ES2229288T3 - Metodos mejorados para transformar cepas de phaffia, cepas de phaffia transformadas asi obtenidas y dna recombinante en dichos metodos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN ADN RECOMBINANTE QUE INCLUYE UN PROMOTOR DE LA TRANSCRIPCION Y UNA SECUENCIA CADENA ABAJO QUE VA A SER EXPRESADA, ESTANDO EN UNION OPERABLE ENTRE SI, INCLUYENDO EL PROMOTOR DE LA TRANSCRIPCION UNA REGION QUE SE ENCUENTRA CADENA ARRIBA DEL MARCO DE LECTURA ABIERTO DE UN GEN DE PHAFFIA DE ELEVADA EXPRESION, PREFERIBLEMENTE UN GEN DE LA VIA GLUCOLITICA, MAS PREFERIBLEMENTE UN GEN QUE CODIFICA PARA LA GLICERALDEHIDO - 3 - FOSFATO DESHIDROGENASA. OTROS ADN RECOMBINANTES PREFERIDOS SEGUN LA INVENCION CONTIENEN PROMOTORES DE GENES QUE CODIFICAN PROTEINAS RIBOSOMICAS, MAS PREFERIBLEMENTE INCLUYENDO EL PROMOTOR DE LA TRANSCRIPCION UNA REGION QUE SE ENCUENTRA CADENA ARRIBA DEL MARCO DE LECTURA ABIERTO QUE CODIFICA UNA PROTEINA, TAL COMO ESTA REPRESENTADA POR UNA DE LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS QUE APARECEN EN CUALQUIERA DE LAS SEC ID N : 24 A 50. SEGUN OTRO ASPECTO DE LA INVENCION, SE DESCRIBE UNA SECUENCIA DE ADN AISLADO QUE CODIFICA PARA UNA ENZIMA IMPLICADA EN LAVIA BIOSINTETICA DE LOS CAROTENOIDES DE PHAFFIA RHODOZYMA, PRESENTANDO PREFERIBLEMENTE DICHA ENZIMA UNA ACTIVIDAD SELECCIONADA ENTRE LA ACTIVIDAD ISOPENTENILO PIROFOSFATO ISOMERASA, LA ACTIVIDAD GERANILGERANILO PIROFOSFATO SINTASA, LA ACTIVIDAD FITOENO SINTASA, LA ACTIVIDAD FITOENO DESATURASA Y LA ACTIVIDAD LICOPENO CICLASA, AUN MAS PREFERIBLEMENTE AQUELLAS QUE CODIFICAN PARA UNA ENZIMA QUE PRESENTA UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS SELECCIONADA ENTRE UNA DE LAS REPRESENTADAS EN LAS SEC ID N : 13, SEC ID N : 15, SEC ID N : 17, SEC ID N : 19, SEC ID N : 21 O SEC ID N : 23. OTRAS REALIZACIONES TRATAN DE VECTORES, ORGANISMOS HUESPED TRANSFORMADOS, PROCEDIMIENTOS PARA PREPARAR PROTEINAS Y/O CAROTENOIDES TALES COMO LA ASTAXANTINA, Y PROCEDIMIENTOS PARA AISLAR PROMOTORES DE EXPRESION ELEVADA A PARTIR DE PHAFFIA.

Description

Métodos mejorados para transformar cepas de Phaffia, cepas de Phaffia transformadas así obtenidas y DNA recombinante en dichos métodos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para transformar la levadura Phaffia, cepas de Phaffia transformadas, así como DNA recombinante para su uso.

Antecedentes de la invención

Los métodos para transformar la levadura Phaffia rhodozyma han sido comunicados en la Solicitud de Patente Europea 0 590 707 A1. Estos métodos involucran la incubación de protoplastos con DNA o incubación de células de Phaffia con DNA seguido por un tratamiento con acetato de litio. El DNA recombinante usado para transformar cepas de Phaffia con cualquiera de estos métodos comprende un gen promotor de la actina de Phaffia para dirigir la expresión de los genes marcadores seleccionables que codifican para la resistencia contra G418 o fleomicina. Los métodos implican PEG largos y tiempos de incubación de acetato de litio y las frecuencias de transformación son bajas. Cuando se usan los protoplastos, la frecuencia de transformación es dependiente de la calidad de la suspensión de protoplastos, haciendo el procedimiento menos fiable.

Recientemente ha sido comunicado un método para transformar cepas de Phaffia por Adrio J.L. y Veiga M. (Julio 1995, Biotechnology Techniques Vol. 9, No. 7, pp. 509-512). Con este método las frecuencias de transformación están en el rango de 3 a 13 transformantes por \mug de DNA, que es poco. Otro inconveniente del método presentado por estos autores consiste en un aumento del tiempo de duplicación de las células transformadas. Los autores hipotetizan que esto puede ser debido a interferencia del vector replicativo autónomo con la replicación del cromosoma.

El aumento de las frecuencias de transformación de Phaffia fueron comunicadas por Adrio J. y Veiga M. (1995, An. Real Acad. Farm. Vol. 61, pp. 463,471) utilizando el promotor de fosfoglicerato quinasa y el terminador de Saccharomyces cerevisiae. No obstante, el inconveniente de este método es que los transformantes transformados de Phaffia rhodozyma obtenidos muestran una pobre resistencia a G418.

Claramente, existe aún una necesidad para un método fiable y eficiente para la transformación de cepas de Phaffia con DNA extraño. Es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos y medios para obtenerlo. Es otro objetivo de la invención optimizar la expresión de ciertos genes en Phaffia rhodozyma para poder hacer de Phaffia un huésped más adecuado para la producción de ciertos compuestos valiosos.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para obtener una cepa transformada de Phaffia, comprendiendo los pasos de contactar las células o protoplastos de una cepa de Phaffia con DNA recombinante bajo condiciones que ayudan a la incorporación de las mismas, dicho DNA recombinante comprende un promotor de trascripción y una secuencia corriente abajo para expresarse que es heteróloga a dicho promotor de trascripción, en una vinculación operable con eso, identificando las células de Phaffia rhodozyma o protoplastos que han obtenido dicho DNA recombinante en una forma expresable, en donde el promotor de trascripción comprende una región que se encuentra corriente arriba del marco de lectura abierto de un gen altamente expresado de Phaffia. De acuerdo con una realización preferida de la invención dicho gen altamente expresado de Phaffia es un gen de la ruta glicolítica, más preferible un gen de la ruta glicolítica que codifica para la Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa (GAPDH). De acuerdo con un aspecto de la invención, dicha secuencia corriente abajo heteróloga comprende un marco de lectura abierto que codifica para la resistencia contra un agente selectivo, como el G418 o fleomicina.

Otro método preferido de acuerdo con la invención es uno, en donde dicho DNA recombinante comprende además un terminador de trascripción corriente abajo de dicho DNA a ser expresado, en conexión operable con este, tal terminador de trascripción comprende una región encontrada corriente abajo del marco de lectura abierto de un gen de Phaffia. Es aún más preferido, que el DNA recombinante esté en forma de DNA lineal.

Otra realización preferida comprende, además de los pasos anteriores, el paso de proporcionar un electropulso tras contactar las células de Phaffia o protoplastos con el DNA.

De acuerdo con otra realización la invención proporciona una cepa de Phaffia transformada capaz de expresar un alto nivel de secuencias heterólogas de DNA, dicha cepa es obtenible mediante un método de acuerdo con la invención. Preferiblemente, dicha cepa de Phaffia contiene al menos 10 copias de dicho DNA recombinante integrado en su genoma, como un cromosoma, particularmente en el locus de DNA ribosomal de dicho cromosoma.

La invención también proporciona DNA recombinante que comprende un promotor de trascripción y una secuencia heteróloga corriente abajo a ser expresada, en conexión operable con ésta, en donde el promotor de trascripción comprende una región encontrada corriente arriba del marco de lectura abierto de un gen altamente expresado de Phaffia, preferiblemente un gen de la ruta glicolítica, más preferiblemente un gen que codifica para la Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa.

También se proporciona un DNA recombinante de acuerdo con la invención, en donde la secuencia heteróloga corriente abajo comprende un marco de lectura abierto que codifica para reducir la sensibilidad contra un agente selectivo, preferiblemente G418 o fleomicina. Dicho DNA recombinante preferiblemente comprende además un terminador de la trascripción corriente abajo de dicha secuencia heteróloga de DNA a ser expresada, en conexión operable con este.

Otros aspectos de la invención conciernen a microorganismos portadores de DNA recombinante de acuerdo con la invención, preferiblemente cepas de Phaffia, más preferiblemente cepas de Phaffia rhodozyma, así como cultivos de las mismas

De acuerdo con aún otras realizaciones preferidas se proporcionan fragmentos de DNA aislados que comprenden un gen de Phaffia GAPDH, o un fragmento del mismo, así como el uso de tal fragmento para construir un DNA recombinante. De acuerdo con una realización en este aspecto dicho fragmento es una región reguladora localizada corriente arriba o corriente abajo del marco de lectura abierto codificando para GAPDH, y es usado en conjunción con una secuencia heteróloga a ser expresada bajo el control del mismo.

La invención de acuerdo con otro aspecto, proporciona un método para producir una proteína o un pigmento cultivando una cepa de Phaffia bajo condiciones que ayudan a la producción de dicha proteína o pigmento, en donde la cepa de Phaffia es una cepa de Phaffia transformada de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, un método para obtener una cepa de Phaffia transformada, comprende los pasos de

contactar células o protoplastos de una cepa de Phaffia con DNA recombinante bajo condiciones que ayudan a la incorporación de estas,

dicho DNA recombinante comprende un promotor de trascripción y una secuencia corriente abajo a expresar en conexión operable con este,

identificando las células de Phaffia rhodozyma o protoplastos habiendo obtenido dicho DNA recombinante en una forma expresable,

en donde la secuencia corriente abajo a expresar comprende una secuencia de DNA aislada que codifica para un enzima involucrado en la ruta biosintética de carotenoides de Phaffia rhodozyma. Preferiblemente, dicho enzima posee una actividad seleccionada de geranilgeranil pirofosfato sintasa (crtE), fitoeno sintasa(crtB), fitoeno desaturasa (crtI) y licopeno ciclasa (crtY), más preferiblemente un enzima que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada de la representada por la ID DE SEC NO: 13, ID DE SEC NO: 15, ID DE SEC NO: 17 e ID DE SEC NO: 19. De acuerdo con otra realización, el promotor de trascripción es heterólogo a dicha secuencia de DNA aislada, como un gen de la ruta glicolítica en Phaffia. Especialmente preferida de acuerdo con esta realización es el gen promotor de la Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa (GAPDH).

También se proporciona una cepa de Phaffia transformada obtenible mediante un método de acuerdo con la invención y capaz de expresar, preferiblemente sobreexpresar la secuencia de DNA que codifica un enzima involucrado en el gen de la ruta de la biosíntesis de carotenoides.

La invención esta también en una realización con DNA recombinante que comprende una secuencia de DNA aislado de acuerdo con la invención, preferiblemente en forma de vector.

También se reivindica el uso de tal vector para transformar un huésped, como una cepa de Phaffia.

Un huésped obtenible mediante transformación, opcionalmente de un predecesor, usando un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho huésped es preferiblemente capaz de sobreexpresar DNA de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otra realización se proporciona un método para expresar un enzima involucrado en la ruta de biosíntesis de carotenoides, cultivando un huésped de acuerdo con la invención bajo condiciones que ayudan a la producción de dicho enzima. También se proporciona un método para producir un carotenoide mediante cultivo de un huésped de acuerdo con la invención bajo condiciones que ayudan a la producción de carotenoides.

Las siguientes figuras además ilustran la invención.

Descripción de las figuras

Fig. 1. Mapa de los sitios de restricción alrededor del gen GAPDH de Phaffia rhodozyma. Gel de agarosa teñido con bromuro de etídio 0,8% (A) y Southern blot de DNA cromosomal (B) y cósmido pPRGDHcos1 (C) digerido con varios enzimas de restricción e hibridado con el fragmento de PCR de 300-pb del gen GAPDH de Phaffia rhodozyma. Carril 1, DNA x KpnI; 2, xPstI; 3, xSmaI; 4, xSphI; L, DNA lambda digerido con BstEII; 5, xSstI; 6, xXbaI y 7, xXhoI.

El blot se hibridó en 6 x SSC, 5 x Denhardt's, 0,1% SDS, 100 ng/ml DNA esperma de arenque a 65ºC y lavado con 0,1 x SSC/0,1% SDS a 65ºC. El tiempo de exposición del autoradiograma fue 16 h para el cósmido y 48 h del blot que contiene el DNA cromosomal.

Fig. 2. La organización de dos subclones; pPRGDH3 y derivados (A) y pPRGDH6 y derivados (B) conteniendo (una parte de) el gen GAPDH de Phaffia rhodozyma. La sonda de PCR está indicada por una caja sólida. La dirección y extensión de la determinación de secuencia está indicada por flechas.

Cajas sólidas: secuencia codificante de GAPDH

Caja abierta: 5' corriente arriba y región promotora de GAPDH

Caja abierta: 3' secuencia GAPDH no codificante de Phaffia rhodozyma

Línea sólida: intrón GAPDH

Caja tachada: Poli-linker que contiene sitios para diferentes enzimas de restricción

Línea punteada: fragmentos cortados

Fig. 3. Diagrama de clonaje del vector de transformación de Phaffia; pPR2.

Caja sólida: 5' corriente arriba y secuencia promotora de GAPDH

Caja tachada: G418

Línea sólida: pUC 19

Caja abierta: DNA ribosomal de Phaffia rhodozyma

Sólo se indican sitios de restricción usados para clonaje.

Fig. 4. Construcción de pPR2T a partir de pPR2T.

Caja sólida (fragmento BamHI-HindIII): terminador de trascripción GAPDH de Phaffia. Todas las otras cajas y líneas son como la Fig. 3. Sólo se han descrito detalles relevantes.

Fig. 5. Mapa físico detallado de pGB-Ph9. pbs = pares de bases; rDNA = locus de DNA ribosomal de Phaffia; act.pro 2 = promotor de la trascripción de la actina; act.1 = región 5' aminoterminal y no traducida del marco de lectura abierto; NO COD. = región no codificante corriente abajo del gen G418;

Fig. 6. Mapa físico detallado de pPR2. GPDHpro = región promotora de trascripción de GAPDH de Phaffia. Otros acrónimos como en la Fig. 5.

Fig. 7. Mapa físico detallado de pPR2T. Tgdh = terminador de la trascripción de GAPDH de Phaffia. El resto de acrónimos como en la Fig. 5 y 6.

Fig. 8. Visión general de la ruta biosintética de carotenoides de Erwinia uredovora.

Fig. 9. Representación de fragmentos de cDNA y un mapa de enzimas de restricción de los plásmidos pPRcrtE (A); pPRcrtB (B), pPRcrtI (C) y pPRcrtY (B).

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona en términos generales un método para obtener una cepa de Phaffia transformada, comprendiendo los pasos de

contactar células o protoplastos de una cepa de Phaffia con DNA recombinante bajo condiciones que ayudan a la incorporación de las mismas,

dicho DNA recombinante comprende un promotor de trascripción y una secuencia corriente abajo a ser expresada que es heteróloga a dicho promotor de trascripción, en conexión operable con este,

identificando células de Phaffia rhodozyma o protoplastos habiendo obtenido dicho DNA recombinante en una forma expresable,

en donde el promotor de trascripción comprende una región que se encuentra corriente arriba del marco de lectura abierto de un gen de Phaffia altamente expresado.

Para poder ilustrar las diferentes vías de prácticas la invención, algunas realizaciones serán destacadas y el significado o alcance de ciertas frases será esclarecido.

El significado de la expresión de DNA recombinante es bien conocida en el campo de la modificación genética, indicando que una molécula de DNA se proporciona, de cadena simple o doble, tanto lineal o circular, mellada o de otra manera, caracterizada por la unión de al menos dos fragmentos de origen diferente. Tal unión se realiza normalmente, pero no necesariamente in vitro. Así, dentro del ámbito de las reivindicaciones están las moléculas que comprenden DNA de diferentes organismos o diferentes genes del mismo organismo, o incluso regiones diferentes del mismo gen, siempre que las regiones no sean adyacentes por naturaleza. El DNA recombinante de acuerdo con la invención está caracterizado por un promotor de trascripción encontrado corriente arriba de un marco de lectura abierto de un gen de Phaffia altamente expresado, fusionado con una secuencia de DNA heteróloga. Con heteróloga se indica "no adyacente por naturaleza". Así la secuencia de DNA heteróloga puede ser de diferentes organismos, un gen diferente del mismo organismo, o incluso del mismo gen como el promotor, a condición que la secuencia corriente abajo haya sido modificada, normalmente in vitro. Tal modificación puede ser una inserción, delección o sustitución, afectando la proteína codificada y/o su entrada en la ruta de secreción, y/o su procesamiento post-traduccional, y/o su uso de codón.

