TW480175B - Application of phospholipases in animal feed - Google Patents

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TW480175B
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Robert Franciscus Beudeker
Arie Karst Kies
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Gist Brocades Bv
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Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480175 A7 ____B7_ 五、發明説明（1 ) 發明領域 本發明是有關在家畜飼料中應用酵素。 發明背景 在動物的胃腸道中分泌許多酵素以消化食物。這些酵 素各自作用在部份胃腸道特殊環境之特異組份上。例如， 胃蛋白酶，在胃的酸性環境中具活性，而其他的蛋白酶如 胰凝乳蛋白酶及羧基肽酶在p Η 6 - 7的小腸上半部份具 有活性。此類酵素有許多在被活化前需有前軀體。如胃蛋 白酶，僅在酸性環境中才自胃蛋白酶原形成。胰凝乳蛋白 酶及羧肽酶均以未活化型式分泌，且由蛋白酶胰蛋白酶所 活化。 脂質的水解是個複雜的過程。動物飼料中大部份的脂 質可呈三甘油酯型式應用。這些三甘油酯若非完全也是極 難爲小腸所吸收，且需降解成單，及二甘油酯，甘油及自 由態脂肪酸。此轉化作用可由酵素脂酶所催化，其係由胰 臟所分泌。此酵素在水及油之界面處活化。於食物消化時 ，在油水乳液中需有極小之油滴。乳化劑爲一種界面活性 劑，可將脂質分散在水相中。在胃腸道中最重要的乳化劑 是膽汁。膽汁由肝分泌且可貯存於膽囊中。膽汁中含有膽 酸及鹽類，膽固醇及磷脂類。小粒子-微團-由膽汁組份 與（其餘的）三甘油酯產物之混合所形成。 這些微團可擴散至空腸上皮細胞，在此其內容物被釋 出並吸收。在這些上皮細胞中，三甘油酯被重新組成。加 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480175 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
素 膽 II X X I 〇 I 〇=P I〇 I ο Η ο I I I Hmc— · - — — - —c—Η I I I Η 〇 H I c =〇 1 2 R A 7 __ B7 五、發明説明（2 ) 上膽固醇，膽固醇酯，磷脂及蛋白質，其可形成新的水溶 性粒子，稱之爲乳糜微膠粒。 磷脂，如卵磷脂可由磷脂A及B作用而酵素水解，其 也由胰臟所分泌。 卵磷脂爲極性及中性脂質之混合物，其中極性脂質之 含量至少6 0 %。由於其疏水性/親水性特色，極性脂質 (及因此之卵磷脂）可充作乳化劑。極性脂質包括（甘油 )磷脂及糖脂。甘油磷脂之基本結構如下：
乙醇胺 肌醇 絲胺酸 氬 甘油磷脂基本上由甘油部份與C 1 一及c 2位置上的 脂肪酸組成。C 3 —位置以磷酸脂化。此磷酸常以醇基連 接，由此產生以下化合物： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）
480175 A7 ______B7 五、發明説明（3 ) -磷脂醯基 一乙醇胺 ( P E ；X : =乙醇胺） 一鱗脂酿基 一膽驗 ( P C ；X : =膽鹼） -磷脂醯基 一弱胺酸 ( P S ；X : =弱胺酸） -磷脂醯基 一肌醇 ( P I ；X : =肌醇） -磷脂醯基 -酸 ( P A ；X : =氫） 僅攜一個（而非一般的二個）脂肪酸殘基的甘油磷脂 稱爲溶血一磷脂。 卵磷脂在許多應用中作爲乳化劑之用，包括食物及飼 料。乳化劑爲界面活性物質，其可使油液相分散在水相中 。乳化劑在相同分子內具有親水及親脂基。親水基對親脂 基之比例，已知爲H L B値，爲乳化劑特色之指示。 脂溶性疏水性乳化劑，具有0至少於1 0之H L Β値 ，而水溶性化合物具有1 0以上及2 0間之H L Β値。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如卵磷脂之乳化劑加至動物飼料中可達成使飼料的營 養値改善，或使得在液態飼料例子中有更佳的分散。也已 知可將溶血卵磷脂加至動物飼料中（由Kemin公司以1^5〇-f ο Γ t e ®之商品名出售），其有改善的乳化特性，使得可 有更佳的營養價値（Pluimveehouderij 24:20-21，Marc-hlS, 1994 ) 。 卵磷脂之乳化特性不僅可因將卵磷脂以乾比例納入而 利用於家畜之產製上，也可應用於動物是給予含大量脂質 之液態飼料例領域中。這些是牛主要的乳汁代替物，及小 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 480175 A7 B7 五、發明説明（4 ) 豬之牝豬乳汁代用物。卵磷脂的功能是在即可製備之液態 飼料中產生儘可能細緻的脂質分散相。細緻的分散相使動 物對脂質有改善的消化力。此外，卵磷脂在將不溶性組份 沈澱在液態飼料之時呈現有益的作用。 近年來，飼料工業開始使用由工業產生之酵素來補充 在動物胃腸道產生之酵素。實例包括肌醇六磷脂酶，α 一 澱粉酶，蛋白酶，及各種植物細胞壁降解酵素。然而，在 先前的技藝中並無一處描述將磷脂直接加至動物飼料中以 促進動物之生長，因爲動物本身已在小腸之上半部位分泌 大量這些酵素。 在ΕΡ—Α-0 619 079中掲示特別是使用 磷脂爲顆粒劑之外層，而此中含有具生物活性之物質以納 入反芻類之飼料中。