ES2228042T3 - Sistema de suministro de vacuna basada en vesiculosomas gonococales. - Google Patents

Abstract

Una vacuna para suministrar a un individuo inmunidad frente a una enfermedad, de modo que dicha vacuna comprende vesiculosomas aislados de Neisseria gonorrhoeae, en la que un polipéptido inmunógeno específico para dicha enfermedad se expresa en la superficie de dichos vesiculosomas, y en la que dicho polipéptido inmunógeno es heterólogo y está presente en dosis farmacológicamente efectiva en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

Sistema de suministro de vacuna basada en vesiculosomas gonococales.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención suministra composiciones que comprenden vesiculosomas que expresan un polipéptido inmunógeno específico para una enfermedad, procedimientos para fabricar los mismos, procedimientos para detectar anticuerpos específicos para dichos polipéptidos inmunógernos, y procedimientos para inmunizar a un animal usando dichos vesiculosomas.

Exposición de los antecedentes

La inmunización es una característica principal para mejorar la salud de lactantes y niños pequeños. A pesar de la disponibilidad de una variedad de vacunas eficaces frente a la mayoría de las infecciones frecuentes de la infancia, las enfermedades infecciosas siguen siendo una causa importante de muerte en niños. Los problemas significativos inherentes a las vacunas existentes incluyen la necesidad de inmunizaciones repetidas y la falta de eficacia de los sistemas actuales de administración de vacunas para un amplio espectro de enfermedades.

El número de enfoques eficaces del desarrollo de vacunas es casi tan amplio como el número de agentes infecciosos. A medida que ha progresado la tecnología, ha sido posible definir a nivel molecular la naturaleza del inmunógeno protector. En los últimos años las vacunas acelulares se han convertido en el procedimiento de elección para el desarrollo de vacunas, porque se pueden administrar con subunidades de una variedad de patógenos (es decir, vacunas multicomponentes) y tienen la posibilidad de tener un menor número de reacciones adversas. Las vacunas subunitarias están compuestas de antígenos protectores purificados definidos procedentes de microorganismos patógenos.

Tal vez el mejor ejemplo de éxito con las vacunas subunitarias es la vacuna actual que previene las enfermedades producidas por H. influenzae. Una vacuna conjugada compuesta por el polisacárido capsular polirribosilribitolfosfato (PRP) de H. influenzae conjugado con un complejo proteico de la membrana externa (CPME) de N. meningitidis ha resultado ser segura y efectiva en la generación de respuestas inmunológicas o protectoras en lactantes incluso de dos meses. El acoplamiento covalente de PRP al CPME da lugar a un conjugado que media de manera efectiva el cebado de los portadores y que además suministra un antígeno particulado insoluble que contiene lipooligosacáridos (LOS) que tienen actividad adyuvante. Se acepta de manera generalizada que esta vacuna es segura y eficaz en la reducción de la morbilidad y de la mortalidad que se asocia a las enfermedades producidas por H. influenzae (Stover, C.K. y col., Nature 351: 456-460, 1991; Husson, R.N. y col., J. Bacteriol. 172: 519-524, 1990; Jacobs, WR, y col., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 155: 153-160, 1990; Jacobs, W.R., y cols., Nature 327: 532-535, 1987).

Aunque ha habido algunos éxitos sorprendentes, actualmente se usa un pequeño número de vacunas subunitarias. Tal vez la razón más desalentadora que dificulta el uso de las vacunas subunitarias es el problema de la administración de los antígenos. Para una administración óptima del antígeno, el antígeno se debe administrar a las células presentadoras de antígeno en su contexto biológico, o el antígeno se debe reconocer y captar pronto por los fagocitos. La mayoría de los antígenos posee estructuras tridimensionales que son importantes para las interacciones célula huésped-parásito, y muchas de estas estructuras se pierden durante la purificación de los antígenos.

Un enfoque que se adopta para evitar la mayor parte de los problemas que se asocian a la producción de vacunas subunitarias es el desarrollo de vehículos vivos para las vacuna recombinantes, basados en virus y bacterias atenuados que se han modificado mediante ingeniería genética para que expresen antígenos protectores in vivo (es decir, formas recombinantes de virus de la vacuna, adenovirus, Salmonella y Mycobacterium tuberculosis typhus bovinum var. Bacilo de Calmette-Guerin o BCG) (Snapper, S.B. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6987-6991, 1998; Jackett, P. S. et al., J. Clin. Micro. 26: 2313-2318, 1988; Lamb, J.R. y col., Rev. Infect. Dis. 11: S443-S447, 1989; Shinnick, T.M. y col., Infect. Immun. 56: 446-451, 1988).

Las vacunas vivas presentan ventajas en el sentido de que el antígeno se expresa en el contexto de una forma inmunógena de manera innata; el sistema de administración vivo hace que se replique y persista en el huésped, volviendo a estimular el sistema inmunológico del huésped y evitando la necesidad de múltiples dosis; los sistemas de vectores vivos eliminan la necesidad de purificar el antígeno y su producción es menos costosa; y los vectores vivos se pueden diseñar para que administren múltiples antígenos, reduciendo el número de veces que se debe vacunar a un individuo.

Los investigadores que desarrollan Escherichia coli y Salmonella como vacuna en vehículos vivos han desarrollado vectores de exportación usando flagelos, fimbrias u otras proteínas principales de la membrana externa (OmpA y OmpB) como portadores para exportar los epítopes protectores a la superficie del vehículo de la vacuna bacteriana (Stover, C.K. y col., Infect. Immun. 58: 1360-1475, 1990; Thole, J.E.R. y col., Infect. Immun. 55: 1466-1475, 1988). Sin embargo, el enfoque de injertar epítopes en estas superficies es limitado, porque sólo se pueden insertar epítopes pequeños, y los epítopes se presentan en el contexto de una proteína extraña que puede limitar su capacidad de asumir su conformación nativa.

A fin de desarrollar vacunas frente a patógenos que han sido recalcitrantes al desarrollo de vacunas, y/o para superar los inconvenientes de las vacunas disponibles comercialmente debido a su infrautilización, se deben desarrollar nuevos procedimientos de presentación de antígenos que permitan realizar menos inmunizaciones, y/o que tengan menos efectos adversos a la vacuna. En esta solicitud se describe un nuevo sistema de administración de vacunas que se basa en Neisseria gonorrhoeae como huésped, una bacteria que de manera natural evierte su membrana externa en vesículas inmunógenas que se aislan con facilidad.

N. gonorrhoeae es un patógeno humano de las superficies mucosas. N. gonorrhoeae es una bacteria gram-negativa que tiene una membrana externa ondulante que aparece como una estructura bicapa (revisado en: The Gonococcus, P.B. Roberts (Ed.), Wiley, Nueva York). El cromosoma del gonococo contiene aproximadamente 2,1 x 10^{6} pares de nucleótidos. Durante la fase logarítmica, el gonococo forma vesículas de pared celular que se reproducen mediante gemación de la membrana externa (Schorr, J.B. y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press Vaccines 91: 387-392, 1991). Estas vesículas son esféricas y están rodeadas por una estructura tipo membrana bicapa similar a una membrana. Las vesículas procedentes de Neisseria tienen una estructura tridimensional liposómica y suministran una estimulación inmunológica (actividades adyuvantes) frente a antígenos acoplados covalentemente a ellas (Brandt, M.E. y col. Infect. Immun. 58: 983-991, 1989). Los perfiles proteicos de las vesículas gonocócicas son muy similares a los de las proteínas que se ven en la membrana externa del gonococo (Melchers, F. y col., J. Exp. Med. 142: 473-482, 1975). Las vesículas gonocócicas contienen en su superficie las proteínas I (Pistor, S. y G. Hobom, Wochenschr. 66: 110, 1988), II (Bakker, D. y col., Microb. Path. 8: 343-352, 1990) y H8 (Charbit, A. y col., EMBO 5(11): 3029-3037, 1986). Además, contienen el lipooligosacárido (LOS) gonocócico.

Se ha trabajado mucho para caracterizar los antígenos de la superficie celular del gonococo, y muchos de los genes que codifican los antígenos proteicos se han clonado, y se han determinado sus secuencias de ADN (Vodkin, M.H. y Williams, J.C., J. Bact. 170: 1227-1334, 1988; Young, D.L. y col., Infect. Immun. 54(1): 177-183, 1986; Young, D.R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 4267-4270, 1998; Newton, S.M. y col., Science 244: 70-244, 1989). Los estudios sobre la biosíntesis y la genética subyacente a la biosíntesis de cada uno de los componentes del LOS están suficientemente avanzados como para permitir la construcción con éxito de cepas con una estructura definida de LOS y una superficie celular estable. Se ha descrito que se pueden producir con facilidad mutantes de Neisseria que son deficitarias en LOS y en otras proteínas de la superficie celular. Además, es fácil aislar las vesículas gonocócicas, y ya existen vectores para las manipulaciones genéticas de Neisseria.

Los vesiculosomas tienen ventajas respecto a los liposomas como portadores de antígenos. Los liposomas se hacen de manera artificial y las proteínas de interés quedan atrapadas en su interior o se conjugan químicamente con su superficie. Los vesiculosomas de la presente invención no precisan ningún tratamiento especial, y las proteínas son plegadas de manera natural por enzimas nativos y se pueden modificar mediante ingeniería genética para su expresión en el interior o en el exterior de la vesícula.

La presente invención suministra un sistema de administración de vacunas que comprende N. gonorrhoeae modificado mediante ingeniería genética, en el que dicha bacteria expresa y dirige cualquier antígeno diana heterólogo hacia su membrana externa. La membrana externa con la proteína antigénica se muda de manera natural en las vesículas gonocócicas durante el crecimiento celular. Es fácil aislar el complejo antígeno diana-vesícula de membrana o vesiculosoma resultante, y representaría una partícula no viva pero parecida a una célula inmunógena que se puede usar para desencadenar una respuesta inmunológica protectora.

