ES2229252T3 - Aplicacion de fosfolipasas en la alimentacion del ganado. - Google Patents
Aplicacion de fosfolipasas en la alimentacion del ganado.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCESO PARA MEJORAR LA EFICACIA DE UTILIZACION DE ALIMENTOS Y/O PARA ESTIMULAR EL CRECIMIENTO DE ANIMALES EN EL CUAL A UN ANIMAL SE LE ALIMENTA CON UNA DIETA QUE COMPRENDE UNA COMPOSICION QUE COMPRENDE UNA SUSTANCIA ALIMENTICIA Y UN ADITIVO DE FOSFOLIPASA PREPARADO PARA USO. PREFERIBLEMENTE DICHA COMPOSICION TAMBIEN COMPRENDE AL MENOS UN FOSFOLIPIDO. DICHAS COMPOSICIONES SE UTILIZAN PARA MEJORAR LA DIGESTIBILIDAD DE LA GRASA Y PARA ESTIMULAR EL CRECIMIENTO DEL ANIMAL. EL FOSFOLIPIDO ES PREFERIBLEMENTE LECITINA Y LA FOSFOLIPASA PREFERIDA ES UNA FOSFOLIPASA A2 DE MAMIFERO. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, LA FOSFOLIPASA SE PRODUCE UTILIZANDO TECNOLOGIA DE ADN RECOMBINANTE PARA EXPRESAR LA ENZIMA EN UN HUESPED ADECUADO COMO UN MICROORGANISMO O UN VEGETAL TRANSGENICO.
Description
Aplicación de fosfolipasas en la alimentación del
ganado.
La presente invención se refiere a la aplicación
de enzimas en la alimentación del ganado.
Un número de enzimas son secretadas en el tracto
gastrointestinal de los animales para digerir la comida. Cada una
de estas enzimas actúa sobre componentes específicos, en un
ambiente específico de una parte del tracto gastrointestinal. Las
pepsinas, por ejemplo, son activas en el ambiente ácido del
estómago, mientras que otras proteasas, tales como la quimotripsina
y las carboxipeptidasas muestran actividad en la parte superior del
intestino delgado, a pH 6-7. Muchas de dichas
enzimas necesitan estar en forma de precursor antes de activarse.
La pepsina, por ejemplo, se forma solamente a partir de pepsinógeno
en un ambiente ácido. La quimotripsina y las carboxipeptidasas se
secretan en una forma inactiva, y se activan por la proteasa
tripsina.
La digestión de la grasa es un proceso complejo.
La mayoría de la grasa en las dietas para animales está disponible
en forma de triglicéridos. Estos triglicéridos son difícilmente o
en absoluto absorbibles por el intestino, y necesitan degradarse a
mono o diglicéridos, glicerol y ácidos grasos libres. Está
conversión está catalizada por la enzima lipasa, que se secreta por
el páncreas. Esta enzima es activa sobre la interfase entre agua y
aceite. Para una buena digestión, es esencial tener gotitas muy
pequeñas de grasa en una emulsión de aceite en agua. Los
emulsionantes son sustancias activas en superficie, que permiten la
dispersión de la grasa en una fase acuosa. El emulsionante más
importante en el tracto gastrointestinal es la bilis. La bilis se
secreta por el hígado, y puede almacenarse en la vesícula biliar.
La bilis contiene, entre otros, ácidos biliares y sales, colesterol
y fosfolípidos. Pequeñas partículas, micelas, se forman por la
mezcla de los componentes de la bilis con los (restantes) productos
de triglicéridos.
Estas micelas difunden a las células epiteliales
yeyunales, donde sus contenidos se liberan y se absorben. En estas
células epiteliales, los triglicéridos se reconstituyen. Junto con
el colesterol, los ésteres de colesterol, los fosfolípidos y las
proteínas, forman nuevas partículas, solubles en agua, denominadas
quilomicrones.
Los fosfolípidos, tales como la lecitina, son
degradados enzimáticamente mediante la acción de las fosfolipasas A
y B, que también se secretan por el páncreas.
La lecitina es una mezcla de lípidos polares y
neutros, en la que el contenido de lípidos polares es al menos de
60%. Dado su carácter hidrófobo/hidrófilo los lípidos polares (y
por lo tanto las lecitinas), se utilizan como emulsionantes. Los
lípidos polares incluyen (glicero)fosfolípidos y
glicolípidos. La estructura básica de un glicerofosfolípido es como
sigue:
| X= | Colina | |
| Etanolamina | ||
| Inositol | ||
| Serina | ||
| Hidrógeno |
Los glicerofosfolípidos básicamente consisten en
un resto glicerol con ácidos grasos en las posiciones C1 y C2. La
posición C3 está esterificada con ácido fosfórico. El ácido
fosfórico está frecuentemente ligado a un grupo alcohol, generando
así los siguientes compuestos:
| - fosfatidil-etanolamina | (PE; X = etanolamina) |
| - fosfatidil-colina | (PC; X = colina) |
| - fosfatidil-serina | (PS; X = serina) |
| - fosfatidil-inositol | (PI; X = inositol) |
| - ácido fosfatídico | (PA; X = hidrógeno) |
Los glicerofosfolípidos que tienen solo un
residuo de ácido graso (en lugar de los dos habituales), se
denominan liso-fosfolípidos.
