JP2000512151A

JP2000512151A - 糸状菌におけるヘムタンパク質生産を増加せしめるための方法

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Publication number: JP2000512151A
Application number: JP10501761A
Authority: JP
Inventors: エル．エルロド，スーザン; アール．チェリー，ジョエル; ジョーンズ，オウブレイ
Original assignee: ノボノルディスクバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2000-09-19
Anticipated expiration: 2017-06-09
Also published as: DE69728878D1; US6261827B1; EP0910642A1; CN1221453A; ATE265534T1; DE69728878T2; EP0910642B1; CN1267556C; WO1997047746A1; US6100057A; AU3307797A; JP3462218B2; DK0910642T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、（ａ）糸状菌細胞中に、（ｉ）前記糸状菌細胞に内因性の第１核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を方向づけることができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に操作可能的に連結され；及び／又は（ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを導入し；（ｂ）ヘムタンパク質及びへム生合成酵素の生成のために適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そして（ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク質を回収することを含んで成る、ヘムタンパク質を生成するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】糸状菌におけるヘムタンパク質生産を増加せしめるための方法発明の背景発明の分野本発明は、糸状菌におけるヘムタンパク質の生産方法、及びヘムタンパク質を生産できる糸状菌に関する。関連技術の記載ヘム、すなわちプロトポルフィリンIX及び鉄のキレート錯体は、ヘムタンパク質の補欠分子族として作用する。プロトポルフィリンIXは、４個のメチル基、２個のビニル基及び２個のプロピオン酸基により置換されており、ヘムを形成するために鉄原子を獲得するポルフィリン環から成る。グリシン及びスクシニル−Co Aからのヘムの生合成は、５−アミノレブリン酸シンターゼ（EC２．３．１．37 ）、ポルホビリノーゲンシンターゼ（EC４．２．１．24）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（EC４．３．１．８）、ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（E C４．２．11．75）、ウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ（EC４．１．１．37）、コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ（EC１．３．３．３）、プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ（EC１．３．３．４）及びフェロケラターゼ（EC４．99．１．１)により触媒される８種の酵素段階を包含する。５ −アミノレブリン酸シンターゼは、５−アミノレブリン酸を形成するためにグリシン及びスクシニル−CoAの縮合を触媒する。ポルホビリノーゲンシンターゼ（５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ又は５−アミノレブリン酸デヒドラーゼとも呼ばれる）は、ポルホビリノーゲンを形成するために５−アミノレブリン酸の２つの分子の縮合を触媒する。ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ又はウロＩシンターゼとも呼ばれる）は、プレウロポルフィリノーゲンへのピロールポルホビリノーゲンの四重合を触媒する。ウロポルフィリノーゲンIII シンターゼ（ウロIIIシンターゼ又はウロIIIコシンターゼとも呼ばれる）は、ウロポルフィリノーゲンIIIを生成するためにプレウロポルフィリノーゲンの第四環の転移、続く環化を触媒する。ウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ（ウロ又はウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼとも呼ばれる）は、コプロポルフィリノーゲンIIIを生成するために、メチル基へのウロポルフィリノーゲンIIIのすべての４個の酢酸側鎖の脱カルボキシル化を触媒する。コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ（コプロポルフィリノゲナーゼとも呼ばれる）は、プロトポルフィリノーゲンを生成するために、コプロポルフィリノーゲン IIIのＡ及びＢ環上の位置２及び４での２つのプロピオネート基のビニル基への酸化脱カルボキシル化を触媒する。プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼは、プロトポルフィリンIXを生成するためにプロトポルフィリノーゲンIXの６個の電子酸化を触媒する。フェロケラターゼ（フェロリラーゼ、ヘムシンターゼ、又はプロトヘムフェロリラーゼとも呼ばれる）は、ヘムを生成するためにプロトポルフィリン中への鉄の挿入を触媒する。ヘムタンパク質へのアポタンパク質の転換は、ヘム生合成路により供給されるヘムの利用可性に依存する。ヘムタンパク質のアポタンパク質形はヘムと結合してヘムタンパク質を形成し、このヘムタンパク質は、アポタンパク質よりもタンパク質分解攻撃に対してヘムタンパク質を安定にするコンホメーションを獲得する。微生物により生成されるヘムの量が生成されるアポタンパク質の量に対して低い場合、アポタンパク質は、蓄積し、そしてタンパク質分解を受けて、活性ヘムタンパク質の生成を低める。この問題を克服するために、Jensenは、発酵培地へのヘム又はヘム含有材料の添加が、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus or yzae）により生成されるペルオキシダーゼの生成の有意な上昇を導びくことを示した（WO93/19195）。発酵培地へのヘム補充はヘムタンパク質の収率の有意な改良をもたらすが、それは大規模的に実施するためには不適切で、費用がかかり、且つ困難である。 Wuなど．（1991，Journal of Bacteriology 173：325-333）は、シロヘムの合成のために必要とされるウロポルフィリノーゲンIIIメチルトランスフェラーゼをコードするサルモネラ・チピムリウム（Salmonella typhimurium）cysG遺伝子をプラスミドに導入することを含んで成る、Ｅ．コリ NADPH−亜硫酸レダクターゼ、すなわちシロヘムタンパク質の過剰発現方法を開示する。商業的に有意な量を生成するために糸状菌株におけるヘムタンパク質の生成を高めるための改良された方法を提供することが本発明の目的である。発明の要約本発明は、（ａ）糸状菌細胞中に、（ｉ）前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令することができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作用可能に連結されており；及び／又は（ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを導入し；（ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のために適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そして（ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク質を回収する；ことを含んで成る、ヘムタンパク質の製造方法に関する。本発明はまた、糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指令することができる１又は複数の第１制御配列、及び／又はヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成る組換え糸状菌細胞にも関する。図面の簡単な説明図１は、プラスミドpSEO4の制限地図を示す。図２は、アスペルギラス・オリザエ５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を含む4.2Kbのゲノムフラグメントの制限地図を示す。キロ塩基（Kb）での尺度が地図下に示される。矢印は、遺伝子のオープンリーディングフレームの位置を表わす。図３は、アスペルギラス・オリザエ５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定上のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号ｌ及び２）を示す。潜在的に重要な転写部位、すなわちCCAATボックス及びTATAボックスは下線が引かれている。２つの保存された推定上のHRMモチーフがボックス内にあり；ピリドキサールリン酸補因子結合に関与するグリシンループが円内にあり、そして重要なリシンが星印により示されている。図４は、種々の５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子における保存されたヘム調節モチーフを示す。ペンタペプチドモチーフがボックス内にある。図５は、アスペルギラス・オリザエ、アスペルギラス・ニジュランス（Asperg illus nidulans）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae ）及びヒト赤芽からの５−アミノレブリン酸シンターゼについての推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２，22，23及び24）を示す。保存されたアミノ酸はボックス内にある。図６は、プラスミドpBANe6の制限地図を示す。図７は、プラスミドpSE31の制限地図を示す。図８は、プラスミドpJVi9の構成を示す。