外層可保護生物活性物質於瘤胃中， 使得其接下來的消化及吸收可經由第四胃後之消化器官。 ΕΡ—Α 0 619 079中進一步揭示視所需的磷 脂酶也可納入保護性外層中以助其水解，然而，Ε Ρ — A 一 〇 6 1 9 079中並未揭示或建議磷脂酶可加至飼 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 料中以促進生長，或改善飼料利用之效率。 GB—A-2 267 033是有關促進生長，然 而，GB — A - 2 267 033敎示將含有磷脂卵磷 脂加上鏈霉菌之套組加至秣草中。其中建議，鏈霉菌可在 秣草之醱酵中產生磷脂酶A 2。但此中該套組之使用受動 物飼料之限制，即產製過程需包括一個醱酵階段，其係與 由該鏈霉菌產生之磷脂相容。因此，爲改善飼料利用率及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^格（210x 297公釐） ~ 一 480175 A7 B7 五、發明説明（5 ) /或促進動物之生長，此中仍需有可廣泛應用，多方面且 即可用之磷脂酶飼料添加物。 發明要點 本發明提出改善飼料利用率之過程，其中動物所餵食 之飼料包括由飼料物質及即可用之磷脂酶添加物所組成之 組成物。 本發明也提出促進動物生長之過程，其中動物所餵食 之飼料包括由飼料物質及即可用之磷脂酶添加物所組成之 組成物。 本發明進一步提出一種動物飼料組成物，其中含有飼 料物質及即可使用之磷脂酶添加物。 此外本發明提出產生動物飼料之方法，此方法包括在 微生物或導入外來基因之植物中重組產生磷脂酶，並將如 此得到之磷脂酶與飼料物質混合。 詳細說明 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之法意事項再填寫本頁) 本發明揭示動物飼料中，外加的及即可使用的磷脂酶 之用法，以改善胃腸道中磷脂之乳化特性，由是改善飼料 利用效率及/或促進動物生長。因此促進動物生長在此定 義爲促進生長是依時間變化之獲重（生長速率）及/或促 進生長是依飼料效率（飼料轉換率）而言。 可應用於本發明的磷脂酶包括：磷脂酶A 1 (EC 3 · 1 · 1 · 3 2 )，磷脂酶A 2，磷脂酶B (溶血磷脂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐） 480175 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（6 ) 酶），磷脂酶C及磷脂酶D。 特言之，本發明揭示應用其中加有磷脂酶A 2之飼料 (EC，3 · 1 . 1 · 4)。磷脂酶A2之產生可分離自 豬之胰臟，可爲胰島素產製中之副產物。另外，磷脂酶 A 2可以重組體方式產生，係在微生物如乳酸克魯維酵母 中表現異質基因而得。酵素利用醱酵可自此微生物中獲得 ，並順流處理以回收酵素。 將磷脂酶外加至含卵磷脂動物飼料的另一個可能性是 加含有導入外來基因植物物質之磷脂酶，較好是導入外來 基因之種子，其中磷脂酶經由異質基因表現而合成。爲獲 得此，將編碼磷脂酶之基因選殖於植物表現載體內，並在 適合的植物表現訊號控制之下，如組織特異的啓動子，如 種子特異的啓動子。含有磷脂酶基因之表現載體接下來轉 形至植物細胞內，再選擇經轉形之植物以再生成完整植物 。如此得到的導入外來基因之植物可生長及回收，且含有 異質磷脂酶之植物部位可包括在動物飼料中，可呈此型式 或經過進一步處理才納入。異質的磷脂酶可含於導入外來 植物之種子中，或其可含於其他植物物質中，如根，莖， 葉，木材，花，樹皮及/或果實。 此種磷脂酶添加物經了解表示磷脂酶，其並非主要飼 料物質之天然組份，或並非以其天然濃度含於此，如磷脂 酶與飼料物質分別加至飼料中，可單獨地或配合其他的飼 料添加物，或者磷脂酶是飼料物質之一的完整部份，但在 其中係以重組體D N A技術所產製的。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）
480175 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 即可用的磷脂酶添加物在此定義爲在動物飼料中並非 於原位產生之添加物。即可用的磷脂酶添加物可直接加入 動物飼料中，較好在與其他飼料組份混合後直接加入。即 可用的磷脂酶添加物包括呈不活化原型之磷脂酶，但其可 於G I道中活化，如經由蛋白水解處理修飾。 較佳的飼料含有磷脂，較好是卵磷脂，呈原料型式存 在如全脂之大豆，全脂之油菜籽，大豆油，油菜籽油或其 他任一種油籽或富含卵磷脂（除了外加之磷脂酶外）之油 ，其較好是（微生物產製的）豬磷脂酶A2。然而，飼料 並不需含有磷脂，因爲胰臟已可分泌磷脂。 在本發明另一方面，磷脂酶，較好是（微生物產生的 〉豬磷脂酶A 2，包括在含有卵磷脂之乳汁替代物中，以 用於年幼的動物。此可改善年幼動物對脂質之消化力。 又本發明另一方面是將磷脂酶包括在魚及甲殼類之食 物中，以改善生長及飼料轉換率。 在以如磷脂酶A2 (PLA2)之處理下，卵磷脂之 HLB値可由7升至約8或9，其可在卵磷脂之乳化特性 上對磷脂酶A 2處理提供益處。 豬磷脂酶A 2在pH 6 · 0以下之試管內未呈現任何 活性。單胃動物G I道內普遍的PH値在鳥之滕囊及胃內 爲6 · 0以下。 吾等對於磷脂酶A 2之添加並不預期有任何益處因爲 a )由於在普遍的p Η及酵素的P Η依賴性間有失誤 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 >< 297公釐） in . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