Las cepas que producen vesículas de forma libre o que producen hipervesiculación permiten obtener la producción necesaria de grandes cantidades de vesiculosomas para su uso en la vacuna. A fin de producir comercialmente una vacuna basada en vesículas gonocócicas, debe ser posible producir grandes cantidades de vesiculosomas. Aunque todas las cepas gonocócicas producen vesículas, el rendimiento tiende a ser bajo, y prohibitivo para su uso como sistema de administración de vacunas. Una cepa que produce hipervesiculación da el elevado rendimiento necesario de vesículas para la producción económica de la vacuna. Todavía no se ha descrito en la bibliografía esa cepa que produce grandes cantidades de vesículas. Por lo tanto, hay necesidad de obtener una cepa de N. gonorrhoeae que pueda producir hipervesiculación, a fin de producir económicamente cantidades de vesiculosomas que contienen los antígenos diana en cantidades suficientes para su uso como sistema de administración de vacunas.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a una mutante de la cepa WR302 de N. gonorrhoeae que es defectuosa en un parámetro desconocido de crecimiento. Este defecto hace que el gonococo crezca anormalmente y que mude su membrana externa a una frecuencia muy elevada o que produzca hipervesiculación. Esta cepa produce muchas más vesículas de membrana externa que otras cepas, y las vesículas se visualizan fácilmente mediante microscopia electrónica.

La presente solicitud también describe la producción de otras cepas de N. gonorrhoeae con el fenotipo de hipervesiculación usando una técnica de transformación puntual no selectiva. Esta técnica permite la fácil identificación de las transformantes de N. gonorrhoeae en ausencia de presión selectiva. Esta técnica comprende las etapas de mezclar un número limitante de células con una cantidad excesiva de ADN, sembrar mediante salpicado la mezcla en la superficie de una placa de agar, incubar la mezcla y volver a sembrar y seleccionar las células transformadas. Las células que producen hipervesiculación tienen alteraciones de la expresión del lipooligosacárido (LOS). Las células transformadas se pueden identificar fenotípicamente basándose en su adquisición de una nueva reactividad a
anticuerpos monoclonales y en la difusión de las vesículas lejos de la colonia.

Usando la técnica de transformación puntual que se describe anteriormente en cepas de N. gonorrhoeae con diferentes mutaciones y/o que ya poseen genes para diferentes antígenos, se pueden producir cepas de N. gonorrhoeae que producen hipervesiculación y que expresan antígenos para diferentes enfermedades. Los vesiculosomas que se recogen de estas cepas que producen hipervesiculación se pueden usar para producir una vacuna para la inmunización frente a estas enfermedades. Las vacunas que se producen de esta manera tienen una ventaja sobre las vacunas que contienen toda la célula, porque los antígenos están presentes en ausencia de otros componentes celulares. Además, los antígenos se ensamblan en la membrana biológica natural, lo que permite que el antígeno forme una conformación nativa, simulando mejor lo que se encuentra en el organismo natural.

Estos vesiculosomas se pueden usar en ensayos diagnósticos en los que se puede detectar la presencia de anticuerpos frente a la enfermedad en muestras de un paciente que se sospecha que tiene la enfermedad.

Los vesiculosomas también se pueden usar como sistema de administración de otras moléculas elaboradas biológicamente, como fármacos quimioterápicos para su uso en quimioterapia, o potenciadores/supresores inmunológicos.

Además, los vesiculosomas se pueden usar para acelerar la purificación de las proteínas de la membrana del gonococo (ya sean naturales o modificadas mediante ingeniería genética). Los vesiculosomas están significativamente enriquecidos en proteínas de la membrana externa del gonococo, porque están ausentes la mayoría de los componentes citoplásmicos de las células. Por lo tanto, el aislamiento de los vesiculosomas representa una purificación significativa de esas proteínas de membrana gonocócicas. De manera similar, los vesiculosomas se pueden enriquecer con proteínas que se han modificado mediante ingeniería genética para ser expresadas en el vesiculosoma, por ejemplo una proteína receptora, y ofrecerían una mejora significativa para ayudar a producir y purificar esas proteínas.

Por lo tanto, la presente solicitud describe una cepa de N. gonorrhoeae con hipervesiculación que produce grandes cantidades de vesículas útiles para la producción de vesiculosomas que contienen antígenos específicos para su uso como vehículo para la administración de vacunas o como agente diagnóstico.

La presente solicitud describe un procedimiento para la producción de cepas de N. gonorrhoeae que producen hipervesiculación.

La presente solicitud describe un procedimiento para la producción de grandes cantidades de una proteína deseada en forma purificada, de modo que dicho procedimiento comprende la introducción del gen deseado en una cepa de N. gonorrhoeae, de manera que la proteína se expresa en vesiculosomas, y aislando dichos vesiculosomas.

Es otro objeto de la presente invención suministrar un sistema de administración de vacunas que comprenda los vesiculosomas que expresan un antígeno específico para dicha enfermedad y que suministrarían inmunidad frente a dicha enfermedad.

Dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se comprenderán mejor en lo referente a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 muestra una inmunotransferencia de N. gonorrhoeae que produce hipervesiculación.

La Figura 2 muestra mapas de restricción parciales y la representación de las deleciones que se construyen para los clones del sistema R/M S. NgoI, II, IV, V y VII. Las flechas muestran los marcos abiertos de lectura predichos para la metiltransferasa (M) y para la endonucleasa de restricción (R). Los recuadros negros representan las regiones eliminadas de cada clon. Las abreviaturas de los puntos de restricción son: B, BglI; C, ClaI; D, DraI; E, EcoRI; H, HindIII; Hp, HpaI; N, NcoIII; P, PstI; R, RsaI; S, SalI; Sm, SmaI; Sp, SphI; Ss, SspI; St, StyI; Su, Sau3AI; U, secuencia de captación del gonococo; y X, XhoI.

La Figura 3 ilustra la técnica de transformación puntual.

La Figura 4 representa una autorradiografía mediante transferencia Southern que confirma la incorporación de las deleciones de R/M en el cromosoma. El primer carril de cada conjunto es el ADN de FA 19 y el segundo carril el de JUG029. Conjunto 1, deleción NgoI (estudiada con el fragmento PstI-XhoI de pLJPC30); Conjunto 2, deleción NgoII (estudiada con pLV155); Conjunto 3, deleción NgoIV (estudiada con pCBB49.0); Conjunto 4, deleción NgoV (estudiada con pJM5); y Conjunto 5, deleción NgoVII (estudiada con pF,63). Los ADN se digirieron con: Conjunto 1, DraI; Conjunto 2, Sau3AI; Conjunto 3, SspI; Conjunto 4, RsaI; y Conjunto 5, EcoRI + HindIII.

La Figura 5 muestra un ensayo para la ausencia de actividad MTasa de S. NgoI, II, IV, V y VII en la cepa JUG029. El primer carril de cada conjunto es ADN aislado de FA 19 y el segundo carril de JUG029. Cada conjunto se digirió con su isoesquizómero (o un enzima con una secuencia de reconocimiento que se solapa): Conjunto 1, HaelI (NgoI); Conjunto 2, HaelII (NgoII); Conjunto 3, NgoMI (NgoIV); Conjunto 4, BamHI (NgoV); y Conjunto 5, Fnu4HI (NgoVII). La calle M es el marcador HindIII lambda.

La Figura 6 muestra los cebadores de PCR que se usan para amplificar los genes p6 y pspA. La Figura 6A muestra los cebadores que se usan para amplificar el gen p6. La Figura 6B muestra los cebadores que se usan para amplificar el gen pspA.

La Figura 7 muestra los mapas de plásmidos de pLEE20 que contienen los insertos p6 y pspA. La Figura 7A muestra pLEE20-p6, que tiene aproximadamente 6,6 kb. El gen p6 tiene su propia secuencia lipoproteica y se traduce a partir de su propio ATG. Erm = Eritromicina^{R}. La Figura 7B muestra pLEE20-pspA. pspA también se traduce a partir de su propio ATG.

La Figura 8 es un gel de SDS-PAGE teñido con Azul de Coomasie. Los números A8, #18 y #19 son clones de pLEE20-p6.

La Figura 9 es una transferencia Western del gel de SDS-PAGE de la Figura 8.

Descripción Cepas que producen hipervesiculación

La presente invención puede usar N. gonorrhoeae que produce hipervesiculación como vacuna. "Hipervesiculación", como se usa en esta invención, significa que la cepa mutante produce vesículas en mayor cantidad que la cepa parental de la que se ha obtenido. En general, las mutantes que producen hipervesiculación producen más del 10% de vesículas más que sus cepas parentales, preferentemente más del 20%, más preferentemente más del 30%.

Las cepas de N. gonorrhoeae que producen hipervesiculación se pueden preparar y seleccionar como se describe en los Ejemplos que se presentan a continuación. Por ejemplo, se pueden usar dos enfoques para construir una cepa que produce hipervesiculación. El enfoque más preciso sería identificar la base genética de esta mutación, y clonar el gen.

El segundo enfoque es el procedimiento de transformación puntual no selectivo que se describe en los Ejemplos que se presentan a continuación. De manera breve, los ADN cromosómicos que se aislan a partir de la cepa que produce hipervesiculación se usan para transformar una cepa de tipo natural. El fenotipo de hipervesiculación se identifica fácilmente porque las cepas que producen hipervesiculación reaccionan con los anticuerpos monoclonales 2-1-L8 y 1B2 específicos de LOS en transferencias por absorción de colonias, por ejemplo. El anticuerpo monoclonal 2-1-L8 se puede obtener del Dr. Wender Zollinger, Walter Reed Army Institute for Research, Washington DC. El anticuerpo 1B2 se puede obtener de la American Type Culture Collection como número de Acceso ATCC 2199.

Las N. gonorrhoeae que producen hipervesiculación se ponen de manifiesto por una cepa novedosa denominada WR302^{++}, que es un derivado de la cepa que no produce hipervesiculación WR302. WR302 se puede obtener del Dr. Daniel Stein. WR302^{++} se depositó bajo los supuestos del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD el 16 de octubre de 1996, con el número de acceso ATCC 55857.

Los vesiculosomas se pueden aislar con facilidad a partir de células que no tienen fimbrias. Por ejemplo, se pueden recuperar los vesiculosomas mediante centrifugación diferencial y filtración. De manera alternativa, se puede usar centrifugación de alta velocidad. Véase una referencia general sobre el aislamiento de vesículas en Buchanan y Arko, J. Infect. Dis. 135: 879-887, 1977.