El promotor fuerte de trascripción de acuerdo con la invención debe estar en conexión operable con la secuencia heteróloga corriente abajo para permitir la maquinaria transcripcional y traduccional reconocer las señales de partida. Las regiones corriente arriba del marco de lectura abierto de genes de Phaffia altamente expresados que contienen estructuras de tipo TATA que están situadas de 26 a alrededor de 40 nucleótidos corriente arriba del sitio del "cap"; el último aproximadamente corresponde con el sitio de inicio transcripcional. Así para permitir la trascripción de la secuencia heteróloga corriente abajo para empezar en la localización correcta, se deben respetar distancias parecidas. Es de conocimiento general, no obstante, que existe cierta tolerancia en la localización de la señal TATA en relación con el sitio de inicio de la trascripción. Normalmente, mRNAs del tipo eucariota contiene una secuencia leader 5'-sin traducir (5'-utl), que es la región que abarca el sitio de inicio de trascripción hasta el inicio de traducción; esta región puede variar de 30 a más de 200 nucleótidos. Ni la longitud ni el origen de 5'-utl es muy crítico; preferiblemente estará entre 30 y 200 nucleótidos. Puede ser del mismo gen que el promotor, o puede ser del gen codificante para la proteína heteróloga. Es bien conocido que los genes eucariotas contienen señales para la terminación de la trascripción y/o poliadenilización, corriente abajo del marco de lectura abierto. La localización de la señal de terminación es variable, pero normalmente estará entre 10 y 200 nucleótidos corriente abajo del lugar de parada traduccional (el final del marco de lectura abierto), más normalmente entre 30 y 100 nucleótidos corriente abajo del lugar de parada traduccional. Aunque la elección del terminador de la trascripción no es crítica, se sabe que, cuando el terminador se selecciona de una región corriente abajo de un gen de Phaffia, preferiblemente de un gen de Phaffia altamente expresado, más preferiblemente del gen codificante de GAPDH, el nivel de expresión, así como la frecuencia de transformación es mejorada.

Se ha encontrado que un número significativo de clones obtenidos que pueden crecer en concentraciones de G418 muy altas (hasta y por encima de, 1 mg/ml). Promotores de trascripción de acuerdo con la invención son aquellos que vienen de los genes altamente expresados, cuando pueden permitir el crecimiento de células transformadas de Phaffia, cuando se unen a un gen de resistencia a G418 como se expone en los Ejemplos, en presencia de al menos 200 \mug/ml, preferiblemente más de 400, incluso más preferiblemente más de 600, aún más preferiblemente más de 800 \mug/ml de G418 en el medio de cultivo. Ejemplos de tales promotores son, además del promotor corriente arriba del gen GAPDH en Phaffia, los promotores a partir de genes de Phaffia que son homólogos a los genes altamente expresados de otras levaduras, como Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, o hongos, como Trichoderma, Aspergillus, y similares. Los promotores que cumplen los requisitos de acuerdo con la invención, pueden ser aislados de DNA genómico usando técnicas de biologia molecular que están, como tales, disponibles para las personas entendidas en el campo. La presente invención proporciona una nueva estrategia para aislar promotores fuertes de Phaffia como sigue. Se obtiene una biblioteca de cDNA a partir de mRNA de Phaffia, usando métodos conocidos. Entonces para un número de clones con un inserto de cDNA, el fragmento de DNA (que representa el complemento de cDNA del mRNA expresado) es secuenciado. Como regla todos los fragmentos representan genes expresados de Phaffia. Además, los genes que están expresados abundantemente (tales como los promotores glicolíticos) están sobrerepresentados en la población de mRNA. Así, el número de fragmentos de DNA a ser secuenciados para encontrar un gen altamente expresado, está limitado a menos de 100, probablemente incluso a menos de 50. La secuenciación en sí es rutinaria, y no suele llevar más de unas cuantas semanas. Las secuencias de nucleótidos obtenidas de este número limitado de fragmentos, es consecuentemente comparado con las secuencias conocidas almacenadas en bases de datos electrónicas como el EMBL o Geneseq. Si un fragmento muestra homología de más del 50% sobre una longitud determinada (preferiblemente más de 100 pares de bases) el fragmento es probable que represente el equivalente en Phaffia del gen encontrado en la base de datos electrónica. En levaduras diferentes de Phaffia, un número de genes altamente expresados han sido identificados. Estos genes incluyen los genes de la ruta glicolítica, fosfoglucoisomerasa, fosfofructoquinasa, fosfotriosaisomerasa, fosfoglucomutasa, enolasa, piruvate quinasa, y genes alcohol dehidrogenasa (EP 120 551, EP 0 164 556; Rosenberg S. et al., 1990, Meth. Enzymol.: 185, 341-351; Tuite M.F. 1982, EMBO J. 1, 603-608; Price V. et al., 1990, Meth. Enzymol. 185, 308-318) y el regulón de la galactosa (Johnston, S.A. et al., 1987, Cell 50, 143-146). Por lo tanto, aquellos fragmentos de cDNA de Phaffia que son significativamente homólogos a los genes de levaduras altamente expresados (más del 40%, preferiblemente más del 50% de identidad en una comparación del mejor emparejamiento sobre un rango de más de 50, preferiblemente más de 100 nucleótidos) se utilizará para cribar una biblioteca genómica de Phaffia, para encontrar el gen correspondiente. Utilizando este método, 14 mRNAs altamente expresados de Phaffia rhodozyma han sido copiados en DNA, secuenciados, y su marco de lectura abierto (putativo) comparados con una base de datos de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos. Esto devolvió que 13 de estos catorce cDNAs codificaban para genes de proteína ribosomal, de los que uno codificaba simultáneamente para ubiquitina; un cDNA codifica para un gen represor de glucosa. El aislamiento de genes y los promotores normalmente se encuentra corriente arriba de las regiones codificantes de estos genes se encuentra en vías de desarrollo, y se anticipa que cada uno de estos promotores de trascripción puede ventajosamente utilizarse para expresar genes heterólogos, tales como genes de biosíntesis de carotenoides. Entre los genes y promotores de trascripción especialmente preferidos de acuerdo con esta invención están el promotor encontrado corriente arriba de la proteína 40S ubiquitina ribosomal correspondiente al cDNA representado en la ID DE SEC NO:10, el cDNA reprimido por glucosa representado en el ID DE SEC NO:26, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 40S S27 representada en la ID DE SEC NO:28, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 60S Pl\alpha representada por la ID DE SEC NO:30, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 60S L37e representada por la ID DE SEC NO:32, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 60S L27a representada por el ID DE SEC NO:34, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 60S L25 representada por la ID DE SEC NO:36, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 60S P2 representada por el ID DE SEC NO:38, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 40S S17A/B representada por el ID DE SEC NO:40, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 40S S31 representada por la ID DE SEC NO:42, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 40S S10 representada por el ID DE SEC NO:44, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 60S L37A representada por el ID DE SEC NO:46, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 60S L34 representada por el ID DE SEC NO:48, el cDNA codificante de la proteína ribosomal 40S S16 representada por el ID DE SEC NO:50.

Promotores de estos u otros genes altamente expresados pueden ser recogidos mediante el método de acuerdo con la invención usando únicamente habilidades rutinarias de (a) realizar una biblioteca de cDNA sobre mRNA aislado de una cepa de Phaffia crecida bajo las condiciones deseadas, (b) determinando (parte de) la secuencia de nucleótidos de los cDNAs (parciales) obtenidos en el paso (a), (c) comparando los datos de secuencia obtenida en el paso (b) con datos de secuencia conocidos, como los almacenados en las bases de datos electrónicas, (d) clonando el fragmento del promotor putativo del gen localizado tanto directamente corriente arriba del marco de lectura abierto o directamente corriente arriba del sitio de inicio de trascripción del gen correspondiente con el cDNA expresado, y (e) verificando si las secuencias promotor han sido obtenidas mediante la expresión de un marcador adecuado, tales como el gen de resistencia G418, o una secuencia adecuada "marcadora" no seleccionable corriente abajo de un fragmento obtenido en (d), transformando el DNA en una cepa de Phaffia rhodozyma y determinando el nivel de expresión del gen marcador o secuencia marcadora de los transformantes. Un promotor transcripcional suele ser un gen altamente expresado si es capaz de hacer células de Phaffia rhodozyma transformadas con un constructo de DNA comprendiendo dicho promotor unido corriente arriba del marcador de resistencia G418 resistente a G418 en concentraciones que exceden 200 \mug por litro de medio de cultivo, preferiblemente al menos 400, más preferiblemente más de 600 \mug/l. Promotores especialmente preferidos son aquellos que confieren resistencia contra más de 800 \mug/ml de G418 en el medio de crecimiento.

Opcionalmente, el lugar de inicio de trascripción puede estar determinado por el gen correspondiente al cDNA correspondiente a un gen altamente expresado, antes de clonar las secuencias promotores putativas; esto puede servir para localizar el sitio de iniciación transcripcional de forma más precisa, y además, ayuda a determinar la longitud del leader 5'-no-traducido del gen. Para determinar la localización del sitio de inicio de trascripción, puede realizarse la extensión reversa del cebador, o mapeo S1 clásico, basado en el conocimiento de la secuencia de cDNA. Así la posición exacta del promotor de la trascripción puede determinarse sin demasiado trabajo, y el aislamiento del fragmento corriente arriba del sitio de inicio de trascripción y que contiene el promotor, a partir de un clon genómico hibridante (por ejemplo un fago o un cósmido) es rutinario. Clonar el fragmento putativo del promotor delante (corriente arriba) de la región codificante de, por ejemplo el gen de resistencia a G418, y transformando el casete génico en Phaffia para evaluar el nivel de resistencia a G418, y por lo tanto el nivel de expresión del gen de resistencia a G418 como consecuencia de la presencia del promotor, es rutinario.

De manera esencialmente igual a la descrita para el aislamiento de otros promotores fuertes, como antes, un terminador de la trascripción puede ser aislado, con la condición, que el terminador está localizado corriente abajo del marco de lectura abierto. El sitio de parada de la trascripción puede determinarse usando procedimientos que son esencialmente los mismos que para la determinación del sitio de inicio de trascripción. Todos estos procedimientos son bien conocidos por aquellos entendidos en la materia. Un manual útil es Nucleic Acid Hybridisation, Editado por B.D. Hames & S.J. Higgins, IRL Press Ltd., 1985; o Sambrook, sub. No obstante, no es crítico que el terminador de la trascripción está aislado a partir de un gen de Phaffia altamente expresado, mientras que sea de un gen
expresado.

Usando DNA recombinante de acuerdo con la invención en donde el marco de lectura abierto codifica para sensibilidad reducida contra G418, una frecuencia de transformación se obtuvo de hasta 160 transformantes por \mug de DNA lineal, a una concentración de G418 en el medio de 40 \mug/ml.

Se obtuvieron alrededor de 10 a 20 veces más colonias transformantes tanto con el vector de acuerdo con la invención (pPR2) como con el vector anterior pGB-Ph9, revelado en EP 0 590 707 A l (ver Tabla 2; en el experimento del Ejemplo 7, la mejora es incluso más impactante).

El método de acuerdo con la invención requiere de condiciones que ayuden a la incorporación de DNA recombinante. Tales condiciones han sido reveladas en la EP 509 707. Incluye pero no se limita a la preparación de protoplastos usando procedimientos estándar conocidos por aquellos entendidos en la materia, y consecuentemente en la incubación con el DNA recombinante. Alternativamente, las células de Phaffia pueden ser incubadas toda la noche en presencia de LiAc y DNA recombinante. Aún más métodos alternativos implican el uso de aceleración de partículas. De acuerdo con una realización preferida, las condiciones que ayudan a la incorporación implica la electroporación de DNA recombinante en células de Phaffia, tal como describe por Faber et al., (1994, Current Genetics 25, 305-310). Condiciones especialmente preferidas comprende electroporación, en donde el DNA recombinante comprende DNA ribosomal de Phaffia, estando dicho DNA recombinante en forma lineal, más preferiblemente rompiendo dicho DNA recombinante en dicha región ribosomal. Condiciones aún más preferidas, comprenden el uso de DNA recombinante en cantidades entre 1 y 10 \mug por 10^{8} células, más preferiblemente se usa alrededor de 5 \mug de DNA recombinante para 2x10^{8} células, que se cultivan 16 h a 21ºC.

Una vez las células han sido transformadas de acuerdo con el método, la identificación de las células transformadadas puede realizarse usando cualquier técnica adecuada. Así, la identificación puede realizarse mediante técnicas de hibridación, técnicas de amplificación de DNA tales como la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores basados en el DNA recombinante usado, y similares. Un método preferido para identificar células transformadas es uno que emplea la selección para el DNA recombinante que comprende un gen codificante para una sensibilidad reducida contra un agente selectivo. Un agente selectivo útil es G418, higromicina, fleomicina y amdS. Genes que codifican para una sensibilidad reducida contra estos agentes selectivos son bien conocidos en la materia. Los marcos de lectura abiertos de estos genes pueden utilizarse como la secuencia heteróloga corriente abajo de acuerdo con la invención, permitiendo el enriquecimiento selectivo de las células transformadas, antes de la identificación de las células transformadas. Una vez las células transformadas han sido identificadas pueden utilizarse para una posterior manipulación, o usarse directamente en la producción de compuestos valiosos, preferiblemente fermentadores a gran escala.

Estará claro, que un método muy eficiente para transformar cepas de Phaffia ha sido revelado. Además, no sólo la frecuencia de transformación es alta, sino que los niveles de expresión del DNA transformante es muy alto también, tal como se ilustra por la resistencia excepcionalmente alta contra G418 de las células de Phaffia transformadas cuando el marco de lectura abierto del gen de resistencia a G418 se ha fusionado con un promotor de acuerdo con la invención cuando se compara con el gen de resistencia a G418 bajo control del promotor de la actina en pGB-Ph9. Se concluye, por lo tanto, que el promotor GAPDH es un promotor transcripcional de alto nivel que puede usarse de forma adecuada en conjunción con cualquier secuencia de DNA heteróloga, para alcanzar niveles de alta expresión de las mismas en cepas de Phaffia.

Estará claro que la disponibilidad de las nuevas herramienta de expresión, en forma de DNA recombinante de acuerdo con la invención, crea un abanico de posibilidades para producir nuevas y valiosas biomolécules en Phaffia.

Preferiblemente, la secuencia corriente abajo comprende un marco de lectura abierto codificando para proteínas de interés. Por ejemplo los genes ya presentes en Phaffia, como aquellos involucrados en la ruta de los carotenoides, puede ser manipulado por clonaje de estos bajo control de los promotores de alto nivel de acuerdo con la invención. El aumento de expresión puede cambiar la acumulación de intermediarios y/o productos finales o cambiar la ruta del \beta-caroteno, cantaxantina, astaxantina y similares. La sobreexpresión del gen crtB de Erwinia uredovora aumentará probablemente los niveles de astaxantina, ya que el producto de este gen está involucrado en el paso limitante de velocidad. La expresión de una proteína de interés también pueden hacer aumentar las xantofilas que no se conoce que se produzcan de forma natural en Phaffia, como la zeaxantina. Un marco de lectura abierto que puede ser empleado de forma adecuada en tal método incluye pero no se limita a uno que codifica la proteína productora de zeaxantina (gen crtZ) obtenido de Erwinia uredovora (Misawa et al. 1990. J.Bacteriol. 172; 6704-6712). Otros genes de síntesis de carotenoides pueden obtenerse, por ejemplo de Flavobacterium (una bacteria gram-positiva), Synechococcus (una cianobacteria) o Chlamydomonas o Dunaliella(algas). Obviamente, los genes de síntesis de carotenoides de una cepa de Phaffia, una vez han sido aislados y clonados, son clonados de forma adecuada en un DNA recombinante de acuerdo con la invención y usado para modificar el contenido de carotenoides de las cepas de Phaffia. Ejemplos de genes carotenoides clonados que pueden de forma adecuada ser sobreexpresado en Phaffia, son aquellos mencionados en la Fig. 8. Particularmente útil es crtE de Phycomyces blakesleanus, que codifica Geranilgeranil Difosfato Sintasa, y crtB, que codifica fitoeno sintasa, siendo este paso el limitante en la tasa de síntesis de carotenoides en Termus thermophylus (Hoshino T, et al., 1994, Journal of Fermentation and Bioengineering 77, No. 4, 423-424). Fuentes especialmente preferidas para aislar genes de biosíntesis de carotenoides o cDNAs son los hongos Neurospora crasa, Blakeslea trispora. Otras levaduras que muestran poseer especies de genes de biosíntesis de carotenoides de hibridación cruzada son Cystofylobasidium, pej. bisporidii y capitatum.