La lecitina se utiliza como un emulsionante en
numerosas aplicaciones, incluyendo la comida y el alimento para
animales. Los emulsionantes son sustancias activas en superficie
que permiten la dispersión de una fase grasa líquida en una fase
acuosa. Los emulsionantes poseen tanto grupos hidrófilos como
lipófilos dentro de la misma molécula. La razón entre los grupos
hidrófilos y lipófilos, conocida como valor HLB es un indicador
característico de los emulsionantes.
Los emulsionantes hidrófobos solubles en grasa
tienen valores HLB en el intervalo de 0 a menos de 10, mientras que
los compuestos solubles en agua tienen valores HLB por encima de 10
y 20.
Emulsionantes tales como la lecitina, se añaden
al alimento de animales, para conseguir un valor nutritivo del
alimento mejorado, o para conseguir una mejor dispersión en el caso
de alimentos líquidos. También se añade lisolecitina al alimento de
animales (bajo el nombre comercial de Lysoforte®, vendida por la
compañía Kevin), que tiene propiedades emulsionantes mejoradas, lo
que permite conseguir un valor nutritivo mejor (Pluimveehouderij
24: 20-21 (18 de marzo de 1994)).
Las propiedades emulsionantes de la lecitina no
se explotan únicamente en la producción de ganado, mediante la
inclusión de lecitina en las raciones secas, sino también en áreas
en las que a los animales se les da alimento líquido que contiene
una gran proporción de grasa. Estos son primariamente sustitutos de
leche para terneras, y sustitutos de leche de cerda para cerdos. La
función de las lecitinas es producir la dispersión más fina posible
de la grasa en un alimento líquido ya preparado. La dispersión fina
da como resultado una digestibilidad mejorada de la grasa por los
animales. Además, la lecitina exhibe un efecto favorable en el
establecimiento de los constituyentes insolubles en un alimento
líquido.
En los años recientes, la industria alimenticia
ha comenzado a utilizar industrialmente enzimas producidas, para
complementar las enzimas producidas naturalmente en el tracto
gastrointestinal de los animales. Algunos ejemplos incluyen
fitasas, \alpha-amilasas, proteasas y diversas
enzimas de degradación de las paredes de las células de las
plantas. Sin embargo, en ningún lugar de la técnica anterior se ha
descrito la adición de fosfolipasas al alimento de animales, con el
propósito de promover el crecimiento de los animales, ya que los
animales por si mismos secretan grandes cantidades de estas enzimas
en la parte superior del intestino delgado.
El Documento
EP-A-0 619 079 describe la
utilización de fosfolípidos inter alia, como revestimiento
para granulados que contienen sustancias biológicamente activas,
para incluir en el alimento para rumiantes. El revestimiento sirve
para proteger las sustancias biológicamente activas en la panza,
para permitir su digestión subsiguiente y su absorción a través de
los órganos digestivos post-abomaso. El Documento
EP-A 0 619 079 además describe que opcionalmente
puede también incorporarse una fosfolipasa en el revestimiento
protector, para ayudar a su hidrólisis, sin embargo, el Documento
EP-A 0 619 079 no describe ni sugiere que la
fosfolipasa pueda añadirse al alimento para promover el crecimiento
o mejorar la eficiencia de la utilización del alimento.
El Documento
GB-A-2 267 033 se refiere a la
promoción del crecimiento, sin embargo, el Documento
GB-A-2 267 033 enseña a añadir un
kit que comprende el fosfolípido lecitina junto con la cepa
Streptomyces al ensilaje. Se había sugerido que la cepa
Streptomyces era capaz de producir una fosfolipasa A2 durante
la fermentación del ensilaje. Se sigue que la utilización de dicho
kit se limita al alimento de animales, cuyo proceso de producción
comprende una etapa de fermentación, que es compatible con la
producción de fosfolipasa por dicha cepa Streptomyces. Así,
existe todavía una necesidad para un aditivo de fosfolipasa para
alimento, ampliamente aplicable, versátil y listo para usar, para
mejorar la eficiencia de la utilización del alimento y/o la
promoción del crecimiento de los animales.
La presente invención proporciona un
procedimiento para mejorar la eficiencia de la utilización de
alimento, en el que un animal es alimentado con una dieta que
comprende una composición que contiene las sustancias del alimento y
un aditivo de fosfolipasa listo para usar.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para la promoción del crecimiento de los animales, en
el cual un animal es alimentado con una dieta que comprende una
composición que contiene las sustancias del alimento y un aditivo
de fosfolipasa listo para usar.
Además, la invención proporciona un procedimiento
para la producción de un alimento para animales, que comprende
mezclar una fosfolipasa lista para usar con las sustancias del
alimento.
La presente invención describe la utilización de
una fosfolipasa añadida exógenamente y lista para usar, a un
alimento para animales, para mejorar las propiedades emulsionantes
de los fosfolípidos en el tracto gastrointestinal, y de esta manera
mejorar la eficiencia de la utilización del alimento y/o la
promoción del crecimiento del animal. La promoción del crecimiento
de los animales es aquí definido como la promoción del crecimiento
en términos de ganancia de peso en tiempo (tasa de crecimiento) y/o
promoción del crecimiento en términos de eficiencia del alimento
(razón de conversión del alimento).
Las fosfolipasas que pueden utilizarse en la
invención incluyen: fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32), fosfolipasa A2,
fosfolipasa B (lisofosfolipasa), fosfolipasa C y fosfolipasa D.
