaciones, los fagocitos y los anticuerpos.

Las bacterias incrustadas en el mucílago que crecen sobre biomateriales, cuando son expuestas a antibióticos, muestran concentraciones inhibidoras mínimas y bactericidas mínimas que pueden ser incluso cientos de veces más altas que los valores correspondientes obtenidos cuando las bacterias crecen en ausencia de biomaterial.

Cuando una biopelícula alcanza determinada masa crítica, libera en el medio líquido que la rodea pequeños agregados de células bacterianas que pueden desplazarse y colonizar nuevas superficies del biomaterial.

Las infecciones protésicas se caracterizan a menudo por signos clínicos escasos e inespecíficos, que con frecuencia se confunden con infecciones virales banales, y que desaparecen después del tratamiento antibiótico habitual para volver a manifestarse transcurrido cierto tiempo. Estos episodios generalmente se deben a la liberación de pequeños agregados bacterianos de la biopelícula, que mientras circulan por la sangre son fácilmente reconocidos por las defensas inmunitarias del huésped, causando fiebre y, dado que se encuentran en forma planctónica, mueren fácilmente por la acción de los antibióticos comunes, imitando así la erradicación de la infección. Los signos clínicos se hacen evidentes en las fases avanzadas de la infección, con la formación de grandes tumefacciones de partes blandas que rodean el injerto, fístulas, o signos evidentes de afectación general.

Debido a estas características peculiares, el diagnóstico precoz resulta extremadamente difícil, incluso como consecuencia de una elevada incidencia de falsos negativos de los cultivos microbiológicos, que obedece al hecho de que las bacterias sésiles no son capaces de adaptarse rápidamente a las condiciones de cultivo in vitro.

Hasta la fecha, el diagnóstico de las infecciones de injertos vasculares se ha basado en el análisis de parámetros clínicos objetivos, parámetros sanguíneos y en datos instrumentales obtenidos a través de ecografía, tomografía computarizada, resonancia magnética, esófago-gastro-duodenoscopia, y gammagrafía tras inyección de leucocitos marcados con radiotrazador. De esta forma, en la mayoría de los casos es imposible detectar las fases precoces de la infección, debido a la insuficiente sensibilidad o la falta de criterios bien definidos de interpretación de los datos y las
imágenes.

En conjunto, las posibilidades diagnósticas actuales son absolutamente inadecuadas, especialmente en las fases precoces de la enfermedad, en las que las condiciones para el éxito terapéutico son más favorables.

Karamanos N.K. y col., Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 342 Nº 2 (1997), págs. 389-395, describen un polisacárido del mucílago extracelular de Staphylococcus epidermidis de 20 kDa que es reconocido por anticuerpos y que muestra diferencias estadísticamente significativas entre S. epidermidis y otras especies de estafilococos en el grado de reactividad.

El documento GB 992132 describe compuestos de polisacáridos capaces de inmunizar contra infecciones por diferentes cepas de Staphylococcus aureus. El polisacárido se puede preparar calentando con ácido acético diluido el material sólido insoluble en fenol y en agua que resulta de la extracción de determinadas cepas de Staphylococcus aureus con fenol y un disolvente acuoso.

El documento WO 90/03398 describe un antígeno de adhesina de polisacárido capsular aislado del mucílago de cepas patógenas de S. epidermidis, y los anticuerpos desencadenados contra él se pueden usar en el diagnóstico para detectar con gran precisión la presencia de cepas de Staphylococcus epidermidis entre una población general de bacterias.

Ahora se ha descubierto, y ello constituye el objeto de la presente invención, un procedimiento fiable y barato, fácil de aplicar a muestras de suero u otros fluidos biológicos, capaz de revelar la presencia de infecciones que afectan a dispositivos protésicos incluso en las fases precoces de su desarrollo. Este procedimiento se puede realizar sistemáticamente para la vigilancia constante de pacientes que han sido tratados con la implantación de cualquier tipo de dispositivo protésico con riesgo de infección, especialmente causada por estafilococos.

Este procedimiento consiste en la determinación cuantitativa de la presencia de anticuerpos, dirigidos específicamente contra polisacáridos extracelulares, extraídos de cepas virulentas de estafilococos.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar y purificar estos polisacáridos extracelulares a partir de células estafilocócicas cultivadas adecuadamente.

Las cepas estafilocócicas que se pueden usar para este procedimiento son tanto coagulasa negativas como positivas, virulentas o capaces de alguna manera de producir mucílago. Se prefieren en particular cepas virulentas de Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus aureus.