Los vesiculosomas se pueden almacenar a 4ºC antes de su uso, o se pueden fijar, si la fijación no interfiere significativamente con la utilidad última del vesiculosoma en cuanto sistema de producción de proteínas, reactivo diagnóstico o sistema para la administración de vacunas. De manera alternativa, las colonias de N. gonorrhoeae que producen vesiculosomas con el antígeno deseado se pueden usar en sí mismas en ensayos mientras se cultivan sobre agar. Además, las bacterias se pueden liofilizar y almacenar para su uso después de la reconstitución.

Procedimientos para producir proteínas usando vesiculosomas

En una forma de realización, la presente solicitud describe un procedimiento para la producción de grandes cantidades de proteínas. El gen de la proteína deseada se puede introducir en Neisseria usando vectores capaces de replicarse en el gonococo y capaces de ser introducidos en el gonococo mediante transformación o conjugación.

La proteína se puede expresar en la superficie o en el interior del vesiculosoma, dependiendo de la presencia o ausencia de una secuencia funcional de señales, que se clona cerca de la proteína deseada. Las secuencias de señales adecuadas para la expresión de la proteína deseada en la superficie del vesiculosoma incluyen la secuencia de señales de la lipoproteína H8, la secuencia de exportación PIII y la secuencia de importación piliA.

Los vesiculosomas que expresan las proteínas deseadas se pueden recoger según los procedimientos que se han mencionado más arriba y se pueden usar directamente o se pueden acompañar de otros agentes de elección. Preferentemente las proteínas se pueden recoger mediante precipitación inmunológica usando anticuerpos monoclonales específicos frente a la proteína de interés.

Las proteínas adecuadas para la expresión incluyen citocinas como las interleucinas 1-12, y proteínas de membrana externa como OspA, P6 o PspA. Se pueden expresar simultáneamente varios antígenos o proteínas diferentes en el mismo gonococo, si se desea.

Vectores para la manipulación genética de Neisseria

Los ejemplos de vectores que se podrían usar según esta invención incluyen, aunque no están limitados a ellos, pLES2 (Stein y col., Gene 25: 241-247, 1983) y pLEE10 (Sandlin y col., Infect. Immun. 61: 3360-3368, 1993).

Los procedimientos para introducir dichos vectores y para analizar las transformantes son conocidos y se encuentran dentro del conocimiento de una persona con conocimientos normales en la materia.

Sistema de administración de vacunas basado en vesiculosomas

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a los vesiculosomas como sistema para la administración de vacunas en seres humanos y en animales, de modo que los animales incluyen animales veterinarios, ganado y animales de compañía. La cepa ideal usada para la presente invención debería poseer ciertas características, algunas las cuales incluyen la capacidad de producir un LOS truncado a fin de mantener la capacidad de los vesiculosomas como adyuvantes sin tener el componente inmunodominante (Chamberlain y col., Infect. Immun. 57: 2872-2877, 1989); ausencia de la proteína PIII que, cuando está presente en la vacuna gonocócica, se ha mostrado que estimula una respuesta inmunológica que interfiere con la inmunogenicidad de los otros antígenos presentes en la vacuna (Young y Garbe, Res. Microbiol. 142: 55-65, 1991); capacidad de estimular el desarrollo de respuestas inmunológicas humorales y celulares, y de proporcionar inmunidad sistémica y en las mucosas; capacidad de crecer fácilmente y de expresar de manera estable las diferentes proteínas recombinantes, y finalmente, y de manera más importante, capacidad de producir vesículas libremente.

Las vacunas de la presente invención se podrían utilizar para desarrollar una respuesta inmunológica protectora frente a enfermedades producidas por bacterias como Clostridium tetani, Streptococcus pneumoniae y Borrelia burgdorferi.

Las N. gonorrhoeae que usadas en la presente invención se pueden modificar mediante ingeniería genética para expresar y dirigir cualquier gen heterólogo de un antígeno deseado que podría desencadenar una respuesta inmunológica en un paciente.

Las N. gonorrhoeae usadas en la presente invención producirían números elevados de vesículas que contienen dicho antígeno deseado. Posteriormente se pueden purificar los vesiculosomas de los detritus bacterianos y se pueden administrar como vacuna con o sin excipientes a un paciente o a un animal. Alternativamente, se puede purificar más el antígeno a partir del vesiculosoma para obtener un antígeno para su uso como vacuna.

También se puede construir vacunas conjugando Neisseria mutantes con vehículos usando técnicas que son conocidas en la materia. Por ejemplo, la Administración Estadounidense de Alimentos y Fármacos (FDA) ya ha aprobado para uso humano una vacuna que emplea proteosomas derivados de Neisseria como vehículo conjugado químicamente para el polisacárido capsular de Hemophilus influenzae, y está disponible en la actualidad. De manera similar, las mutantes de la presente invención también se podrían conjugar con polisacáridos bacterianos.

Las vacunas se pueden preparar a partir de uno o más antígenos o vesiculosomas inmunógenos. La preparación de vacunas que contienen un antígeno inmunógeno como ingrediente activo es conocida para una persona con conocimientos normales de la materia. Típicamente, esas vacunas se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o como suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o la suspensión en un líquido antes de la inyección. Los ingredientes inmunógenos activos con frecuencia se mezclan con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares como agentes humectantes, agentes tamponadores del pH y/o adyuvantes que potencian la eficacia de la vacuna.

De manera convencional, las vacunas se administran por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular. Otras formulaciones que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Además, la vacuna que contiene los vesiculosomas o los antígenos purificados a partir de los mismos se puede administrar junto a otros agentes inmunoreguladores, por ejemplo, inmunoglobulinas.

Las vacunas se pueden administrar de una manera que sea compatible con la formulación posológica, y en una cantidad que sea efectiva profiláctica y/o terapéuticamente. La cantidad que se debe administrar, que habitualmente está en el intervalo de 5 \mug a 250 \mug de vesiculosomas o de antígenos purificados a partir de los mismos por dosis, depende del individuo que se va a tratar, de la capacidad del sistema inmunológico del individuo de sintetizar anticuerpos, y del grado de protección que se desea. La cantidad precisa de ingrediente activo que es necesario administrar puede depender del juicio del médico y puede ser específica de cada individuo.

Ensayos que usan vesiculosomas

Además, la presente solicitud describe un procedimiento para detectar la presencia de anticuerpos frente a una enfermedad en una muestra. Usando metodología estándar que es bien conocida en la técnica, se puede construir un ensayo diagnóstico recubriendo una superficie (es decir, un soporte sólido), por ejemplo, una placa de microtitulación o una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa), con vesiculosomas enteros o con partes de los mismos que contienen el antígeno específico de la enfermedad que se va a detectar, y poniéndolos en contacto con una muestra de una persona o animal del que se sospecha que tiene la enfermedad. La presencia del complejo resultante que se forma entre el vesiculosoma y los anticuerpos específicos frente al mismo que hay en la muestra se puede detectar mediante cualquiera de los procedimientos conocidos que son habituales en la técnica, como espectroscopia de anticuerpos fluorescentes o colorimetría. Este procedimiento se puede usar, por ejemplo, para el diagnóstico de enfermedades víricas como la rabia o la hepatitis, de enfermedades bacterianas como la salmonelosis o la neumonía, de enfermedades fúngicas y de enfermedades parasíticas.

Además, la presente solicitud describe un kit diagnóstico que contiene vesiculosomas con el antígeno(s) deseado(s)
y reactivos auxiliares que son bien conocidos en la técnica y que son adecuados para su uso en la detección de la presencia de anticuerpos frente a una enfermedad, de modo que dichos anticuerpos están presentes en muestras procedentes de un paciente sospechoso.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos, que no son limitantes, ilustran la invención con más detalle. Los ejemplos que se suministran describen el uso de la técnica de transformación puntual no selectiva para la producción de derivados mediante deleción. No sería difícil para una persona con conocimientos normales de la materia aplicar la metodología para transformación de una cepa de N. gonorrhoeae en una N. gonorrhoeae que produce hipervesiculación, usando el fenotipo de hipervesiculación para la detección de transformantes.

Los siguientes materiales y procedimientos se utilizaron en los ejemplos que siguen.

Cepas y plásmidos

Los clones recombinantes que se utilizan en este estudio se han descrito previamente (Gunn y col., J. Bacteriol. 174: 5654-5660, 1992) y se representan de manera esquemática en la Figura 1. La cepa FA 19 se obtuvo del Dr. W. Shafer, Universidad de Emory. En aras de la claridad, la nomenclatura que se usa para los sistemas de R/M del ADN gonocócico que se usan en este estudio se muestra en la Tabla 1.

Medios y tampones

Todos los cultivos de N. gonorrhoeae se cultivaron en caldo GCP (Difco, Detroit, MI) más suplementos de Kellogg (Kellogg y col., J. Bacteriol. 85: 1274-1279, 1963) y bicarbonato sódico (0,042%) o en agar GCK. Los cultivos de E. coli se cultivaron en caldo LB o en placas LB (Miller, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Cuando fue necesario, se añadió al medio de cultivo ampicilina (35 \mug/ml), kanamicina (30 \mug/ml) o cloranfenicol (35 \mug/ml). Se añadió ácido nalidíxico (1 \mug/ml) o eritromicina (2 \mug/ml) al medio de cultivo de N. gonorrhoeae cuando era necesario.

Productos químicos, reactivos y enzimas

Los productos químicos fueron de grado analítico o mayor y se compraron a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Las endonucleasas de restricción se compraron a New England Biolabs (Beverly, MA) o a Promefa (Madison, MI), y se usaron con los tampones que se suministraban según las instrucciones del fabricante.