Específicamente, la presente invención describe
la aplicación de un alimento al que se añade fosfolipasa A2 (EC
3.1.1.4). La fosfolipasa A2 puede producirse mediante aislamiento
de, por ejemplo, páncreas porcino, como un producto secundario de,
por ejemplo, la producción de insulina. Alternativamente, la
fosfolipasa A2 puede producirse de forma recombinante mediante
expresión de un gen heterólogo en un microorganismo tal como, por
ejemplo, Kluyveromyces lectis. La enzima se obtiene de dichos
microorganismos por medio de la fermentación y procedimientos
posteriores, para recuperar la enzima.
Otra posibilidad para la adición exógena de
fosfolipasas al alimento para animales que contiene lecitina, es
añadir materiales de planta que contienen fosfolipasa,
preferiblemente semillas transgénicas, en las que la fosfolipasa se
ha sintetizado a través de la expresión de un gen heterólogo. Para
obtener esto, el gen que codifica la fosfolipasa se clona en un
vector de expresión de planta, bajo el control de las señales de
expresión de plantas apropiadas, por ejemplo, un promotor específico
de tejido, tal como un promotor específico de semillas. El vector
de expresión que contiene el gen de la fosfolipasa, se trasforma
posteriormente en células de plantas, y las células de plantas
trasformadas se seleccionan para regeneración en plantas completas.
Las plantas transgénicas así obtenidas pueden cultivarse y
recolectarse, y aquellas partes de la planta que contienen la
fosfolipasa heteróloga, pueden incluirse en el alimento para
animales, bien como tales, o tras un procesamiento posterior. La
fosfolipasa heteróloga puede estar contenida en las semillas de las
plantas transgénicas, o pueden estar contenidas en otros materiales
de plantas, tales como raíces, tallos, hojas, tronco, flores,
corteza, y/o frutos.
Así, el aditivo de fosfolipasa se entiende como
una fosfolipasa que no es un constituyente natural de las
principales sustancias del alimento, o que no está presente en
ellas en su concentración natural, es decir, la fosfolipasa se añade
al alimento separadamente de las sustancias del alimento, sola o en
combinación con otros aditivos del alimento, o la fosfolipasa es
una parte integral de una de las sustancias del alimento, pero se
ha producido en ella mediante tecnología de DNA recombinante.
Aditivos de fosfolipasa lista para usar incluyen fosfolipasas que
están en una pro-forma inactiva, pero que pueden
activarse en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, mediante un
proceso proteolítico.
Un alimento preferido contiene fosfolípidos,
preferiblemente lecitina, tal como está presente en los materiales
crudos, como por ejemplo las semillas de soja con toda su grasa,
las semillas de colza con toda su grasa, el aceite de semilla de
soja, el aceite de colza o el aceite rico en lecitina, además de la
fosfolipasa añadida exógenamente, que es preferiblemente fosfolipasa
A2 porcina (producida en microbios). Sin embargo, el alimento no
necesita contener fosfolípidos, ya que el páncreas ya secreta
fosfolípidos.
Es otro aspecto de esta invención que la
fosfolipasa, preferiblemente fosfolipasa A2 porcina (producida en
microbios), se incluya en los sustitutos de leche que contienen
lecitina para animales jóvenes. Esto mejora la digestibilidad de la
grasa por los animales jóvenes.
Es todavía otro aspecto de esta invención que se
incluya una fosfolipasa en las dietas de peces y crustáceos, para
mejorar el crecimiento y la razón de conversión del alimento.
Después del tratamiento con, por ejemplo,
fosfolipasa A2 (PLA2), el valor HLB de la lecitina se eleva desde 7
hasta aproximadamente 8 ó 9, lo que puede contribuir al efecto
beneficioso del tratamiento con fosfolipasa A2 sobre las propiedades
emulsionantes de la lecitina.
La fosfolipasa A2 porcina no exhibe actividad
in vitro por debajo de pH 6,0. El pH prevalente en el tracto
gastrointestinal de los animales monogástricos está por debajo de
6,0 en el buche y el estómago.
Uno no esperaría ningún efecto beneficioso de la
adición de fosfolipasa A2, ya que:
- a)
- no se espera actividad de una fosfolipasa añadida en el buche y el estómago, como consecuencia de una desproporción entre el pH prevalente y la dependencia de pH de la enzima; y
- b)
- los animales por si mismos secretan grandes cantidades de esta enzima en la parte superior del intestino delgado, donde el pH prevalente está en línea con la dependencia de pH de la enzima.
Sorprendentemente, se ha observado que la adición
de fosfolipasa A2 exógena porcina da como resultado una mejoría
marcada en la razón de conversión del alimento en pollos (Ejemplo
3).
Aparte de en los animales monogástricos, la
fosfolipasa A2 también puede utilizarse de forma ventajosa en los
poligástricos. Durante la lactación temprana en vacas de alta
producción de leche, por ejemplo, es de interés incluir niveles
elevados de grasa en sus dietas para compensar en parte los
balances energéticos muy negativos. Se sabe de la literatura que la
digestibilidad de ácidos grasos en el tracto gastrointestinal de
vacas de leche varía en función de la relación de la composición
inter alia y de la fuente de la grasa. Se ha observado que
la digestibilidad de los ácidos grasos varía entre 87% para una
dieta que contiene 500 g de grasa saturada, alta en ácido palmítico
(C16:0), y 64% para una dieta que contiene 1000 g de grasa
saturada, alta en ácido esteárico (C18:0) (Weisbjerg et al.,
Acta Agric. Scand. Section A, Animal Sciences 42 p.