Estas cepas se pueden obtener bien directamente de pacientes que sufren una infección protésicas o a partir de colecciones de cultivos estándar de cepas de referencia. Las características de una cepa típica de este tipo se describen en el siguiente Ejemplo 1. Los experimentos fueron también demostrativos cuando se realizaron utilizando la cepa de Staphylococcus aureus depositada por el solicitante de patente en DSMZ Nº 11942.

Las bacterias se cultivan en medio líquido descrito en Hussain y col., J. Med. Microbiol. 34: 143-147, 1991 (medio HHW), con algunas modificaciones que se describen en el Ejemplo 2 a continuación.

El procedimiento para preparar los polisacáridos según la invención implica esencialmente las siguientes etapas:

a): cultivar una cepa virulenta de Staphylococcus epidermidis o aureus productora de mucílago durante 4-6 días en medio HHW modificado;

b): homogeneizar las células bacterianas en un tampón fisiológico;

c): centrifugar a 13.000 g durante 15 minutos y separar el sobrenadante;

d): desalinizar por diálisis el sobrenadante empleando membranas con un valor discriminante de 12 kDa;

e): congelar y liofilizar la solución obtenida en (d);

f): suspender el material liofilizado en una solución desproteinizante, por ejemplo ácido tricloroacético;

g): centrifugar a 30.000 g la solución obtenida (f) y separar el sobrenadante con adición de etanol;

h): centrifugar el sobrenadante de la etapa (g) a 20.000 g para obtener el polisacárido;

i): lavar el polisacárido precipitado con etanol absoluto, deshidratándolo en vacío y suspendiéndolo en H_{2}O estéril.

La cuantificación del polisacárido purificado podría realizarse por ejemplo según el procedimiento descrito por Pelkonen y col., Journal of Bacteriology 170, 2646, 1988.

El polisacárido obtenido según el procedimiento arriba descrito se emplea en el análisis para la determinación de anticuerpos en el suero u otros fluidos biológicos en pacientes con un dispositivo protésico implantado.

Preferentemente el análisis determina la presencia anticuerpos de la clase IgG o IgM, según los procedimientos inmunoquímicos convencionales, como por ejemplo el análisis de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación en gel, inmunodifusión o contrainmunoelectroforesis, radioinmunoanálisis, fijación de complemento y hemaglutinación pasiva.

Se prefiere un procedimiento de fase sólida en el que el polisacárido esté inmovilizado sobre una superficie sólida, por ejemplo, pocillos de microtitulación, y después se permite que reaccione con la muestra en condiciones adecuadas para la formación del inmunocomplejo. Una vez que se forma el inmunocomplejo puede revelarse mediante la reacción con moléculas apropiadas, como por ejemplo anticuerpos o sus fragmentos inmunocompetentes, marcados con isótopos radiactivos, sustancias quimioluminiscentes o fluorógenas, o acoplado a enzimas que catalizan reacciones colorimétricas y otras sustancias similares.

La eficiencia del procedimiento desvelado por la invención fue confirmada por los siguientes experimentos.

En una primera serie de experimentos, se analizaron sueros de 15 pacientes con una infección de injerto vascular. La presencia de infección en la prótesis en estos pacientes se confirmó tanto mediante análisis microbiológicos de muestras tomadas de los tejidos periprotésicos como de los propios injertos después de su sustitución quirúrgica. Se aisló como mínimo una cepa estafilocócica en cada muestra.

De estos 15 pacientes 11 presentaban signos clínicos manifiestos de infección, mientras que cuatro solamente exhibían signos clínicos inespecíficos de infección, pero la gammagrafía era positiva tras la inyección de leucocitos marcados con ^{99m}Tc.

Como controles negativos se usaron sueros de 10 adultos sanos de ambos sexos.

La reactividad de los sueros fue analizada en un formato de ELISA, frente a:

a.: biopelículas monoespecíficas formadas por diferentes cepas estafilocócicas (tanto aislamientos clínicos como cepas de referencia) formadas sobre pequeños cilindros de polipropileno (0,5 x 1 mm);

b.: biopelículas poliespecíficas formadas por diferentes cepas estafilocócicas (tanto aislamientos clínicos como cepas de referencia) formadas sobre pequeños cilindros de polipropileno (0,5 x 1 mm);

c.: proteínas superficiales extraídas de cultivos de diferentes cepas estafilocócicas;

d.: los polisacáridos descritos en la presente invención, extraídos de cultivos de Staphylococcus aureus DSM 11942 y de Staphylococcus epidermidis SA 1545 (véase en el ejemplo 1 la caracterización de esta cepa).