図９は、プラスミドpJeRS6の制限地図を示す。図10は、プラスミドpJRoC50の制限地図を示す。図11は、プラスミドpAJO05-1の制限地図を示す。図12は、アスペルギラスオリザエポルホビリノーゲンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３及び４）を示す。CAATボックスには下線が引かれており、そしてTATAボックスはボックス内にある。推定上のイントロンは点下線により同定され、そして推定上の亜鉛フィンガードメインはダッシュ下線により同定される。ライブラリープルーブは黒実線により同定され、そして活性リシンは円により示される。図13は、Ｂ．スブチリス（B.subtilis）、Ｅ．コリ、ヒト、エンドウ、ラット、ホウレンソウ、酵母及びアスペルギラス・オリザエからのポルホビリノーゲンシンターゼについての推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号25，26，27 ，28，29，30，31及び４）を示す。図14は、pAJO23の制限地図を示す。図15は、プラスミドpSE7t1の制限地図を示す。図16は、プラスミドpSE37の制限地図を示す。図17は、プラスミドpSE39の制限地図を示す。図18は、プラスミドpMT1612の制限地図を示す。図19は、プラスミドpBANe13の制限地図を示す。図20は、プラスミドpSE38の制限地図を示す。図21は、プラスミドpJaL292の制限地図を示す。図22は、プラスミドpKS6の制限地図を示す。図23は、プラスミドpMHan37の制限地図を示す。図24は、プラスミドpBANe8の制限地図を示す。発明の詳細な記載本発明は、（ａ）糸状菌細胞中に、（ｉ）前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令することができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に操作可能的に連結されており；及び／又は（ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを導入し；（ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のために適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そして（ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク質を回収する；ことを含んで成る、ヘムタンパク質の製造方法に関する。 “ヘムタンパク質”とは、補欠分子族としてヘムを含むタンパク質のいづれかのメンバー群として本明細書において定義される。ヘムタンパク質は、補欠分子族としてヘムを含む、グロビン、チトクローム、オキシドレダクターゼ、又はいづれか他のタンパク質であり得る。ヘム含有グロビンは、ヘモグロビン及びミオグロビンを包含する。ヘム含有チトクロームは、チトクロームｐ450、チトクロームｂ、チトクロームｃ₁、及びチトクロームｃを包含する。ヘム含有オキシドレダクターゼは、カタラーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい態様においては、オキシドレダクターゼはカタラーゼである。もう１つの好ましい態様においては、オキシドレダクターゼはオキシダーゼである。もう１つの好ましい態様においては、オキシドレダクターゼはオキシゲナーゼである。もう１つの好ましい態様においては、オキシドレダクターゼはハロペルオキシダーゼである。もう１つの好ましい態様においては、オキシドレダクターゼはペルオキシダーゼである。さらに好ましい態様においては、ペルオキシダーゼは、コプリナス（Coprinus）株、アルトロミセス(Arthromyces)株、又はファネロカエト(Phanerochaete)株から得られる。さらにより好ましい態様においては、ペルオキシダーゼは、コプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)株、たとえば、コプリナス・シネレウスIFO 8 371、コプリナス・マクロリゾス（Coprinus macrorhizus）株、又はアルトロミセス・ラモサス(Arthromyces ramosus)株から得られる。もう１つのさらに好ましい態様においては、カタラーゼは、スシタリジウム(Scytalidium)株、アスペルギラス(Aspergillus)株、又はヒュミコラ（Humicola）株から得られる。もう１つのさらに好ましい態様においては、カタラーゼは、スシタリジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）株、たとえばスシタリジウムサーモフィラムCBS 117.65、アスペルギラス・ニガー(Aspergillus niger)株、又はヒュミコラ・インソレンス(Humicola insolens)株から得られる。ヘムタンパク質は、糸状菌に対して内因性か又は外因性かであり得る。制御配列及び／又は核酸配列は、当業界において知られている方法により糸状菌中に導入され得る。たとえば、前記配列は、前記配列の１又は複数のコピーが単一の標的配列及び／又は複数の標的配列中に組込まれる相同又は非相同組換えにより宿主ゲノム中に導入され、そして組込まれ得る。他方では、前記配列は、組込まれない発現ベクター、たとえば自己複製する染色体外プラスミドとして導入され、そして維持され得る。糸状菌中に核酸配列を導入するための当業界における標準方法は、それ自体知られている態様でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプラストの細胞壁の再生を包含する（EP 238,023号及びMslardierなど．，1989，Gene 78：147-156を参照のこと）。細胞は、好ましくは、糸状菌細胞の宿主ゲノム、好ましくは染色体中に便利に組込まれる、ヘム生合成酵素をコードする制御配列及び／又は核酸配列を含む核酸構造体を含んで成るインテグレイティブベクターにより形質転換される。用語“核酸構造体”とは、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然に存在しない態様で組合され、そして並置される核酸のセグメントを含むように修飾された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味するものとして本明細書においては定義される。本発明の糸状菌細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のために適切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、適切な培地において、及びヘムタンパク質の発現及び／又は単離を可能にする条件下で実施される実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は固形状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培地において行われる（たとえば、Bennett，J．W．and Lasure，L.，eds.，More Gene Manipulatio ns in Fungi，Academic Press，CA，1991を参照のこと）。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開された組成（たとえば、American Type Cultur e Collectionのカタログにおける）を用いて調製され得る。ヘムタンパク質が栄養培地中に分泌される場合、そのヘムタンパク質は培地から直接的に回収され得る。糸状菌宿主細胞におけるヘムタンパク質の分泌のためのシグナルペプチドコード領域は、たとえばアスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor mi ehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)セルラーゼ遺伝子、又はリゾムコル・ミエヘイリパーゼ遺伝子から得られる。ヘムタンパク質が分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。得られるヘムタンパク質は、当業界において知られている方法により回収され得る。たとえば、ヘムタンパク質は、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により栄養培地から回収され得る。回収されたタンパク質は、種々のクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は同様の方法によりさらに精製され得る。本発明の１つの観点においては、ヘムタンパク質は、糸状菌細胞中に、前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指令することができる、前記第１核酸配列に作用可能に連結された１又は複数の第１制御配列を導入することによって、前記糸状菌細胞において多量に生成される。前記第１核酸配列は、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ポルホビリノーゲンシンターゼ、ポルホビリノーゲンデアミラーゼ、ウロポリフィリノーゲンシンターゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及びフェロケラターゼから成る群から選択されたヘム生合成酵素をコードするいづれかの糸状菌核酸配列であり得、ここで前記第１核酸配列は、糸状菌宿主細胞に対して内因性である。用語“内因性”とは、糸状菌宿主細胞に起因するものとして本明細書においては定義される。用語“制御配列”とは、第１核酸配列のコード配列の発現のために必要であるか又は好都合であるすべての成分を含むことを本明細書においては意味する。制御配列は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列に対して内因性であり得、他の源から得られ、又は生来の及び外来性の制御配列の組合せであり得る。外来性制御配列は、そのコード配列に通常関連する天然の制御配列に対して所望のヘム生合成酵素の高められた生産性を得るために、単に置換することができ、又は天然の制御配列に付加され得る。そのような配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。制御配列の指令下での発現のためには、本発明に従って使用されるべき第１核配列は、その第１核酸配列のコード配列の発現が制御配列と適合できる条件下で達成されるような態様で制御配列に作用可能に連結される。