480175 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 之結果因此在鳥的滕嚢及胃中添加磷脂酶並不預期有活性 ;及 b)動物本身可在小腸上半段分泌大量的此種酵素， 在此普遍的P Η値與酵素之P Η依賴性調和。 令人驚訝地，頃發現添加外來的豬磷脂酶A 2，可在 嫩雞中造成飼料轉換率顯著地改善。 除了單胃動物，磷脂酶A 2也可有益地應用於多胃動 物中。例如，在高產量之乳牛早期泌乳中，令人感興趣的 是在其食物中納入高水平的脂質，以部份補償大的負面能 量平衡。由文獻中已知，乳牛G I道內脂肪酸之消化力， 特別是以脂質之比例組成及來源呈函數關係而變化。頃發 現脂肪酸之消化力在含有5 0 0克富含棕櫚酸（C 1 6 : 0 )之飽和脂質食物的8 7%及含有1 0 0 0克富含硬脂 酸（C 1 8 : 0 )之飽和脂質食物的6 4 %間變化（We i -s b j e r g e t a 1 . , Acta A g r i c. S c a n d. Section A, Animal Sciences 42;p. 115-120, 1992) 0 乳牛脂肪酸消化力上的變化大部份可由小腸中消化力 之變化來解釋（同上，P114 — 120)。乳牛小腸中 磷脂酶A 2之作用似乎是加强脂肪酸之消化力。 蛋白質如酵素磷脂酶A 2通常可在瘤胃中快速降解。 因此，這些蛋白質應可以避免在瘤胃中降解之方式遞送至 小腸。許多調和方法可爲精藝者所應用，以保護酵素免於 在瘤胃中被失去活性。 由加上磷脂酶，尤其是豬磷脂酶A 2至非反芻牛，頃 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480175 A7 B7 五、發明説明（9 ) 發現對脂質之消化力有顯著的改善。（實例4 ) 魚及甲殼類之食物中也常添加相當高濃度之磷脂類， 以達到可接受之生長，健康及飼料轉換。依據本發明，碟 脂類也可加至這些食物中，以進一步改善生長及飼料之轉 換率0 又本發明進一步方面是添加磷脂酶及視所需之磷脂至 動物飼料中，可減少昂貴磷脂組份之量，如維生素及/或 著色劑。 磷脂酶添加至飼料內之濃度，可依磷脂之型式及濃度 及標的動物而變化，通常每公斤磷脂在約1 ，0 0 0 — 5，0 0 0，0 0 0國際單位之間（I U，其定義見實例 1)。較好每公斤磷脂內加約10，000 — 5 0 0，0 0 0 IU。一般而言，動物飼料中每公斤含有 約1 一 2克的磷脂。因此，每公斤飼料1 一 1 0，〇 0 0 IU，或較好1 0 — 1，0 0 0 IU是適合的，然而最佳 的範圍是每公斤約10 0 — 1 ，0 0 0 IU。在不尋常的 飼料磷脂含量例子中，可調整所添加之磷脂酶劑量。 於本發明一個較佳具體實例中，磷脂酶是利用重組體 DNA技術所獲得的。磷脂酶之重組產製係在適合的宿主 有機體中表現磷脂酶基因或c DNA，或者，將適合的內 源基因行同源之過度表現。 本發明此中所述之特異具體實例是使用豬之磷脂酶 A2，其係在乳酸克魯維酵母中行異質基因表現所產製的 。然而，精藝者應了解，由其他來源所得之磷脂酶在本發 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 0 12 480175 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 附件la :第851〇7433號專利申請案中文說明書丨|爹正頁 民國88年1月呈氣f 五、發明説明（1() ) 1 … . 明中也可作用。此種磷脂酶可衍生自其他哺乳動物，如大 鼠，老鼠，或人類，此中所有的磷脂酶A2基因均爲技藝 中可應用的。另外，磷脂酶可衍生自哺乳動物以外的有機 體，如微生物，或甚至是植物磷脂酶。 類似地，用於產製本發明所使用之磷脂酶之微生物， 並不需限制於乳酸克魯維酵母。除了乳酸克魯維酵母，已 在大腸桿菌，釀酒酵母及黑曲霉中報告豬磷脂酶A 2基因 成功的異質表現。（總覽可見Swinkeles et al. 1993, A ntonie van Leeuwenhoek 6 4, 1 8 7-2 0 1 )。因此預期本發 明磷脂酶可在各樣微生物中獲得成功的（異質）表瑪。基 於此目的，較佳的微生物爲芽孢桿菌及大腸桿菌屬，酵母 屬，克魯維酵母屬，漢遜酵母屬，畢赤酵母屬，Yarrowia 屬，假絲酵母屬或曲霉屬，鐮孢及木霉屬等有菌絲之真菌。 關於磷脂酶在導入外來基因之植物物質中表現之方法 ，較好在種子中，可參見國際申請案 W 0 91 / 14772，其已列爲此中參考，且其中揭 示酵素於植物中（異質）表現之一般方法，包括酵素之種 子一特表現方法。 精藝者應了解，磷脂酶呈導入外來基因之植物物質型 式般加入，如含有磷脂酶呈導入外來基因之種子，需將植 物物質處理修飾以使酵素可被利用，或至少是改善其利用 率。此種處理修飾技術包括各種輾磨及磨擦技術，或熱機 械處理如延展或擴大。 本發明在秣草之醱酵中並不限於使用可產生磷脂酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公势4 13 了 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 、11 480175 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（11 ) A 2之鏈霉菌，其特別是提供以下優點： -可包括任何的磷脂酶。如此可使用內源於動物之磷脂 酶，其中欲應用酵素，其有助於自調控當局獲得產物許可。 -此進.一步可選出最適合充作飼料添加物使用之磷脂 酶。 -可排除爲於原位產生酵素而醱酵飼料之必要。因而 可精確地控制飼料中磷脂酶添加物之量，此在某些應用中 使磷脂酶濃度達最佳範圍之觀點下十分重要（見實例3 )。 -此在調和酵素添加物及含彼之飼料上極具彈性。 -添加哺乳動物之磷脂酶A 2，對於生長促進有、意外 的高度作用。 生長增重，飼料攝取量及飼料轉換率之實驗結果予以 統計分析。