115-120, 1992).
Una gran parte de la variación en la
digestibilidad de los ácidos grasos en vacas de leche, se explica
por las variaciones en la digestibilidad en el intestino delgado
(Ibid, p. 114-120). La acción de la fosfolipasa A2
en el intestino delgado de las vacas de leche parece aumentar la
digestibilidad de los ácidos grasos.
Las proteínas tales como la enzima fosfolipasa A2
son generalmente degradadas rápidamente en la panza. Como
consecuencia, estas proteínas deberían liberarse en el intestino
delgado, como forma de prevenir su degradación en la panza. Un
número de métodos de formulación están disponibles para las
personas expertas en la técnica de protección de enzimas de la
inactivación en la panza.
Se ha observado una mejoría significativa en la
digestibilidad de la grasa en terneras no rumiantes, con la adición
de fosfolipasa, específicamente fosfolipasa A2 porcina (Ejemplo
4).
Las dietas para peces y crustáceos se suplementan
frecuentemente con concentraciones relativamente muy elevadas de
fosfolípidos, para conseguir un crecimiento, salud y conversión del
alimento aceptables. De acuerdo con la invención, la fosfolipasa
puede también añadirse a estas dietas para mejorar el crecimiento y
la razón de conversión del alimento.
Es todavía un aspecto más de la invención que la
adición de fosfolipasa, y opcionalmente fosfolípidos, al alimento
para animales, permite reducir las cantidades de ingredientes caros
del alimento, tales como vitaminas y/o colorantes, que se
incorporan al alimento para animales.
La fosfolipasa puede añadirse al alimento en una
concentración que varía en función del tipo y la concentración de
fosfolípido y del animal diana, generalmente entre alrededor de
1.000 - 5.000.000 unidades internacionales (IU, para definición,
véase el Ejemplo 1), por kg de fosfolípido. En general, el alimento
para animales contiene alrededor de 1-2 g de
fosfolípido por kg. Consecuentemente, un intervalo de 1 - 10.000
IU/kg, o preferiblemente de 10 - 1.000 IU/kg de alimento será
apropiado, sin embargo, el intervalo más preferido está alrededor de
100 - 1.000 IU/kg de alimento. Se sigue que la dosificación de
fosfolípasa añadida al alimento puede ajustarse, en caso de un
contenido inusual de fosfolípidos en el alimento.
En una realización preferida de la invención, la
fosfolipasa se obtiene utilizando tecnología de DNA recombinante.
La fosfolipasa se obtiene de forma recombinante, mediante expresión
heteróloga de un gen de fosfolipasa o cDNA, en un organismo
hospedante adecuado, o, alternativamente, mediante sobreexpresión
homóloga de un gen endógeno adecuado.
Las realizaciones específicas de la presente
invención descritas aquí utilizan fosfolipasa A2 porcina, producida
mediante expresión heteróloga del gen en la levadura
Kluyveromyces lactis. Sin embargo, los expertos entenderán
que las fosfolipasas obtenidas de otras fuentes funcionarán también
en la presente invención. Dichas fosfolipasas pueden derivarse de
otros mamíferos, tales como por ejemplo ratas, ratones o seres
humanos, para todos los cuales están disponibles en la técnica los
genes de la fosfolipasa A2. Alternativamente, las fosfolipasas
pueden derivarse de organismos diferentes de mamíferos, tales como,
por ejemplo, fosfolipasas microbianas o incluso de
plantas.
plantas.
De forma similar, los microorganismos utilizados
para la producción de la fosfolipasa utilizada en la invención no se
limitan necesariamente solo a la levadura Kluyveromyces
lactis. Aparte del K. lactis, se ha referido expresión
heteróloga de la fosfolipasa A2 con éxito en Escherichia coli,
Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus niger (revisado
por Swinkels et al., 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64,
187-201). Es por lo tanto esperable que pueda
obtenerse la expresión exitosa (heteróloga) de las fosfolipasas de
la invención en un amplio rango de microorganismos. Los
microorganismos preferidos para este propósito son las bacterias del
género Bacillus y Escherichia, las levaduras de los
géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia,
Yarrowia, Candida, o los hongos filamentosos de los géneros
Aspergillus, Fusarium, y Trichoderma.
Con respecto a los métodos para la expresión de
las fosfolipasas en materiales de plantas transgénicas,
preferiblemente en semillas, nos referimos a la Solicitud
Internacional WO 91/14772, que describe métodos generales para la
expresión (heteróloga) de las enzimas en plantas, incluyendo
métodos para la expresión de enzimas específicas de semillas.
Los expertos entenderán que la adición de la
fosfolipasa en la forma de material de planta transgénica, por
ejemplo semillas transgénicas que contienen fosfolipasa, puede
requerir el procesamiento del material de planta para hacer
disponible a la enzima, o al menos para mejorar su disponibilidad.
Dichas técnicas de procesamiento pueden incluir diversas técnicas
de molienda y trituración, o tratamientos termomecánicos, tales
como la extrusión o la expansión.
La presente invención no se limita a la
utilización de las cepas de Streptomyces capaces de producir
una fosfolipasa A2 durante la fermentación del ensilado, que
proporciona inter alia las siguientes ventajas:
- -
- Cualquier fosfolípido puede incluirse. Esto permite la utilización de fosfolipasas que son endógenas al animal en el que la enzima va a aplicarse, lo que facilitará la obtención de la aprobación del producto por las autoridades reguladoras.