用語“コード配列”とは、本明細書において定義される場合、上記で言及された制御配列の制御下に配置される場合、mRNA中に転写され、そしてヘム生合成酵素に翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’−末端での翻訳開始コドン及び３’−末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、DNA ，cDNA、及び組換え核酸配列を包含することができるが、但しそれらだけには限定されない。第１制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち第１核酸配列の発現のために糸状菌宿主により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ヘム生合成酵素の発現を仲介する転写及び翻訳制御配列を含む。プロモーターは、選択の宿主細胞における転写活性を示すいづれかのプロモーター配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか、又は非相同である遺伝子から得られる。糸状菌宿主における第１核酸配列の転写を指令するための適切なプロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリ(Aspergillus awamori)グルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ、及びそれらのハイブリッドをコードする遺伝子から得られるプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、 NA2-tpi(アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)、及びglaAプロモーターである。第１制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために糸状菌宿主により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列の３’末端に作用可能に連結される。ターミネーター配列は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列に対して内因性であり得、又は他の源、すなわち外来性ターミネーター配列から得られる。選択の糸状菌宿主細胞において機能的であるいづれかのターミネーターが、本発明において有用であるが、しかし特に好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。第１制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち糸状菌宿主による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列の５’末端に作用可能に連結される。リーダー配列は、第１核酸配列に対して内因性であり得、又は他の源、すなわち外来性リーダー配列から得られる。選択の糸状菌宿主細胞において機能的であるいづれかのリーダー配列は、本発明において有用であるが、しかし特に好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。第１制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち第１核酸配列の３’末端に作用可能に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するために糸状菌宿主により認識される配列でもあり得る。ポリアデニル化配列は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列に対して内因性であり得、又は他の源、すなわち外来性ポリアデニル化配列から得られる。選択される糸状菌宿主において機能的であるいづれかのポリアデニル化配列は、本発明において有用であるが、しかし特に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。第１制御配列はまた、特定の細胞区画へのヘム生合成酵素の局在化を可能にする、ヘム生合成酵素のアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域でもあり得る。そのシグナルペプチドコード領域は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列に対して内因性であり得、又は外来性源から得られる。第１核酸配列のコード配列の５’末端は、局在化されたヘム生合成酵素をコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠と整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含むことができる。他方では、そのコード配列の５’末端は、局在化されたヘム生合成酵素をコードするコード配列のその部分に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域をコードする核酸を含むことができる。シグナルペプチドコード領域は、ニューロスポラクラサ（Neurospora crassa）ATPアーゼ遺伝子(Viebrockなど.，1982，EMBO Journal 1：565-571)又はサッカロミセスセレビシアエチトクロームｃペルオキシダーゼ遺伝子(Kaputなど.，1982，Journal of Biological Chemistry 257：15 054-1508)から得られる。しかしながら、選択の糸状菌宿主においてヘム生合成酵素の局在化を可能にすることができるいづれかのペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。第１制御配列はまた、生化学的に活性的な成熟ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロ酵素は一般的に不活性であり、そしてプロ酵素からのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的分解により成熟活性ポリペプチドに転換され得る。生化学的に活性的なポリペプチドは、その天然の相対物の生化学活性を実施する活性形て生成されるヘム生合成酵素として本明細書において定義される。プロペプチド配列は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列に対して内因性であり、又は他の源、すなわち外来性プロペプチド配列から得られる。プロペプチドをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びマイセリオプソラ・サーモフィラム(Myceliophthora thermophilum)ラッカーゼをコードする遺伝子から得られる。本発明のもう１つの観点においては、ヘムタンパク質は、ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを糸状菌細胞中に導入することによって、糸状菌細胞において多量に生成される。前記第２核酸配列は、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ポルホビリノーゲンシンターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲンシンターゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及びフェロケラターゼから成る群から選択されたヘム生合成酵素をコードするいづれかの核酸配列であり得る。第２核酸配列は、いづれかの微生物源から得られる。第２核酸配列源の選択は、糸状菌宿主細胞に依存するが、しかし好ましい源は菌類源、たとえば酵母及び糸状菌である。好ましい糸状菌源は、アクレモニウム（Acremomium）、アスペルギラス(Aspergill us)、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、マイセリオプソラ（M yceliophthora）、ムコル(Mucor)、ニューロスポラ（Neurospora）、ぺニシリウム(Penicillium)、ファネロカエート(Phanerochaete)、チエラビア(Thielavia) 、トリポクラジウム(Tolypocladium)、及びトリコダーマ(Trichoderma)の種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい酵母源は、カンジダ(Candida)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ピチア（Pichia）、サッカロミセス(Saccha romyces)、シゾサツカロミセス(Schizosaccharomyces)、及びヤロウイア（Yarro wia）の種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。さらに、第２核酸配列は、糸状菌宿主細胞に対して内因性であり得る。第２核酸配列は、次のものからの１又は複数のものであり得る：１．５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子：ａ．サッカロミセス．セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）(Urban-Gri malなど.，1986，European Journal of Biochemistry 156：511-59)；ｂ．アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）(Bradshawなど. ，1993，Current Genetics 23：501-507)；ｃ．ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）(Taiなど. ，1988，Gene 70：139-152)；ｄ．ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）(Hornbergerなど.，1990，Molecular General Genertcs 211：371-378)；及びｅ．エスシェリシア・コリ（Escherichiacoli）(Droletなど.，1989，Molecul ar General Generics 216：347-352)。２．ポルホビリノーゲンシンターゼ遺伝子：ａ．サッカロミセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）(Myersなど. ，1987，Journal of Biological Chemistry 262：l6822-16829)；ｂ．スタフィロコーカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）(Kafala and Sasarman，1994，Canadian Journal of Microbiolog y 40：651-657)；ｃ．ロドベクター・フファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）(Delaunay など.，1991，Journal of Bacteriology 173：2712-2715)；ｄ．エスミエリシア・コリ（Escherichia coli）(Echelardなど.，1988，Mole cular General Genetics 214：503-508)；及びｅ．バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）(Hanssonなど.，1991，Jour nal of Bacteriology 173：2590−2599)。３．ポルホビリノーゲンデアミナーゼ遺伝子：ａ．サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）(Kengなど. ，1992，Molecular General Generics 234：33-433)；ｂ．ヒト（Yoo-など.，1993，Genomics 15：221-29；Raichなど.，1986，Nucl eic Acids Research 14：5955-5968)；ｃ．エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）(Thomas and Jordan，1986， Nucleic Acids Research 14：6215-6226)；及びｄ．バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）(Petricekなど.，1990，Jou rnal of Bacteriology 172：2250-2258)。４．ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ遺伝子：ａ．サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）(Amillet a nd Labbe-Bois，1995，Yeast 11：419-424)；ｂ．バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）(Hanssonなど.，1991，Jour nal of Bacteriology173：2590-2599)；及びｃ．エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）(Jordanなど.，1987，Nuclei c Acids Research．15：10583)。５．ウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ遺伝子：ａ．サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae ）(Gareyなど.，1992，European Journal of Biochemistry 205：1011-1016)；及びｂ．ヒト（Romeoなど.，1986，Journal of Biological Chemistry 261：9825 −9831）。６．コプロホルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子：ａ．ヒト（Martasekなど.，1994，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 911：3024-3028）；ｂ．エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）(Troupなど.，1994，Journal of Bacteriology 176：673-680)；及びｃ．サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）(Zaagorec など.，1986，Journal of Biological Chemistry 263：9718-9724)。７．プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ遺伝子：ａ．ヒト(Taketaniなど.，1995，Genomics 29：698-703)；ｂ．バシラススブチリス（Bacillus subtilis）(Daileyなど.，1994，Journ al of Biological Chemistry 269：813-815)；及びｃ．エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）(Sassrmanなど.，1993，Cana dian Journal of Microbiology 39：155-161)。８．フェロケラターゼ遺伝子：ａ．サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）(Labbe-Boi s，1990，Journal of Biological Chemistry 265：7278-72883)；ｂ．ウシ（Shibuyaなど.，1995，Biochimica Biophysica Acta 1231：117-120 )；ｃ．ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium Japonicum）(Frustac i and O'Brian，1993，Applied Environmental Microbiology 59：347-2351)；ｄ．エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）(Frustaci and O'Brian，199 3，Journal of Bacteriology 175：2154-2156)；及びｅ．バシラススブチリス（Bacillus subtilis）(Hansson and Hederstedt， 1992，Journal of Bacteriology 174：8081-88093)。より好ましい態様においては、第２核酸配列は、アスペルギラスの種から得られる。さらにより好ましい態様においては、第２核酸配列は、アスペルギラス・フィキューム（Aspergillus ficuum）、アスペルギラス・ホエチダス（Aspergil lus foetidus）、アスペルギラス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギラス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギラス・ニジュランス（A spergillu snidulans)、又はアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から得られる。もう１つのさらに好ましい態様においては、第２核酸配列はサッカロミセスの種から得られる。さらにより好ましい態様においては、第２核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・ジアスタニカス(Sacchar omyces diastaricus)、サッカロミセス・ドウグラシ(Saccharomyces douglasii) 、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビホルミス(Sa ccharomyces oviformis)から得られる。最とも好ましい態様においては、５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする第２核酸配列は、アスペルギラス・オリザエ株Ａ1560(IFO4177)、たとえば配列番号１に示される核酸配列から得られる。５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする第２核酸配列はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号１と異なる、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸配列でもあり得る。もう１つの最とも好ましい態様においては、ポルホビリノーゲンシンターゼをコードする第２核酸配列は、アスペルギラス・オリザエ株Ａ1560(IFO41 77)、たとえば配列番号３に示される核酸配列から得られる。ポルホビリノーゲンシンターゼをコードする第２核酸配列はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号３とは異なる、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲンシンターゼをコードする核酸配列であり得る。本発明の第２核酸配列はさらに、配列番号１及び３に示される両ゲノム配列、及びそれらの対応するcDNA及びRNA配列を包含する。用語“核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、合成DNAを包含するすべてのそのような変形体を包含することが理解されるであろう。好ましい態様においては、第２核酸配列は、１又は複数の第２制御配列に作用可能に連結され、糸状菌宿主中に導入される。第２制御配列は、ヘム生合成酵素をコードする第２核酸配列に対して内因性であり、又は外来性源から部分的に又は完全に得られる。外来性制御配列は、コード配列に通常関連する天然の制御配列に対して所望のヘム生合成酵素の高められた生産性を得るために天然の制御配列を単純に置換することができる。第２制御配列配列は第１制御配列に関して上記に例示された制御配列のいづれであってもよい。本発明のもう１つの観点においては、１又は複数の第１制御配列の１又は複数のコピー及び１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーが、糸状菌細胞中に導入される。好ましくは、第２核酸配列は、１又は複数の第２制御配列に作用可能に連結される。第１制御配列、第２核酸配列及び／又は第２制御配列は同じ核酸構造体に含まれ得、又はそれらは異なった核酸構造体に含まれ得る。個々の核酸構造体は、正確な位置で菌類宿主のゲノム中への相同組換えにより組込みを指令するための組込み要素を含んで成ることができる。正確な位置での組込みの傾向を高めるためには、組込み要素は好ましくは、相同組換えの確立を高めるために対応する標的配列と高い相同性である、十分な数の核酸、たとえば100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、そして最も好ましくは800〜1,500塩基対の核酸を含むべきである。