測試組各組數據之間的差異顯著性係根據最低 t; Snedecor & Cochran, 1 9 80)分析其偏差。利用電腦 程式SPSS/PC，5.〇版（Norusius, 1 9 9 2 )計算偏差值之分 析結果。所有顯著性之統計係根據或然率P < G. 0 5。 乳替代品中使用磷脂酶A 2之試驗結果，係採用學生 t -試驗法予以成對方式統計分析。 本說明書提供之實例僅供說明之用，不欲在任一方面 限制本發明之範圍。 實例1 於乳酸克魯維酵母 (Kluvveronivces lactis) 中表現藉爾 脂酶 A 9 C P L A ,) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公兑士 14= ~ 一 • 1— I - - I--II』 •φφ— 請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁 、1Τ 4·—.
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480175 五、發明説明（12 ) 編碼豬磷脂酶a2蛋白質之基因，其本質及分子選殖 在先前已詳述於 Geus et al. (Nucl. Acid Res. 15， 3743-3759, 1987)及van den Bergh et al· (Eur· J·
Biochem 1 7 0, 24 1 -246, 1 9 87 )。 以這些充份鑑定的純系之一，p CB 0 8T，其含有 完整的PLA2 cDNA序列及克魯維酵母特異之遺傳控 制要件，吾等構築表現匣pKLAPLA — 11 ，以在乳 酸克魯維酵母中獲得豬PLA2之表現。關於PLA2 c D N A序列及乳酸克魯維酵母調控要件之序列，均可在 公開之資料庫中獲得，精藝者可得到構築表現匣以在、乳酸 克魯維酵母中表現P L A2所需的所有物質。 所有標準的分子選殖技術，如核酸之分離及純化，核 酸之電泳，酵素修飾，核酸之解離及/或擴大，大腸桿菌 之轉形等，吾等均依文獻所述進行（Sambrook et al.( 1989) "Molecul ar Cloning： a laboratory manual*丨，Co d Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbo-r，New York; Innis et al· (eds.)(1990)及"PCR prot-ocols, a guide to methods and applications" Acade-m i c P r e s s, S a n D i e g o )。寡一去氧核替酸之合成及 D N A 序列分析，可在 Applied Biosystems 3 80 B DNA合成儀及3 7 3A DNA定序儀上，依廠商供應 之使用者手冊分別進行。 爲促進pKLAPLA-11之構築，第一個適合的 兩側限制位置經聚合酶鏈反應（P C R )引入成熟的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS M4規格（ 210X 297公t 4 15 一 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁)
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（13 )......... ’—' 一 …——·…— PLAcDNA序列之界線。在5，一界線，就在前一及 成熟的PLA2蛋白質解離位置處，有一個Sma I位置 ，在3 > —界線，就在停止密碼子之下游，同時引入 XhoI及ΚρηΙ限制位置。爲進行此，於是合成二個 寡核苷酸： 寡聚物1 成熟的PLA2 Sma I 寡聚物2 、停止密碼子PLA2 進行P CR擴大作用，以寡聚物1及2爲引子， p CB 0 8T爲模板。所得的經擴大的4 0 O b p PLAcDNA片段，以SmaI及ΚρηI水解再嵌入 適合大小的ΡΤΖ 1 8R內，利用分子選殖進行。生成的 載體命名爲PPLA—1。此經修飾的PLAcDNA片 段完全定序以確實P C R擴大反應，及所引入之鄰接的限 制位置。 爲了在PLA2前原訊號序列之5 > —邊界引入一個 S a a 1 I限制位置及最佳的酵母轉譯起始序列，於是合 成二個互補的合成寡核苷酸。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公势} if -------·# (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁)
In SI j j — i- - -·-* ?i-、 ------ rl.Jrr - ::------ 訂 J·.·—. 480175 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（14 )
Sa/\ SSpre 5' -TCG ACA AAA HI議 AAA TTC CTC GTG TTG GCT GTT CTG CTC ACA-GT TTT Τλί TTT AAG GAG CAC AAC CGA CAA GAC GAG TGT- —pr〇PLA2 -GTG GGC GCT GCC CAG GAA GGC ATC AGC TCA A-3; -CAC CCG CGA CGG GTC CTT CCG TAG TCG AGT Τ'5， 此二寡聚物回冷後，所得的雙股DNA片段分子選殖 至pPLA — 1的適當位置上（Sail及Smal)。 所得的質體命名爲pKLAPLA — 5，且含有整個pre-proPLA2 cDNA，在鄰接的端爲獨特的 S a f I限制位置，在3 >端則爲X h ο I限制位置。 