- -
- Esto permite además seleccionar la fosfolipasa más adecuada para aplicación como aditivo del alimento.
- -
- La necesidad de fermentar el alimento, con objeto de producir la enzima in situ, se obvia. Esto permite controlar con precisión la cantidad de aditivo de fosfolipasa añadida en el alimento, que es importante, a la vista del intervalo de concentraciones de fosfolipasas óptimas en ciertas aplicaciones (véase Ejemplo 3).
- -
- Esto permite una gran flexibilidad en la formulación tanto del aditivo de la enzima como del alimento que la contiene.
- -
- La adición de fosfolipasa A2 de mamíferos proporciona una promoción del crecimiento inesperadamente alta.
La identificación y la clonación molecular del
gen que codifica la proteína fosfolipasa A_{2} porcina, está
descrita en detalle previamente por Geus et al. (Nucl. Acid
Res. 15, 3743-3759, 1987), y van den Bergh
et al. (Eur. J. Biochem. 170,
241-246, 1987).
Con uno de estos clones bien caracterizado, el
pCB08T, que contiene la secuencia de cDNA completa de PLA_{2}, y
elementos reguladores genéticos específicos del
Kluyveromyces, construimos el casete de expresión
pKLAPLA-11, con objeto de obtener la expresión de
PLA_{2} porcina en la levadura Kluyveromyces lactis. Como
la secuencia de cDNA de PLA_{2} y las secuencias para los
elementos reguladores de K. lactis están todos disponibles
en bases de datos públicas, los expertos pueden obtener todos los
materiales requeridos para construir casetes de expresión para la
expresión de PLA_{2} en K. lactis.
Todas las técnicas estándar de clonación, tales
como el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos, la
electroforesis de ácidos nucleicos, la modificación enzimática, la
escisión y/o amplificación de ácidos nucleicos, la trasformación de
E. coli, etc., se realizaron como están descritos en la
literatura (Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: a
laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring
Harbour, New Cork; Innis et al. (eds.) (1990) y "PCR
protocols, a guide to methods and applications" Academic Press,
San Diego). La síntesis de oligo-desoxinucleótidos
y el análisis de la secuencia de DNA se realizaron en un
sintetizador de DNA 380B y en un secuenciador de DNA 373A de
Applied Biosystems, respectivamente, según los manuales de uso
proporcionadas por el fabricante.
Para facilitar la construcción de
pKLAPLA-11, primero se introdujeron lugares de
restricción flanqueantes apropiados, en los extremos de la secuencia
madura de cDNA de PLA, mediante la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR). En el extremo 5', justo en el lugar de escisión
de la proteína PLA_{2} pro- y madura, un lugar SmaI, y en
el extremo 3', justo aguas abajo del codón de terminación, se
introdujeron simultáneamente lugares de restricción XhoI y
KpnI. Para hacer eso, se sintetizaron dos
oligonucleótidos:
La amplificación por PCR se realizó con los
oligonucleótidos 1 y 2 como cebadores, y el pCBO8T como plantilla.
El fragmento amplificado obtenido de 400 pares de bases de cDNA de
PLA, se digirió con SmaI y KpnI, y posteriormente se
insertó en los lugares apropiados de pTZ18R mediante clonación
molecular. El vector resultante se denominó pPLA-1.
Este fragmento modificado de cDNA de PLA se secuenció
completamente, para verificar la reacción de amplificación por PCR,
y los lugares de restricción flanqueantes introducidos.
Para introducir un lugar de restricción
SalI, y las secuencias óptimas de iniciación de la
traslación de la levadura, en el extremo 5' de la secuencia de
prepro-señal de PLA_{2}, se sintetizaron dos
oligonucleótidos sintéticos complementarios.
Después de la reasociación de estos dos
oligonucleótidos, el fragmento de DNA de doble cadena obtenido se
clonó molecularmente en los lugares apropiados (SalI y
SmaI) de pPLA-1. El plásmido obtenido se
denominó pKLAPLA-5 y comprendía el cDNA de
preproPLA_{2} completo, flanqueado en el extremo 5' por un único
lugar de restricción SalI, y en el extremo 3' por un lugar
de restricción XhoI.
Para la expresión de PLA_{2} porcina en K.
lactis, se utilizó el potente promotor de lactasa (P_{LAC})
de K. lactis. Además de la producción de lactasa en K.
lactis, esta secuencia promotora P_{LAC} había sido utilizado
previamente para expresar quimosina bovina (Berg van den J. et
al., 1990, Bio/Technol. 8, 135-139), y
albúmina sérica humana (HSA) en K. lactis. Para la expresión
de HSA, se construyó el plásmido pGBHSA-20, que se
ha descrito previamente por Swinkels et al., 1993 (Antonie
van Leeuwenhoek 64, 187-201).
Para la expresión de HSA en K. lactis, la
secuencia de cDNA de HSA, en pGBHSA-20, se dirigió
por el promotor LAC4 de K. lactis. El extremo 3' del
cDNA de HSA está flanqueado por las secuencias de terminación de
LAC4. Además, para la selección de células trasformadas, el
pGBHSA-20 contiene el gen fosfotransferasa
Tn5, que confiere resistencia al antibiótico G418
(Geneticin, BRL; Reiss et al. (1984) EMBO J. 3,
3317-3322), dirigido por el promotor ADH1 de
S. cerevisiae (Bennetzen y Hall (1982) J. Biol. Chem.
257, 3018-3025). En el único lugar
SstII del promotor LAC4, el pGBHSA-20
contiene el vector de E. coli pTZ19R, que se utiliza para la
amplificación en E. coli. Antes de la trasformación del K.
lactis, se eliminaron las secuencias pTZ19R de E. coli
del pGBHSA-20, mediante digestión con SstII y
purificación en gel de agarosa. La trasformación del
pGBHSA-20 hecho lineal en el lugar SstII del
promotor LAC4 en el K. lactis, da como resultado la
integración en el promotor LAC4 genómico, mediante
recombinación homóloga.