Los experimentos arrojaron los siguientes resultados:

a.: Los títulos de anticuerpos IgG e IgM contra las biopelículas estafilocócicas monoespecíficas o poliespecíficas o las proteínas estafilocócica superficiales y secretorias no presentaban diferencias significativas entre los pacientes infectados y no infectados;

b.: Tanto los títulos de anticuerpos IgG como IgM contra el polisacárido estafilocócico de la invención fueron significativamente diferentes entre los pacientes infectados y los no infectados; además permitieron diferenciar entre los pacientes infectados manifiestamente sintomáticos y los pacientes oligosintomáticos con gammagrafía positiva.

TABLA 1

Intervalo, media y desviación estándar de los títulos de IgG e IgM en análisis de ELISA realizados en muestras de suero de 11 pacientes con infección sintomática de injerto vascular, cuatro pacientes con infección de injerto vascular oligosintomática pero con gammagrafía positiva tras la inyección de leucocitos marcados con ^{99m}Tc, y 10 controles sanos, usando el polisacárido extraído de cultivos de S. aureus DSM 11942 para sensibilizar los pocillos de microtitulación.

1

TABLA 2

Intervalo, media y desviación estándar de los títulos de IgG e IgM obtenidos en análisis por ELISA en muestras de suero de 11 pacientes con infección sintomática de injerto vascular, cuatro pacientes con infección de injerto vascular oligosintomática pero con gammagrafía positiva después de la inyección de leucocitos marcados con ^{99m}Tc, y 10 controles sanos, usando el polisacárido extraído de cultivos de S. epidermidis SA 1545 para sensibilizar los pocillos de microtitulación.

2

En un segundo conjunto de experimentos, se analizó un número mayor de sueros para determinar los títulos de IgG e IgM por ELISA empleando sólo el polisacárido de la invención para sensibilizar los pocillos de microtitulación. En todos estos experimentos se usó el polisacárido extraído de la cepa SA 1545 (descrito en el ejemplo 1).

En estos experimentos se analizó un total de 97 sueros. De estos 97 sueros, 19 habían sido obtenidos de pacientes de control no infectados y no portadores de un injerto vascular, 3 fueron obtenidos de pacientes de control no infectados pero con un injerto vascular implantado, 5 fueron obtenidos de pacientes portadores de un injerto vascular infectado por bacterias gramnegativas, 13 fueron obtenidos de pacientes no infectados pero portadores de un injerto vascular y con antecedente de infección de injerto vascular causada por Staphylococcus spp., y 57 fueron obtenidos de pacientes portadores de un injerto vascular infectado por Staphylococcus spp.

En todos estos sueros se determinaron los títulos de IgG e IgM usando diluciones del suero a 1/160 y 1/320; se realizaron dos series de determinaciones duplicadas con el fin de evaluar la reproducibilidad del análisis intra-experimento e inter-experimento. Los análisis de ELISA se realizaron como se describe en el ejemplo 4.

En la tabla 3 se resumen los resultados obtenidos en este conjunto de experimentos.

TABLA 3

Resultados de los análisis de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) realizados usando el preparado de polisacárido de S. epidermidis SA 1545 sobre 97 muestras del suero.

Los títulos de IgM de cada muestra del suero usados para la valoración estadística fueron valores medios de cuatro determinaciones diferentes obtenidas en dos experimentos diferentes. Los títulos de IgG de cada muestra del suero usados para la valoración estadística fueron valores medios de dos determinaciones diferentes obtenidas en un experimento.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

4

Resultados de la prueba de la T de Student para comparación de títulos de IgM medidos a una dilución aproximada del suero de 1:160:

A(A1 +A2) frente a D: p = 1,7 x 10^{-15}.

B frente a D: p = 2,0 x 10^{-4}.

C frente a D: p = 7,2 x 10^{-8}.

A+B+C frente a D: p = 5,3 x 10^{-23}

A+C frente a B: p = 0,142.

A frente a C. p = 2,07 x 10^{-11}.

Resultados de la prueba de la T de Student para comparación de títulos de IgM medidos a una dilución aproximada del suero de 1:320:

A(A1+A2) frente a D: p= 4,5 x 10^{-21}.