爲於乳酸克魯維酵母中表現豬PLA2 ，使用乳酸克 魯維酵母强的乳酸酶啓動子（PLAC )。除了在乳酸克魯 維酵母中產生乳酸酶外，此PLAC啓動子序列先前係用來 表現於乳酸克魯維酵母牛凝乳酶（Berg van den J. et al·, 1 990, BioAechnol· 8，1 35 - 1 39 )及人類血清白蛋 白（HSA)。爲了表現HSA，於是構築質體 pGBHSA-2 0 並如 Swinkel et al. 1993 先前所述 (Antonie van Leeuwenhoek 64, 187-201) 〇 爲了於乳酸克魯維酵母中表現HSA，pGBHSA 一 2 0中的HSAcDNA序列由乳酸克魯維酵母 LAC4啓動子所驅動。在3 / —端，HSAcDNA鄰 接以L A C 4終結子序列。此外，爲選擇轉形細胞， pGBHSA— 2 0中含有Τη 5轉磷酸酶基因，其可提 供對抗生素 G 4 1 8 之抗性（Genetic in, BRL; Reiss et 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ------------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ΦΙ蓄. -17 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480175 A7 B7 五、發明説明（15 ) al. ( 1 984 )EMB0 J. i, 33 1 7 - 3322 )，後者由釀酒酵母 ADH1 啓動子所驅動（Bennetzen and Hall (1982) J. Biol. Chem. 257, 30 1 8 - 3025 )。在 LAC4 啓動子的獨 特S s t II位置上，pGBHSA - 2 0含有大腸桿菌載 體pTZ 1 9 R，其用於在大腸桿菌中之擴大作用。在乳 酸克魯維酵母轉形之前，大腸桿菌ρΤΖ 1 9 R序列以 S s t II水解移出自p G B H S Α - 2 0，再行瓊脂糖凝 膠電泳純化。將在LAC 4啓動子S s t II位置上線化之 pGBHSA — 2 0轉形至乳酸克魯維酵母內，可造成經 由同源重組之整合至基因體LAC 4啓動子內。 爲於乳酸克魯維酵母內表現豬PLA2 ， preproPLA2序列適當地融合至pGBHSA-2 0中 的乳酸克魯維酵母啓動子序列。因此pGBHSA — 2 0 以Sa^ I及Xho I水解，且HSAcDNA序列·經由 分子選殖替代pKLAPLA — 5中之S a iTI —
Xho IDNA片段。如上述，pKLAPLA— 5之 S a芡I 一 Xh ο I DNA片段含有preproPLA2編碼 序列。用於PLA 2之最終表現載體命名爲 pKLAPLA - 11〇 以吾等已發表之專利案E P — A 0 635 574所述之步驟可產生酵母轉形細胞 ，此以I to H . e t a 1 ·之方法爲基礎（J · Bac t er丨ο 1 · 153 ,1 63 - 1 68, 1 983 ) 〇pKLAPLA-ll 以 Sstll 水解在L A C 4啓動子中線化。p T Z 1 9 r序列經由在 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） mil (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 _ 18 - 480175 A7 ___B7_ 五、發明説明（16 ) 瓊脂糖凝膠中分級分離及純化而移出。此DNA片段取 1 5微克轉移至乳酸克魯維酵母株CBS 2 3 6 0及 CBS 6 8 3中，並在3 0°C下培育3天後可得二菌株 之G418—抗性集落。 先選出各宿主株有限數目的轉形細胞，以測試培養基 中活性的豬PLA2之表現。轉形細胞接種於乳酸克魯維 酵母培養基中，其中含有：l%(w/v)酵母浸育；2 %(w/v)蛋白練；2%(w/v)葡萄糖及50微克 /毫升G4 1 8。在3 0°C下經過3天之生長後，收集上 清液並由下述的蛋黃活性分析來測試活性PLA2之存在 與否，在此樣品並先以胰蛋白酶處理。爲將不具活性的酶 原（由乳酸克魯維酵母轉形細胞所產生）活性成爲具活性 者，成熟的pla2 ，肽原的解離是必要的。 所有的轉形細胞似乎都可產生具活性之豬PLA2 ， 範圍由5至4 0單位/毫升。 1單位（I U)定義爲在標準條件下：蛋黃受質（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 0 · 4% 磷脂），pH8，40°C，6mM Ca+2，每 分鐘產生1微莫耳自由態脂肪酸所需之酵素量。 實例2 穢定酵素製劑之產製 乳酸克魯維酵母之肉汁接受盤式過濾，繼以超過濾。 超過濾濾液以〇.3%胰蛋白質在口1'18.0下處理，並 有1 OmM CaC$2之存在歷2 · 5小時，如此造成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -19 - 480175 A7 B7 五、發明説明（17) 酶原t肽之移去以活化酵素。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 加入作爲保藏劑之苯甲酸及山梨酸，pH4 · 0，留 下之胰蛋白酶活性再於7 0°C下滅活3 0分鐘。最終的產 物呈微棕色，且含有1 0，〇 〇 〇 IU/毫升之活性。 進一步純化及貯於低溫下可進一步改善此製劑之穩定 性。在4 °C下貯存1個月後，並未觀察到酵素活性有何喪 失。 實例3 在動物飼料中應用磷脂胸A2 以嫩雞進行試驗以測試磷脂酶A2之效力。公的嫩雞 (Rqss)保持在標準食物下1至5天。在第5天，自此群 中選出動物分配在各欄內。考量動物之體重及其變化。每 欄內之平均重量及其偏差是相同的。每欄有15隻動物。 