Para la expresión de PLA_{2} porcina en K.
lactis, la secuencia preproPLA_{2} se fusionó apropiadamente
a la secuencia del promotor de lactasa de K. lactis en
pGBHSA-20. Entonces el pGBHSA-20 se
digirió con SalI y XhoI, y la secuencia de cDNA de
HSA se sustituyó por el fragmento de DNA SalI-XhoI de
pKLAPLA-5 mediante clonación molecular. Como se
describió anteriormente, este fragmento de DNA
SalI-XhoI de pKLAPLA-5, contiene la
secuencia de codificación de preproPLA_{2}. El vector de
expresión final para PLA_{2} se denominó
pKLAPLA-11.
Las levaduras trasformadas se generaron mediante
procedimientos como los descritos en nuestra solicitud de patente
publicada EP-A 0 635 574, que están basados en los
métodos de Ito H. et al. (J. Bacteriol. 153,
163-168, 1983). El pKLAPLA-11 se
hizo lineal en el promotor de LAC4, mediante digestión con
SstII. Las secuencias de pTZ19r se eliminaron mediante
fraccionamiento y purificación en geles de agarosa. Se
transfirieron 15 \mug de este fragmento de DNA a las cepas CBS
2360 y CBS 683 de K. lactis, y se obtuvieron colonias
resistentes a G418 de ambas cepas, después de incubación a 30ºC
durante 3 días.
Un número limitado de células trasformadas de
cada cepa hospedante se seleccionó inicialmente, para analizar la
expresión de PLA_{2} porcina activa en el medio de cultivo. Las
células trasformadas se inocularon en medio de cultivo de K.
lactis YEPD, que contenía: 1% (p/v) de extracto de levadura; 2%
(p/v) de peptona; 2% (p/v) de glucosa, y 50 \mug/ml de G418.
Después de 3 días de crecimiento a 30ºC, los sobrenadantes se
recolectaron y se analizaron para la presencia de PLA_{2},
mediante el ensayo de actividad de yema de huevo, como se describe
más adelante, después del tratamiento de las muestras con tripsina.
La escisión del pro-péptido es necesaria para
activar la pro-enzima inactiva (producida por las
K. lactis trasformadas), a PLA_{2} activa, madura.
Todos las células trasformadas parecían producir
PLA_{2} porcina activa, en el intervalo desde 5 hasta 40 U/ml.
Una unidad (IU) se define como la cantidad de
enzima que produce 1 micromol de ácidos grasos libres por minuto,
bajo condiciones estándar: sustrato de yema de huevo (0,4% de
fosfolípidos), pH 8, 40ºC, Ca^{2+} 6 mM.
El cultivo de Kluyveromyces lactis se
sometió a filtración de placa, seguida de ultrafiltración. El
ultrafiltrado se trató con tripsina al 0,3% a pH 8,0, en presencia
de CaCl_{2} 10 mM, durante 2,5 horas, lo que dio como resultado la
eliminación del heptapéptido de la pro-enzima para
la activación de la enzima.
Se añadieron ácido benzoico y ácido sórbico como
conservantes a pH 4,0, y la actividad tripsina restante se inactivó
durante 30 minutos a 70ºC. El producto final es pardo y contiene
una actividad de 10.000 IU/ml.
La estabilidad de esta preparación puede
mejorarse mediante posterior purificación y almacenamiento a baja
temperatura. Después de un mes de almacenamiento a 4ºC, no se
observa pérdida de actividad enzimática.
Se llevaron a cabo ensayos con pollos, para
analizar la eficacia de la fosfolipasa A2. Se mantuvieron pollos
machos (Ross) desde el día 1 hasta el día 5 en una dieta estándar.
En el día 5, se seleccionaron animales de este grupo y se dividieron
en jaulas. Se tomó en cuenta el peso de los animales y su
variación. El peso medio y su desviación eran iguales en cada
jaula. Quince animales se mantuvieron en una jaula. Las jaulas se
situaron en una casa para pollos calentada, ventilada e iluminada
artificialmente. El espacio de suelo de cada jaula era de 0,98
m^{2}, con suelos de alambre. La casa para pollos estaba
iluminada durante 24 horas al día. Durante el periodo experimental,
la intensidad de la luz se redujo gradualmente. La temperatura se
redujo gradualmente desde 28ºC durante la primera semana, a 23ºC
durante la última semana del experimento. La humedad en la unidad
de pollos era aproximadamente del 60% durante el periodo
experimental. Los animales habían sido vacunados contra la
enfermedad de New Castle, utilizando un método de aerosol, a una
edad de uno y catorce días respectivamente. El experimento duró 33
días, comprendiendo un periodo de pre-tratamiento de
5 días y un periodo de ensayo de 28 días.
Las dietas experimentales se ofrecieron ad
lib a los animales. El agua estaba disponible libremente.
El alimento era en bolas frías (se mantuvieron
las temperaturas por debajo de 65ºC), de un diámetro de 3 mm.