B frente a D: p = 7,5 x 10^{-8}.

C frente a D: p = 8,0 x 10^{-7}.

A+B+C frente a D: p = 3,1 x 10^{-21}.

A+C frente a B: p = 0,265.

A frente a C: p = 0,024.

Comentarios

\bullet: Los títulos de anticuerpo detectables contra el polisacárido del mucílago (SP; slime polysaccharide) de S. epidermidis SA 1545 mostraron diferencias significativas en los grupos de sujetos diferentes, en función de su historia clínica.

\bullet: Se encontraron títulos de anticuerpos significativamente más elevados contra el SA 1545-SP en pacientes portadores de injertos vasculares infectados por Staphylococcus spp., en comparación con: i) sujetos de control sin antecedentes de este tipo de infección, portadores de injerto vascular o no; ii) pacientes portadores de un injerto vascular infectado por bacterias gramnegativas; iii) sujetos portadores de un injerto vascular no infectado, pero que comunicaban un antecedente de infección de injerto vascular por Staphylococcus spp. Estos datos indican globalmente que la infección de injerto vascular causada por Staphylococcus spp. desencadena una respuesta humoral específica contra el SP, y que esta respuesta puede ser detectada en inmunoanálisis enzimáticos que emplean una fase sólida sensibilizada con la preparación de SA 1545 SP, como se describe en la solicitud de patente.

\bullet: El análisis de la respuesta isotípica anti-SA 1545 SP en los grupos anteriores de sujetos mostró diferencias significativas tanto en los títulos de anticuerpos IgM como IgG. Los títulos de IgM eran los que mostraban una relación más estrecha con el estado de infección activa causada por Staphylococcus spp.

La existencia de una diferencia estadísticamente significativa entre los títulos de los pacientes infectados y no infectados permite establecer un valor discriminante por encima del cual resulta posible definir una alta probabilidad de la existencia de un proceso infeccioso. Además, es posible usar este procedimiento para vigilar al paciente después de la implantación del injerto, empleando como valor de referencia específico para el seguimiento el título de anticuerpo determinado en el momento de la implantación.

Parece claro que el procedimiento descrito más arriba posee varias ventajas, en comparación con los procedimientos diagnósticos convencionales en este campo, puesto que resulta fácil de realizar, es barato, y permite obtener resultados fiables (sin necesidad de procedimientos invasivos) incluso en las fases tempranas de la infección, cuando es frecuente que todos los restantes procedimientos disponibles fracasen en proporcionar informaciones diagnósticas claras; además este procedimiento permite la monitorización periódica de la existencia de infecciones latentes en los pacientes y podría proporcionar informaciones fiables sobre los resultados terapéuticos.

Finalmente, la invención proporciona un kit para realizar el análisis, que incluye el preparado de polisacárido, anticuerpos y reactivos estándar para la detección, en recipientes adecuados, junto con los vehículos, excipientes y aditivos como conservantes y estabilizantes.

Preferentemente, el kit contendrá tiras de microtitulación pre-sensibilizadas con el antígeno junto con sueros de control positivos y negativos (con sus títulos originales).

Los siguientes ejemplos tratan de clarificar más la invención.

Ejemplo 1 Caracterización de una cepa bacteriana adecuada para el ensayo

Se aisló una cepa de Staphylococcus epidermidis, indicada como SA 1545 - que produjo el código numérico 6704773 cuando fue sometida a identificación en el sistema de identificación API 20 STAPH -, procedente de un injerto aorto-bifemoral extraído de un varón adulto.

El aislamiento mostraba un evidente dimorfismo de las colonias al ser cultivado en placas de agar de Columbia suplementadas con sangre desfibrinada de oveja al 5%. Fue negativo para la fermentación de manitol en cultivo sobre agar con sal de manitol, con colonias de 1 mm de diámetro o menos a las 18 horas de incubación a 37ºC.

El aislamiento fue sensible a los siguientes antibióticos, determinados con el análisis de Kirby Bauer: Gentamicina, Vancomicina, Ofloxacino, Eritromicina, Imipenem, Cefalotina, Amoxicilina + ácido clavulánico, cefoperazona.