Genes de biosíntesis de carotenoides han sido identificados también en plantas; estos cDNAs de plantas o genes de plantas también pueden utilizarse. Opcionalmente, el uso de codón de los genes de Phaffia o de los cDNAs pueden adaptarse al uso preferido en el organismo huésped.

De interés especial de acuerdo con la presente invención, son las secuencias de DNA que codifican para cuatro enzimas diferentes en la ruta de biosíntesis de carotenoides de Phaffia rhodozyma, representado en el listado de secuencias. Estará claro para aquellos entendidos en el campo, que una vez estas secuencias de DNA han estado disponibles será posible llevar a cabo ligeras modificaciones a la secuencia de DNA sin modificar la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones son posibles debido a la degeneración del código genético. Tales modificaciones están englobadas en la presente invención. No obstante, también se conciben modificaciones en las secuencias codificadas que crean modificaciones en la secuencia de aminoácidos del enzima. Es bien conocido por aquellos entendidos en el campo que pequeñas modificaciones son perfectamente permisibles en términos de actividad enzimática. La mayoría de cambios, tales como deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos no afectan a la actividad enzimática, al menos no de forma drástica. Tales variantes que comprenden una o más deleciones de aminoácidos, adiciones o sustituciones puede probarse fácilmente usando la prueba de complementación revelado en la especificación. La persona entendida estará también familiarizada con el término "sustituciones de aminoácidos conservativas", indicando sustituciones de aminoácidos mediante aminoácidos similares residiendo en el mismo grupo. La persona entendida estará también familiarizada con el término "variante alélica", indicando variantes que ocurren de forma natural en un enzima particular. Estas sustituciones conservativas y variantes alélicas de enzimas no se alejan de la invención.

Tal como se afirma, al nivel de DNA una variación considerable es aceptable. Aunque la invención revela seis secuencias de DNA, representadas en la ID de SEC Nº: 12, ID de SEC Nº: 14, ID de SEC Nº: 16, ID de SEC Nº: 18, ID de SEC Nº: 20 o ID de SEC Nº: 22, en detalle también variantes isocodificantes de la secuencia de DNA representada en la ID DE SEC NO: 12, ID DE SEC NO: 14, ID DE SEC NO: 16, ID DE SEC NO: 18, ID DE SEC NO: 20, o ID DE SEC NO: 22, son comprendidas en la presente invención. Aquellos entendidos en el arte no deberían tener dificultades en adaptar la secuencia de ácido nucleico con el fin de optimizar el uso del codón en otro huésped que no sea P. rhodozyma. Aquellos entendidos en el campo deberían saber como aislar variantes alelicas de una secuencia de DNA como la representada por la ID DE SEC NO: 12, ID DE SEC NO: 14, ID DE SEC NO: 16, ID DE SEC NO: 18, ID DE SEC NO: 20, o ID DE SEC NO: 22 a partir de cepas relacionadas de Phaffia. Tales variantes alelicas no derivan claramente de la presente invención.

Además, usando las secuencias de DNA reveladas en el listado de secuencias, notablemente ID DE SEC NO: 12, ID DE SEC NO: 14, ID DE SEC NO: 16 ó ID DE SEC NO: 18, como una sonda, seria posible aislar los correspondientes genes de otras cepas, o otras especies microbianas, o aún más especies eucariotas remotas si se desea, proporcionando que haya suficiente homología de secuencia, para detectarlas usando las mismas técnicas de hibridación o amplificación conocidas en el arte.

Normalmente, los procedimientos para obtener fragmentos de DNA similares implican el cribaje de placas de bacterias o bacteriófagos transformadas con plásmidos recombinantes conteniendo fragmentos de DNA de un organismo conocido o esperado para producir enzimas de acuerdo con la invención. Tras la replicación in situ del DNA, el DNA es liberado de las células o placas, y es inmobilizado en los filtros (generalmente nitro-celulosa). Los filtros se pueden cribar para fragmentos de DNA complementarios usando una sonda de ácido nucleico marcada en cualquiera de las secuencias representada por el listado de secuencias. Dependiendo de si el organismo a cribar está o no relacionado estrechamente o distante, las condiciones de hibridación y lavado se deberían adaptar con el fin de recoger verdaderos positivos y reducir la cantidad de falsos positivos. Un procedimiento típico para la hibridación del DNA inmovilizado en el filtro se describe en el Capítulo 5, Tabla 3, 35 pp. 120 y 121 en: Nucleic acid hybridisation- a practical approach, B.D. Hames & S.J. Higgins Eds., 1985, IRL Press, Oxford). Aunque las condiciones óptimas se determinan normalmente empíricamente, unas pocas reglas útiles de manejo se pueden dar para secuencias estrechamente relacionadas y no tan estrechamente relacionadas.

Con el fin de identificar fragmentos de DNA muy estrechamente relacionados con la sonda, la hibridación se realiza tal como se describe en la Tabla 3 de Hames & Higgins, supra, (los esenciales de los cuales se reproducen posteriormente) con un paso de lavado final a una elevada astringencia en 0,1 * tampón SET (20 veces SET= 3M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4 M Tris-HCl, pH 7,8), 0,1% SDS a 68º Celsius).

Para identificar las secuencias con limitada homología para la sonda el procedimiento a seguir es tal como en la Tabla 3 de Hames & Higgins, supra, pero con la temperatura reducida de hibridación y lavado. Un lavado final a 2 * tampón SET, 50ºC por ejemplo debería permitir la identificación de secuencias con alrededor de un 75% de homología. Como es bien conocido por aquellas personas entendidas en el campo, la relación exacta entre las condiciones de homología e hibridación dependen de la longitud de la sonda, la composición de las bases (% de G + C) y la distribución de los desemparejamientos; una distribución aleatoria tiene un mayor efecto disminuidor en T_{m} que un patrón no aleatorio o agrupado de los desemparejamientos.

Los puntos esenciales del procedimiento descrito en la Tabla 3, Capítulo 5 de Hames & Higgins son los siguientes:

(1) prehibridación de los filtros en ausencia de la sonda, (2) hibridación a una temperatura entre 50 y 68ºC entre 0,1 y 4 * SET tampón (dependiendo de la astringencia), 10 * solución Denhardt (100 * solución Denhardt contiene albúmina de suero bovino al 2%, 2% Ficoll, 2% polivinilpirrolidona), 0,1% SDS, 0,1% sodio-pirofosfato, 50 \mug/ml DNA de esperma de salmón (de un estoc obtenible por disolución de 1 mg/ml de DNA de esperma de salmón, se sometió a ultrasonidos a una longitud de 200 a 500 pb, se dejó reposar en un baño de agua durante 20 min., y se diluyó con agua a una concentración final de 1 mg/ml); el tiempo de hibridación no es demasiado crítico y puede ser cualquiera entre 1 y 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas (toda la noche); la sonda se marca normalmente mediante traducción de muesca usando ^{32}Pcomo marcador específico a una actividad específica entre 5 * 10^{7} y 5 * 10^{8} c.p.m./\mug; (3) lavado (repetido) del filtro con 3 * SET, 0,1% SDS, 0,1% sodio-pirofosfato a 68ºC a una temperatura entre 50ºC y 68ºC (dependiendo de la astringencia deseada), lavados repetidos mientras se disminuye la concentración de SET a 0,1%., se lavó una vez durante 20 min. en SET a temperatura ambiente, se secaron los filtros en papel 3MM, la exposición de los filtros a una película de rayos X en un cassette a -70ºC durante entre 1 hora y 96 horas, y desarrollando la película.

Generalmente, el volumen de mezclas de pre-hibridación e hibridación debería mantenerse al mínimo. Todos los pasos "húmedos" se pueden llevar a cabo en bolsas pequeñas selladas en un baño de agua pre-calentado.

El anterior procedimiento sirve para definir los fragmentos de DNA dichos que se hibridan de acuerdo con la invención. Obviamente, se pueden hacer numerosas modificaciones al procedimiento para identificar y aislar fragmentos de DNA de acuerdo con la invención. Se debe entender, que los fragmentos de DNA así obtenidos caen dentro de los términos de las reivindicaciones siempre y cuando se puedan detectar siguiendo el anterior procedimiento, independientemente de si se han identificado en realidad y/o aislado usando este procedimiento.

Numerosos protocolos, que pueden usarse apropiadamente para identificar y aislar fragmentos de DNA de acuerdo con la invención, se han descrito en la literatura y en los libros de texto, incluyendo el citado Hames & Higgins, supra).

Con la llegada de nuevas técnicas de amplificación de DNA, tales como la PCR directa o invertida, también es posible clonar fragmentos de DNA in Vitro una vez se conocen las secuencias de la región codificante.

También comprendida por las reivindicaciones está una secuencia de DNA capaz, cuando se une al filtro de nitrocelulosa y tras la incubación bajo condiciones hibridantes y posterior lavado, de hibridarse específicamente a un fragmento de DNA radio-marcado con la secuencia representada por la ID de SEC Nº: 12, ID DE SEC NO 14, ID DE SEC NO: 16 o ID DE SEC NO: 18, tal como es detectable mediante autoradiografia del filtro tras incubación y lavado, en donde dicha incubación bajo condiciones de hibridación y el consiguiente lavado se realiza mediante incubación del DNA unido al filtro a una temperatura de al menos 50ºC, preferiblemente al menos 55ºC, más preferiblemente al menos 60ºC en la presencia de una solución de dicho DNA radio-marcado en 0,3 M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,8 durante al menos una hora, donde el filtro se lava después al menos dos veces durante alrededor de 20 minutos en 0,3 M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1 SDS, pH 7,8, a una temperatura de 50ºC, preferiblemente al menos 55ºC, más preferiblemente al menos 60ºC, antes de la autoradiografia.

La secuencia de DNA heteróloga de acuerdo con la invención puede comprender cualquier marco de lectura abierto codificando por proteínas valiosas o sus precursores, mientras que las proteínas farmacéuticas tales como albúmina de suero humana, IL-3, insulina, factor VIII, tPA, EPO, \alpha-interferón, y similares, enzimas detergentes, tales como proteasas y lipasas y similares, enzimas degradantes de la pared celular, tales como xilanasas, pectinasas, celulasas, glucanasas, poligalacturonasas, y similares, y otros enzimas que pueden ser útiles como aditivos para comidas o alimentos (p.ej. quimosina, fitasas, fosfolipasas, y similares). Tales genes pueden expresarse con propósito de recuperar la proteína en cuestión antes del consiguiente uso, pero a veces no es necesario que la proteína se pueda añadir a un producto o proceso de una forma no purificada, por ejemplo como un filtrado de cultivo o encapsulado dentro de las células Phaffia.

Las células de levadura contienen los carotenoides que se pueden usar tal cual o de forma seca como aditivos a alimentos animales. Además, las levaduras se pueden mezclar con otros compuestos tales como proteínas, carbohidratos o aceites.

Sustancias valiosas, tales como proteínas o pigmentos producidos mediante DNA recombinante de la invención se pueden extraer. Los carotenoides también se pueden aislar por ejemplo tal como se describe por Johnson et al. (Appl. Environm. Microbiol. 35: 1155-1159 (1978)).

Los carotenoides purificados se pueden usar como colorante en alimentos y/o comidas. También es posible aplicar los carotenoides en cosmética o en composiciones farmacéuticas.

La secuencia heteróloga corriente abajo también puede comprender un marco de lectura abierto codificante por sensibilidad reducida frente a un agente selectivo. El marco de lectura abierto codificante por una enzima proporcionando resistencia G418 se usó satisfactoriamente en el método de acuerdo con la invención, pero la invención no está limitada a este marcador de selección. Otros marcadores de selección útiles, tal como el gen de resistencia a la fleomicina se pueden usar, tal como se revela en PE 590 707. Cada uno de estos genes se expresa favorablemente bajo el control de un promotor fuerte de acuerdo con la invención, tal como el promotor GAPDH.

La invención se ilustra ahora en mayor detalle mediante los siguientes Ejemplos no limitantes.

Experimentación

Cepas:

E. coli DH5\alpha: supE44lacU169 (80lacZM15) hsdRl7 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1

\quad

E. coli LE392: supE44 supF58 hsdR514 galK2 galT22 metB1 trpR55 lacY1

\quad

P. rhodozyma CBS6938

\newpage

Plásmidos:

\quad

pUCl9 (Gibco BRL)

\quad

pTZ 19R

\quad

PUC-G418

\quad

pGB-F9 (Gist-brocades)

\quad

pMT6 (1987, Breter H.-J., Gene \underline{53}, 181-190))

Medio:

LB: 10 g/l bacto triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10 g/l NaCl. Placas; +20 g/l bacto agar. Cuando son apropiados 50 \mug/ml ampicilina.

\quad

YePD: 10 g/l extracto de levadura, 20 g/l bacto peptona, 20 g/l glucosa. Placas; +20 g/l bacto agar. Cuando era apropiado 50 \mug/ml Geneticina (G418).

Métodos:

Todas las técnicas de clonación molecular se llevaron a cabo esencialmente tal como se describe por Sambrook et al. en Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª Edición (1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Las incubaciones de enzimas se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones descritas por el fabricante. Estas incubaciones incluyen digestión con enzimas de restricción, desfosforilación y ligación (Gibco BRL).

El aislamiento de DNA cromosómico de Phaffia rhodozyma tal como se describe en el ejemplo 3 de la patente Gist-brocades; PE 0 590 707 A1. El DNA cromosómico de K.lactis y S.cerevisiae se aíslan tal como se describe por Crier et al. (Methods in Cell Biology 12: 39, Prescott D.M. (ed.) Academic Press, New York).

El aislamiento de grandes fragmentos de DNA (>0,5 kb) de agarosa se realizó usando el Kit Geneclean II mientras que los fragmentos de DNA pequeños (<0,5-kb) y fragmentos de DNA o fragmentos de mezclas de PCR se aislaron usando el sistema Wizard™ DNA Clean-Up (Promega).

La transformación de E. coli se realizó de acuerdo con el método CaCl_{2} descrito por Sambrook et al. El empaquetamiento de las ligaciones del cósmido y la transfección a E. coli LE392 se llevó a cabo usando el sistema de empaquetamiento Packagene Lambda DNA (Promega), siguiendo los protocolos Promega.

El aislamiento del DNA del plásmido a partir de E. coli se realizó usando el QIAGEN (Westburg B.V. NL).

La transformación de Phaffia CBS6938 se realizó de acuerdo con el método para H. polymorpha descrito por Faber et al., supra;

- Inocular 30 ml de YePD con 1 colonia CBS6938

- Crecer 1-2 días a 21ºC, 300 rpm (pre-cultivo)

- Inocular 200 ml de YePD con pre-cultivo a DO_{600}= entre 0 y 1 (si es 1 diluir con agua)

- Crecimiento durante toda la noche a 21ºC, 300 rpm hasta DO_{600}= 1,2 (diluido antes de la medición)

- Centrifugar a 5 min. 8000 rpm, a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante completamente

- Resuspender el pellet en 25 ml de 50 mM KPi pH 7,0, 25 mM DTT (recién elaborado)

Transferir la suspensión a un tubo de centrífuga de 30 ml estéril y fresco e incubar durante 15 min. a temperatura ambiente

- Centrifugar 5 min a 8000 rpm 4ºC, eliminar completamente el sobrenadante

- Resuspender el pellet en 25 ml de STM enfriado en hielo (270 mM sacarosa, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM MgCl_{2})

- Centrifugar 5 min a 8000 rpm, 4ºC

- Repetir el paso de lavado

- Resuspender las células en 0,5 ml de STM enfriado en hielo (3 * 10^{9} células/ml). Mantener en hielo!