Transformaciones genéticas

Las transformaciones de E. coli se consiguieron mediante el procedimiento estándar de CaCl_{2} (Sambrook y col., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Las formas replicativas M13mp18 y M13mp19 se transformaron en JM101 mediante el procedimiento estándar de CaCl_{2} y se transfirieron a placas con una cubierta de 3 ml que contenía IPTG 0,3 mM, 1 mg de X-gal y 100 \mul de un cultivo de JM101 que se había dejado cultivar durante una noche. N. gonorrhoeae se transformó mediante uno de los dos procedimientos. Las células que tenían fimbrias se volvieron a suspender hasta obtener aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml en caldo GCP que contenía MgCl_{2} 10 mM, suplemento de Kellogg 1X y NaHCO_{3} al 0,042%. Las células más el ADN (1 \mug) se incubaron con agitación durante tres horas a 37ºC antes de sembrarlas en placas sobre medios adecuados. En el segundo procedimiento, denominado técnica de transformación puntual, las células que tenían fimbrias se volvieron a suspender hasta obtener una turbidez moderada (Klett = 35) en GCP más MgCl_{2} 10 mM. Este cultivo se diluyó hasta 10^{-5} y 10^{-6} (en GCP + MgCl_{2}), y 10 \mul de cada dilución se mezclaron con ADN (100 ng de la forma linealizada o superenrollada), y la mezcla de ADN/células se sembró mediante salpicado en placas de agar. Después de la incubación durante una noche, las colonias individuales que había en las gotas de mezcla se recogieron y se sembraron varias veces para su aislamiento. Posteriormente se cribó a las colonias únicas aisladas para la composición genérica deseada.

Detección de la actividad ENasa/MTasa

Se usaron ENasas disponibles comercialmente que reconocen el mismo punto que los enzimas gonocócicos (isoesquizómeros) para determinar si un clon tenía un gen de MTasa funcional. Un gen portador de una MTasa funcional debe ser resistente a la escisión por su correspondiente ENasa o isoesquizómero. Todos los sistemas excepto S.NgoVII tienen isoesquizómeros que permiten la detección mediante este procedimiento. No se conoce ningún isoesquizómero perfecto para el sistema S.NgoVII [5'-GC(G/C)GC-3'], pero la MTasa protege frente a la digestión por R.HaeIII (5'-GGCC-3') si su secuencia de reconocimiento es seguida por una citosina o si está precedida por una guanina y tiene la base adecuada en la posición variable. La MTasa de S.NgoVII también protege frente a la digestión en aproximadamente la mitad de los puntos Fnu4HI (5'-GCNGC-3').

La actividad metilasa también se detectó con la cepa AP1-200-9 (Piekarowicz y col., Nucl. Acids Res. 19: 1831-1835, 1991). Esta cepa contiene un alelo mcrB termosensible que, cuando se activa por el ADN metilado a la temperatura permisiva, produce lesión del ADN. La lesión del ADN induce posteriormente una fusión cromosómica dinD::lacZ. Las células se transformaron con plásmidos que contenía un posible gen de la MTasa y se cultivaron en placas con LB + Amp (100 \mug/ml) + X-gal (35 \mug/ml) durante una noche a 42ºC. Posteriormente se cultivaron las placas a 30ºC durante tres horas y posteriormente se volvieron a incubar a 42ºC. Una colonia que contiene un plásmido con el gen de la MTasa funcional activará la fusión dinD::lacZ y dará lugar a una colonia de color azul.

La presencia de actividad ENasa se determinó mediante uno o más de los siguientes procedimientos: (i) reducción de la EOP del fago lambda, (ii) reducción de la eficiencia de la transformación de pFT180 o (iii) técnicas de aislamiento de proteínas. El fago Lambda que se recogió a partir de DH5\alphaMCR se usó para infectar al DH5\alphaMCR que albergaba el vector sólo o un clon sospechoso de codificar la ENasa. Se usó una reducción de la EOP como medida de la actividad de la ENasa. Se usó el plásmido pFT180 (aislado a partir de DH5\alphaMCR) para transformar al DH5\alphaMCR que contenía un clon sospechoso de ENasa y a DH5\alphaMCR que contenía el vector solo. Se usó una reducción de la frecuencia de transformación del vector experimental frente al control como evaluación de la actividad ENasa. Las ENasas se purificaron a partir de cepas de E. coli que contenían genes de ENasa mediante FPLC según el procedimiento de Piekarowicz y col., Nucl. Acids Res. 16: 5957-5972, 1988.

Análisis de transferencia Southern

Los ADN cromosómicos digeridos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa TBE, se transfirieron a membranas Genescreen (DuPont, Wilmington, DE) usando el procedimiento de transferencia alcalina de Reed y Mann (Nucl. Acids Res. 13: 7207-7221, 1985) y se fijaron en la membrana mediante exposición a radiación UV (1,5 J/cm^{2}). Se consiguió la hibridación y visualización de las gotas de mezcla mediante el uso de Lumi-Phos y del kit Genius (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Todas las etapas siguieron el protocolo del fabricante excepto en lo siguiente: las membranas se lavaron con SSC 1 X, SDS al 0,1% y SSC 0,1 X, SDS al 0,1% a 65ºC; se usó leche en polvo descremada al 1% como agente bloqueante y en la solución de hibridación; y el anticuerpo anti-digoxigenina se diluyó al 1:10.000 en lugar de al 1:5000. Se realizaron siembras mediante salpicado de las colonias mediante el procedimiento de Sambrook y col. (1989).

Construcción de pUP1-1

Se unieron dos cebadores, se fosforilaron y se ligaron al vector pUC19 digerido con BamHI. La introducción de estos cebadores unidos a pUC19 se confirmó mediante secuenciación del ADN. La secuenciación del punto de clonación múltiple de este vector es:

5' . . GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCAGAATTCAGACGGCTGATCC\dotl

TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG . . 3' (SEC ID. Nº 1 Y SEC.ID. Nº 2)

En la secuencia anterior, la secuencia del cebador está subrayada y la secuencia de captación del gonococo está en negrita. Este cebador tiene un punto EcoRI en su interior; por lo tanto, la digestión con EcoRI dará lugar a la pérdida de la mitad del punto de clonación múltiple pero no de la secuencia de captación del gonococo.

Secuenciación del ADN/análisis de la secuencia del ADN

Los genes que codifican los enzimas de los sistemas R/M S.NgoI, II y VII se secuenciaron mediante la técnica didesoxi de Sanger usando el kit Sequenase (US Biochemicals, Cleveland, OH). El ADN se secuenció usando una combinación de clones de M13 monocatenario y de clones de plásmidos bicatenarios. Los moldes bicatenarios se desnaturalizaron antes de marcarlos mediante el siguiente protocolo. La solución desnaturalizante (2 \mul de NaOH N y EDTA 2 mM) se añadió a 1 \mug de ADN del plásmido hasta un volumen final de 22 \mul. Después de incubaron durante 5 min a temperatura ambiente, se añadieron 8 \mul de Tris 1 M (pH 4,5) y se precipitó el ADN. Los cebadores que se obtuvieron del The University of Maryland Biopolymer Laboratory o del Walter Reed Army Institute for Research se usaron en la secuenciación de los genes S.NgoI, II y VII. Las reacciones de secuenciación se sometieron a electroforesis en un gel en cuña de poliacrilamida al 4% con urea 8 M en un aparato de secuenciación
LKB.

Las secuencias del ADN se analizaron con el uso de los programas informáticos GENEPRO (Riverside Scientific, Seattle, WA) y PC/GENE (Intelligenetics).

Construcción de las mutaciones por deleción de R/M S.NgoII

El clon S.NgoII, pLV 155, se digirió con NcoI y HpaI, y el extremo NcoI se rellenó con Klenow. Esta mezcla de reacción se diluyó y se ligó y el ADN se transformó en la cepa DH5\alphaMCP. Se identificó un transformante que contenía un clon que carecía del fragmento de 1272 pb NcoI-HpaI (pLV 156). Este clon carece de actividad MTasa y ENasa, como lo demuestra la sensibilidad a la digestión por HaeIII y un aumento logarítmico de seis veces de la eficiencia del crecimiento en placas del fago lambda en E. coli que contiene estos plásmidos (no se muestran los datos). La cepa FA 19 se transformó con este plásmido mediante la técnica puntual, y las colonias resultantes se recogieron y se cultivaron para aislar el plásmido de 4,2 Kb que aparece de manera natural (plásmido críptico) y que se encuentra en la mayor parte de los gonococos (plásmido críptico). Se identificó una cepa cuyo plásmido críptico era susceptible a la digestión por HaeIII (denominado JUG025).

S.NgoV

El clon S.NgoV, pJM5, se digirió completamente con SspI y se relegó, lo que eliminó una región de 722 pb que se solapaba con el gen de la MTasa y con el posible gen de la ENasa. Este plásmido, pJM10, era ahora sensible a la digestión con BamHI, demostrando la pérdida de la actividad MTasa (no se muestran los datos). Se usó el plásmido PJM10 para transformar la cepa de N. gonorrhoeae JUG025. Como el plásmido críptico del gonococo no contiene ningún punto S.NgoV, se identificaron las transformantes que habían incorporado esta deleción a su cromosoma mediante la ausencia de hibridación con el plásmido pUCV51, que contiene uno de los fragmentos eliminados con SspI. Se identificaron algunas colonias que no hibridaron con este plásmido. Se eligió una cepa para estudios posteriores y se denomina JUG026.

S.NgoIV

El clon S.NgoIV, pCBB49.1, se digirió completamente con BglI y parcialmente con SspI. El extremo BglI se hizo plano con la ADN polimerasa T4 y el ADN se ligó. Después de cribar las transformantes se identificó un clon que había perdido el fragmento de 200 pb BglI-SspI (pCBB49.17). Este clon es deficitario en las actividades MTasa y ENasa (no se muestran los datos). Se clonó un fragmento NotI que contenía todo el inserto de pCBB49.17 en p[Bluescript Sk-]. Se clonó un fragmento de este clon KpnI-SacI, que una vez más contenía todo el inserto, en el plásmido pUP1-1 para producir el plásmido pUP49.17. Esta etapa era necesaria, ya que no se había identificado ninguna secuencia de captación del gonococo en este clon. La cepa JUG026 se transformó con este constructo mediante la técnica puntual. Se recogieron y cultivaron varias colonias, y se aisló el plásmido críptico a partir de estos cultivos. Se identificó una cepa, JUG027, que contenía un plásmido críptico susceptible a la digestión por NgoMI.