El patrón bioquímico del aislamiento fue el siguiente:

Fermentación	Glucosa	+
Fermentación	Fructosa	+
Fermentación	Maltosa	+
Fermentación	Lactosa	+
Fermentación	Trehalosa	-
Fermentación	Manitol	-
Fermentación	Xilitol	-
Fermentación	Melibiosa	-
Fermentación	Rafinosa	-
Fermentación	Xilosa	-
Fermentación	Sacarosa	+
Producción	Nitratos	-
Producción	Fosfatasa alcalina	-
Producción	Acetoína	-
Producción	N-acetil-glucosaminidasa	-
Producción	Arginina hidrolasa	+
Producción	Ureasa	+

En muchos otros casos se han aislado cepas de características similares y adecuadas para su uso en el análisis de la invención.

Ejemplo 2 Preparación del medio de cultivo

El medio de cultivo contiene los siguientes compuestos por 1 litro.

Na_{2}HPO_{4}(2H_{2}O)	10 g
KH_{2}PO_{4}	3 g
Ácido L-aspártico	150 mg
L-alanina	100 mg
L-arginina	100 mg
L-cistina	50 mg
Glicina	100 mg
Ácido L-glutámico	150 mg
L-histidina	100 mg
L-isoleucina	150 mg
L-lisina	100 mg
L-leucina	150 mg

(Continuación)

L-metionina	100 mg
L-fenilalanina	100 mg
L-prolina	150 mg
L-serina	100 mg
L-treonina	150 mg
L-triptófano	100 mg
L-tirosina	100 mg
L-valina	150 mg
Glucosa	10 g
MgSO_{4}(7H_{2}O)	500 mg
Biotina	0,1 mg
Ácido nicotínico	2 mg
Ácido D-pantoténico	2 mg
Piridoxal	4 mg
Piridoxamina	4 mg
Riboflavina	2 mg
Tiamina	2 mg
Adenina	20 mg
Guanina	20 mg
CaCl_{2} (6H_{2}O)	10 mg
MnSO_{4}	5 mg
(NH_{4})_{2}SO_{4}FeSO_{4}(6(H_{2}O)	6 mg

La formulación del medio corresponde a la descrita por Hussain, Hastings, White, J. Med. Microbiol. 34: 143-147,1991 con las siguientes modificaciones, referentes a la preparación: después de pesar todos los componentes del medio, se disuelve MgSO_{4}(7H_{2}O) en agua destilada, y después se introducen de uno en uno todos los restantes componentes, bajo agitación continua. Es necesario disolver la L-cistina en 2 ó 3 gotas de NaOH 5N antes de introducirla en el medio.

Una vez disueltos todos los componentes (aunque puede persistir una pequeña cantidad de precipitado) se ajusta al volumen a 1l con agua destilada, y se esteriliza mediante la filtración a través de membranas porosas de 0,2 \mum.

Ejemplo 3 Preparación del polisacárido

Las cepas se cultivan durante 6 días a 37ºC en 1000 ml de medio HHW modificado con agitación.

El sedimento bacteriano se recoge por centrifugación a 13.000 g durante 15 minutos a 4ºC, se suspende en 20 ml de suero salino fisiológico estéril helado (NaCl al 0,9%) y se congela a -20ºC durante dos horas. La suspensión bacteriana se descongela después a temperatura ambiente homogeneizándola 10 veces durante 30 segundos con intervalos de 30 segundos.

El homogeneizado se centrifuga después a 13.000 g durante 15 minutos a 4ºC, y el sobrenadante resultante se almacena a 4ºC, mientras que el sedimento resultante se vuelve a suspender en 20 ml de suero salino helado estéril homogeneizándolo como se ha descrito. El sobrenadante resultante de la segunda etapa de homogeneización se añade al obtenido previamente, desalinizándolo por diálisis contra 1000 volúmenes de agua destilada a 4ºC durante dos horas, empleando membranas de diálisis con un valor discriminante de 12 kDa. Después se congela la muestra a -80ºC, se liofiliza, se suspende en ácido tricloroacético al 5% (peso por volumen) y se incuba durante 15 minutos a 4ºC.

A continuación se centrifuga la muestra a 30.000 g durante 30 minutos a 4ºC; y después se añaden al sobrenadante 4 volúmenes de etanol absoluto helado, y se continúa incubando a 4ºC durante 48 horas. El grueso del polisacárido se recupera entonces por centrifugación a 20.000 g durante 30 minutos a 4ºC, se lava con 0,5 volúmenes de etanol absoluto helado, se deshidrata al vacío y finalmente se suspende en 2 ml de agua destilada estéril. El polisacárido obtenido como se ha descrito se usa para sensibilizar pocillos de microtitulación después de una dilución adecuada (típicamente en alícuotas de 50 \mul).