組込み要素は、糸状菌宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同であるいづれかの配列であり得る。さらに、組込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。他方では、個々の核酸構造体は、非相同組換えにより糸状菌宿主細胞のゲノム中に組込まれ得る。核酸構造体は適切なベクター中に挿入され得、又は第２核酸配列は、当業界において知られている分子生物学的技法を用いて、制御配列をすでに含むベクター中に直接的に挿入され得る。前記ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そして本発明の核酸配列の発現をひき起こすことができるいづれかのベクターであり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である糸状菌細胞と前記ベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色体外存在物、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体として存在するベクターであり得る。他方では、ベクターは、糸状菌中に導入される場合、ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。ベクター系は、糸状菌宿主のゲノム中に導入される全DNA を一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドであり得る。本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養株〜栄養要求株、及び同様のものを提供する生成物の遺伝子である。選択マーカーは、amdS，pyrG，argB，niaD，sC，trpC，bar 及びhygBから成る群から選択され得るが、但しそれらだけには限定されない。アスペルギラス細胞への使用のためには、アスペルギラスニジュランス又はアスペルギラスオリザエのamdS及びpyrGマーカー、及びストレプトミセスヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）のbarマーカーが好ましい。さらに、選択は、選択マーカーが別々のベクターに含まれるWO91/17243に記載されるように、同時形質転換により達成され得る。核酸構造体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素を連結するために使用される方法、及び複製のために必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Samb rookなど.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d，ed.，Cold Spring Harbor，New York，1989を参照のこと）。本発明の方法はさらに、ヘムタンパク質をコードする１又は複数の第３核酸配列の１又は複数のコピーを、糸状菌細胞中に導入することを含んで成る。ヘムタンパク質をコードする第３核酸配列は、段階ａの前又は後に、但し段階ｂの前に導入され得る。第３核酸配列は、第ｌ制御配列、第２核酸配列及び第２制御配列と同じベクターに含まれ得、又はそれらは異なったベクターに含まれ得る。好ましくは、第３核酸配列は、第３制御配列に作用可能に連結された。前記第１制御配列に関して上記に例示される制御配列はまた、第３制御配列に適用できる。本発明の方法はさらに、ヘム源、その類似体、又は１又は複数の経路中間体を栄養培地に導入することを含んで成る。ヘム類似体及び経路中間体の列挙については、Product Brochure of Porphyrin Products Inc．(Logan，UT)を参照のこと。たとえば、ヘム生合成路における酵素の１つをコードする核酸配列が糸状菌細胞中に導入される場合、１又は複数の前の段階における１又は複数の経路中間体が律速となる。そのような場合、それらの１又は複数の経路中間体により培養培地を補充することができる。それらの経路中間体を細胞中に導入するためには、細胞膜を半透過性にすることができる酵素、たとえばNOVOZYM234^TM（Novo Nor disk A/S）を使用できる。本発明の方法はさらに、栄養培地中に鉄源を導入することを含んで成る。他方では、本発明の方法はさらに、ポルフィリン合成を誘発できるいづれかの他の金属イオンを導入することを含んで成る。たとえば、Mametなど.，1996，BioMetal s，9：73-77を参照のこと。本発明はまた、糸状菌に対して内因性の第１核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指令することができる１又は複数の第１制御配列、及び／又はヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成る組換え糸状菌細胞にも関する。前記配列は、菌類細胞のゲノム中に組込まれ得、又は自己−複製染色体外ベクターに含まれ得る。本発明の糸状菌細胞はさらに、糸状菌細胞におけるヘムタンパク質の発現を指令することができる第３制御配列に作用可能に連結された、ヘムタンパク質をコードする第３核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成り、ここで前記ヘムタンパク質をコードする第３核酸配列は菌類細胞のゲノム中に組込まれ、又は自己− 複製染色体外ベクターに含まれる。糸状菌細胞の選択は、制御配列源、ヘム生合成酵素をコードする核酸配列源及びヘムタンパク質源にかなりの程度、依存するであろう。好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒュミコラ、マイセリオプソラ、ムコル、ニューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム及びトリコダーマの種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はアスペルギラス細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はアクレモニウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はヒューミコラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はマイセリオプリラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はムコル細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はペニシリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はチエラビア細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はトリコダーマ細胞である。より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はアスペルギラス・フィキューム細胞、アスペルギラス・ホエチダス細胞、アスペルギラス・ジャポニカス細胞、アスペルギラス・ニガー細胞、アスペルギラス・ニジュランス細胞、又はアスペルギラス・オリザエ細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・オキシスポラム細胞又はフサリウム・グラミネアラム細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はヒューミコラ・インソレンス細胞又はヒューミコララ・ヌギノサス細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はマイセリオプソラサーモフィラム細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はムコルミエヘイ細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はニューロスポラクラサ細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はペニシリウムパープロゲニウム細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はチエラビア・テレストリス細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、トリコダーマ・ハルジアナム細胞、トリコダーマ・コニンジ細胞、トリコダーマロンジブラキアタム細胞、トリコダーマ・レセイ細胞、又はトリコダーマ・ビリデ細胞である。本発明はさらに、次の例により記載されるが、しかしそれらは本発明の範囲を限定するものではない。実施例例１：アスペルギラス・オリザエ株Ａ1560ゲノムDNA抽出アスペルギラス・オリザエ株Ａ1560(IFO4l77)を、0.5％酵母抽出物−２％グルコース(YEG)培地25mlにおいて32℃及び250rpmで24時間、増殖せしめた。次に、菌糸体を、Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)を通しての濾過により集め、そして10mMのトリス−１mMのEDTA（TE）緩衝液25mlにより１度洗浄した。過剰の緩衝液を菌子体から排水し、続いて、その菌子体を液体窒素において凍結した。凍結された菌糸体を電気コーヒーグラインダーにより細かな粉末に粉砕し、そしてその粉末を使い捨てプラスチック製遠心分離管におけるTE緩衝液20ml及び20％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）５ml に添加した。その混合物を数回、軽く逆にし、混合を確保し、そして等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１；ｖ／ｖ／ｖ）により２度抽出した。酢酸ナトリウム（３Ｍ溶液）を添加し、0.3Ｍの最終濃度にし、続いて2.5体積の氷冷却エタノールを添加し、核酸を沈殿せしめた。次に、核酸を、15,000×ｇで30分間、前記管を遠心分離することによりペレット化した。そのペレットを30分間、空気乾燥せしめ、続いて、TE緩衝液0.5mlに再懸濁した。DNアーゼ−フリーのリボヌクレアーゼＡを添加し、100μｇ/mlの濃度にし、そしてその混合物を37℃で30分間インキュベートした。次に、プロテイナーゼＫを200μｇ／mlの濃度で添加し、そしてその混合物を37℃でさらに１時間インキュベートした。最終的に、前記混合物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１；ｖ／ｖ／ｖ）により２度、抽出し、その後、前記のようにして、酢酸ナトリウム及びエタノールによりDNAを沈殿せしめた。