每欄放在人工加熱，通風及照明之雞舍內。各欄之地板空 間爲0 · 9 8平方米，並爲有鐵網之地板。雞舍每天照光 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2 4小時。在實驗期間’逐漸減弱光度。溫度由第一週的 2 8 °C逐漸減低至最後一週的2 3 °C。在實驗期間雞舍的 濕度爲約6 Q%。動物利用噴灑方法在分別是1至1 4天 大時接種疫苗以拮抗新城雞瘟。實驗持續3 3天，包括5 天的試驗前期及2 8天的實驗期。 實驗食物自由供給至動物。水也自由取用。 飼料在低溫下成團塊溫度保持在6 5 °C下）’直徑 爲3毫米。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs") A4規格（210X 297公釐）_ _ 480175 A7 B7 ___ 五、發明説明（18 ) 實驗包括以下的處理： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) a )玉米/小麥/大豆食物（陰性對照組） b )玉米/小麥/大豆食物+1 〇 〇 IU/公斤 c )玉米/小麥/大豆食物+5 0 0 IU/公斤 各種處理法均重覆6次（每種處理法共9 0隻雞）。 測度獲重及飼料之轉換率。所使用飼料之組成示於表1中 0 表1嫩雞實驗中玉米/小麥/大豆食物之物成
經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 組成 玉米 小麥 豆油 動物脂 樹薯粉 豆粉（5 0%粗製蛋白質） 全脂烘焙的大豆 魚粉 肉粉桶槽渣滓，油含量高 豆類 維生素/礦物質預混物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480175 A7 B7 五、發明説明（ 19 ’石灰石 磷酸鈣 鹽類（N a C艾 D L —甲硫胺酸 .8 2 .0 0 .3 0 .2 5 10 0.00 ME嫩雞（MJ/公斤） 粗製蛋白質（％ ) 粗製脂質（％ ) 賴胺酸（可運用的）（％) 甲硫胺酸+賴胺酸（可運用的）U) 12.55 22 . 1 1.23 ( 1 .0 4 ) 0.91(0.79) 酵素加至此食物中，係先與載劑混合。 結果示於表2中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -22 - 480175 五、發明説明（20 ) 表2玉米/小麥/大豆食物中磷脂酶A2對於5至3 3天 大嫩雞生長及飼料轉換率上之影響 飼料之攝取 (克） 生長（克） 飼料轉換率 基礎食物 2613± 67 1 445 ± 38 1 · 8 1 ±j) · 0 2 8 食物+1 00 I U /公斤 2 5 6 9 ± 67 1458土 38 1. 76L0. 028 食物+ 5 0 0 IU /公斤 2 5 2 6 ± 67 1 472 ± 38 1. 72L0. 028 *最低顯著性偏差（LSD於P=0.05) -------------訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 至於第二個實驗，基本上和第一個相同，其中以表 所示之小麥/裸麥/大豆食物爲基礎食物。 實驗處理包括以下處理： a )小麥/裸麥/大豆食物（陰性對照組） b) 小麥/裸麥/大豆食物+1〇〇Iu/公斤 c) 小麥/裸麥/大豆食物+500 I U/公斤 d) 小麥/裸麥/大豆食物+1 00 0 I U/公斤 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSM4規格（ 210X 297公犮23 - 480175 A7 B7 五、發明説明（21 ) 所有其他的變數如上文玉米/小麥/大豆實驗中所述 表3嫩雞實驗中小麥/裸麥/大豆食物之組成 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 組成 小麥 裸麥 豆油 1 動物脂 6 樹薯粉 4 大豆粉（4 5 . 4 %粗製蛋白質） 22 全脂烘焙的大豆 10 肉粉桶槽渣滓（58%粗製蛋白質） 3 維生素/礦物質預混物 1 石灰石 〇 磷酸鈣 1 鹽類（N a C艾） 〇 L 一賴胺酸HCi? 〇 D L —甲硫胺酸 〇 含量（％ ) 4 0 1 0 2 8 9 4 2 0 請 先 閲 讀 背 s 之― 注 意 Φ'項<
訂 f 1 0 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）〜 -24 - 480175 A7 B7 五、發明説明（22 ) ME嫩雞\ M J /公斤） 11.9 粗製蛋白質（％ ) 21.4 粗製脂質（％ ) 10.5 賴胺酸（可運用的）（％ ) 1.23(1.05) 甲硫胺酸+半胱胺酸（可運用的） 0.90(0.77) 酵素加至此食物中係先與載劑混合。 結果示於表4中。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -25 - 480175