El experimento comprendía los siguientes
tratamientos:
a) dieta de maíz/trigo/soja (testigos
negativos)
b) dieta de maíz/trigo/soja + 100 IU/kg
c) dieta de maíz/trigo/soja + 500 IU/kg
Cada tratamiento se repitió seis veces (90
pájaros por tratamiento en total). Se midieron la ganancia de peso
y la conversión del alimento. La composición del alimento utilizado
se muestra en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| Ingredientes | Contenido (%) | |
| Maíz | 25,00 | |
| Trigo | 15,00 | |
| Aceite de soja | 3,50 | |
| Grasa animal | 2,00 | |
| Manioco | 11,68 | |
| Harina de soja (50% de proteína cruda) | 19,45 | |
| Semillas de soja tostadas con toda su grasa | 10,00 | |
| Comida de pescado | 1,00 | |
| Comida de carne, elevado aceite | 4,00 | |
| Guisantes | 5,0 | |
| Premezcla de vitaminas/minerales | 1,00 | |
| Piedra caliza | 0,82 | |
| Fosfato monocálcico | 1,00 | |
| Sal (NaCl) | 0,30 | |
| DL-metionina | 0,25 | |
| \overline{100,00} | ||
| ME de pollos (MJ/kg) | 12,55 | |
| Proteína cruda (%) | 22,1 | |
| Grasa cruda (%) | 9,6 | |
| Lisina (disponible) (%) | 1,23 (1,04) | |
| Metionina + Cisteína (disponibles) (%) | 0,91 (0,79) |
La enzima se añadió a esta dieta, mezclándola
primero con un excipiente.
Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Se llevó a cabo un segundo experimento, idéntico
en esencia al descrito previamente, en el que se utilizó una dieta
de trigo/centeno/soja, como la especificada en la Tabla 3, como
dieta básica.
El experimento comprendía los siguientes
tratamientos:
a) dieta de trigo/centeno/soja (testigos
negativos)
b) dieta de trigo/centeno/soja + 100 IU/kg
c) dieta de trigo/centeno/soja + 500 IU/kg
d) dieta de trigo/centeno/soja + 1000 IU/kg
Todos los demás parámetros fueron los mismos que
los utilizados en el experimento anterior con la dieta de
maíz/trigo/soja.
| Ingredientes | Contenido (%) | |
| Trigo | 40,00 | |
| Centeno | 10,00 | |
| Aceite de soja | 1,00 | |
| Grasa animal | 6,00 | |
| Manioco | 4,28 | |
| Comida de semilla de soja (45,4% de proteína cruda) | 22,00 | |
| Semillas de soja tostadas con toda su grasa | 10,00 | |
| Comida de carne (58% de proteína cruda) | 3,00 | |
| Premezcla de vitaminas/minerales | 1,00 | |
| Piedra caliza | 0,94 | |
| Fosfato monocálcico | 1,20 | |
| Sal (NaCl) | 0,26 | |
| L-lisina HCl | 0,11 | |
| DL-metionina | 0,21 | |
| \overline{100,00} | ||
| ME de pollos (MJ/kg) | 11,9 | |
| Proteína cruda (%) | 21,4 | |
| Grasa cruda (%) | 10,5 | |
| Lisina (disponible) (%) | 1,23 (1,05) | |
| Metionina + Cisteína (disponibles) (%) | 0,90 (0,77) |
La enzima se añadió a esta dieta, mezclándola
primero con un excipiente.
Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Como se muestra en la Tabla 4, hay un óptimo en
el intervalo de las concentraciones de fosfolipasa que deben
utilizarse en esta dieta particular para pollos, es decir, más de
alrededor de 100 IU/kg de alimento y menos de alrededor de 1000
IU/kg de alimento. Para otros sistemas, pueden existir diferentes
óptimos, que pueden determinarse mediante experimentos de
rutina.
Se llevó a cabo un experimento, utilizando 3
grupos de 5 terneras machos Friesian Dutch
Holstein-Friesian cada uno.
Durante el periodo
pre-experimental, se administró un sustituto de
leche comercial. Después de 14 días, los animales se dividieron
para recibir tres tratamientos, teniendo en cuenta el peso y las
variaciones en el peso. Los animales se mantuvieron en cuadras
individuales. El establo estaba iluminado naturalmente; se
ventilaba, y se mantenía a una temperatura de alrededor de
18ºC.
Los animales se adaptaron a su dieta durante 14
días. Posteriormente, las heces se recolectaron cuantitativamente
durante 5 días consecutivos, durante 24 horas al día. Las terneras
se guarnicionaron antes del periodo experimental. Las heces se
recolectaron en bolsas de plástico enganchadas a los arneses. Una
vez al día, las heces se pesaron, se juntaron y se almacenaron a
-20ºC. Antes del análisis, las heces se mezclaron concienzudamente y
se subdividieron.
Los animales se alimentaron individualmente,
según su peso, siguiendo un esquema de alimentación. El sustituto de
leche utilizado tenía la siguiente composición:
| % | |
| Leche en polvo desnatada | 58,5 |
| Grasa | 19,8 |
| Lactosa | 17,6 |
| Almidón. Vitaminas, minerales | 4,1 |
| ME | 4450 kcal/kg |
| Proteína cruda (N*6,25) | 21,5% |
| Grasa cruda | 19,5% |
El polvo de sustituto de leche se mezcló con agua
antes de administrarlo como alimento, a una temperatura de alrededor
de 40ºC.