S.NgoVII

El clon S.NgoVII, pE63, se digirió con SalI (la extensión de 5' rellenada con Klenow). Este ADN se digirió parcialmente con SspI (hay un punto SspI en el vector). El ADN se ligó y se identificó un clon que carecía de las actividades ENasa y MTasa y que había perdido el fragmento de 1159 pb SalI-SspI (pE640) (no se muestran los datos). El plásmido pE640 se ligó al plásmido pUP1-1 y se identificó un dímero EcoRI de ambos plásmidos (pPUP7). La cepa JUG027 se transformó con el plásmido pPUP7, y se identificaron las transformantes que habían incorporado la deleción mediante transferencia por absorción de colonias por la ausencia de hibridación con el plásmido pE641 (que contiene el fragmento delecionado SalI-SspI). La cepa resultante se denominó JUG028.

S.NgoI

El clon S.NgoI, pUPK30, se digirió con DralI. Hay tres puntos DralI en el inserto y ninguno en el vector del plásmido (pK18). Se identificó un clon que contenía una deleción parcial (de 652 pb) de DralI, y se denominó pUPK32. Este clon carecía de actividad MTasa y ENasa, como lo demostró la sensibilidad a la digestión por HaeII y una reducción de tres logaritmos de la eficiencia del cultivo en placas del fago lambda en E. coli que contiene estos plásmidos (no se muestran los datos). La cepa JUG028 se transformó con pUPK32, y se cribaron las transformantes potenciales para detectar la incorporación de la deleción, estudiando con una sonda la transferencia de colonias con un plásmido que contenía el fragmento de 652 pb DralI. Se identificaron varias colonias que no hibridaban con la sonda. La colonia que se eligió para el análisis posterior se denominó JUG029.

Resultados Análisis de los clones de los genes R/M

Se han descrito previamente los clones recombinantes que codifican las ADN MTasas de los sistemas S.NgoI, II, IV, V y VII (Gunn y col., 1992; Sullivan y Saunders, 1988; Stein y col., 1995). En la Tabla 1 se muestran las especificidades de estos sistemas. Se han caracterizado y secuenciado dos de estos clones recombinantes, que codifican los sistemas R/M S.NgoII y S.NgoIV (Sullivan y Saunders, 1988; Stein y col., 1992). Se ha verificado la expresión de los genes de la MTasa de los sistemas S.NgoI, II, IV y V a partir de plásmidos recombinantes mediante la demostración de la resistencia de estos plásmidos a la digestión con un isoesquizómero del sistema que se examina. La detección de una deleción en el sistema R/M S.NgoVII es indirecta, porque no hay isoesquizómeros perfectos para este enzima. El enzima Fnu4HI reconoce la secuencia GGNCC. Esto significa que la mitad de los puntos Fnu4HI estará protegida por M.NgoVII. La pérdida de M.NgoVII por el gonococo dará lugar a que haya más puntos que puedan ser escindidos por este enzima. Si el ADN cromosómico de una cepa que carece de M.NgoVII es digerido con Fnu4HI, las bandas resultantes en general tendrán menor peso molecular.

Se determinó la localización de los genes de la metilasa de estos plásmidos, analizando la capacidad de varios subclones, obtenidos mediante deleción, de inducir una señal positiva en una cepa comprobadora de la ADN metilasa (Piekarowicz y col., 1991). Se determinó la presencia de una ENasa funcional mediante al menos uno de los siguientes procedimientos: demostración de la reducción de la eficiencia de formación de placas del fago lambda por células de E. coli que contenían el clon; demostración de la capacidad de las células que contenían el clon de restringir la transformación del ADN; o aislamiento de proteínas con actividad ENasa a partir de células que contienen los plásmidos. Usando al menos uno de estos ensayos para cada sistema, pudimos detectar actividad ENasa y MTasa en los clones que codifican NgoI, II, IV y VII, y actividad Mtasa, pero no actividad ENasa en el clon NgoV (no se muestran los datos). Usando análisis de deleciones y de subclonación, hemos localizado el ADN que codifica estos genes (véanse en la Figura 1 los mapas de restricción). El análisis de la secuencia del ADN mostró que aunque el clon NgoV carecía de actividad ENasa, contenía un ORF corriente abajo del gen de la MTasa, y este ORF estaba situado de manera similar al gen de la ENasa de otros sistemas R/M. Creemos que este ORF representa la ENasa de NgoV.

Construcción de deleciones de plásmidos e identificación de transformantes del gonococo que contienen deleciones cromosómicas

A fin de construir una cepa de gonococo deficitaria en R/M mediante técnicas de transformación, el ADN transformante debe contener una secuencia de captación del gonococo. Puesto que no se identificó ninguna secuencia de captación del gonococo en la secuencia de ADN de nuestros clones que codificaban los sistemas R/M NgoIV y NgoVII (no se muestran los datos), se construyó un vector plasmídico (pUP1-1) que contenía una secuencia de captación del gonococo. Esto se consiguió insertando un conector que contenía esta secuencia en el punto BamHI de pUC19. Como pUC19 no se replica en el gonococo, cuando las deleciones del ADN de interés se clonan en este plásmido y posteriormente se introducen en el gonococo mediante transformación, las deleciones se pierden desde la célula o entran en el cromosoma mediante recombinación homóloga.

Como queríamos desorganizar múltiples genes, la inactivación del gen deseado mediante la inserción de un marcador seleccionable no era práctica. Se usó la información del mapa de restricción para construir deleciones que se solapaban con los genes asociados de la MTasa y de la ENasa de los sistemas S.NgoI, II, IV, V y VII. La Figura 1 muestra los insertos de ADN de cada clon de plásmido y los segmentos que se habían eliminado en cada inserto. Estas deleciones fueron específicas para los ORF predichos de la ENasa y de la MTasa, y su tamaño varió desde 1,8 Kb (NgoII) a 200 pb (NgoIV). Todas las deleciones se construyeron de tal manera que había al menos 100 pb de ADN gonocócico flanqueando las deleciones. Éste es el tamaño mínimo que se necesita para la recombinación eficiente con regiones homologas del cromosoma (DCS, observaciones no publicadas).

Como no se hizo la selección de la recombinación eficaz de estas deleciones en el cromosoma, se utilizó la técnica siguiente para identificar las transformantes que habían adquirido la deleción deseada. Este procedimiento se basa en el hecho de que todas las células gonocócicas son competentes para captar ADN extracelular. Debido a esto, si se incuba un número limitado de células con una cantidad excesiva de ADN, todas las células deberían adquirir el ADN transformante. La posibilidad de identificar una transformante que ha adquirido la deleción estaría limitada sólo por la eficiencia del gonococo para incorporar la deleción a su cromosoma. De una placa se recogieron células que tienen fimbrias y se volvieron a suspender en caldo GCP más MgCl_{2} 10 mM para moderar la turbidez (Klett = 35). Las células se centrifugaron y se diluyeron en GPC + MgCl_{2}. Se prepararon diluciones de diez veces de las células, se mezcló una alícuota de 10 \mul de cada dilución con aproximadamente 0,1-0,5 \mug de ADN, y la mezcla ADN/células se sembró mediante salpicado en la superficie de una placa de agar. Después de la incubación durante una noche, se recogieron las colonias aisladas de las gotas de mezcla y se volvieron a sembrar. Una sola colonia se volvió a sembrar al menos dos veces más antes de estudiar la incorporación de la deleción a las colonias. Esto es necesario por dos razones: (i) una célula se puede haber dividido antes de adquirir el ADN, lo que da lugar a una población mixta de células, las que han recombinado la deleción en su cromosoma y las que no lo han hecho, y (ii) los gonococos que tienen fimbrias se agrupan y la mayor parte de las colonias no procede de una sola célula. Usando esta técnica, la cepa FA19 de N. gonorrhoeae se transformó sucesivamente con cada constructo de deleción. Esta técnica de transformación funcionó bien y al menos el 20% de las colonias que se examinaron en cada experimento había adquirido la deleción
deseada.

Se usaron dos procedimientos para verificar que se había introducido la deleción deseada en el cromosoma. El ADN cromosómico se aisló a partir de posibles transformantes y se incubó con el isoesquizómero del sistema que se estaba sometiendo a deleción. La digestión adecuada de este ADN indicaba pérdida de función de la MTasa y demostró que se había incorporado la deleción. Para verificar que la pérdida de función se debía a una deleción y no a una inactivación por inserción, analizamos gotas de mezcla de colonias de posibles transformantes con parte del fragmento de ADN que se había eliminado del clon del plásmido. Las colonias que no hibridaron con la sonda debían haber incorporado la deleción. Todas las colonias que se estudiaron que ya no expresaban la metilasa en estudio se unieron a la sonda específica de metilasa.

Se realizó una transferencia Southern para comparar la digestión de FA19 y de JUG029 (la cepa que contenía las deleciones de los sistemas R/M NgoI, II, IV, V y VII). Cada conjunto se digirió con los enzimas adecuados, se sometió a electroforesis y se sembró mediante salpicado. La membrana se cortó en tiras, y se estudió cada tira con ADN que atraviesa la región eliminada en cada uno de los cinco sistemas R/M. El conjunto 1 se digirió con DraI y se analizó con el fragmento PstI-XhoI de pUPC30. El ADN cromosómico de JUG029 carecía del fragmento de 652 pb DraI. En el conjunto 2 se examinó el sistema NgoII. JUG029 carecía de la banda Sau3AI de 1414 pb que se extiende a lo largo de la deleción. La segunda banda de hibridación era mayor que la banda FA19. Los análisis posteriores de transferencia Southern del ADN cromosómico digerido con otros enzimas demuestran que la deleción se extiende más corriente arriba del punto NcoI (no se muestran los datos). El sistema NgoIV se estudió en el conjunto 3. El ADN cromosómico digerido con SapI mostró la pérdida esperada del fragmento de 400 pb SspI y el posterior aumento de tamaño de 250 pb del fragmento SspI de mayor tamaño. En el conjunto 4 el ADN cromosómico se digirió con RsaI para confirmar la deleción de NgoV. La cepa que tiene la deleción carece de los fragmentos de 452 pb y 684 pb debido a la pérdida de los puntos RsaI en las posiciones 1057 y 1527. También se puede observar aumento esperado del tamaño del fragmento de mayor tamaño. El conjunto 5 examinó la deleción de NgoVII. El ADN cromosómico se digirió con EcoRI + HindIII. El fragmento híbrido EcoRI-HindIII es 1,2 Kb menor que el de FA19.