Ejemplo 4 Ejecución del análisis de ELISA

Los pocillos de una placa de microtitulación se sensibilizan con 50 \mul del polisacárido preparado según el ejemplo 3 y diluido al 1/80 en agua destilada estéril, sellándolos adecuadamente e incubándolos durante 18-24 horas a 4ºC. Después de la incubación se vacían los pocillos y se lavan cinco veces con 100 \mul de Tween 20 al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Después se vacían los pocillos, se saturan con 200 \mul de leche de soja al 10% en PBS, se sellan adecuadamente y se incuban a 37ºC durante una hora. A continuación se vacían los pocillos, se lavan como se ha descrito anteriormente, y se introducen alícuotas de 50 \mul de los sueros diluidos. Los sueros, incluyendo un control positivo y un control negativo, se suelen diluir a 1/160 y 1/320 en PBS. Tras la adición de los sueros, los pocillos se sellan adecuadamente y se incuban a 37ºC durante una hora. A continuación, los pocillos se vacían y se lavan como se ha descrito más arriba, y se añaden 50 \mul o bien de una "IgG anti-humana de conejo conjugada con peroxidasa" (por ejemplo DAKO cod. P0214) (diluida a 1/15.000 el leche de soja al 10% en PBS) o ``IgM anti-humana de conejo conjugada con peroxidasa (por ejemplo DAKO cod. P0215) (diluida al 1/1500 en leche de soja al 10% en PBS). Después se sellan adecuadamente los pocillos, se incuban a 37ºC durante una hora, se vacían y se lavan como se ha descrito anteriormente.

Tras el último lavado se adicionan a cada pocillo 50 \mul de sustrato cromogénico de peroxidasa (por ejemplo BM Blue POD Substrate Boehringer Mannheim, cod 1484281).

A continuación se incuban los pocillos durante 10 minutos a 37ºC y la reacción se detiene después adicionando 50 micro litros de H_{2}SO_{4} 0,5N. La DO_{450 nm} (absorbancia) de cada pocillo se evalúa después utilizando un lector de placas de microtitulación usando como blanco un pocillo sin tratar que contiene 100 \mul de H_{2}SO_{4} 0,5 N.

Como regla general, las DO_{450nm} del control positivo no deben superar el valor de 1,5.

Si esto sucediera, debería repetirse el análisis disminuyendo el tiempo de incubación del sustrato de peroxidasa.

Claims

1. Un procedimiento para la determinación de infecciones protésicas en las que participa al menos una cepa de Staphylococcus, que comprende la detección en muestras de sangre o muestras de otros fluidos biológicos de anticuerpos que reaccionan con un polisacárido obtenido a través de las siguientes etapas:

a): cultivo de una cepa virulenta de Staphylococcus epidermidis o aureus productora de mucílago en un medio con una composición HHW durante un período de 4-6 días;

b): homogeneización de las células bacterianas en un tampón fisiológico;

c): centrifugación a 13.000 g durante 15 minutos y separación de los sobrenadantes;

d): desalinización del sobrenadante por diálisis usando membranas con un valor discriminante de 12 kDa;

e): congelación y liofilización de la solución obtenida en (d);

f): suspensión del material liofilizado en una solución desproteinizante;

g): centrifugación a 30.000 g de la solución obtenida en (f) y separación del sobrenadante con adición de etanol;

h): centrifugación del sobrenadante de la etapa (g) a 20.000 g para obtener el polisacárido;

i): lavado del polisacárido precipitado con etanol absoluto, deshidratación en vacío y suspensión en H_{2}O estéril.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que los anticuerpos son IgG o IgM.

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-2, que está en forma de ELISA, inmunoprecipitación en gel, inmunodifusión, contrainmunoelectroforesis, análisis radioinmunológico, fijación de complemento.

4. Un procedimiento para preparar un polisacárido a partir de cultivos de cepas virulentas de Staphylococcus epidermidis o aureus productoras de mucílago que comprende:

a): cultivo de una cepa virulenta de Staphylococcus epidermidis o aureus productora de mucílago en medio HHW modificado durante un período de 4-6 días;

d): desalinización por diálisis del sobrenadante usando membranas con un valor discriminante de 12 kDa;

e): congelación y liofilización de la solución obtenida en (d);

f): suspensión del material liofilizado en una solución desproteinizante;