\newpage

- Transferir 60 \mul de la suspensión celular a los tubos Eppendorf pre-enfriados conteniendo 5 \mug de DNA transformante (usar puntas pre-enfriadas!), Mantener en hielo

-Transferir la mezcla Célula/DNA a las cubetas de electroporación pre-enfriadas (de arriba a abajo)

- Pulso: 1,5 kV, 400 \Omega, 25 \muF

- Inmediatamente añadir 0,5 ml de YePD enfriado en hielo. Transferir de nuevo a ep usando una pipeta Pasteur estéril

- Incubar 2,5 hrs a 21ºC

- Disponer 100 \mul en placas YePD conteniendo 40 \mug/ml de G418

- Incubar a 21ºC hasta que aparecieron las colonias.

La Electroforesis en campo pulsado se realizó usando un GENE Navigator + accesorios (Pharmacia). Condiciones: 0,15 * TBE, 450 V, tiempo pulso 0,5 s, 1,2% agarosa, tiempo de corrido 2 h.

Los experimentos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron en mezclas con la siguiente composición:

-

5 ng de DNA de plásmido o 1 \mug de DNA cromosomal

-

0,5 \mug de oligonucleótidos (5 \mug de oligos degenerados en combinación con DNA cromosómico)

-

10 nm de cada dNTP

-

2,5 \mum KCl

-

0,5 \mum Tris pH 8,0

-

0,1 \mum MgCl2

-

0,5 \mug gelatina

-

1,3 U Taq polimerasa (5 U en combinación con DNA cromosómico)

Se añadió H_{2}O en un volumen total de 50 \mul

Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador automático (Perkin-Elmer).

Condiciones: 5 min. 95ºC , seguido de 25 ciclos repetidos; 2' 94ºC, 2' 45ºC3' 72ºC

Fin: 10 min. 72ºC.

Las reacciones de PCR de fusión se realizaron tal como se describe anteriormente, excepto que 2 fragmentos de DNA con extremos compatibles se añadieron como molde en cantidades equimolares.

Las secuencias de oligonucleótidos fueron las siguientes:

3005: CGGGATCCAA(A/G)CTNACNGGNATGGC (ID DE SEC NO: 1);

3006: CGGGATCC(A/G)TAICC(C/A/G)(C/T)A(T/C)TC(A/G)TT(A/G) TC(A/G)TACCA (ID DE SEC NO: 2);

4206: GCGTGACTTCTGGCCAGCCACGATAGC (ID DE SEC NO: 3);

5126: TTCAATCCACATGATGGTAAGAGTGTTAGAGA (ID DE SEC NO: 4);

5127: CTTACCATCATGTGGATTGAACAAGATGGAT (ID DE SEC NO: 5);

5177: CCCAAGCTTCTCGAGGTACCTGGTGGGTGCATGTATGTAC (ID DE SEC NO: 6);

5137: CCAAGGCCTAAAACG G AT C CCTCCAAACCC (ID DE SEC NO: 7);

5138: GCCAAGCTTCTCGAGCTTGATCAGATAAAGATAGAGAT(ID DE SEC NO:8)

Ejemplo 1 Resistencia G-418 del transformante Phaffia G418-1

Para determinar la expresión del gen de resistencia G418 en pGB-Ph9, transformante G418-1 (PE 0 590 707 Al) se expuso para concentraciones crecientes de G418.

Dos diluciones de un cultivo G418-1 se pusieron en YepD agar conteniendo 0-1000 \mug/ml de G418 (Tabla 1).

TABLA 1 Supervivencia de transformantes Phaffia G418-1 en medio YepD agar conteniendo concentraciones crecientes de G418

1

A una concentración de 600 \mug/ml de G418 inferior al 1% de las células en placas sobrevivieron. Se puede concluir, que a pesar de la integración multicopia de pGB-Ph9, G418-1 muestra una tasa de resistencia más bien débil a G418 (Scorer et al., 1994, Bio/Technology 12, p. 181 et seq., Jimenez y Davies, 1980, Nature 187 p. 869 et seq.), más probablemente debido a la acción débil del promotor de actina Phaffia en el plásmido. Los resultados que el promotor de actina de Phaffia trabaja pobremente, nos incita a aislar secuencias promotoras de Phaffia con una fuerte actividad promotora.

Ejemplo 2 Síntesis de sondas específicas de genes glicolíticos de Phaffia rhodozyma por PCR

La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se usó en un intento de sintetizar una sonda homóloga de los genes que codifican por la gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH), fosfoglicerato quinasa (PGK) y la triosa fosfato isomerasa (TPI) de Phaffia rhodozyma.

Un equipo de oligonucleótidos degenerados se diseñó basándose en las regiones conservadas en el gen GAPDH (Michels et al., 1986. EMBO J. 5: 1049-1056), PGK-gen (Osinga et al., 1985. EMBO J. 4: 3811-3817) y el TPI-gen (Swinkels el al., 1986. EMBO J. 5: 1291-1298).

Todas las posibles combinaciones de oligos se usaron para sintetizar un fragmento de PCR con DNA cromosómico de Phaffia rhodozyma (cepa CBS6938) como molde. El DNA cromosómico de Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromices lactis como molde se usó para monitorizar la especificidad de la amplificación. La PCR se realizó tal como se describe anteriormente, las condiciones de la PCR fueron 1' 95ºC, 2' temperatura de hibridación (T_{a}), en 5' desde la temperatura de hibridación a 72ºC, 2' 72ºC, durante 5 ciclos seguido de 1' 95ºC, 2' 55ºC y 2' 72ºC durante 25 ciclos y otro paso de elongación durante 10' 72ºC. Se usaron tres T_{a} diferentes 40ºC, 45ºC y 50ºC.

Bajo estas condiciones, sólo una combinación de cebadores produjo un fragmento de tamaño esperado en el DNA cromosómico de Phaffia como molde. Usando la combinación de oligos no: 3005 y 3006 y a T_{a} de 45ºC se encontró un fragmento de 0,3-kb. Específicamente, los oligonucleótidos GAPDH corresponden a los aminoácidos 241-246 y 331-338 de la secuencia publicada de S.cerevisiae. (Se concluyó que para aislar los promotores correspondientes a los genes PGK y TPI de Phaffia, también además la optimización de las condiciones de PCR se requiere, o se pueden usar cebadores homólogos. Otro método alternativo para aislar promotores de alto nivel se revela en la descripción detallada, supra.

El fragmento amplificado se purificó a partir de la reacción de PCR y se digirió con BamHI y se ligó en el sitio BamHI desfosforilado de pTZI9R. La mezcla de ligación se transformó a células competentes de E. coli DH5\alpha preparadas por el método CaCl_{2} y las células se dispusieron en placas LB con 50 \mug/ml Amp y 0,1 mM IPTG/50 \mug/ml X-gal. El DNA del plásmido se aisló a partir de las colonias blancas. El pTZ 19R clonado con el inserto derecho, llamado pPRGDH 1, se usó a continuación para el análisis de secuencia de inserto.

La secuencia clonada codificando por el fragmento carboxi Terminal de GAPDH de Phaffia tal como se muestra por comparación con la secuencia del gen GAPDH de S.cerevisiae (Holland y Holland, 1979. J. of Biol. Chem. 254: 9839-9845).

Ejemplo 3 Aislamiento del gen GAPDH de Phaffia

Para obtener el gen GAPDH completo incluyendo las señales de expesión se usó el fragmento de 0,3-kb BamHI de pPRGDH 1 para cribar una genoteca de cósmidos de Phaffia.

Preparación del vector para la clonación de cósmidos

La preparación del vector se simplificó, debido a la presencia de un sitio-cos doble en pMT6. PMT6 se digerió a totalidad con un cortador de extremos romos PvuII para liberar los sitios cos. La eficiencia de la digestión se comprobó por transformación a E.coli DH5\alpha y se encontró que era de >99%.

El pMT6 digerido con PvuII se purificó por extracción en fenol:cloroformo y precipitación en etanol y finalmente se disolvió en 30 \mul de TE a una concentración de 2 \mug/\mul.

El vector a continuación se digerió con los enzimas de clonación BamHI y los brazos del vector se purificaron tal como se describe anteriormente ("Experimentación").

Preparación del DNA diana

El aislamiento de DNA genómico de la cepa Phaffia CBS6938 se realizó tal como se describe en la parte llamada "Experimentación". El cósmido pMT6 contiene insertos de 25-38-kb que se empaquetan muy eficientemente. Por lo tanto el DNA genómico se sometió a digestión parcial con el enzima de restricción Sau3A. El DNA diana se incubó con cantidades diferentes de enzimas. Inmediatamente tras la digestión las reacciones se pararon mediante la extracción de DNA de la mezcla de enzimas de restricción con fenol-cloroformo. El DNA precipitó usando el método del etanol y el DNA pellet tras centrifugación se disolvió en un pequeño volumen de TE. La electroforesis en campo eléctrico homogéneo (CHEF) se usó para estimar la concentración y tamaño de los fragmentos (Dawkins, 1989, J. of Chromatography 492, pp. 615-639).

Construcción de genotecas de cósmidos genómicos

La ligación de aproximadamente 0,5 \mug del DNA del brazo del vector y 0,5 \mug de DNA diana se realizó en un volumen total de 10 \mul en la presencia de 5 mM ATP (para prevenir la ligación de extremos romos). El empaquetamiento en cabezas de fagos y la transfección a E. coli LE 392 es tal como se describe en Experimentación. La genoteca primaria consistía de 7582 transfectantes con un inserto promedio de 28-kb tal como se determina por análisis de restricción. La genoteca representa 3,5 veces el genoma con una probabilidad de presencia de todos los genes en la genoteca de 0,97 tal como se calcula de acuerdo con Sambrook (supra). Para la amplificación de las genotecas los transfectantes se recogieron por resuspensión en 8 ml de caldo de LB. Se añadieron 4,8 ml adicionales de glicerol. La mezcla de transfectantes se dividió en 16 muestras de 800 \mul cada una y se conservó a -80ºC. Esta genoteca amplificada consistía de 2,9*10^{9} transfectantes.

Cribaje de la genoteca de cósmidos

Una muestra de 100 \mul se recogió de esta librería y además se diluyó (10^{6}) en caldo LB y 200 \mul se dispusieron en placas 10 LB conteniendo ampicilina. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Cada placa contenía 300-400 colonias y se prepararon los filtros. Estos filtros se cribaron con la sonda GAPDH usando las condiciones de hibridización y lavado tal como se describe anteriormente ("Experimentación"). Tras 16 horas de exposición, se encontraron 3 señales fuertes de hibridización en el autoradiograma. El DNA del cósmido aislado de estas colonias positivas se llamó pPRGDHcosl, pPRGDHcos2 y pPRGDHcos3.

El DNA cromosómico aislado de la cepa de Phaffia rhodozyma CBS 6938 y el cósmido pPRGDHcos 1 se digerió con varios enzimas de restricción. Los fragmentos de DNA se separaron, se realizó un blot y se hibridaron tal como se describe anteriormente. La autoradiografía se expuso durante diferentes períodos de tiempo a -80ºC. La película mostró fragmentos de DNA de diferente longitud digeridos con diferentes enzimas de restricción que se hibridan con la sonda GAPDH (Fig. 1).

Además, a partir del análisis Southern del DNA genómico de Phaffia usando el fragmento GAPDH como sonda, se concluyó que el gen que codifica por GAPDH está presente como un gen de copia simple en Phaffia rhodozyma, mientras que en GAPDH de Saccharomyces cerevisiae está codificado por tres genes íntimamente relacionados pero sin unir (Boucherie et al., 1995. FEMS Microb. Letters 135:127-134).

Los fragmentos hibridantes de pPRGDHcos 1 para los que se encontró un fragmento de la misma longitud en el DNA cromosómico digerido con el mismo enzima, se aislaron a partir de un gel de agarosa. Los fragmentos se ligaron en los sitios correspondientes en pUC 19. Las mezclas de ligación se transformaron en células competentes de E.coli. Los plásmidos con un inserto 3,3-kb Sall y un inserto 5,5-kb EcoRI se llamaron pPRGDH3 y pPRGDH6, respectivamente. El mapa de restricción de pPRGDH3 y pPRGDH6 se mostró en la Figura 2. El análisis de los datos de secuencia del inserto en pPRGDH1 nos mostró que había un sitio HindIII en la parte C-terminal del gen GAPDH. A partir de estos datos se sugirió que el inserto en pPRGDH6 podría contener la secuencia codificante completa de GAPDH incluyendo las secuencias promotor y terminador.

Ejemplo 4 Caracterización del gen GAPDH

Con el fin de llevar a cabo el análisis de secuencia sin la necesidad de sintetizar un número de cebadores de secuencia específicos un número de construcciones de delección de plásmidos pPRGDH3 y pPRGDH6 se elaboraron usando los convenientes sitios de restricción en o cerca de la región codificante putativa del gen GAPDH.

Los plásmidos se digirieron y tras la incubación una muestra de la mezcla de restricción se analizó por electroforesis en gel para monitorizar la digestión completa. Tras la extracción con fenol-cloroformo el DNA precipitó mediante etanol. Tras la incubación a -20ºC durante 30' el DNA sedimentó por centrifugación, se secó y se disolvió en un gran volumen (0,1 ng/\mul) de TE. Tras la ligación, las mezclas se transformaron en E.coli. El DNA del plásmido aislado de estos transformantes se analizó mediante enzimas de restricción para revelar las construcciones derechas. De este modo las construcciones de delección pPRGDH3\deltaHIII, o pPRGDH6\deltaBamHI, pPRGDH6\deltaSstI y pPRGDH6\deltaSalI (Fig. 1).

Además de esto, los fragmentos de 0,6 kb y 0,8 kb SstI derivados de pPRGDH6 se subclonaron en el correspondiente sitio de pUC 19.

El análisis de la secuencia se llevó a cabo usando cebadores pUC/M 13 forward y reversos (Promega). La estrategia de secuenciación se muestra en la fig. 2 (ver flechas).

Basándose en la homología con la secuencia de genes GAPDH de S. cerevisiae (Holland y Holland, 1979. J. of Biol. Chem. 254: 9839-9845) y K.lactis (Shuster, 1990. Nucl. Acids Res. 18, 4271) y el sitio de corte y empalme conocido consenso J.L. Woolford. 1989. Yeast 5: 439-457), se postularon los posibles intrones y ATG de inicio.

El gen GAPDH tenía 6 intrones (Fig. 1) y codifica un polipéptido de 339 aminoácidos. Esto fue completamente inesperado considerando la organización genómica de los genes GAPDH de K.lactis y S.cerevisiae que no tenían intrones y ambos consistían de 332 aminoácidos. La homología a nivel de aminoácidos entre el gen GAPDH de Phaffia y K.lactis y S.cerevisiae es de 63% y 61%, respectivamente.

La mayoría de los intrones en el gen GAPDH están situados en la parte 5' del gen. Excepto el intrón III todos los intrones contenían secuencias de sitios ramificados conservadas 5'-CTPuAPy-3' obtenido de S.cerevisiae y S.pombe.

Mediante análisis por ordenador de la secuencia corriente arriba usando elementos promotores eucariotas putativos 2 PC-gen, TATA-box (posición 249-263 en ID DE SEC NO: 11) y un número de señales putativo Cap (entre la posición 287 y 302 en ID DE SEC NO: 11) se identificaron.

Ejemplo 5 Clonación del promotor GAPDH unido a G418 en pUCG418

Con el fin de construir una fusión de trascripción entre el promotor GAPDH el gen que codifica la resistencia a G418 se usó la técnica de fusión PCR.

Usando el plásmido pPRGDH6, el promotor GAPDH se pudo amplificar mediante protocolos de PCR estándar ("Experimentación").

En la mezcla de PCR se usaron el pPRGDH6 y los oligos No. 5177 y 5126 (Secuencias en "Experimentación"). Un fragmento de DNA de 416 pb se generó conteniendo la secuencia promotora GAPDH íntegra. Además este fragmento también contenía un sitio de restricción HindIII, Xhol y KpnI en su extremo 5' y un sobrelapamiento de 12 nt con el extremo 5' y del gen G418 que codifica la resistencia.