DNAペレットを真空下で乾燥せしめ、TE緩衝液に再懸濁し、そしてさらなる使用まで、４ ℃で貯蔵した。例２：プラスミドpSE04の構成ゲノムDNAを、例１に記載される同じ方法を用いて、アスペルギラス・ニジュランス株Ａ26(Fungal Genetics stock Center，Kansas City，KS)から得た。プラスミドpSE04を、アスペルギラス・ニジュランスＡ26ゲノムDNAを含む増幅反応からのPCRフラグメントの連結により構成した。前記増幅反応は、次の成分を含んだ：50ngのアスペルギラス・ニジュランスＡ26ゲノムDNA、100μＭの個々のdA TP，dCTP，dGTP及びdTTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、50ｐモルのプラスミド及びALAS3d 5’-TTTATGATGGAGGCCCT TCTCCAGCAGTCTC-3’（配列番号５）及びALAS4e5’-CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGAC TGG-3’（配列番号６）、２単位のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp.， Branchburg，NJ）、及び１×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液（Perkin-Elmer Corp. ，Branchburg，NJ）。前記反応物を、それぞれ95℃で１分間、55℃で１分間、及び72℃で90秒間、30サイクルの間プログラムされたPerkin-Elmer Thermal Cycle r(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)においてインキュベートした。２kbのP CR生成物を、1.1％の低溶融温度アガロースゲル(FMC，Rockland，ME)及び40mMのトリス−酢酸塩−１mMのジナトリウムEDTA(TAE)緩衝液を用いての電気泳動の後での切断により単離し、そして製造業者の説明書に従って、pCRIIベクター(Invi trogen，San Diego，CA)中にサブクローン化し、pSE04を生成した（図１）。例３：アスペルギラス・オリザエ株Ａ1560 DNAライブラリー、及びALAシンターゼ（hemA）クローンの同定アスペルギラス・オリザエ株A1560ゲノムDNAライブラリーを、組換えバクテリオファージのプレート化及び精製のための宿主としてＥ．コリY1090ZL細胞、及び個々のpZL1-hemAクローンの切断のためのＥ．コリDH10Bzipを用いて、製造業者の説明書に従って、バクテリオファージクローニングベクターλZipLox(Life Technologies，Gaithersburg，MD)を用いて構成した。例１に記載されるようにして調製された全細胞DNAを、Tsp509Iにより部分的に消化し、そして50mMのトリス−50mMの硼素酸塩−１mMのジナトリウムEDTA(TBE)緩衝液を用いて１％アガロースゲル上でサイズ分別した。４〜７kbのサイズ範囲に移動するDNAフラグメントを、Prep-a-Gene試薬(BioRad Laboratories，Hercules，CA)を用いてゲルから切断し、そして溶離した。その溶離されたDNAフラグメントを、EcoRＩ- 切断され、そして脱リン酸化されたλZipLoxベクターアームと共に連結し、そしてその連結混合物を市販のパッケージング抽出物（Stratagene，La Jolla，CA）を用いてパッケージングした。そのパッケージされたDNAライブラリーを、Ｅ．コリY1090ZL細胞にプレート化し、そして増幅した。増幅されていないゲノムライブラリーは、１×10⁶pfu／mlを含んだ。７×10⁴個のプラークからのバクテリオファージDNAを、円状Nytran Plus膜(Sc hleicher & Schuell，Keene，NH)を重複するために移行し、そして例２に記載されるプラスミドpSE04からのアスペルギラスニジュランスhemAゲノムDNAのPCR増幅により調製された、ジゴキシゲニン(DIG)−ラベルされたプローブによりプローブした。前記増幅反応は次の成分を含んだ：１×DIGプローブ合成混合物(Boeh ringer Mannheim，Indianapolis，IN)、100μＭの個々のdATP，dCTP，dGTP及びd TTP、50ｐモルの例２に記載されるプライマーALAS3d及びプライマーALAS4e、２単位のTaq DNAポリメラーゼ、及び１×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液。前記反応物を、それぞれ95℃で１分間、55℃で１分間、及び72℃で２分間、30サイクルの間プログラムされたPerkin-Elmer Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。変性されたプローブを、２ng／mlの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、そしてプレハイブリダイズされた膜と共に一晩インキュベートした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、５×SSC，0.1％のサルコシル、0.02％のSDS，1％のGeniusブロッキング剤(Boehringer Mannheim，Indian apolis，IN)、及び30％ホルムアミド溶液において42℃で行なわれた。膜を、５ ×SSC−0.1％SDSにより２度、続いて２×SSC−0.1％SDSにより２度洗浄した。個々の洗浄は室温で15分間、実施された。洗浄された膜を、室温で約２時間、Koda k X-OMAT ARフィルムに露光し、続いて、製造業者の説明書に従って、Konica QX-70自動フィルム処理機を用いて現像した。主要プラークを精製し、そして二度目に、スクリーンした。５個のクローンを、製造業者の説明書（Bethesda Research Laboratories，In c.，Gaithersburg，MD）に従って、同定し、そしてpZL誘導体中に切り出した。p ZL誘導体を、Ｅ．コリDH5α pSE11，pSE13，pSE15，pSE17及びpSE20と命名した。それらのクローンは、制限地図が図２に示される、4.2kbの領域をオーバーラップし、そして及ぶことが見出された。例４：５−アミノレブリン酸シンターゼ（hemA）プローブによるアスペルギラスオリザエ株Ａ1560ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション例１に記載のようにして調製されたアスペルギラス・オリザエ株Ａ156Oゲノム DNA(10μｇ)を、BamHＩ又はEcoRＩのいづれかにより制限消化した。フラグメントを、１％アガロース−TBEゲル上での電気泳動により分離した。DNAを、製造業者の説明書に従ってTurboBlot装置(Schleicher & Schuell，Keene，NH)を用いて、0.4ＮのNaOHにおけるNytran Plus膜に移した。膜を、Hybaidオーブン（Labnet ，Woodbridge，NJ）における５×SSC，0.1％サルコシル、0.02％SDS，１％Geniu sブロッキング剤(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)及び50％ホルムアミド溶液において42℃で２時間、プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、例３に記載のようにしてPCR増幅により生成される、DIG−ラベルされたhe mAプローブにより実施したが、但し、hemAクローンpSE17を、プライマーhemA 5 ’5’-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3’（配列番号７）及びプライマーhemA 3 ’5’-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3’（配列番号８）と共に鋳型として使用した。DIG−ラベルされたhemAプローブ（１ngのプローブ／mlの溶液）を、新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、そして前記膜と共に42℃で一晩インキュベートした。続いて、膜を、室温で５×SSC−0.1％SDSにより15分間２度、続いて同じ条件下で２×SSC−0.1％SDSにより２度洗浄した。洗浄された膜をKodak X-OMAT AR フィルムに室温で２時間、露光し、続いて製造業者の説明書に従って、Konica Q X-70自動フィルム処理機を用いて現像した。アスペルギラス・オリザエhemAプローブによるアスペルギラス・オリザエゲノムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションは、単一の遺伝子コピー数と適合するハイブリダイゼーションシグナルの存在を示した。BamHＩレーンに観察される1.7kbのバンドが制限地図から示された（図２）。例５：アスペルギラス・オリザエＡ1560 ５−アミノレブリン酸シンターゼ（he mA）遺伝子の特徴化例３に記載されるＥ．コリDH5α pSE17を、次の方法に従ってDNA配列決定にゆだねた。両鎖のDNA配列決定を、M13逆方向（−48）及びＭ13前方向（−20)プライマー（New England Biolabs，Beverly，MA）及び配列決定されるDNAに対して独得なプライマーを用いて、色素−ターミネーター化学と共にプライマーウォーキング技法(Primer walking technique)(Gieseckeなど.，1992，Journal of Vir ol．Methds 38：47-60)を用いるApplied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer（Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA）により実施した。クローン化された遺伝子のヌクレオチド配列は、図３に示されるような1911個のヌクレオチドの読取り枠を示した（配列番号１）。そのコード配列は、cDNAクローニング、及びその５’末端で１つのイントロンを含むアスペルギラス・ニジュランスhemA遺伝子に対照しての配列分析により確認されたいづれのイントロンも含まない（ Bradshawなど.，1993，Current Genetics 23：501-507）。５’末翻訳配列は、他の菌類遺伝子におけるようないくつかのピリミジンに富んでいる領域及びATに富んでいる領域(Currなど.，1987，Kinghorn，J.R．(ed.)，Gene Stracture in Eukaryotic Microbes，pp．