Para demostrar la pérdida de la actividad biológica de la MTasa de los cinco sistemas R/M que se habían eliminado de JUG029, se aisló ADN cromosómico y se incubó con los isoesquizómeros de los sistemas que se habían eliminado. La digestión eficaz del ADN cromosómico indicaría la pérdida funcional de la MTasa. Mientras que el ADN cromosómico de FA19 permanece sin digerir con los isoesquizómeros de NgoI, II, IV y VII, la digestión de JUG029 parece continuar hasta completarse. Cuando se analiza el sistema NgoVII, es evidente que el ADN cromosómico que se aisla a partir de JUG029 se digiere en mayor medida que el ADN cromosómico que se aisla de FA19. En conjunto estos datos demuestran que se introdujeron con éxito en el cromosoma todas las deleciones adecuadas, y que JUG029 poseía el fenotipo adecuado de metilación defectuosa.

Comparación de la frecuencia de transformación de FA19 frente a JUG029

Para determinar si la pérdida de las cinco ENasas haría que el gonococo fuera más susceptible a la transformación con el ADN que se propaga en E. coli, se transformaron las cepas JUG029 y FA19 con pSY6 y pRDL2. El plásmido pSY6 contiene ADN que codifica una ADN girasa mutante (Stein y col., 1991). Cuando se introduce esta mutación en el cromosoma, las células se hacen resistentes al ácido nalidíxico. La transformación con este plásmido no se ve afectada por las ENasas endógenas porque las transformantes resistentes al ácido nalidíxico se originan por la recombinación entre el ADN linealizado del plásmido y el cromosoma del huésped. Los datos que se presentan en la Tabla 2 muestran que la frecuencia de transformación a Nal^{R} con pSY6 fue similar para ambas cepas (1,8 x 10^{-4} para FA19 frente a 1,7 x 10^{-4} para JUG029).

TABLA 2 Examen de la restricción in vivo por FA19 y JUG029

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a \+  \begin{minipage}[t]{135mm}  Las cepas de  N.
gonorrhoeae  se transformaron con 35 ng de pSY6 o con 0,5  \mu g 
de pRDL2 y se incubaron durante 3 horas a  37ºC  con agitación antes
de colocarlas en placas de un medio adecuado. La frecuencia de
transformación es el número de transformaciones por UFC por ml. Las
frecuencias presentadas proceden de un solo experimento; sin
embargo, el experimento se repitió tres veces, sin diferencias
significativas entre los ensayos.\end{minipage} \cr  b \+
 \begin{minipage}[t]{135mm}  pSY6 contiene una forma mutante del
gen de la ADN girasa que, después de su recombinación con el
cromosoma del huésped, suministra a la célula resistencia al ácido
nalidíxico.\end{minipage} \cr  c \+
 \begin{minipage}[t]{135mm} pRDL2 es un derivado de pLEE20
(Ery ^{R})  que contiene un inserto del ADN gonocócico de 456 pb que
contiene una secuencia de captación. Cuando este plásmido se aisla a
partir de una cepa de gonococo con una MTasa totalmente funcional
(F62 en este caso), es metilado y después de la transformación no
debería estar sujeto a restricción por el
huésped.\end{minipage} \cr}

A fin de que un plásmido transforme con éxito al gonococo, debe adoptar de nuevo la forma circular y debe formar un plásmido funcional. El plásmido pRDL2, que es un derivado de pLEE20 que contiene un fragmento de ADN gonocócico de 456 pb que contiene una copia de la secuencia de captación, se puede cultivar en E. coli o en N. Gonorrhoeae. Por lo tanto, se puede usar pRDL2 metilado (de N. Gonorrhoeae) y no metilado (de E. coli) en los ensayos de transformación. El pRDL2 metilado no debe estar restringido tras la transformación del gonococo, pero el pRDL2 metilado puede estar sujeto a restricción por el huésped. Las frecuencias de transformación por los plásmidos usando pRDL2 metilado fueron similares para FA19 y JUG029 (2,2 x 10^{-6} y 4,1 x 10^{-6}, respectivamente). La transformación con pRDL2 no metilado dio lugar a pocas transformantes en JUG029 (1,5 x 10^{-8}) y a ninguna en FA19 (< 1,6 x 10^{-9}). Estos datos demuestran que, aunque JUG029 sigue siendo capaz de restringir al ADN transformado, se puede detectar una reducción mesurable de su capacidad de restricción. Esto indica que al menos parte de las ENasas restantes pueden participar en la restricción mediada por el huésped.

Referencias

Biswas y col., (1977) J. Bacteriol. 129: 983-992.

Biswas y Sparling, (1981) J. Bacteriol. 145: 638-640.

Butler y Gotschlich, (1991) J. Bacteriol. 173: 5793-5799.

Drazek et al, (1995) J. Bacteriol. 177: 2321-2327.

Goodman y Scocca, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6982-6986.

Gunn y col., (1992) J. Bacteriol. 174: 5654-5660.

Kellogg y col., (1963) J. Bacteriol. 85: 1274-1279.

Korch y col., (1983) J. Bacteriol. 155: 1324-1332.

Mathis y Scocca, (1964) J. Gen. Microbiol. 130: 3165-3173.

Miller, (1982) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Piekarowicz y col., (1988) Nucl. Acids Res. 16: 5957-5972.

Piekarowicz y colal, (1991) Nucl. Acids Res. 19: 1831-1835.

Reed y Mann, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 7207-7221.

Sambrook y col., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Sandlin y Stein, (1994) J. Bacteriol. 176: 2930-2937.

Sox y col., (1979) J. Bacteriol. 138: 510-518.

Sparling (1966) J. Bacteriol. 124: 1364-1371.

Stein y col., (1988) Role of restriction and modification on genetic exchange in Neiseria gonorrhoeae. In Gonococci and Meningococci. Poolman et al (eda). 5th International Neisseria Conference. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos. pp. 323-327.

Stein y col, (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 622-626.

Stein (1991) Can. J. Microbiol. 37: 345-349.

Stein y col., (1992) J. Bacteriol. 174: 4899-4906.

Sullivan y Saunders, (1988) Determination of the endonuclease and methylase content of Neisseria gonorrhoeae strain P9 and the cloning therefrom of two functional methylase genes. In Gonococci and Meningococci. Poolman et al (eds). 5th International Neisseria Conference. Kluwer Academic Publishers,Dordrecht, Países Bajos. pp. 329-334.

Ejemplo 2 Materiales y procedimientos

Cepas bacterianas. N. Gonorrhoeae F62 se obtuvo de P. Frederick Sparling (Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC). E. coli DH5 MCR se obtuvo de Bethesda Research Laboratories (Bethesda, MD). Los gonococos se cultivaron en caldo GCP complementado con la solución de Kellogg (White, L.A., D.S. Kellogg, Jr., Appl. Micro. 13: 171-174, 1965) y bicarbonato sódico al 0,042% y sobre agar GCK que contenía eritromicina (2 \mug/ml), vancomicina (3 \mug/ml), colistina (7,5 \mug/ml) y nistatina (1,25 unidades/ml) cuando fue necesario. E. coli DH5 MCR se cultivó en caldo L o en agar LB que contenía ampicilina (30 \mug/ml), kanamicina (30 \mug/ml), eritromicina (300 \mug/ml) y x-gal (35 \mug/ml) cuando fue necesario.

Productos químicos, reactivos y enzimas. Los enzimas de restricción y la ADN ligasa T4 se compraron a New England Biolabs (Beverly, MA). Los productos químicos que se usaron para los estudios de transformación eran de grado de reactivo o mejores y se compraron a Sigma Chemical (St. Louis, MO), salvo que se indique lo contrario.

Manipulaciones del ADN. El ADN plasmídico se aisló mediante el procedimiento de lisis alcalina y se purificó por gradientes de cloruro de cesio-bromuro de etidio (Birnboim y Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979). El ADN plasmídico se introdujo en E. coli usando el procedimiento de transformación con CaCl_{2} (Sambrook y col., en Molecular cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

Secuenciación del ADN. Las reacciones de secuenciación del ADN se realizaron mediante el procedimiento didesoxi de Sanger (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74: 5463-5467, 1977) usando el kit de secuenciación Sequenae Version II (United States Biochemicals, Cleveland, OH) y -[35S] DATP (New England Nuclear, DuPont, Boston, MA). La secuenciación mediante PCR se realizó directamente con los productos de la PCR según las instrucciones de kit de secuenciación del ADN mediante el procedimiento didesoxi de ciclo térmico (New England Biolabs, Beverly, MA). Los productos de la secuenciación se separaron en un gel de acrilamida al 4% de 55 cm por 0,2 mm (urea 7 M en tampón TBE 1X (Tris 100 mM, ácido bórico 0,083 M y EDTA 1 mM)) con una cuña de 0,6 mm (grosor máximo) en los últimos 10 cm. Los geles se fijaron, secaron y expusieron a una película radiográfica XOMAT (Kodak) durante 36 horas.

Reacción en cadena de la polimerasa. La PCR se realizó usando el kit de PCR de GeneAmp de Perkin Elmer CETUR (Norwalk, CT) en las condiciones recomendadas. La reacción de 100 l se realizó con desnaturalización durante un minuto a 94ºC seguida de templado durante un minuto a 50ºC y de extensión durante un minuto a 72ºC hasta un total de 30 ciclos. Los cebadores que se usaron en este estudio para el análisis mediante PCR y para el análisis de la secuencia se hicieron en MedImmune. La secuencia de los cebadores que se usaron para amplificar H8RS1 fueron: H.8-5',

CCCTGAATTCAAATCATACTGAATTAT

(SEC. ID. Nº: 3); H.8-3'

CCGATCAGTTCAAAACTGC (SEC. ID. Nº4)

La secuencia de los cebadores que se usaron para añadir los puntos SphI a H.8 fueron GGCTGCATGCGGCGGAG y CCGCCGCATGCAGCCAAAG (SEC. ID.Nº5)

ATTCCAGTCGACAAGCAAAATGTTAGCAGC (SEC. ID Nº6)

La secuencia de los cebadores que se usaron para amplificar OspA fueron: OspA-5',

ATTCCAGCATGCTTATTTTAAAGCGTTTTTAATTTC (SEC. ID. Nº7)

OspA-3',

Conjugación. Los plásmidos se introdujeron en la cepa gonocócica F62 mediante conjugación con E. coli S17-1 (Nassif, x., D. Puaou, y M. So. 1991. Transposition of TN1545-3 in the pathogenic Neisseriae: a genetic tool for mutagenesis. J. Bact. 173: 2147-2154). Las conjugaciones se realizaron mediante acoplamiento con filtro y se permitió que el proceso durara tres horas. Para seleccionar las transconjugantes de los gonococos, las células del filtro se volvieron a suspender en caldo GCP y se sembraron en placas en GCK que contenía eritromicina, vancomicina, nistatina y colistina.