La porción de 217 pb del extremo 5' de la secuencia codificante G418 también se amplificó por PCR usando pUC-G418 y los oligos 4206 y 5127. Un fragmento de DNA de 226 pb se obtuvo conteniendo 217 pb en el extremo 5' de G418 y con un sobrelapamiento de 9 nucleótidos con el extremo 3' del fragmento promotor GAPDH generado tempranamente. También contiene un sitio Mscl en su extremo 3'.

Los fragmentos de PCR se purificaron a partir de la mezcla de PCR usando el WIZARD Kit. Aproximadamente 1 \mug del fragmento promotor GAPDH y 1 \mug del fragmento de PCR G418 se usaron junto con los oligos 5177 y 4206 en un experimento de PCR de fusión (Experimentación). Se generó un fragmento de DNA de 621 pb, conteniendo el promotor GAPDH directamente fusionado con la porción 5' de G418. Tras la purificación del fragmento de DNA se digerió con Mscl y Kpnl. El fragmento de 3,4 Kb Mscl-KpnI de pUC-G418, conteniendo las secuencias pUC y la porción 3' de G418, se usó como un vector.

La mezcla de ligación se transformó en células competentes de E.coli DH5\alpha. Las colonias transformantes conteniendo el DNA de fusión de la PCR insertado se identificaron mediante la digestión con diferentes enzimas de restricción.

Así, se obtuvo el plásmido pPRI, conteniendo el promotor GAPDH directamente fusionado al gen marcador G418. Tres vectores pPRI aislados de transformantes independientes se usaron en otros experimentos de clonación.

Para señalizar como diana al plásmido, tras la transformación, a un sitio de integración específico, un fragmento de 3,0-kb SstI que contenía una parte del DNA ribosomal de Phaffia se clonó en pPRI. El fragmento de DNA ribosomal se aisló a partir de un gel de agarosa tras la digestión con SstI del plásmido pGB-Ph11 (EP 590 707 Al). Este fragmento se ligó en el sitio desfosforilado Sst1 de pPRI. La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli competentes. El DNA del plásmido se aisló y usando el análisis por restricción se mostró que varias colonias contenían el plásmido esperado pPR2. Se muestra la estrategia de clonación completa en la Fig. 3.

Ejemplo 6 Transformación de Phaffia con pPR2

La transformación de la cepa de Phaffia 6938 se realizó usando un procedimiento de electroporación tal como se ha descrito previamente por Faber et al. (1994, Curr. Genet. 1994: 25,305-310) con las siguientes modificacio-
nes:

- Se realizó una electropulsación usando el Bio-rad Gene Pulsador con el Controlador de Pulso y con cubetas Bio-rad de 2mm.

- Phaffia se cultivó durante 16 h a 21ºC.

- Para la transformación se usaron 2x10^{8} células junto con 5 \mug de vector linearizado. La linearización se hizo en la secuencia rDNA usando ClaI para permitir la integración en el locus rDNA en el genoma de Phaffia. Siguiendo el pulso eléctrico (7,5kV/cm, 400 Q y 25 \muF) 0,5 ml de medio YePD se añadió a la mezcla de célula/DNA. La mezcla se incubó durante 2,5 h a 21ºC y a continuación se dispuso en 5 placas de agar selectivas YEDP conteniendo 40 \mug/ml de G418.

Tal como se muestra en la Tabla 2 éramos capaces de generar transformantes con 115 transformantes por \mug de DNA; el promedio de frecuencia de transformación fue de 50 transformantes/\mug pPR2 a juzgar por el número de experimentos. La transformación de la forma circular cerrada de pPR2 no resultó en una transformación sugiriendo que no había secuencias que se replicaran autónomamente presentes en las secuencias vector. Usando pPR2 se encontró un aumento de 10 a 50 veces en la frecuencia de transformación comparado con el vector de transformación construido previamente para Phaffia, llamado pGB-Ph9. En este último vector se hizo una fusión de traducción entre la parte 5' de los genes de actina de Phaffia y G418.

Con el fin de analizar el nivel de resistencia de los transformantes, la mezcla de células/DNA se dispuso en placas selectivas conteniendo diferentes cantidades de G418. Aunque el número total de transformantes disminuyó con cantidades crecientes de G418, eramos aún capaces de obtener un número considerable de transformantes (tabla 3).

En otro experimento se obtuvieron 30 transformantes bajo las condiciones de selección estándar (40 \mug/ml) se transfirieron a las placas conteniendo 50, 200 ó 1000 \mug/ml. Tras la incubación de las placas a 21ºC durante 4-5 días, 23 transformantes de los 30 ensayados fueron capaces de crecer eb las placas conteniendo 200 \mug/ml de G418. Un transformante fue capaz de crecer en placas conteniendo hasta y por encima de 1000 \mug/ml G418.

TABLA 2 Frecuencia transformación de pGB-Ph9 y pPR2

		Exp.1	Exp. 2
	- - -	69	8
	pGB-Ph9xBg/II	46	7
	pPR2 ccc	n.d.	n.d.
	pPR2(A)xClaI	714	56
	(B)	639	124
	(C)	443	153

Número total de transformantes (> 1 mm) en diferentes experimentos de transformación tras 4-5 días de incubación

TABLA 3 Comparación de la sensibilidad a G418 como resultado de dos genes de resistencia G418 diferentes en pGB-Ph9 y pPR2

	Concentración	\hskip0.6cm Número de transformantes
	G418 (\mug/ml)
		pPR2xClaI	pGB-Ph9xBg/II (=pYac4)
	40	480	2
	50	346	-
	60	155	-
	70	61	-
	80	141	-
	90	72	-
	100	64	-

Análisis de transformantes pPR2

Para analizar el evento de integración y el número de copias de vector integrado, se aisló el DNA genómico total de seis transformantes independientes. Por lo tanto estos transformantes se cultivaron bajo condiciones selectivas, esto es YePD + 50 \mug/ml G418. El DNA cromosómico se digerió con ClaI. Los fragmentos de DNA se separaron mediante electroforesis en gel y se transfirieron a nitrocelulosa y el Southern blot fue ensayado con DNA de Phaffia.

Además de la banda de rDNA de 9,1 kb, una banda adicional de 7,1 kb de una intensidad de fluorescencia similar se observó en los transformantes. Esta banda corresponde a la forma linearizada de pPR2. A partir de la intensidad de esta banda se concluyó que el número de copias fue de alrededor de 100-140 copias de pPR2. Estos resultados fueron similares a aquellos observados para pGB-Ph9, eliminando la posibilidad de que la mejora de la resistencia G418 sea debida a las diferencias en el número de copias de los vectores integrados solo. No se conoce si el evento de copias múltiples está causado por múltiples copias de integración de pPR2 o por la amplificación de una copia simple en el rDNA o una combinación de ambos eventos.

Ejemplo 7 Construcción de pPR2T mediante clonación del terminador GAPDH en pPR2

Los mRNAs eucariotas contienen secuencias terminales modificadas, específicamente el poli(A) terminal 3'. Tal como el gen procariota que codifica la resistencia G418 carece de señales de terminación eucariota, con lo que puede efectuar la terminación de la trascripción correcta y estabilidad de mRNA (1994, Raue, H.A., TIBTECH 12: 444-449), se introdujo una parte de la secuencia no codificante 3' de GAPDH.

A este extremo, un fragmento de 307 pb, consistente de 281 pb de la región no codificante 3' de GAPDH y otras secuencias de clonación adicionales, se amplificó por PCR usando los oligos 5137 y 5138 ("Experimentación"). El oligo corriente arriba 5137 consiste de los últimos 14 nucleótidos de la región codificante y 17 nucleótidos de la región no codificante 3' de GAPDH. Mediante sustituciones base del nucleótido 5º (T --> A) y 8º (T --> C) de la secuencia no codificante se introdujo un sitio de restricción BamHI. Además este fragmento contiene un sitio de restricción Xhol y un sitio de restricción HindIII en su extremo 3'.

El fragmento de PCR se purificó a partir de la mezcla de PCR usando el kit de Purificación WIZARD y se digerió con BamHI e HindIII. Un fragmento de 288 pb se aisló y clonó en los sitios correspondientes de vector de transformación Phaffia construido previamente pPR2, proporcionando pPR2T.

Tras la transformación de Phaffia, usando G418 como agente selectivo, las frecuencias de transformación (número de transformantes por \mug de DNA) obtenido con la construcción mejorada pPR2T fue aproximadamente de 5 a 10 veces mayor que la frecuencia de transformación de pPR2 (esto es, señal de terminación de la trascripción homóloga Phaffia). Los resultados de un experimento típico se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Frecuencia de transformación a 50 \mug/ml de G418 para pGB-Ph9, pPR2 y pPR2T

	Vector	transformantes	transformantes/\mug DNA
	pGB-Ph9 (ccc)	-	-
	pGB-Ph9 (xBglII)	60	1
	pPR2 (ccc)	1	-
	pPR2 (xClaI)	3000 - 9600	50 - 160
	pPR2T (ccc)	-	-
	pPR2T (xClaI)	45600	760
	pPR2T (xSfil)	1080	18

Las células Phaffia transformadas con pPR2T se ensayaron para ver su capacidad de crecimiento a altos niveles de G418. El nivel de G418 en el que el crecimiento es aún posible se tomó como medida del nivel de expresión del gen de resistencia G418 en los transformantes, como resultado de la presencia del promotor Phaffia, y/o terminador. Los resultados preliminares indicaron que el número de transformantes capaces de crecer a altos niveles de G418 fueron significativamente mayores que sin terminador.

En resumen

A partir de los anteriores resultados, se concluyó, que la presencia del promotor GAPDH (pPR2) resultó en un aumento considerable de la frecuencia de transformación (desde 1 a al menos 50 por \mug de DNA) cuando se comparó con el vector que contiene el promotor de actina (pGB-Ph9). Estos resultados son acordes con los resultados obtenidos con el ensayo de sensibilidad G418 (Tabla 3 y 4) que indican niveles de expresión superior bajo el control del promotor GAPDH. La posibilidad que la diferencia en la frecuencia de transformación podría ser debida solamente a la diferencia en la linearización de los vectores, (BglII, ClaI y SfiI todos cortados en el locus de DNA ribosomal, pero en diferentes posiciones), se quitaron todas las posibilidades por comparación de pPR2(xSfil) con pGB-Ph9(xSfil). La diferencia en la frecuencia de transformación entre los dos pPR2 y pGB-F9 linearizados con SfiI es aún considerable. No obstante, se concluye que la elección del sitio de linealización tiene efecto en la frecuencia de transformación; se prefiere la linearización con ClaI.

Las mejoras obtenidas usando un promotor de alto nivel, tal como GAPDH, son independientes de si usa un terminador homólogo (pPR2 (sin terminador homólogo) lo hace mejor que pGB-Ph9, ambos en los ensayos de sensibilidad G418, así como en los términos de frecuencia de transformación).

La presencia de un terminador homólogo resulta en ambas frecuencias de transformación mayores y elevados niveles de expresión; este resultado se concluye que es independiente del promotor usado. Los resultados preliminares indican que se obtienen mejoras considerables cuando la construcción pGB-Ph9 se completa con un terminador de la trascripción, tal como el terminador GAPDH usado en pPR2T.

Los siguientes Ejemplos ilustran el aislamiento de DNA codificante de enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de carotenoides de Phaffia rhodozima. Estas secuencias de DNA pueden usarse apropiadamente para una variedad de propósitos; por ejemplo para detectar y aislar secuencias de DNA que codifican enzimas similares en otros organismos, tales como levaduras mediante procedimientos de rutina de hibridación, para aislar los promotores de trascripción y/o terminadores, que se pueden usar para construir vectores de expresión para ambos heterólogos así como homólogos de secuencias corriente abajo a ser expresadas. Las secuencias de DNA codifican genes de la biosíntesis de carotenoides que se pueden usar apropiadamente para estudiar la sobre-expresión, tanto bajo el control de sus propios promotores o heterólogos, tal como los promotores de la vía glicolítica ilustrados anteriormente. Por ejemplo, la transformación de Phaffia rhodozyma con secuencias de DNA que codifican carotenoides de acuerdo con la invención efectivamente resultan en la amplificación del gen respecto a la situación de tipo salvaje, y como una consecuencia de los mismos para sobreexpresar la enzima codificada.

Por lo tanto, el efecto de sobre-expresión de uno o más genes codificando la biosíntesis de carotenoides que se puede así estudiar. Se concibe que las cepas mutantes de Phaffia se pueden obtener produciendo cantidades elevadas de carotenoides valiosos, tal como \beta-caroteno, cantaxantina, zeaxantina y/o astaxantina. De forma similar, las secuencias de DNA codifican enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de carotenoides se pueden introducir en otros huéspedes, tales como bacterias, por ejemplo E. coli, levaduras, por ejemplo especies de Saccharomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Phycomices, Hansenula, Picchia, hongos, tales como Aspergillus, Fusarium, y plantas tales como zanahorias, tomates y similares. Los procedimientos de transformación y expresión son bien conocidos por aquellas personas entendidas en el campo.

Cepas:

E.coli XL-Blue-MRF'\Delta(mcrA)183\Delta(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1 supE44 thi-1 recAl gyrA96 relA1 lac [F' proAB laq^{q}Z\DeltaM15 Tn10 (Tet^{r})]

ExAssist™ fago ayudante resistente a interferencias (Stategene^{R})

P. rhodozyma CBS6938 ó

P. rhodozyma asta 1043-3

Plásmidos usados para la clonación:

pUC19 Ap^{r} (Gibco BRL)

Uni-ZAP™ XR vector (lambda ZAP^{R} II vector digerido con EcoRI XhoI, CIAP tratado; Strategene^{R})

Medio: LB: 10 g/l bacto triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10 g/l NaCl. Placas; +20 g/l bacto agar.

Cuando es apropiado se añaden 50-100 \mug/ml de ampicilina (Ap), 30 \mug/ml cloramfenicol (Cm) y 1 mM isopropil-1-tio-\beta-D-galactopiranósido (IPTG). YePD: 10 g/l extracto de levadura, 20 g/l bacto peptona, 20 g/l glucosa. Placas; +20 g/l bacto agar.

Todas las técnicas de clonación molecular se llevaron a cabo esencialmente tal como se describen en Sambrook et al. en Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª Edición (1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press). La transformación de E. coli se llevó a cabo de acuerdo con el método de CaCl_{2} descrito por Sambrook et al.

Las incubaciones de enzimas se realizaron siguiendo las instrucciones descritas por el fabricante. Estas incubaciones incluyen digestión con enzimas de restricción, desfosforilación y ligación (Gibco BRL). El aislamiento del DNA del plásmido de E.coli se realizó usando el QIAGEN (Westburg B.V. NL).

Para las deleciones de análisis de secuencia se hicieron construcciones y oligonucleótidos para completar la secuencia usando un kit de Secuenciación de Ciclo de Cebador Taq DYE (Applied Biosystems).

Ejemplo 8 Descripción de los plásmidos

Los plásmidos (pACCAR25t\DeltacrtE, pACCAR25\DeltacrtB, pACCRT-EIB, pACCAR16\DeltacrtX y pACCAR25\DeltacrtX), que contienen diferentes combinaciones de genes implicados en la biosíntesis de carotenoides en Erwinia uredovora se cambiaron a partir de Prof. Misawa; Kirin Brewery co.,LTD.; Japón). La ruta biosíntetica de la síntesis de carotenoides en Erwinia uredovora se muestra en la fig 8. Además, un derivado de pACCAR25\DeltacrtX, designado pACCAR25\DeltacrtXAcrtI, se hizo en nuestro laboratorio. Mediante la introducción de un cambio de marco en el sitio de restricción BamHI se inactivó el gen crtI. Las cepas de E. coli llevando este plásmido acumulan fitoeno que se puede monitorizar mediante el fenotipo rojo de la colonia.

Todos los plásmidos son derivados del plásmido pACYC184 (Rose RE; Nucl. Acids Res. 16 (1988) 355), que contiene un marcador que confiere resistencia al cloramfenicol. Además, estos plásmidos y derivados de los mismos contienen un origen de replicación que es compatible con los vectores tales como pUC y pBluescript. Cada plásmido contiene un equipo de genes biosintéticos de carotenoides de Erwinia uredovora mediando la formación de diferentes carotenoides en E. coli. La lista completa de plásmidos usados en este estudio se muestra en la Tabla 5.