93-139，IRL Press，Oxford)、位置−249でのCCAAT 配列、及び位置−35で位置する推定上のTATAボックスを含む。CCAAT配列は、酸素に応答して転写を調節する転写レギュレーター、たとえば酵母及びヒトにおけるHap2/3/4転写調節複合体のためのコンセンサス結合部位である（Olesen and G uarente，1990，Molecular and Cellular Biology 12：2302-2314）。この調節複合体はまた、哺乳類においても保存され、そしてCCAAT−結合活性はアスペルギラスニジュランスにおいても同定されている(Davisなど.，1993，Genetics 90 ：133-145)。アスペルギラス・オリザエhemA遺伝子におけるこの配列の重要性は知られておらず、そして制限された配列情報のために、アスペルギラスニジュランスhemA ５’領域においては確認されていない（Bradshawなど.，1993、前記）。酸素に応答してのアスペルギラスオリザエhemA遺伝子の転写調節は現在知られていないが、しかしアスペルギラス・ニジュランスhemA遺伝子は酸素制限の条件下でさえ転写的に調節されるとは思われない（Bradshawなど.，1993、前記）。興味あることには、酵母HEM1遺伝子はまた、構成的に発現されるが、しかしその発現は陽性及び陰性調節部位間のバランスにより制御される(Keng and Guarente ，1987，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84：9113-911 7)。(AC)₃₅反復モチーフは３’末翻訳領域に存在する。類似する反復体はまた、哺乳類及び酵母遺伝子のサブテロマー、イントロン及びプロモーター領域においても観察され、そしてそれらは遺伝子増幅現象において包含されるが、既知の機能を有さない(Passanantiなど .，1987，EMBO Journal 6：1697-1703)。アスペルギラス・オリザエ株Ａ1560遺伝子生成物の推定されるアミノ酸配列は図３に示されている（配列番号２）。そのヌクレオチド配列は、68kDaの分子量を有する636個のアミノ酸の予測されるタンパク質をコードする。この酵素はミトコンドリアに位置するので、そのＮ−末端はミトコンドリアリーダー配列を含むことが予測される。実際、最初の35個のアミノ酸は、ミトコンドリアリーダーとしての機能と適合する、セリン、トレオニン、リシン及びアルギニン残基に富んでいる。可能性あるヘム調節モチーフ(HRM)は、アスペルギラス・ニジュランス及びアスペルギラス・オリザエhemA配列（図４）の両者の推定されるミトコンドリアリーダー配列において存在する。リーダー配列に局在化されるHRMは、ヘムとの直接的な相互作用を通してマウスにおけるミトコンドリア中への５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質の輸送を妨げると思われる（Lathrop and Ti mko，1993，Science 259：522-525；Zhang and Guarente，1995，EMBO Journal 14：313-320）。第２の可能性あるHRMはまた、推定上の成熟タンパク質配列の開始部にも存在する。HRMは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の調節において役割を演じると思われる。興味あることには、サッカロミセス・セレビシアエ５ −アミノレブリン酸シンターゼタンパク質配列は、いづれの推定上のHRMも含まず、そして酵母ヘム生合成におけるキー調節段階であるとは思われない(Labbe-B ois and Labbe，In Daley，Harry A.，ed.，Biosynthesis of Heme and Chlorop hylls，1990，McGraw Hill Publishers，New York，pp．235-285)。全体的には、図５に示されるような推定されるアミノ酸配列は、アスペルギラス・ニジュランスhemA遺伝子（配列番号22）と81％の同一性を共有し、サッカロミセス・セレビシアエHEM1遺伝子（配列番号23；Urban-Grimal，1986，European Journal of Biochemistry 156：511-51 9）と57％の同一性を共有し、そしてヒト赤芽hem1(ALAS2)遺伝子(配列番号24；B ishop，1990，Nucleic Acids Research 18：7187-7188)と51％の同一性を共有する（Applied Biosystems GeneAssistプログラム（blosum62．mat matrix）を用いて決定された）。しかしながら、最高の程度の保存性が、触媒ドメインを含むタンパク質のＣ末端の２／３において存在する。さらに、他の５−アミノレブリン酸シンターゼ酵素における触媒活性及びピリドキサールリン酸補因子結合のために重要なリシン及びグリシンーループ（Ferreiraなど.，1995，Journal of Bi oenergetics and Biomembrances 27：151-159；Ferreira，1995，Protein Scien ce 4：1001-1006）はまた、高く保存される。例６：プラスミドpSE31の構成プラスミドpSE31を、pBANe6中へのPCR−増幅されたアスペルギラスオリザエhe mA DNAの直接的なクローニングにより構成した（図６）。PCR増幅反応を、例３に記載されるhemAクローンＥ．コリDH5α pSE17からのDNAを用いて行ない、ここで前記反応は次の成分を含んだ：50ngのpSE17、２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）、1×Vent DNAポリメラーゼ緩衝液（New England Biolabs，Beverly，MA）、400μＭの個々のdATP，dCTP，dGTP、及びdT TP（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）、及び50ｐモルのプライマーhem A 5’5’-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3’（配列番号７）及びプライマーhemA 3’5’-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3’（配列番号８）。前記反応物を、それぞれ95℃で１分間、55℃で１分間及び72℃で90秒間、30サイクルの間プログラムされたPerkin-Elmer Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。プライマーh emA 5’は、SwaＩ部位（下線）を含み、そしてプライマーhemA 3’はPacＩ部位（下線）を含み、それらはpSE31を生成するために、SwaＩ及びPacＩにより消化されたpBANe6中へのクローニングのために使用された（図７）。例７：アスペルギラス・オリザエ株JRoC50.3.18Aの構成プラスミドpJROC50を含むアスペルギラスオリザエ株JRoC50.3.18Aを、次のようにして構成した。コプリナスシネレウス（Coprinus cinereus）IFO8371ペルオキシダーゼcDNAフラグメントを、コプリナスマクロリザス（Coprinus macro thizus）ペルオキシダーゼのアミノ酸配列(Baunsgaardなど.，1993，European J ournal of Biochemistry 213：605-611)に基づいて構成された、下記に示される特定のオリゴヌクレオチドプライマー(Saikiなど.，1988，Science 239：487-49 1)を用いてのPCRにより調製した：１．5’-GCGCGAATTCGTNGGNATNGGNATNAA(CT)CA(CT)GG-3’（配列番号９）２．3’-TACAGNTT(GA)AC(GA)GGNGGCCTAGGCG-5’（配列番号10）３．5’-GCGAATTCACNCCNCA(GA)GTNTT(CT)GA(CT)AC-3’（配列番号11）４．3’-GGNAA(GA)GGNCCNCT(CT)AA(GA)CCTAGGCG-5’（配列番号12）５．5’-GCGCGAATTCTGGCA(GA)TCNAC-3’（配列番号13）６．5’-GCGCGAATTCTGGCA(GA)AGNATG-3’（配列番号14）７．3’-CGNTACCGNTT(CT)TACAGCCTAGG-5’（配列番号15） PCRを、Gene Amp Kit及び装置(Perkin Elmer Cetas，Norwalk，CT)を用いて製造業者の説明書に従って実施し、但し、反応は、第１鎖cDNA（コプリナスシネレウス株IFO8371から得られるmRNAから調製された）への良好なハイブリダイゼーションを得るために、PCRの最初の３サイクルの間28℃で、及び続いて30サイクルの間65℃ で行なわれた。プライマーを次のようにして組合した：１と２；３と４；５と７；６と７；１と４；及び３と７。PCRフラグメントを、５’末端でのEcoRＩ部位及び３’末端でのBamHＩ部位により延長した。反応を１％アガロース−TBEゲル上で分析し、ここで予測されるサイズのバンドがすべての反応において見出された。バンドがペルオキシダーゼ−特異的配列に対応することを確証するために、ゲルをサザンブロットにゆだね、そしてプライマー３と４との間に位置する次の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした：5’-GT(CT)TC(GA)AT(GA)TA GAA(CT)TG-3’（配列番号16）。前記プローブは、約130bp，420bp，540bp及び240bpのバンドにハイブリダイズすることが見出され、従って観察されるDNAバンドがペルオキシダーゼ配列に対応することを確認した。種々のPCR反応からのDNAを、EcoRＩ及びBamHＩにより消化し、そしてプラスミドpUC19(New England BioLabs，Beverly，MA)中にクローン化した。正しいPCRフラグメントを含むコロニーを、上記オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号16）を用いてのハイブリダイゼーションにより同定した。陽性コロニーからのDNAを、Sangerなど．(1977，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74：5463-5467)により記載されるようにして制限マッピング及び部分DNA配列分析により分析した。プライマー１及び４を用いることによって得られた、クローンの１つからの430bpフラグメントを用いて、下記のようにしてコプリナスシネレウスcDNAライブラリーをスクリーンした。全RNAを、Boelなど．(1984，EMBO Journal 3：1097-1102)及びChirgwinなど．