Aislamiento de los vesiculosomas

Transferencia Western. Los lisados de vesiculosomas (aproximadamente \mug de proteínas totales) se analizaron mediante SDS-PAGE Y transferencia Western con el Ac monoclonal H5332 específico de OspA (Green, B.A., T. Quinn-Dey, y G.W. Zlotnick. 1987. Biologic activities of antibody to a peptidoglycan-associated lipoprotein of Hemophilus influenzae against multiple clinical isolates of H. influenzae type b. Infect. Immun. 55: 2878). La expresión de OspA se comparó con la lipoproteína OspA purificada, cedida amablemente por el Dr. L. Erdile (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA). Las bandas proteicas que reaccionaban con H5332 se visualizaron después de la incubación con anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa del rabanito) usando el sistema de estimulación de la detección mediante quimioluminiscencia (EDL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) según las instrucciones del fabricante.

Fraccionamiento con Triton X-114. Los vesiculosomas se suspendieron en PBS, se rompieron mediante sonicación y se solubilizaron a 4ºC mediante la adición de Triton X-114 (TX114) al 2% (volumen/volumen). El material insoluble (fracción enriquecida en pared celular) se sedimentó mediante centrifugación a 100.000 x g y el sobrenadante se sometió a partición en fase con detergente (Bordier, C. 1981. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution, J. Biol. Chem. 265: 1604). Después de calentar brevemente a 37ºC la solución TX114, se consiguió la separación de las fases acuosa y de detergente mediante una centrifugación breve. Las dos fases se retroextrajeron tres veces y las proteínas de muestras representativas se precipitaron mediante la adición de nueve volúmenes de acetona. Una porción del sobrenadante de cada uno de los cultivos se sometió a SDS-PAGE, se transfirió a nitrocelulosa y se detectó con el Ac monoclonal anti-OspA H5332.

Inmunogenicidad de los constructos de los vesiculosomas. Se recogió suero de la vena caudal de ratones inmunizados en diferentes momentos después de la inmunización y se combinó para cada grupo de ratones para monitorizar las respuestas mediadas por anticuerpos mediante ELISA. Las placas de ELISA (Immunolon 4) se recubrieron con 50 \mul de Borrelia completa (cepa 31) suspendida en tampón de carbonato (pH 9,6) a 10 \mug/ml o con temperatura o durante toda la noche a 4ºC. Posteriormente se eliminó la solución de antígeno y las placas se incubaron con solución bloqueante (BSA al 0,5% y leche seca descremada al 0,5%) en PBS con Tween-20 al 0,1% (PBS-T20) durante una hora a temperatura ambiente. Se hicieron diluciones seriadas del suero de dos en dos comenzando a 1/200 en la solución de cloqueo, y se añadieron 50 \mul de cada dilución a pocillos duplicados de la placa recubierta de antígeno. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las placas se lavaron con PBS-T20 y se incubaron con 50 \mul de una dilución de PBS-T20 al 1:1000 del anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) durante una hora. El color se reveló con el reactivo del sustrato 2,2'-azino-dif[sulfonato de 3-etil-benztiazolina] (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.), y se midió mediante la absorbancia a 405 nm en un lector de ELISA (Dynatech). El criterio de valoración de los títulos se definió como la máxima dilución a la que los valores de A405 eran el doble de los valores del suero de ratones normales diluido a una concentración equivalente.

Estudios de provocación. Las dosis de provocación se obtuvieron mediante expansión de una sola colonia de la cepa sh.2 de B. burgdorferi de bajo paso (Schwan, T.G., W. Burgdorfer, M.E. Crumpf, y R.H. Karstens. 1988. The urinary bladder, a consistent source of Borrelia burgdorferi in experimentally infected white-footed mice (Peromyscus leucopus). J. Clin. Microbiol.). Se hizo la provocación a ratones inmunizados y a ratones controles por vía intradérmica en la base de la cola con 10^{4} espiroquetas. Esto representó aproximadamente 100 unidades de DI_{50} de la cepa Sh. 2 de B. burgdorferi. Se sacrificó a los ratones 13 días después de la provocación, y se recogieron tejidos de la vejiga y de la articulación tibiotarsiana y se cultivaron en medio BSK-II, como se ha descrito previamente (Erdile, L.F., M. Brandt, D.J. Warakomski, G.J. Westrack, A. Sadziene, A.G. Barbour, y J.P. Mays. 1993. Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA. Infect. Immu. 61: 81). Los cultivos se monitorizaron durante 14 días mediante microscopia de contraste de fase para detectar la presencia de espiroquetas. Se consideró una infección positiva la presencia de una o más espiroquetas por cada 20 campos de gran aumento en cualquier cultivo.

Resultados

Construcción de Neisseria gonorrhoeae que expresa OspA. N. gonorrhoeae produce una lipoproteína, H. 8, como una de sus proteínas normales de la membrana externa. A fin de determinar si era posible sobreexpresar esta proteína en la membrana externa del gonococo, el gen que codifica esta proteína se clonó en un plásmido de elevado número de copias, pLEE20. La secuencia de ADN que codifica esta proteína se amplificó mediante PCR a partir de la cepa F62 de N. gonorrhoeae, según la información de la secuencia que se publicó para la cepa R10 (Baehret y col., 19__, Mol. Microbiol. 3: 49-55). Se diseñaron los cebadores de tal modo que las secuencias 5' del ADN del gen contenían un punto EcoRI y las secuencias 3' del ADN del gen contenían un punto HindIII. El ADN amplificado se digirió y se insertó en pLEE20 que había sido digerido con EcoRI y parcialmente digerido con Hindi. El ADN ligado se introdujo en Escherichia coli DH5 MCR, y se identificaron transformantes resistentes a eritromicina que contenían el amplicón. La secuencia de ADN se determinó a partir de uno de estos clones para verificar que el ADN amplificado codificaba H.8. Los datos indicaron que el gen clonado era H.8 (no se muestran los datos).

El constructo que codifica H.8 se introdujo en la cepa S17-2 de E. coli mediante transformación. Esta cepa se usó para movilizar el pLEE20-H.8 hacia el interior de N. Gonorrhoeae F62 mediante conjugación. Se seleccionaron transconjugantes en el medio de Thayer Martin complementado con eritromicina. Los perfiles de SDS-PAGE de F62 (pLEE20-H.8) indicaron que esta cepa expresaba más H.8 que las cepas naturales. Estos experimentos demuestran que es posible sobreexpresar lipoproteínas en el gonococo.

Para asegurarnos de que N. Gonorrhoeae podría procesar correctamente la secuencia de señales OspA de Borrelia, la proteína se expresó en forma de proteína de fusión. A fin de conseguirlo, se introdujo un punto SphI en la secuencia H.8 en un punto que correspondía a la cisteína que actúa como señal de lipidación. La secuencia del ADN que codifica OspA se amplificó a partir de pTRH44 (Bersgtromet y col., Mol. Microbio. 3: 479-486, 1989) mediante PCR. Los cebadores se diseñaron de tal modo que introdujeran un punto SphI en una localización que correspondía a la cisteína que se lipidiza en OspA. El cebador que correspondía al extremo 3' del gen también contenía un punto SphI. El amplicón y el vector de clonación se digirieron con SphI, se ligaron y se introdujeron en E. coli DH5 MCR. Se identificaron los plásmidos que contenían el inserto, y la secuencia del ADN del constructo se verificó mediante análisis de la secuencia del ADN. Este plásmido se introdujo en E. coli S17-2, y posteriormente se introdujo en el gonococo mediante conjugación, como se describe más arriba.

Cuantificación y localización. La cantidad de OspA que se expresa en los vesiculosomas se cuantificó usando un ensayo cuantitativo de transferencia Western en el que el nivel de unión de un Ac monoclonal anti-OspA a los vesiculosomas se comparó con la unión a OspA purificado. El resultado de ese análisis indica que OspA representa aproximadamente el 0,2% de todas las proteínas del vesiculosoma.

Para determinar si la expresión del gen de OspA por el vector de expresión de lipoproteínas daba lugar a acilación de los lípidos de OspA recombinante, se sometió a los vesiculosomas a análisis de partición en fase de detergente con Triton X-114 para enriquecer en lipoproteínas asociadas a la membrana (Bordier, J. Biol. Chem. 256: 1604, 1981; Radolf y cols., Infect. Immun. 56: 490, 1988). La expresión de la proteína OspA asociada a la secuencia de la señal de lipidación H8 dio lugar a un producto que estaba localizado exclusivamente en la fracción soluble en detergentes, que esta muy enriquecida en proteínas lipófilas. Este hallazgo indica que la fusión de la secuencia de la señal H8 con OspA dio lugar a un producto que se exportó de manera eficiente y que se modificó en la membrana del vesiculosoma después de la traducción.