TABLA 5 Resumen de los carotenoides productores de cepas de E.coli usadas en este estudio

2

Genes codificando: crtE, geranilgeranil pirofosfato sintasa; crtB, Fitoeno sintasa; crtl, fitoeno desaturasa; crtI, licopeno ciclasa; crtX, \beta-caroteno hidroxilasa; crtZ, zeaxantina glicosilasa

Ejemplo 9 Construcción de una genoteca de cDNA de Phaffia rhodozyma a) Aislamiento de RNA total de Phaffia rhodozyma

Todas las soluciones se hicieron en agua destilada tratada con DEPC y todos los equipamientos se mantuvieron en remojo toda la noche en 0,1% DEPC y entonces se autoclavaron.

Un Erlenmeyer de 300 ml conteniendo 60 ml de medio de cultivo YePD se inoculó con una cepa de Phaffia rhodozyma CBS6938/1043-3 a partir de un pre-cultivo a una DO_{600} final de 0,1. Este cultivo se incubó a 21ºC (300 rpm) hasta que la DO_{600} alcanzó 3-4.

Las células se cultivaron por centrifugación (4ºC, 8000 rpm, 5 mm) y se resuspendieron en 12 ml de un tampón de extracción enfriado en hielo (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 M LiCl; 0,1 mM EDTA). Tras la centrifugación, las células se resuspendieron en 2 ml de un tampón de extracción enfriada en hielo, se añadieron 4 g de perlitas de vidrio (0,25 mm) y 2 ml de fenol.

La mezcla se dispuso en un vórtice 5 veces a una velocidad máxima durante 30 s con intervalos de enfriamiento de la incubación de 30 s en hielo.

La mezcla célula/perlas de vidrio/fenol se centrifugó (5 mm, 15.300 rpm, 4ºC) y la fase acuosa (sup 1) se transfirió a un tubo fresco y se mantuvo en hielo.

La fase fenólica se retractó mediante adición de un volumen adicional de 1 ml de tampón de extracción y 2 ml de fenol.

Tras la centrifugación (5 mm, 15,300 rpm, 4ºC). La fase acuosa se transfirió a sup 1 y se extrajo con un volumen final de fenol:cloroformo.

Tras la centrifugación (5 mm, 15,300 rpm, 4ºC), la fase acuosa se transfirió a un tubo fresco y 0,1 volumen de NaAc 3 M; pH 5,5 y 2,5 volúmenes de EtOH se añadió al RNA precipitado (incubación durante toda la noche a -20ºC).

El precipitado se recogió por centrifugación (10 mm, 15.300 rpm, 4ºC) y se drenó el exceso del líquido y el pellet del RNA se lavó con EtOH 70% enfriado en hielo.

Tras eliminar el exceso de líquido, el RNA se resuspendió en 200-800 \mul de agua tratada con DEPC. El RNA se conservó a -70ºC. Un cultivo de 60 ml proporcionó 400 - 1500 \mug de RNA total. La integridad del RNA total se comprobó mediante electroforesis en gel del RNA formaldehído.

b) Selección de RNA poli(A)^{+}

El aislamiento de poli(A)^{+} del RNA total se llevó a cabo esencialmente tal como se describe por Sambrook et al., 1989 (Molecular cloning, a laboratory manual, segunda edición) usando las siguientes soluciones. Todas las soluciones se prepararon en agua tratada con DEPC y se dispusieron en el autoclave.

El tampón de desnaturalización del RNA: 1 M NaCl; 18% (v/v) DMSO.

Tampón de carga de la columna (HEND): 10 mM Hepes, pH 7,6; 1 mM EDTA; 0,5 M NaCl; 9% (v/v) DMSO. Tampón de elución (HE): 10 mM Hepes, pH 7,6; 1 mM EDTA.

La oligo(dT)-celulosa de tipo 7 fue suministrada por Pharmacia Biotech. 0,1 g (peso seco) de oligo(dT)-celulosa se añadió a 1 ml de HEND y la suspensión se agitó enérgicamente durante 1 h a 4ºC. El RNA total (1,5 mg disuelto en 500 \mul) y 1 ml 1M NaCl; 18% (v/v) DMSO se calentó a 65ºC durante 5 min. Entonces 600 \mul de NaCl/DMSO se añadió al RNA, se mezcló y se dispuso en hielo durante 5 min. El aislamiento de poli(A)^{+} se llevó a cabo mediante dos ciclos de purificación. El rendimiento final fue de alrededor de 45 \mug poli(A)^{+} RNA.

c) Síntesis de cDNA

Los cDNAs se sintetizaron a partir de 7,5 \mug de poli(A)-RNAs usando el Kit de Síntesis de cDNA (#200401; Strategene®). La síntesis se llevó a cabo de acuerdo con el manual de instrucciones con alguna modificación menor.

La SuperScript™ II RNasa H^{-} Reversa Transcriptasa (Gibco BRL) se usó en la primera reacción de cadenas de MMLV-RT.

Los siguientes reactivos se añadieron en una microcentrífuga:

3 \mul de poli(A)^{+} RNAs

2 \mul de cebador-enlazante

23,5 \mul DMQ

Incubar 10 min 70ºC, agitar enérgicamente en la microcentrífuga y añade,

10 \mul de 5 x Primer Tampón de Cadena (proporcionado por Gibco BRL)

5 \mul de 0,1 M DTT (proporcionado por Gibco BRL)

3 \mul de mezcla de la primera cadena de metil nucleótido

1 \mul de Inhibidor de la ribonucleasa de Bloqueo Rnasa (40 U/\mul)

La hibridación del molde y los cebadores por incubación de la mezcla a 25ºC durante 10 min seguido de 2 min a 42ºC y finalmente añadiendo;

2,5 \mul de SuperScript™ II RNasa H^{-} Transcriptasa Reversa

La Primera reacción en cadena se llevó a cabo a 42ºC durante 1 h.

La fraccionación del tamaño se llevó a cabo usando el kit Geneclean^{R} II (proporcionado por BIO 101, Inc.). El volumen de la mezcla de cDNA obtenida tras digestión Xhol se llevó a cabo mediante adición de DMQ a un volumen final de 200 \mul. Se añadieron tres volúmenes de Nal y el tubo de microcentrífuga se dispuso en hielo durante 5 min. El pellet de la mezcla lechosa se lavó tres veces usando 500 \mul de New Wash. Finalmente el cDNA se eluyó en 20 \mul de DMQ.

El rendimiento del cDNA fue de alrededor de l \mug usando estas condiciones.

d) Clonación del cDNA

La genoteca del cDNA se construyó en el Uni-ZAP™ XR usando 100 ng de cDNAs. La ligación se realizó dos veces durante la incubación en toda la noche a 12ºC. La genoteca de cDNA se empaquetó usando el sistema de empaquetamiento de Packagene^{R} lambda DNA (Promega) de acuerdo con el manual de instrucciones. El título calculado de la genoteca de cDNA fue 3,5 10^{6} pfu.

e) Escisión de la masa

La escisión de la Masa se llevó a cabo tal como se describe en el protocolo usando derivados de E. coli XL-Blue-MRF' tal como aceptor de cadena (ver Tabla 5). La dilución de las mezclas de células se dispusieron en placas de agar de 145 mm de LB conteniendo ampicilina, cloramfenicol e IPTG, proporcionando 250-7000 colonias en cada placa. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37ºC y además se incubaron uno o dos días más a temperatura ambiente.

Ejemplo 10 La clonación del gen geranilgeranil pirofosfato sintasa (crtE) de Phaffia rhodozyma a) Aislamiento de clones de cDNA

La genoteca entera se escindió en células que acumulaban farnesilpirofosfato/isopentenil pirofosfato de E.coli XL-Blue-MRF, que lleva el plásmido pACCAR25\DeltacrtE (además indicado como XL-Blue-MRF'[pACCAR25\DeltacrtE]). El cribaje del gen crtE se basó en el color de los transformantes. La introducción del gen crtB en un trasfondo genético de XL-Blue-MRF'[pACCAR25\DeltacrtE] podría resultar en una restauración de la ruta completa para la biosíntesis de zeaxantina-diglucósido, que podría ser monitorizado por la presencia de una colonia pigmentada de color amarillo/naranja. Alrededor de 8.000 colonias se dispusieron en placas de agar LB conteniendo los antibióticos adecuados e IPTG. Una colonia se encontró que había cambiado al color amarillo anaranjado.

b) Caracterización del clon de cDNA de complementación

Estas colonias se dispusieron en placas de agar en LB-ampicilina. El DNA del plásmido se aisló de estas colonias y se encontró que incluía un fragmento de 1,85 kb (Fig 2A). El plásmido resultante, designado pPRcrtE, se usó para experimentos de retransformación (Tabla 6). Sólo la transformación de XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtE] con pPRcrtE resultó en un cambio de color de blanco a amarillo en el fenotipo. Para comprobar si el cambio de color fue debido a la complementación y no causado por únicamente el cDNA sólo pPRcrtE se transformó en XL-Blue-MRF'. La selección de los transformantes en una placa de LB-ampicilina agar conteniendo IPTG no resultó en cambios de color de las colonias (Tabla 6). Por lo que se concluye que, habiendo clonado un cDNA de P.rhodozyma codificando la GPPP sintasa que está implicada en la conversión de IPP y FPP a GGPP.

TABLA 6 El fenotipo del color del carotenoide productor de cepas de E. coli transformadas con pPRcrtE

	pUC19 (control)	pPRcrtE
XL-Blue-MRF' (Ap, IPTG)	Blanco	Blanco
XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtE] (Ap, Cm, IPTG)	Blanco	Amarillo/naranja
XL-Blue-MRF' [pACCAR25\Deltacrtb] (Ap, Cm, IPTG)	blanco	Blanco

Transformación: 10 ng de cada plásmido se mezclaron con CaCl, células competentes de E.coli. Las células transformantes se seleccionaron mediante disposición en placas de 1/10 y 1/100 volúmenes de DNA/mezcla de células en medio LB agar conteniendo los antibióticos apropiados (entre corchetes).

c) Análisis de la Secuencia del fragmento de cDNA

El plásmido pPRcrtE se usó para determinar la secuencia de nucleótidos del cDNA 1,85 kb.

La secuencia comprende 1830 nucleótidos y una cola 31 bp poli(A). Un marco de lectura abierto (ORF) de 375 aminoácidos se predijo. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida se muestra como ID DE SEC NO: NO 14 y 15, respectivamente. Una búsqueda en las bases de datos de las secuencias de proteínas SWISS-PROT usando el programa de alineación de las secuencias de aminoácidos Blitz indicando la homología de aminoácidos (52% en un sobrelapamiento de 132 aa; Neurospora crassa) especialmente en el dominio conservado I en enzimas geranilgeranil-PPi sintasa de diferentes organismos (Botella et al., Eur. J. Biochem. (1995) 233; 238-248).

Ejemplo 11 Clonación del gen de la fitoeno sintasa (crtB) de Phaffia rhodozyma a) Aislamiento del clon de cDNA

La genoteca se escindió en células que acumulaban geranilgeranilpirofosfato de E.coli XL-Blue-MRF', que lleva el plásmido pACCAR25\DeltacrtB (además indicado como XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtB]). El cribaje para el gen crtB se basó en el color de los transformantes.

b) Caracterización del clón de cDNA complementario

Estas colonias se dispusieron en placas de LB-ampicilina agar. El DNA del plásmido, designado pPRcrtB1 a 3, se aisló de estas colonias amarillas y se encontró que incluían un fragmento de 2,5 kb (Fig 2B). Uno de los plásmidos resultantes, pPRcrtB1 se usó para experimentos de retransformación (Tabla 7). Sólo la transformación de XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtB] con pPRcrtB resultó en un cambio de color de blanco a amarillo en el fenotipo. Por lo tanto se concluye que hemos clonado un cDNA de P.rhodozyma codificando la fitoeno sintasa que está implicada en la conversión de 2 moléculas de GGPP vía la prefitoeno pirofosfato en fitoeno.

TABLA 7

3

c) Análisis de la secuencia del fragmento de cDNA

El plásmido pPRcrtB2, que contiene la inserción de cDNA más larga, se usó para determinar la secuencia de nucleótidos del cDNA 2,5 kb. La secuencia comprende 2483 nucleótidos y una cola poli(A) de 20 pb. Un marco de lectura abierto (ORF) de 684 aminoácidos se predijo. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la ID de SEC. Nº: 12 y 13, respectivamente. Una búsqueda en las bases de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT usando los datos del programa de alineación de secuencia de aminoácidos Bliz indicó poca homología entre aminoácidos (26% de identidad en un sobrelapamiento de 441 aa del gen crtB de Neurospora crassa) con genes crtB de otros organismos.

Ejemplo 12 Clonación del gen fitoeno desaturasa (crtI) de Phaffia rhodozyma a) Aislamiento del clon de cDNA

La genoteca entera se escindió en células que acumulaban fitoeno de E.coli XL-Blue-MRF', que lleva el plásmido pACCAR25\DeltacrtX\DeltacrtI (además indicado como XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtX\DeltacrtI]. El cribaje del gen crtl se basó en el color de transformantes, La introducción del gen crtl en un transfondo genético de XL-Blue- MRF'[pACCAR25\DeltacrtX\DeltacrtI] podría resultar en una restauración de la ruta completa para la biosíntesis de zeaxantina, que podría monitorizarse mediante una colonia pigmentada de color amarillo naranja.

Alrededor de 14.000 colonias se incubaron en placas de LB agar conteniendo antibióticos apropiados e IPTG. Se encontraron dos colonias que cambiaron a color amarillo naranja.

b) Caracterización de clones de cDNA complementarios

Estas colonias se dispusieron en placas de agar LB-ampicilina. El DNA plásmido, designado pPRcrtl.1 y pPRcrtl.2, se aisló de estas colonias de color amarillo y se encontró que incluían fragmento de 2,0 kb (Fig 2C). Uno de los plásmidos resultantes, pPRcrtI.1 se usó para experimentos de retransformación (Tabla 8). Sólo la transformación de XL-Blue-MRF'[pACCAR25\DeltacrtX\DeltacrtI] con pPRcrtI resultó en un cambio de color de blanco a amarillo en el fenotipo. Por lo tanto concluimos que se había clonado un cDNA de P.rhodozyma codificando la fitoeno desaturasa que está implicada en la conversión de fitoeno a licopeno.

TABLA 8 Fenotipo de color del carotenoide productor de cepas de E.coli transformado con pPRcrti

	pUC19	pPRcrtI
XL-Blue-MRF' (Ap, IPTG)	Blanco	Blanco
XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtX\DeltacrtI] (Ap, Cm, IPTG)	Blanco	Amarillo/naranja
XL-Blue-MRF' [pACCAR25\Deltacrtb] (Ap, Cm, IPTG)	blanco	Blanco
Leyenda: ver Tabla 6

c) Análisis de la secuencia del fragmento de cDNA

Uno de los plásmidos pPRcrtl se usó para determinar la secuencia de nucleótidos del cDNA de 2,0 kb. La secuencia comprende 2038 nucleótidos y una cola 20 bp poli(A). Un marco de lectura abierta (ORF) de 582 aminoácidos se predijo. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida se muestra en la ID DE SEC NOs; 16 y l7, respectivamente. Una búsqueda en la secuencia de proteínas de SWISS-PROT usando los datos del programa de Alineación de aminoácidos Blitz indicó homología de DNA del gen de la fitoeno desaturasa de N.crassa (identidad del 53% en sobrelapado 529 aa).

Ejemplo 13 Clonación del gen de la licopeno ciclasa (crtY) de Phaffia rhodozyma a) Aislamiento del clon de cDNA

La genoteca entera se escindió en células que acumulaban licopeno de E.coli XL-B1ue-MRF', que lleva el plásmido pACCRT-EIB (además indicado como XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB]). El cribaje para el gen crtI se basó en el color de los transformantes. La introducción del gen crtY en un transfondo genético de XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB] podría resultar en la restauración de la vía completa para la biosíntesis de \beta-caroteno, que podría ser monitorizado por la presencia de una colonia pigmentada de color amarillo. Alrededor de 8.000 colonias se incubaron en placas LB agar conteniendo los antibióticos apropiados e IPTG. Se encontró que una colonia cambió a color amarillo.

b) Caracterización del clon de cDNA de complementación

Esta colonia se vetó en placas de LB-ampicilina agar. El DNA del plásmido se aisló de esta colonia de color amarillo y se encontró que incluía un fragmento de 2,5 kb (Fig 2B). El plásmido resultante, designado pPRcrtI, se usó para los experientos de retransformación (Tabla 9. Sorprendentemente, no sólo la transformación de XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB] sino también la transformación de XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtB] con pPRcrtI resultó en un cambio de color de rojo a amarillo en el fenotipo.