Según este tratamiento, la grasa consistía en 18%
de grasa bovina, grasa de coco o manteca. Se añadió lecitina a una
concentración del 10% del contenido graso.
Se añadió fosfolipasa A2 porcina a estas dietas,
a una concentración final de 500 IU/kg de sustituto de leche. Se
midió la digestibilidad de la grasa. Los resultados se muestran en
la Tabla 5.
Tabla
5
Los efectos del tratamiento con fosfolipasa A2
sobre la digestibilidad de varias grasas, en terneras no rumiantes
que reciben el 18% de grasa en sus dietas y 1,8% de lecitina (10%
del contenido graso). La fosfolipasa A2 se preparó como se mostró
en el ejemplo 2, y se añadió a la dieta a una concentración final de
500 IU/kg de sustituto de leche.
| Sin fosfolipasa A2 | Con fosfolipasa A2 | |
| Grasa bovina | 70,0% | 73,1% |
| Grasa de coco | 95,6% | 96,2% |
| Manteca | 79,4% | 84,3% |
(1) INFORMACION GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Gist-brocades B. V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Wateringseweg 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Delft
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CODIGO POSTAL (ZIP): 2611 XT
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TELÉFONO: +31-15-2799111
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFAX: +31-15-2793957
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: Aplicación de las fosfolipasas en los alimentos
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskippara animales
\hfill
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cmTGTCATGCCC GGGCATTATG GCAGTTTCGT
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cmAGTCCTCGGT ACCTCGAGTC AGCAGTACTT CTTGGTGTC
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (L)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (M)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (N)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (O)
- NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (P)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Un procedimiento para mejorar la eficacia de
la utilización del alimento, en el que un animal es alimentado con
una dieta, que comprende una composición obtenible mediante un
procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa
listo para usar, con la sustancia del alimento.
2. Un procedimiento para promover el crecimiento
de animales. en el que un animal es alimentado con una dieta, que
comprende una composición obtenible mediante un procedimiento, que
comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa listo para usar, con la
sustancia del alimento.
3. Una composición de alimento para animales, que
mejora la eficiencia de utilización del alimento, obtenible mediante
un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa
listo para usar, con la sustancia del alimento.
4. Una composición de alimento para animales, que
promueve el crecimiento, obtenible mediante un procedimiento, que
comprende mezclar un aditivo de fosfolipasa listo para usar, con la
sustancia del alimento.
5. Una composición según las reivindicaciones 3 ó
4, que comprende fosfolípido.
6. Una composición según la reivindicación 5, en
la que el fosfolípido comprende lecitina.
7. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en la que la fosfolipasa es obtenible de un
mamífero, una planta o un microorganismo.
8. Una composición según la reivindicación 7, en
la que la fosfolipasa es una fosfolipasa A2 de mamífero,
seleccionada del grupo que comprende fosfolipasa A2 bovina,
porcina, murina, de rata o humana.
9. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 8, en la que la fosfolipasa es obtenible
mediante expresión de DNA recombinante en un organismo
hospedante.
10. Una composición según la reivindicación 9, en
la que el organismo hospedante es un microorganismo, seleccionado
del grupo que comprende bacterias, levaduras y hongos
filamentosos.
11. Una composición según la reivindicación 10,
en la que el microorganismo es de un género seleccionado de
Bacillus, Escherichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula,
Pichia, Yarrowia, Candida, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium,
Mucor, Fusarium y Humicola.
12. Una composición según la reivindicación 11,
en la que el microorganismo es Escherichia coli, Saccharomyces
cerevisiae, Kluyveromyces lactis o Aspergillum
niger.
13. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 9, que comprende material de planta, que
contiene la fosfolipasa obtenible de una planta transgénica.
14. Una composición según la reivindicación 13,
que comprende las semillas de una planta transgénica, que contiene
fosfolipasa obtenible mediante expresión de DNA recombinante.
15. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 14, que comprende desde 1.000 hasta 5.000.000
de Unidades Internacionales de fosfolipasa por kg de
fosfolípido.
16. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 18, en la que el aditivo de fosfolipasa está
presente a una concentración en el intervalo de 100 a 1000 Unidades
Internacionales por kg de alimento.
17. Un procedimiento para la producción de un
alimento para animales, según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 16, que comprende mezclar una fosfolipasa
lista para usar, con la sustancia del alimento.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17,
que comprende mezclar una fosfolipasa lista para usar con la
sustancia del alimento y al menos con un fosfolípido.
19. Un procedimiento según las reivindicaciones
17 ó 18, en el que la fosfolipasa se produce de forma
recombinante.
20. Un procedimiento según la reivindicación 19,
en el que la fosfolipasa se añade en forma de material de planta
transgénica.
21. Un procedimiento según la reivindicación 20,
en el que el material de planta transgénica es procesado para hacer
disponible la fosfolipasa.
22. La utilización de una composición obtenible
mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de
fosfolipasa lista para usar, con la sustancia del alimento, para
alimentar a animales no rumiantes.
23. La utilización de una composición obtenible
mediante un procedimiento, que comprende mezclar un aditivo de
fosfolipasa listo para usar, con la sustancia del alimento, para
alimentar a terneras no rumiantes.
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|---|---|---|---|
| EP95201266 | 1995-05-15 | ||
| EP95201266 | 1995-05-15 | ||
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| EP95202442 | 1995-09-08 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2229252T3 true ES2229252T3 (es) | 2005-04-16 |
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