Estudios de inmunización. Se analizó un panel de 5 cepas de ratones distintas para detectar respuestas mediadas por anticuerpos frente a OspA después de la inmunización con vesiculosomas que expresan OspA (Figura ). Los resultados indican que tanto el locus de resistencia a la endotoxina como otros locus pueden controlar las respuestas inmunológicas a los vesiculosomas que expresan OspA. De esta manera, la cepa hiporreactiva C3H/HejLPS generó respuestas anti-OspA sustanciales después del refuerzo con vesiculosomas que contenían OspA, mientras que la cepa relacionada que contenía LPS C3HeB/Fej no lo hizo, lo que indica afectación del locus de la resistencia a la endotoxina en las respuestas a los vesiculosomas. Además, varias cepas generaron distintas respuestas al OspA que se expresaba en los vesiculosomas, aun cuando todos eran portadores del alelo Lps, lo que indica afectación de los locus no asociados al Lps en este fenómeno, De esta manera, los ratones BALB/c generaron respuestas sustanciales frente a OspA después del refuerzo con OspA-vesículas, mientas que SJL/J y C57BL/6 no lo hicieron.

Estudios de provocación. Se examinó la capacidad de los vesiculosomas que expresaban OspA de inducir respuestas inmunológicas protectoras mediante la inmunización de animales y la evaluación de sus respuestas mediadas por anticuerpos frente a OspA y a lisados de células completas de Borrelia dos semanas después de dos refuerzos. Los resultados mostraron que todos los animales inmunizados con vesículas que contenían OspA generaron respuestas anti-OspA detectables, de modo que 4 de 5 animales tenían títulos mayores de 1/3200. Estos mismos cuatro animales también tenían reactividad frente a un lisado preparado a partir de Borrelia entera (el quinto animal no mostró ninguna respuesta detectable frente a Borrelia). Ninguno de los animales a los que se inmunizó con vesiculosomas no recombinantes generó respuestas detectables frente a OspA ni frente a Borrelia.

Se hizo provocación a los animales con gérmenes del género Borrelia vivos. Dos semanas después de la provocación, se pudo recuperar Borrelia en la vejiga y en la articulación tibiotarsiana de todos los animales inmunizados con vesiculosomas no recombinantes. Por el contrario, sólo se pudo recuperar Borrelia en uno de cinco animales inmunizados con vesiculosomas que contenían OspA. En este grupo sólo se pudo cultivar Borrelia a partir del animal que tenía los títulos más bajos de anticuerpos anti-OspA.

Aproximadamente el 40% de los ratones inmunizados consiguió títulos de anticuerpos mayores de 1:400. El 100% de los ratones que tenían este título de anticuerpos estaba protegido de la provocación.

Exposición

Los datos de este ejemplo demuestran el posible uso de vesiculosomas gonocócicos recombinantes como sistema de administración de vacunas. Los vesiculosomas expresan muchas de las características deseables de los sistemas de administración vivos y no vivos: a la vez que evitan muchas de las desventajas que se asocian al uso de sistemas de administración vivos en individuos jóvenes o inmunodeprimidos, se pueden modificar mediante ingeniería genética para que expresen antígenos en el contexto de una membrana biológica que se puede purificar con facilidad sin el uso de procedimientos de purificación extensos y potencialmente desnaturalizantes.

En los experimentos que se presentan aquí, se expresó una proteína de fusión formada por el antígeno OspA de Borrelia burgdorferi unido a la secuencia de señal de lipidación del antígeno de superficie H8 de Neisseria. El objetivo de construir esta proteína de fusión usando una señal endógena de lipidación fue evitar cualquier posible problema en la transferencia y/o de procesado de señales extrañas en el interior de Neisseria. Sin embargo, la proteína de superficie lipidada P6 de Hemophilus influenzae también se ha expresado con éxito bajo el control de su propia secuencia de señales de lipidación, lo que demuestra la localización de este antígeno en la superficie del vesiculosoma en una forma soluble en detergentes, lo que indica que Neisseria es capaz de reconocer y procesar señales de lipidación bacteriana extrañas.

Es evidente que múltiples locus pueden participar en la determinación de la reactividad a los antígenos que presentan los vesiculosomas gonocócicos. En un estudio limitado de las cepas, tanto el locus Lps como otros locus no mapeados parecen controlar la reactividad a OspA. Debido a las propiedades adyuvantes conocidas que se asocian al LPS, tal vez no sea sorprendente ver un efecto del locus Lps sobre las respuestas inmunológicas que desencadena este constructo.

En los experimentos que se describen aquí, OspA se usó como un inmunógeno de prueba porque se ha mostrado que las respuestas frente a este antígeno protegen frente a la provocación frente a aislados 0 de Borrelia que expresan OspA. Sin embargo, no todos los aislados de B. burgdorferi expresan este antígeno 0, y recientemente se ha demostrado que algunos aislados transmitidos por garrapatas que inicialmente expresan OspA inactivan la expresión después de la ingesta de sangre 0. Otros antígenos de Borrelia, en combinación con OspA, pueden inducir respuestas inmunológicas eficaces de manera más generalizada que OspA solo.

Los resultados de estos estudios de inmunogenicidad indican que se pueden inducir respuestas mediadas por IgG frente a una lipoproteína extraña que se expresa en la superficie de los vesiculosomas. No se examinó la capacidad de estas preparaciones de inducir linfocitos Th o LTC específicos de OspA. Se han observado concentraciones elevadas de IFN-\gamma y de IL-2, aunque no de IL-4, en el sobrenadante de cultivos de células de ganglios linfáticos procedentes de ratones inmunizados con vesiculosomas y estimuladas con lisados de Neisseria, lo que indica que los vesiculosomas pueden estimular respuestas intensas mediadas por Th1. La posibilidad de que estas preparaciones estimulen respuestas mediadas por LTC espera a la clonación de antígenos que codifican epítopes conocidos de los LTC en Neisseria. Es probable que los antígenos expresados por los vesiculosomas sean procesados principalmente mediante una ruta endocítica y que por lo tanto sean presentados principalmente en el contexto de las moléculas de clase II del CPH.

Los vesiculosomas que se usan en estos estudios generaron respuestas protectoras mediadas por anticuerpos sin toxicidad aparente. Sin embargo, dosis 3-5 veces mayores que las que se describen aquí dieron lugar a efectos tóxicos significativos. El rizado del pelo se asoció a dosis superiores a 30 mg/animal, y ciertas preparaciones de vesiculosomas fueron letales a dosis de 100 mg/animal o mayores cuando se daban por vía intraperitoneal, especialmente después del refuerzo. Estos efectos tóxicos no se redujeron administrando el antígeno por vía intranasal o cuando se administraba por vía intraperitoneal con alumbre. Experimentos futuros deberán examinar los efectos de otras vías de administración sobre la toxicidad, así como la influencia que la modulación de los niveles de LOS sobre la superficie del vesiculosoma tiene sobre la toxicidad de las preparaciones de vesiculosomas. A este respecto, recientemente se ha generado una serie de mutantes de Neisseria que expresan niveles variables de LOS en su superficie. Será interesante determinar si las cepas que expresan cantidades menores de LOS de superficie mantienen la inmunogenicidad a la vez que reducen la toxicidad.

En resumen, los vesiculosomas gonocócicos que expresan una proteína de superficie bacteriana extraña, OspA de Borrelia burgdorferi, son capaces de inducir respuestas inmunológicas que protegen a los ratones frente a la provocación con Borrelia.

Ejemplo 3 Clonación del gen P6 de Haemophilus influenzae

El gen P6 de H. Influenzae se clonó usando PCR. Brevemente, se usaron dos cebadores, cada uno de los cuales estaba flanqueado por puntos EcoRI, para amplificar un fragmento de aproximadamente 500 pb (Figura 6A). El fragmento amplificado se clonó en pLEE20 (Figura 7A). Los clones se analizaron mediante análisis de restricción. Se obtuvieron clones que contienen el inserto en las dos orientaciones. La expresión se analizó haciendo reaccionar colonias con anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteína P6.

pLEE20-p6 se introdujo en la cepa SB17-2 de E. coli. Los plásmidos que se obtuvieron a partir de E. coli se introdujeron en la cepa F62 de N. gonorrhoeae mediante conjugación. Se hizo cribado a las transconjugantes para detectar la reactividad con el anticuerpo, y se verificó su expresión usando SDS-PAGE (Figura 8) y transferencia Western (Figura 9).

Ejemplo 4 Clonación del gen pspA de Streptococcus pneumoniae

Se clonó el gen pspA de Streptococcus pneumoniae usando PCR. Brevemente, se usaron dos cebadores, cada uno de los cuales estaba flanqueado por puntos EcoRI, para amplificar un fragmento de aproximadamente 1 kb (Figura 6B). El fragmento amplificado se secuenció y se clonó en pLEE20 (Figura 7B). Los clones se analizaron mediante análisis de restricción.

pLEE20-pspA se introduce en la cepa SB17-2 de E. coli. Los plásmidos que se obtienen de E. coli se introducen en la cepa F62 de N. gonorrhoeae mediante conjugación. Se hace cribado de las transconjugantes para detectar reactividad con el anticuerpo, y se verifica su expresión usando SDS-PAGE y transferencia Western.

Evidentemente, son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas mostradas anteriormente. Por lo tanto, se debe entender que en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas, la invención se puede poner en práctica de una manera diferente a la aquí descrita específicamente en esta invención.

Claims (11)

1. Una vacuna para suministrar a un individuo inmunidad frente a una enfermedad, de modo que dicha vacuna comprende vesiculosomas aislados de Neisseria gonorrhoeae, en la que un polipéptido inmunógeno específico para dicha enfermedad se expresa en la superficie de dichos vesiculosomas, y en la que dicho polipéptido inmunógeno es heterólogo y está presente en dosis farmacológicamente efectiva en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que el individuo es un ser humano.

3. La vacuna de la reivindicación 1, en la que el individuo es un animal.

4. La vacuna de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha enfermedad está causada por un microorganismo.

5. La vacuna de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha enfermedad está causada por una bacteria.

6. La vacuna de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha enfermedad está causada por un virus.

7. La vacuna de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha enfermedad está causada por un hongo.

8. La vacuna de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha enfermedad está causada por un protozoo.

9. La vacuna de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dichos vesiculosomas proceden de Neisseria gonorrhoeae que produce hipervesiculación.

10. La vacuna de la reivindicación 5, en la que dichos vesiculosomas comprenden un polipéptido bacteriano de Clostridium tetani, de Streptococcus pneumoniae o de Borrelia burgdorferi.

11. La vacuna de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dichos vesiculosomas comprenden un polipéptido OspA procedente de Borrelia burgdorferi.