If 1、發明説明 表4在玉米/裸麥/大豆食物中磷脂酶a2對於5至3 3 天大嫩灘生長及飼料轉換率上之影響 飼料之攝取 (克） 生長（克） 飼料轉換率 基礎食物 2752土 64 1 5 5 6 ± 41 1. 7 7£0. 02 6 食物+100IU /公斤 2 747 ± 64 1 568 ± 41 1. 75 + 0. 02 6 食物+ 5 0 0 IU /公斤 2 733 ± 64 1 5 8 6 ± 41 1.72+0.026 食物+1 000 IU/公斤 2 7 2 4 ± 6 4 1 5 7 2 ± 41 1.73+0.026 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 *最低顯著性偏差（LSD於P=0·05) 如表4所示’在此特殊的嫩雞食物中有最佳的磷脂酶 濃度範圍，即每公斤飼料大於約1 〇 〇 I U及少於約 1 0 0 0 I U。對於其他系統可能存在不同的最佳範圍， 此可例常的實驗來決定。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2ΐ〇χ 297公势j 26 _ 480175 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（24 ) 實例4 於乳替代品中磷脂酶A 2之應用 利用各 5 隻公的 Friesian Dutch Holstein-Friesia-η牛共三組來進行實驗。 在實驗前期，餵以商品化之乳替代品。1 4天後，動 物分組以接受三種處理法，考慮體重及其變化。動物保持 在個別的欄內。廏內自然照光；通風並保持在約1 8 °C下 0 在1 4天中使動物適應其食物。接下來定量收集其糞 便歷相繼的5天，且每天2 4小時。牛在實驗前加上牛具 。將糞便收集在連接於牛具上之塑膠袋內。一天一次將糞 便稱重，匯集再貯於- 2 0°C下。分析前，糞便充份混合 再取樣。 動物依據其體重依循餵食流程個別餵養。使用之乳替 代品具以下組成： % 脫脂奶粉 58.5 脂質 19.8 乳糖 17.6 澱粉，維生素，礦物質 4.1 ME 4450仟卡/公斤 粗製蛋白質（N · 6 · 2 5 ) 21 . 5 %; 粗製脂質 19.5% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ------11·,·------、訂-----0MW (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -27 - 480175 ΙΓ 五、發明説明（^ 3 Μ -XLI亦 v jL> 一:.2.ητ^! 在餵養前，乳替代品粉末混以水，再於約4 0 °C溫度 下餵養。 依據處理，脂質含有1 8%牛脂，椰子油或豬脂。卵 磷脂以脂質含量的1 0 %濃度加入〃 豬磷脂酶A 2以每公斤乳替代品5 〇 〇 I U之終濃度 加至食物中。可偵測脂質之消化力。結果以表5示之。 表5 :接受1 8%脂質（於食物中）及1 · 8%卵磷脂（ 脂質含量之1 0%)之非反芻牛，其磷脂酶A2處理、對於 各種脂質消化力上之影響。磷脂酶A2依實例2所示製備 ，且以每公斤乳替代品5 Ο Ο I U之終濃度加至食物中 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 無磷脂酶A 2 有磷脂酶A 2 牛脂 7 0.0% 7 3.1% 椰子脂 9 5.6¾ 96.2% 豬脂 79. 4% 8 4.3% 氺 P < 0 . 0 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210Χ 297公浼冬28 - 480175 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26 ) 序列表 (1 ) 一般資料 (i )申請人 (A )名稱：G i s t - b r 〇 c a d e s B · V · (B )街：W a t e r i n g s e w e g 1 (C )市：De1ft (E )國：荷蘭
(F) 郵遞區號：（ZIP) :2611 XT (G) 電話：+31-15 - 2799111 (H) 傳眞：+31 — 1 5-2793957 (ii )標題：磷脂酶在動物飼料上的應用 (iii )序列數目：4 (iv )電腦可讀型式： (A)媒體型式：套裝軟體 (B )電腦：I Β Μ P C可相容 (C)操作系統：PC — DOS/MS-DOS (D )軟體：P a t e n t I N R e 1 e a s e # 1 · 0，V e r s i 〇 n #1.30 (EPO) (2 ) S E Q ID NO:l 資料 (i )序列特色 (A )長度：3 0鹼基對 (Β )型式：核酸 (C )股性：單股 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） -29 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480175 A7 B7 五、發明説明（） 27 (D )拓撲學：線型 ( ii)分子型式：DNA (基因體） (iii )假設：無 (iv )抗意識股：無 (ix )序列說明：S E Q ID Ν Ο ： 1 TGTCATGCCC GGGCATTATG GCAGTTTCGT 30 (2 ) S E Q ID NO:2 資料 (i )序列特色 (A )長度：3 9鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (iii )假設：無 (iv )抗意識股：無 (k )序列說明：S E Q ID N 0 ： 2 AGTCCTCGGT ACCTCGAGTC AGCAGTACTT CTTGGTGTC 39 (2 ) S E Q ID N〇：3 資料 (i )序列特色 本紙張尺度適用中國龢家轟準)（C最库4焱格7( 姨7#@ -.ΊΠ - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ .4#. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480175 A7 ____B7_ 五、發明説明（28 ) (B )型式：核酸 (C )股性：線型 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (iii )假設：無 (iv )抗意識股：無 (ix )序列說明：S E Q ID Ν Ο ： 3 TCGACAAAAA TGAAATTCCT CGTGTTGGCT GTTCTGCTCA CAGTGGGCGC TGCCCAGGAA GGCATCAGCT CAA 73 (2 ) S E Q ID NO:4 資料 (i )序列特色 (A )長度：6 9鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (1丨）分子型式：〇以众（基因體） (iii )假設：無 (iv )抗意識股：有 (ix )序列描述：S E Q ID N 0 ： 4 TTGAGCTGAT GCCTTCCTGG GCAGCGCCCA CTGTGAGCAG AACAGCCAAC ACGAGGAATT TCATTTTTG 69 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐）· ^ · ^------訂-----Aw- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

  1. 480175 A8 B8 _ S_r91 H 六、申請專利範掛 附件一 A : 第8 5 1 0 743 3號專利申請案 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 中文申請專利範圍修正本 民國<91年1月修正 1 . 一種改善飼料利用效率之方法，其中動物餵食的 食物包括由飼料物質及即可用之磷脂酶添加物組成之組成 物。 2 . —種促進動物生長之方法，其中動物餵食的食物 包括由飼料物質及即可用之磷脂酶添加物組成之組成物。 3 . —種可改善飼料利用效率之動物飼料組成物，其 中包括飼料物質及即可使用磷脂酶添加物。 4 · 一種促進生長之動物飼料組成物，其中包括飼料 物質及即可用之磷脂酶添加物。 5 ·如申請專利範圍第3項之組成物，其中包括有磷 脂。 6 ·如申請專利範圍第4項之組成物，其中包括有磷 脂。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7 .如申請專利範圍第5項之組成物，其中磷脂包括 卵磷脂。 8 .如申請專利範圍第6項之組成物，其中磷脂包括 卵磷脂。 9 ·如申請專利範圍第3至8項中任一項之組成物， 其中磷脂酶得自哺乳動物，植物及微生物。 1 〇 ·如申請專利範圍第9項之組成物，其中磷脂酶 本紙浪又度逋用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公f ~ 480175 A8 B8 C8 D8 7、申請專利範®: 是哺乳動物磷脂酶A2，選自下列包括牛，豬，鼠科，大 鼠及人類磷脂酶A 2。 1 1 .如申請專利範圍第1至8項及1 0項中任一項 之組成物，其中磷脂酶由重組體D N A在宿主有機體中表 現而得。 1 2 ·如申請專利範圍第9項之組成物’其中磷脂酶 由重組體D N A在宿主有機體中表現而得。 1 3 .如申請專利範圍第1 1項之組成物，其中宿主 ·欲 有機體是微生物選自下列包括細菌，酵有菌觸之真菌 項之組成，其中宿主 菌，有菌絲的真 Μ Ά/ 項之組成物，其 菌，大腸桿菌， 母 'Yarrowia， 孢及腐質霉。 項之組成物，其 菌，大腸桿菌， 母，Yarrow i a 1 孢及腐質霉。 項之組成物，其 魯維酵母或黑曲 項之組成物，其 中歡. 假絲酵 中讎 S&m 中微生 霉。 中微生 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 4 .如申請專利範圍第1 2 有機體是微生物選自下列包括：細 菌。 經濟部智慧財產局a(工消費合作社印製 1 5 .如申請專利範圍第1 3 物是選自下列各屬，包括：芽孢桿 ，克魯維酵母，漢遜酵母，畢赤酵 母，曲霉，木霉，青霉，毛霉，鐮 1 6 .如申請專利範閨第1 4 物是選自下列各屬，包括：芽孢桿 ，克魯維酵母，漠遜酵母，畢赤酵 母，曲霉，木霉，青霉，毛霉，鐮 1 7 .如申請專利範圍第1 5 物是大腸桿菌，釀酒酵母，乳酸克 1 8 .如申請專利範圍第1 6 本紙伕尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -2 - 480175 A8 B8 C8 __ D8 六、申請專利範圍 物是大腸桿菌，釀酒酵母，乳酸克魯維酵母或黑曲霉。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 9 ·如申請專利範圍第5至8項中任一項之組成物 ’其中每公斤磷脂含有由丨，OQ〇至 5，000，000國際單位之磷脂酶。 2 0 ·如申請專利範圍第5至8項中任一項之組成物 ，其中磷脂酶添加物含量在每公斤飼料1 〇 〇至1 〇 〇 〇 國際單位範圍中。 2 1 ·如申請專利範圍第3至8項中任一項之組成物 ，其用以餵養非反芻之動物。 2 2 ·如申請專利範圍第3至8項中任一項之組成物 ，其用以餵養非反芻之小牛。 2 3 · —種產製如申請專利範圍第3至2 2項中任一 項動物飼料組成物之方法，此方法包括將磷脂酶與飼料物 質混合。 2 4 · —種產製如申請專利範圍第5至2 2項中任一 項動物飼料組成物之方法，此方法包括將磷脂酶與飼料物 質及至少一種磷脂混合。 經濟部智慧財產局3工消費合作社印製 2 5 ·如申請專利範圍第2 3項之方法，其中的磷脂 酶係重組地產製的。 2 6 ·如申請專利範圍第2 4項之方法，其中磷脂酶 係重組地產製的。 本紙張又度逍用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3 -
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