TABLA 9 Fenotipo del color de cepas de E.coli productoras de carotenoides transformadas con pPRcrtI

	pUC19	pPRcrtB
XL-Blue-MRF' (Ap, IPTG)	Blanco	Blanco
XL-Blue-MRF' [pACCRT-EIB (Ap, Cm, IPTG)	Rojo	Amarillo
XL-Blue-MRF' [pACCAR25\DeltacrtB (Ap, Cm, IPTG)	rojo	Amarillo
Leyenda: ver la Tabla 6

Un segundo experimento de transformación se llevó a cabo incluyendo el cDNA clonado previamente de pPRcrtB.

Tal como se muestra en la tabla 6 el cDNA previamente aislado (ejemplo 3) como el codificante por la fitoeno sintasa fue capaz de complementar la delección crtI resultando en la biosíntesis de \beta-caroteno en XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB].

El análisis de la secuencia de la inserción de cDNA de pPRcrtI (ID DE SEC NOs 18 y 19) mostró que era similar a la secuencia del fragmento de cDNA de pPRcrtB.

De estos datos se concluye tentativamente que hemos clonado un cDNA de P. rhodozyma codificando la fitoeno sintasa y la licopeno ciclasa que está implicada en la conversión de 2 moléculas de GGPP vía prefitoeno pirofosfato en fitoeno y licopeno a \beta-caroteno, respectivamente. Este es el primer gen de la ruta biosintética de la síntesis de carotenoides que codifica dos actividades enzimáticas.

TABLA 10 Fenotipo del color de las cepas de E.coli productoras de carotenoides transformadas con diferentes cDNAs de Phaffia rhodozyma (Ap, Cm, IPTG)

4

Ejemplo 14 Clonación del gen isopentenil difosfato (IPP) isomerasa (idi) de Phaffia rhodozyma a) Aislamiento del clon de cDNA

La genoteca de DNA íntegra de Phaffia se escindió en células que acumulaban licopeno de E.coli XL-Blue-MRF', cada una llevando el plásmido pACCRT-EIB (además indicadas como XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB]).

Alrededor de 15.000 colonias se incubaron en placas de LB agar conteniendo los antibióticos apropiados e IPTG. Una colonia se encontró que tenía el fenotipo de colorrojo oscuro.

b) Caracterización del clon de cDNA de complementación

Esta colonia se sembró en placas de LB-ampicilina agar. El DNA del plásmido se aisló de esta colonia de color amarillo y se vió que incluía un fragmento de 1,1 kb. El plásmido resultante, designado pPRcrtX, se usó para el experimento de re-transformación (Tabla 11).

Todas las colonias de XL-Blue-MRF' [pACCAR-EIB] transformadas con pPRcrtX tenían un fenotipo de color rojo oscuro. De estos datos se concluye, que hemos clonado un cDNA de P.rhodozyma la expresión del cual resulta en un aumento de la producción de licopeno en una cepa modificada genéticamente de E. coli.

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TABLA 11 Fenotipo de color del carotenoide productor de cepas de E.coli transformadas con pPRcrtX

	pUC19	pPRcrtX
XL-Blue-MRF' (Ap, IPTG)	Blanco	Blanco
XL-Blue-MRF' [pACCRT-EIB (Ap, Cm, IPTG)	Rojo	Rojo oscuro
Leyenda: ver Tabla 6.

c) Análisis de la Secuencia de fragmentos de cDNA

Con el fin de resolver la naturaleza de este gen se determinó la secuencia completa de nucleótidos del inserto de cDNA en pPRcrtX. La secuencia de nucleótidos consiste de 1 144 pb. La secuencia comprende 1 126 nucleótidos y una cola poli(A) de 18 nucleótidos. Un marco de lectura abierta (ORF) de 251 aminoácidos con una masa molecular de 28,7 kDa se predijo. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en ID DE SEC NOs: 20 y 21, respectivamente.

Una búsqueda en las bases de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT usando los datas del programa de alineación de secuencias de aminoácidos Blitz indicó homología de los aminoácidos a isopentenildifosfato (IPP) isomerasa (idi) de S.cerevisiae (42,2% identidad en 200 aminoácidos sobrelapados). La IPP isomerasa cataliza un paso de activación esencial en la ruta biosintética de isopreno que sintetiza el bloqueo de construcción de 5-carbonos de carotenoides. De forma análoga al gen de la levadura de Phaffia se llamó idi1. El clon de cDNA que lleva los genes se llamó pPRidi.

Ejemplo 15 Sobreexpresión del gen de P.rhodozyma en E. coli carotenogénico

Las células que acumulaban licopeno de E.coli XL-Blue-MRF', que llevaba el plásmido pACCRT-EIB (además indicado como XL-Blue-MRF' [pACCRT-EIB]) se transformaron con pUC19 y pPRidi y los transformantes se seleccionaron en medio de LB solidificado conteniendo Amp y Cm. Los transformantes, llamados XL-Blue-MRF' [pACCRT-EIB/pUC 19 y [pACCRT-EIB/pPRidi], se cultivaron en 30 ml de medio LB conteniendo Amp, Cm e IPTG a 37ºC a 250 rpm durante 16 h. A partir de estos cultivos se usó 1 ml para la extracción de carotenoides y análisis. Tras la centrifugación el pellet de células se disolvió en 200 \mul de acetona y se incubó a 65ºC durante 30 minutos. Cincuenta \mul de la fracción de acetona libre de células entonces se usó para el análisis de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La columna (chrompack cat. 28265; empaquetaje nucleosil l00C18) se desarrolló con agua-acetonitrilo-2-propanol (desde 0 a 45 minutos 9:10:81 y tras 45 minutos 2:18:80) a una tasa de flujo de 0,4 ml por minuto y se grabó con un detector de fotodiódo array a 470 \pm 20 nm. El licopeno demostró tener un tiempo de retención de alrededor de 23 minutos bajo estas condiciones. El área del pico se usó como producción de licopeno relativa (mAu*s). La producción de licopeno relativa fue de 395 y 1165 para XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB/pUC19] y [pACCRT-EIB/pPRidi], respectivamente.

Estos datos muestran los potenciales de la vía metabólica diseñada en Phaffia, tal como aumenta la expresión del idi de Phaffia rhodozyma causa un aumento de 3 veces en la biosíntesis de carotenoides en E.coli.

Este cDNA se puede sobre-expresar en una célula de Phaffia transformada con una vista para potenciar los niveles de carotenoide y/o xantofila. Este cDNA se clona apropiadamente bajo el control de un promotor activo en Phaffia, tal como un promotor fuerte de acuerdo con esta invención, por ejemplo un promotor de la vía glicolítica de Phaffia, tal como el promotor del gen GAPDH revelad aquí, un promotor del gen de proteína ribosomal de Phaffia de acuerdo con la invención (vide sub). Opcionalmente, el cDNA se clonó enfrente de un terminador transcripcional y/o sitio de poliadenilación de acuerdo con la invención, tal como el terminador del gen GAPDH/sitio de poliadenilación. La viabilidad de este logro se ilustra en el próximo ejemplo, donde el gen crtB de Erwinia uredovora está sobre-expresado en Phaffia rhodozyma a modo de ilustración.

Ejemplo 16 Expresión heteróloga de un gen carotenogénico de Erwinia uredovora en Phaffia rhodozyma

La secuencia codificante codifcando por la fitoeno sintasa (crtB) de Erwinia uredovora (Misawa et al., 1990) se clonó entre las secuencias de promotor y terminador de gpd(GAPDH-gen) de Phaffia por fusión PCR. En dos reacciones separadas de PCR la secuencia promotora gpd y la secuencia codificante de crtB se amplificaron. La secuencia anterior se amplificó usando los cebadores 5177 y 5128 y pPRB como molde. Este último vector derivado del vector de transformación de Phaffia pPR2 en el que la secuencia de promotor se ha engrandado y el sitio de restricción BglII se ha eliminado. La secuencia promotor de gpd se amplificó por PCR usando los cebadores 5226 y 5307 y el plásmido pPRgpd6 como molde. Tel fragmento de promotor amplificado se aisló y se digerió con KpnI y BamHI y se clonó en el fragmento KpnI-BglII del vector pPR2, proporcionando pPRB. La secuencia codificante de crtB se amplificó usando los cebadores 5131 y 5134 y pACCRT-EIB como molde. En una segunda reacción de fusión PCR, usando los cebadores 5177 y 5134, 1 \mug del promotor amplificado y el fragmento de región codificante crtB usado como molde proporcionó el producto de fusión Pgpd-crtB. La secuencia terminador se amplificó bajo condiciones de PCR estándar usando los cebadores 5137 y 5138 y el plásmido pPRgdh6 como molde. El cebador 5137 contiene en el extremo 5' los últimos 11 nucleótidos de la región codificante del gen crtB de E.uredovora y los primeros 16 nucleótidos de la secuencia terminadora del gen gpd de P.rhodozyma. Mediante una sustitución de dos pares de bases se introdujo un sitio de restricción BamHI. El producto de fusión amplificado (Pgpd-crtB) y el fragmento terminador amplificado se purificaron y digirieron con HindIII y BamHI y se clonaron en el sitio desfosforilado HindIII del vector de clonación pMTL25. El vector con la construcción Pgpd-crtB-Tgpd se llamó
pPREX 1.1.

El fragmento HindIII conteniendo el cassette de expresión Pgpd-crtB-Tgpd se aisló a partir de pPREX 1,1 y se ligó en el sitio desfosforilado HindIII del vector de transformación Phaffia pPRB. Tras la transformación de la mezcla de ligación en E.coli se escogió un vector (pPR8crtB6,1) con el inserto correcto para el experimento de transformación de Phaffia.

La cepa de Phaffia CBS6938 se transformó con pPR8crtB6.l, llevando el cassette de expresión Pgpd crtB-Tgpd, y los transformantes se seleccionaron en placas conteniendo G418. La cantidad relativa de astaxantina por DO_{660} en tres transformantes resistentes G418 y las cepas de tipo salvaje Phaffia se determinó mediante análisis HPLC (Tabla 12). Para el aislamiento de carotenoides a partir de Phaffia el método de extracción DMSO/hexano descrito por Sedmak et al., (1990; Biotechn. Techniq. 4, 107-112) se usó.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 12 La producción relativa de astaxantina en un transformante Phaffia llevando el gen crtB de E. uredovora

Cantidad relativa	de astaxantina
Cepa:	(mAU*s/DO_{660})
P.rhodozyma CBS6938	448
P.rhodozyma CBS6938
[pPR8crtB6.1]#1	626
[pPR8crtB6.1]#2	716
[pPR8crtB6.1]#4	726
Cebadores usados:

82

Las secuencias gpd se indican en negrita, las secuencias crtB en cursiva, se subrayan los sitios de restricción adicionales para clonación y la sustitución de bases se indica mediante un doble subrayado.

Ejemplo 17 Aislamiento y caracterización del gen crtB de Phaffia

También es posible expresar el gen Phaffia rhodozyma correspondiente a crtB y expresado bajo el control de sus propias regiones reguladoras, o bajo el control de un promotor de un gen altamente expresado de acuerdo con la invención. El procedimiento de transformación de Phaffia revelado aquí, invariablemente conlleva a elevados números de copia establemente integrados del DNA introducido, y se espera, que la expresión del gen bajo el control de su propio promotor también conlleve a una producción aumentada de carotenoides, incluyendo astaxantina. Para ilustrar el principio, se da un protocolo para la clonación de la secuencia genómica crtB, posterior.

Para obtener el gen crtB genómico incluyendo las señales de expresión 2,5 kb BamHI-Xhol el fragmento se aisló del vector pPRcrtB y se usó como sonda para cribar la genoteca de cósmidos de Phaffia.

La construcción y cribaje de la genoteca se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 3 usando el gen crtB como sonda en lugar del gen gapdh.

Tras las rondas de hibridación, se identificaron 2 colonias dando una señal de hibridación fuerte en el autoradiograma tras la exposición. El DNA del cósmido aislado de estas colonias se llamó pPRgcrtB# 1,1 y pPRgcrtB#7, respectivamente.

El DNA cromosómico aislado de Phaffia rhodozyma cepa CBS 6938 y el cósmido pPRgcrtB#7 se digerió con varios enzimas de restricción. Los fragmentos de DNA se separaron, se sometieron a un blot y se hibridaron con una sonda específica amino-terminal (0,45 kb Xbal fragmento) de crtB bajo condiciones tal como se describen anteriormente. Tras la exposición, el autoradiograma mostró fragmentos de DNA de diferente longitud se digerieron mediante diferentes enzimas de restricción que se hibridaron con la sonda crtB. Basándonos en que ningún sitio EcoRI está presente en el clon cDNA un fragmento de EcoRI de alrededor de 4,5 kb se escogió para experimentos de subclonación con el fin de determinar la secuencia en la región promotor y para establecer la presencia de secuencias de intrón en el gen crtB. Un fragmento de hibridación de tamaño similar también se encontró en el DNA cromosómico digerido con EcoRI. El fragmento se aisló de un gel de agarosa y se ligó en el correspondiente sitio de pUCI9. La mezcla de ligación se transformó en las células de E. coli competentes. Los plásmidos con la inserción correcta en ambas orientaciones, llamado pPR10,1 y pPR10,2, se aislaron de los transformantes. La comparación de los patrones de restricción de pPR10,11 pPR10,2 y pPRcrtB digerido con Xbal dio una indicación para la presencia de uno o más intrones como el interno) fragmento 2,0 kb XbaI en el clon de cDNA se encontró que era más grande en los vectores anteriores. El subclon pPR10,1 se usó para el análisis de la secuencia de la región del promotor y el gen estructural mediante el así llamado camino del cebador, aproximación. La secuencia parcial de la inserción se muestra en la ID DE SEC NO: 22. La comparación del cDNA y la secuencia genómica reveló la presencia de 4 intrones.

Ejemplo 18 Aislamiento de secuencias de promotor con elevados niveles de expresión

Este ejemplo ilustra la viabilidad del "método de secuenciación del cDNA" referido en la descripción detallada, con el fin de obtener promotores de trascripción a partir de genes altamente expresados.

Para el aislamiento y la identificación de las secuencias promotoras de trascripción de los genes de Phaffia rhodozyma exhibiendo elevados niveles de expresión, la genoteca de cDNA de Phaffia rhodozyma se analizó mediante el siguiente procedimiento.

La genoteca de cDNA se dispuso en medio LB solidificado conteniendo Amp y 96 colonias se escogieron al azar para el aislamiento del plásmido. El plásmido purificado se digerió con Xhol y Xbal y se cargó en un gel de agarosa. El tamaño de los insertos cDNA varia desde 0,5 a 3,0 kb. A continuación, estos plásmidos se usaron como molde para la secuencia de reacción simple usando el cebador T3. Para los clones 17 cDNA no se obtuvieron ningunos datos de secuencia. Las secuencias obtenidas se tradujeron en tres marcos de lectura. Para cada secuencia cDNA las secuencias de aminoácidos deducidas más largas se compartió con la base de datos de proteínas SwissProt en EBI usando el programa Blitz. Para las 18 secuencias de aminoácidos deducidas no se encontró ninguna homología con las proteínas conocidas mientras que seis secuencias de aminoácidos mostraron homología significativa a proteínas hipotéticas. Cincuenta y cinco secuencias de aminoácidos se encontraron que tenían homología significativa a las proteínas para las que la función es conocida. Alrededor de 50% (38179) se encontró que codificaban proteínas ribosomales de las que se obtuvieron 12 secuencias de longitud completa.

TABLA 13 Visión General de cDNAs expresados, proteínas codificadas y referencias al cDNA del Listado de Secuencias

cDNA	codificando por	ID de SEC Nº
10	Ubiquitina-40S	24
11	Glu-repr. Gen	26
18	40S prot.rib. S27	28
35	60S prot.rib. P1\alpha	30
38	60S prot.rib. L37e	32
46	60S prot.rib. L27a	34
64	60S prot.rib. L25	36
68	60S prot.rib. P2	38
73	40S prot.rib. S17A/B	40
76	40S prot.rib. S31	42
78	40S prot.rib. S10	44
85	60S prot.rib. L37A	45
87	60S prot.rib. L34	48
95	60S prot.rib. S16	50

Por homología de secuencia se concluye que en Phaffia la proteína ribosomal 40S S37 se fusionó a la ubiquitina tal como se encuentra en otros organismos así mismo. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas de clones de cDNA de longitud total se listan en el listado de la secuencia. Se representaron seis proteínas ribosomales en el conjunto aleatorio por más de un clón individual de cDNA. Las proteínas ribosomales 40S S10 (ID DE SEC NO:44), S37 (+ ubiquitina) (ID DE SEC NO:24) y S27 (ID DE SEC NO:28) se representaron dos veces y 60S proteínas ribosomales (acídico) P2 (ID DE SEC NO:38), L37 (ID DE SEC NO:46) y L25 (ID DE SEC NO:36) encontrada tres veces. A partir de estos resultados se concluyó, que estas proteínas están codificadas por múltiples genes o que estos genes están altamente expresados. Por lo tanto el aislamiento de estas secuencias de promotores son nuevas y prometedoras secuencias diana para aislar señales de expresión de alto nivel de Phaffia rhodozyma. Además, un clón de cDNA se aisló que mostró un 50% de homología a un gen represible de glucosa abundante de Neurospora crassa (Curr. genet. 14: 545-551 (1988)). La secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos deducida se muestra en ID DE SEC NO: 26. Una de las ventajas de tal secuencia de promotor es que se puede usar separadamente para el crecimiento (acumulación de biomasa) y la expresión génica (acumulación de productos) en una fermentación a gran escala de Phaffia.

Para el aislamiento de las secuencias de promotor de interés (tal como se indica anteriormente) un fragmento del correspondiente cDNA se puede usar como sonda para cribar la genoteca de Phaffia rhodozyma seguido del logro descrito para el promotor del gen GAPDH (Ejemplo 3, supra). Basado en la secuencia de nucleótidos determinada del promotor, los oligonucleótidos específicos se pueden diseñar para construir una fusión de trascripción entre el promotor y cualquier gen de interés mediante la técnica de fusión de PCR, siguiendo el procedimiento tal como se describe en el Ejemplo 5 (supra).

Ejemplo 19 Aislamiento de los genes carotenogénicos por hibridación heteróloga

Para la identificación y aislamiento de los genes de la ruta biosintética de carotenoides correspondiente de organismos relacionados con Phaffia rhodozyma, experimentos de hibridación heteróloga se llevaron a cabo bajo condiciones de astringencia moderada. En estos experimentos de DNA cromosómico de los dos hongos carotenogénicos (Neurospora crassa y Blakeslea trispora) y las levaduras S.cerevisiae y tres especies de levaduras y hongos del género Cistofylobasidium se usaron. Estas tres levaduras carotenogénicas están, basadas en estudios filogenético, la mayoría relacionados con P. rhodozyma.

El DNA cromosómico de las especies de levaduras Cistofylobasidium infirmo-miniatum (CBS 323), C. bisporidii (CBS 6346) y C. capitatum (CBS 6358) se aisló de acuerdo con el método desarrollado para Phaffia rhodozyma, descrito en el ejemplo 3 de la solicitud de patente Europea 0 590 707 Al ; las porciones relevantes de las cuales se incorporan aquí a modo de referencia. El aislamiento del DNA cromosomal de los hongos Neurospora crassa y Blakeslea trispora se llevaron a cabo esencialmente tal como se describe por Kolar et al. (Gene, 62: 127-134), la parte relevante del cual se incorpora aquí a modo de referencia.

El DNA cromosómico (5 \mug) de C. infirmo-miniatum, C. bisporidii, C. capitatum, S cerevisiae, P. rhodozyma, N. crassa y B. trispora se digirieron usando EcoRI. Los fragmentos de DNA se separaron en un gel de agarosa 0,8%, blot y se hibridó usando las siguientes condiciones.

La hibridización se llevó a cabo a dos temperaturas (50ºC y 55ºC) usando cuatro diferentes sondas ^{32}P marcadas de Phaffia. Las sondas se hicieron usando reacciones de marcaje de hexanucleótidos cebadas aleatoriamente usando el/los fragmento(s) XhoI XbaI a partir de los clones de cDNA pPRcrtE, pPRcrtB, pPRcrtI y pPRidi como molde. La hibridización se llevó a cabo durante toda la noche (16 h) a las temperaturas indicadas. Tras la hibridización los filtros se lavaron 2 veces durante 30 min a las temperaturas de hibridación usando una solución de 3*SSC; 0,1 SDS; 0,05% pirofosfato sódico. Las películas se desarrollaron tras exposición de los filtros a películas de rayos X en un cassette a -80ºC durante 20 h.

Usando el clon de cDNA de crtE de las señales débiles de P.rhodozyma se obtuvieron de C. infirmo-miniatum, C. capitatum, Usando la sonda de cDNA de crtB de señales fuertes de P. rhodozyma se obtuvieron en una porción de elevado peso molecular de DNA a partir de C. infirmo-miniatum y C. capitatum. Además se obtuvo una señal fuerte en el carril cargado con DNA cromosómico digerido de B. trispora. Sólo una señal débil se obtiene de C.capitatum a 50ºC usando el clon de cDNA de crtl de P. rhodozyma. Usando el clon cDNA de idi de señales débiles de P. rhodozyma se obtuvieron con DNA cromosómico de C. infirmo-miniatum, C. bisporidii y C. capitatum a ambas temperaturas. Se obtuvo una señal fuerte en el carril cargado con DNA cromosomal digerido a partir de B. trispora.

Concluimos, que la biosíntesis cDNAs o genes de carotenoides, o idi cDNAs o genes, se pueden aislar de otros organismos, en particular de otras especies de levaduras mediante hibridación cruzada con el fragmento de cDNA codificante por los enzimas de la biosíntesis de carotenoides de P. rhodozyma, o secuencias codificantes por isopentenil pirofosfato isomerasa respectivamente, usando una hibridación moderadamente astringente y condiciones de lavado (50ºC a 55ºC, 3xSSC).

Microorganismos depositados

E. coli conteniendo pGB-Ph9 se ha depositado en Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, Holanda, el 23 de Junio de 1993, bajo el número de acceso CBS 359.93.

Las siguientes cepas se han depositado bajo el Tratado de Budapest en Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baam, Holanda, el 26 de Febrero de 1996;

ID nº.	Organismo	Característica relevante	Número de depósito
DS31855	E. coli	crtY de P. rhodozyma	CBS 232,96
DS31856	E. coli	crtI de P. rhodozyma	CBS 233,96
DS31857	E. coli	crtE de P. rhodozyma	CBS 234,96
DS31858	E. coli	crtB of P. rhodozyma	CBS 235,96

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Gist-brocades B.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Wateringseweg 1

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Delft

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: Holanda

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2611 XT

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos mejorados para la transformación de Phaffia y DNA recombinante para el uso en ella

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 51

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMAS: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

NUMERO DE SOLICITUD:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB3005

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCAA RCTNACNGGN ATGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB3006

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: miscelánea

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: una de (12)

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota="N en la posición 12 es inosina"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCRT ANCCVYAYTC RTTRTCRTAC CA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB4206

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGTGACTTC TGGCCAGCCA CGATAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB5126

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCAATCCAC ATGATGGTAA GAGTGTTAGA GA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB5127

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTACCATCA TGTGGATTGA ACAAGATGGA T

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB5177

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTC TCGAGGTACC TGGTGGGTGC ATGTATGTAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB5137

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: sp.nov.MK1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAGGCCTA AAACGGATCC CTCCAAACCC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO ORIGINAL: AB5138

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAAGCTTC TCGAGCTTGA TCAGATAAAG ATAGAGAT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2309 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: CBS 6938

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 300..330

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 331..530

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 531..578

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 579..668

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 669..690

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 691..767

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 768..805

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 806..905

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 906..923

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 924..1030

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1031..1378

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1379..1508

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1509..2020

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: junto (300..330, 531..578, 669..690, 768..805, 906..923, 1031..1378, 1509..2020)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 338 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 388 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: promotor

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..385

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal TATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 249..263

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/etiqueta=putativa

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal miscelánea

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 287..302

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/función= "señal CAP" /etiqueta=putativa

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: RNA miscelánea

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 386..388

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/función= "inicio de CDS"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica miscelánea

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 85

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "desconocido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

9

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2546 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 225..2246

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcrtB"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 12

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 673 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 13

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1882 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 82..1212

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcrtE"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 376 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2058 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 46..1794

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcrtI"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 16

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 582 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 17

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2470 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 177..2198

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcrtY"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 18

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

27

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 673 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 19

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1165 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 141..896

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRidi"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 20

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 251 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3550 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: CBS 6938

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 941..966

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 967..1077

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1078..1284

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1285..1364

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1365..1877

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1878..1959

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1960..2202

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2203..2292

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2293..3325

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: junto(941..966, 1078..1284, 1365..1877, 1960..2202, 2293..3325)

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRGcrtB GB"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 22

35

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 673 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 23

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 570 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 24..500

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA10"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 24

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 158 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 25

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:26

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 303 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 57..278

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA11"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 26

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:27

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 27

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:28

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 307 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..227

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA18"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 28

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:29

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 29

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:30

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 502 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 30..359

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA35"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 30

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:31

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 109 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 31

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:32

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 381 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 7..282

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA38"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 32

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:33

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 91 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 33

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:34

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 473 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 19..321

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA46"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 34

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:35

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 35

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:36

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 608 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 18..453

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA64"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 36

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:37

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 145 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 37

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:38

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 466 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 81..416

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA68"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 38

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:39

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 39

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:40

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 570 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 49..501

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA73"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 40

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:41

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 41

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:42

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 373 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 13..324

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA76"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 42

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:43

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 103 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 43

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:44

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 514 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 13..435

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA78"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 44

\vskip1.000000\baselineskip

63

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:45

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 45

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:46

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 437 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 30..308

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA85"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 46

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:47

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 47

\vskip1.000000\baselineskip

66

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:48

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 509 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 35..400

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA87"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 48

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:49

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 49

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:50

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 542 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Phaffia rhodozyma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 18..443

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "PRcDNA95"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 50

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:51

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 141 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 51

72

Claims (28)

1. Un DNA recombinante comprendiendo un promotor de trascripción y una secuencia corriente abajo a ser expresada, en unión operativa con la misma,

en donde el promotor de trascripción comprende una región encontrada corriente arriba del marco de lectura abierto de un gen Phaffia altamente expresado y es capaz de hacer transformar a Phaffia rhodozyma con una construcción de DNA comprendiendo dicho promotor unido corriente arriba del marcador de resistencia G418 resistente a G418 en concentraciones excediendo 200 \mug por litro de medio de cultivo, en donde la construcción comprendiendo el promotor de trascripción tiene una frecuencia de transformación de Phaffia de al menos 50 transformantes por \mug de DNA con G418 como marcador de selección.

2. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho gen Phaffia altamente expresado es un gen de una vía glicolítica.

3. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho gen de la ruta glicolítica es un gen codificante por la Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa.

4. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho gen Phaffia altamente expresado es un gen codificante por una proteína ribosomal.

5. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho promotor de la trascripción comprende una región plegada corriente arriba del marco de lectura abierto codificando una proteína tal como se representa por una de las secuencias de aminoácidos descritas en cualquiera de las ID de SEC. Nº 24 a 50.

6. Un DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha secuencia corriente abajo a ser expresada es heteróloga respecto a la secuencia del promotor de la trascripción.

7. Un DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha secuencia corriente abajo comprende un marco de lectura abierto codificante por un polipéptido responsable de la sensibilidad reducida frente a un agente selectivo.

8. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho agente selectivo es G418.

9. Un DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en donde dicha secuencia corriente abajo a ser expresada codifica por una enzima implicada en la ruta de la biosíntesis de carotenoides.

10. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha secuencia corriente abajo a ser expresada codifica un enzima con una actividad seleccionada del grupo consistente en isopentenil pirofosfato isomerasa, geranilgeranil pirofosfato sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, y licopeno ciclasa.

11. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha secuencia corriente abajo a ser expresado codifica un enzima, con una secuencia de aminoácidos seleccionada de una representada por la ID de SEC Nº: 13, ID de SEC Nº: 15, ID de SEC Nº: 17, ID de SEC Nº: 19, ID de SEC Nº: 21 o ID de SEC Nº: 23.

12. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha secuencia corriente abajo a ser expresada codifica por un enzima implicado en la ruta de biosíntesis de carotenoides seleccionada de:

(i) una secuencia de DNA tal como se representa en ID de SEC Nº: 12, ID de SEC Nº: 14, ID de SEC Nº: 16, ID de SEC Nº: 18, ID de SEC Nº: 20, o ID de SEC Nº: 22

(ii) una variante isocodificante de la secuencia de DNA representada en la ID de SEC Nº: 12, ID de SEC Nº: 14, ID de SEC Nº: 16, ID de SEC Nº: 18, ID de SEC Nº: 20 o ID de SEC Nº: 22;

(iii) una variante alélica de la secuencia de DNA tal como se representa en ID de SEC Nº: 12, ID de SEC Nº: 14, ID de SEC Nº: 16, ID de SEC Nº: 18, ID de SEC Nº: 20 o ID de SEC Nº: 22;

(iv) una secuencia de DNA capaz, cuando se une a un filtro de nitrocelulosa y tras la incubación bajo condiciones de hibridación y el consiguiente lavado, de hibridados específicamente a un fragmento de DNA radio-marcado con la secuencia representada en ID de SEC Nº: 12, ID de SEC Nº: 14, ID de SEC Nº: 16, ID de SEC Nº: 18, ID de SEC Nº: 20 y ID de SEC Nº: 22, tal como es detectable mediante autoradiografia del filtro tras la incubación y lavado, en donde dicha incubación bajo condiciones hibridantes y el consiguiente lavado se realiza mediante incubación del DNA unido al filtro a una temperatura de al menos 50ºC, preferiblemente al menos a 55ºC, en la presencia de una solución de dicho DNA radiomarcado en 0,3 M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,8 durante al menos una hora, tras la cual el filtro se lavó al menos dos veces durante 20 minutos en 0,3M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,8, a una temperatura de 50ºC, preferiblemente al menos a 55ºC, antes de la
autoradiografia.

13. Un DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en donde dicha secuencia corriente abajo a ser expresada codifica por una proteína farmacéutica.

14. Un DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho DNA recombinante además comprende un terminador de trascripción corriente abajo de dicha secuencia de DNA a ser expresada, en unión operativa con los mismos.

15. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el terminador es un terminador de Phaffia.

16. Un DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el DNA recombinante está en la forma de un vector capaz de replicación y/o integración en un organismo huésped.

17. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 16, además comprendiendo DNA codificando RNA ribosomal de Phaffia.

18. Un DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 17, que es linealizado mediante la escisión en la porción de DNA que codifica por el RNA ribosomal de Phaffia.

19. Un microorganismo transformado que hospeda un DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

20. Un microorganismo transformado de acuerdo con la reivindicación 19, que es una cepa de Phaffia.

21. Un microorganismo transformado de acuerdo con la reivindicación 20, con el DNA recombinante integrado en su genoma en una cantidad de al menos 10, preferiblemente al menos 50 copias.

22. Un microorganismo transformado de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, que es Phaffia rhodozyma.

23. Una cepa de Phaffia rhodozyma transformada de acuerdo con la reivindicación 22, que es capaz de sobreexpresar una secuencia de DNA codificando un enzima implicado en la ruta de biosíntesis de carotenoides.

24. Una cepa transformada de Phaffia rhodozyma de acuerdo con la reivindicación 23, que produce cantidades crecientes de astaxantina en relación a su predecesor sin transformar.

25. Un método para producir una enzima implicada en la ruta de biosíntesis de carotenoides, mediante cultivo de un microorganismo transformado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 23, bajo las condiciones que conducen a la producción de dicho enzima.

26. Un método para producir un carotenoide, caracterizado porque un microorganismo transformado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 19 a 24 se cultiva bajo las condiciones que conducen a la producción de carotenoides.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el carotenoide es astaxantina.

28. Un método para producir una proteína farmacéutica mediante cultivo de una cepa de Phaffia transformada de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21 bajo las condiciones que llevan a la producción de dicha proteína.