（1979，Biochemistry 18：5294-5299）により記載される方法に従って、最大のペルオキシダーゼ活性の時点で集められた、均質化されたコプリナス・シネレウス株IFO8371菌糸体から抽出した。ポリ（Ａ）−含有RNAを、Ariv and Leder(1972，Proceedings of the National Ac ademy of Science USA 69：1408-1412)により記載のようにして、オリゴ（dT） −セルロース上での２サイクルの親和性クロマトグラフィーにより得た。cDNAを、cDNA Synthesis Kit(Invitrogen，San Diego，CA)により製造業者の説明書に従って合成した。コプリナス・シネレウスcDNAライブラリーからの約50,000個のＥ．コリ組換え体を、Whatman 540紙フィルターに移した。コロニーを、Gerger など．(1979，Nucleic Acids Research 7：2115-2135)により記載のようにして、溶解し、そして固定した。フィルターを、0.2×SSC−0.1％SDSにおける³²Ｐ− ラベルされた430bpペルオキシダーゼ−特異的プローブによりハイブリダイズした。フィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を65℃で実施し、続いて、増強装置スクリーンにより24時間オートラジオグラフィー処理した。オートラジオグラフィーの後、フィルターを上昇する温度で洗浄し、続いて、増強装置スクリーンにより24時間オートラジオグラフィー処理した。この場合、50個以上の陽性クローンを同定した。MiniprepプラスミドDNAを、標準方法(Birnboim and Doly ，1979，Nucleic Acids Research 7：1513-1523)によりハイブリダイズするコロニーから単離し、そしてcDNA挿入体のDNA配列を、Sangerジデオキシ方法(Sanger など.，1977，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74：546 3-5467)により決定した。コロニーの１つを選択し、そしてpCipと命名した。ペルオキシダーゼcDNAフラグメントを、BamHＩ/XhoＩによる切断によりベクターから切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応のために容易にした。cDNAフラグメントを、BamHＩ／XhoＩにより消化されたpHD414に連結し、pJ V19を生成し、ここでcDNAは、図８に示されるように、アスペルギラスオリザエからのTAKAプロモーター及びアスペルギラスニガーからのAMG^TM(Novo Nordisk A /S，Bagsvaed，Denmark)ターミネーターの転写制御下に存在した。コプリナス・シネレウスペルオキシダーゼをコードするcDNAを、BamHＩ−Xho ＩフラグメントとしてプラスミドpJVi9から切り出し、そしてプラスミドpJeRS6 （図９）中にクローン化し、選択マーカーとしてのpyrG、TAKAプロモーター及び amdSターミネーターを含むプラスミドpJRoC50(図10)を生成した。アスペルギラスオリザエ株HowB425の形質転換体を、次の変更を伴って、下記のようにして５μｇの精製されたプラスミドpJRoC50を用いて製造した。寒天被膜を除去し、そしてプロトプラストを最少培地プレート上に直接的にプレートした。形質転換を、２×10⁷個のプロトプラスト／mlの濃度でプロトプラストにより実施した。 100μｌのプロトプラストを、５μｇのDNAと共に氷上に30分間プレートした。 1mlのSPTC(40％のPEG 4000、0.8Ｍのソルビトール、0.05Ｍのトリス、pH8.0、0. 05ＭのCaCl₂)を添加し、そしてプロトプラストを34℃で20分間インキュベートした。形質転換体を、最少培地を含むプレート上に直接的にプレートした。最少培地(pH6.5)は、１ｌ当たり、６ｇのNaNO₃,0.52ｇのKCl,1.52ｇのKH₂PO₄，１mlの微量金属、１ｇのグルコース、500mgのMgSO₄・７H₂O，342.3ｇのスクロース、及び20ｇのNoble寒天から構成された。微量金属溶液（1000×）は、１ｌ当たり、2 2ｇのZnSO₄・７H₂O,11ｇのH₃BO₃，５ｇのMnCl₂・４H₂O,５ｇのFeSO₄・７Ｈ₂O，1 .6ｇのCoCl₂・５H₂O，1.6ｇの(NH₄)₆Mo₇O₂₄、及び50ｇのNa₄EDTAから構成された。プレートを34℃で５〜７日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地のプレートに移し、そして37℃で３〜５日間インキュベートした。 66の形質転換体を次の酵素アッセイを用いて、ペルオキシダーゼ活性についてアッセイした：180μｌの基質緩衝液｛20μｌの0.1Ｍリン酸カリウム−0.01％Tw een-80，pH7.0，250μｌの２，２’−アジノビス(３−エチルベンゾチアゾリン −６−スルホネート)(ABTS)溶液（22mg／ml）及び２μｌの30％過酸化水素｝を、１：900に希釈された培養物上清液20μｌに添加し、続いてすぐに、Molecular Devices Thermomax Microplate Reader(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)を用いて25℃で、405nmでの吸光度を測定した。測定値は、混合しながら２分間にわたって10秒ごとに記録され、そしてVmax値はSOFTmaxプログラム（Molecular D evices，Sunnyvale，CA）を用いて計算された。１ml当たりのペルオキシダーゼ単位（POXU）を、標準として既知量のコプリナスシネレウスペルオキシダーゼにより構成された標準曲線を用いて推定した。POXUを、30℃で１分当たり、0.88μ ＭのH₂O₂，1.67mMのABTS，0.1Ｍのリン酸(pH7.0)の溶液1.0μＭの転換を触媒する酵素の量として定義した。最高レベルを発現する４種の形質転換体は、上記と同じ条件下で同じプレートを用いて胞子を画線培養し、そして単離されたコロニーを採取することによって精製された胞子であった。最終評価を、個々の形質転換体の約５×10⁶個の胞子が、１％酵母抽出物、2.5 ％マルトース、0.2％尿素、及び１×MY塩（pH6.5）を含む25mlのMY25培地中に接種されている振盪フラスコにおいて実施した。１×MY塩は、２ｇのMgSO₄・７H₂O ，２ｇのK₂PO₄,10ｇのKH₂PO₄，２ｇのクエン酸、0.5mlの微量金属溶液及び１ml の10％CaCl₂・２H₂O(１ｌ当たり)から構成された。微量金属溶液は、１ｌ当たり 13.9ｇのFeSO₄・7H₂O，8.5ｇのMnSO₄・H₂O，14.28ｇのZnSO₄・７H₂O,1.63ｇのCu SO₄,0.24ｇのNiCl₂・６H₂O及び3.0gのクエン酸から構成された。ヘミンを、50mMのNaOHにおいて調製された新鮮な10mg ／ml原液から添加し、0.01mg／mlの最終濃度にした。振盪フラスコを、34℃及び 200rpmで７〜８日間インキュベートした。最良のペルオキシダーゼ生成体を、JR oC50.3.18Aと命名した。例８：pSE31 によるアスペルギラス・オリザエJRoC50.3.18Aの形質転換アスペルギラス・オリザエ株JRoC50.3.18AをpSE31により形質転換し、hemA遺伝子の過剰発現がペルオキシダーゼ生成を高めるかどうかを決定した。形質転換を、１ml当たり２×10⁷個のプロトプラストの濃度でプロトプラストにより行なった。100μｌのプロトプラストを34℃で、30分間、10μｇのDNA及び 60％PEG4000−10mMのHEPES−10mMのCaCl₂溶液200μｌと共にインキュベートした。３mlのSPTC(40％PEG4000、0.8Ｍのソルビトール、0.05Ｍのトリス、pH8.0、0. 05ＭのCaCl₂)を添加し、そしてプロトプラストを、amdS形質転換のためにCOVE形質転換プレート(１ｌ当たり：0.52ｇのKCl、0.52ｇのMgSO₄・７H₂O,1.52ｇのKH₂ PO₄、例７に記載のような微量金属溶液１ml，342.3ｇのスクロース、25ｇの貴ガス、１Ｍのアセトアミド10ml、及び３ＭのCsCl 10ml)上に直接的にプレートした。プレートを34℃で５〜７日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地のプレートに移し、そして34℃で３〜５日間インキュベートした。次に、形質転換体を、同じ条件下で同じプレートを用いて、胞子を画線培養し、そして単離されたコロニーを採取することによって精製した。例９：hemA 形質転換体によるペルオキシダーゼ生成例８からの形質転換体を、0.25％の酵母抽出物、0.63％のマルトース及び0.05 ％の尿素(pH6.5)並びに１×MY塩（例７を参照のこと）から構成されるMY25培地１mlを含む24ウェル−マイクロタイタープレートの個々のウェル中に約１×１0⁵個の胞子／ウェルで接種した。マイクロタイタープレートを34℃及び100rpmで５日間、保湿チャンバーにおいてインキュベートした。ペルオキシダーゼ生成レベルを、例７に記載される酵素アッセイを用いて決定した。マイクロタイタープレート試験の結果は、hemA形質転換体の平均POXU／ml がベクターのみの形質転換体の平均よりも1.4倍高く、そして最良のhemA形質転換体がペルオキシダーゼ生成において1.6倍の上昇率を示したことを示す。少数脈（39％）のhemA形質転換体は、ベクターのみの対照の多数脈に類似するペルオキシダーゼレベルを示す。個々の形質転換体から例１に記載されるようにして単離されたゲノムDNA 50ngを用いてのPCR増幅を、例２に記載のようにして実施したが、但しプライマーhemA 3’（例４を参照のこと）及びプライマー 5 ’-TCTCTTCCTTCCTGAATCCTC-3’（配列番号17）を使用した。この分析は、hemA形質転換体が発現カセットを含むことを示した。上記で得られた11の最良hemA形質転換体を振盪フラスコにおいて培養し、ペルオキシダーゼ生成に対する効果を最良に評価した。振盪フラスコ評価のためには、個々の形質転換体の約５×10⁵個の胞子を、１％酵母抽出物、2.5％のマルトース、0.2％の尿素、及び１×MY塩（pH6.5）(例７を参照のこと)を含むMY25培地25 ml中に接種した。振盪フラスコを34℃及び200rpmで７〜８日間インキュベートした。ペルオキシダーゼアッセイを上記のようにして実施した。その結果は、５種の形質転換体SE01-15，SE01-20，SE01-26，SE01-28及びSE01 -32がベクターのみの対照株よりも高いペルオキシダーゼレベルを生成し、そして３種の形質転換体が平均の対照ペルオキシダーゼレベルよりも1.9倍高いレベルでペルオキシダーゼを発現することを示した。残る６種のhemA形質転換体は、対照レベルに相当できるペルオキシダーゼレベルを示した。形質転換体SE01-28及び対照株SE05-18（pBANe6ベクターのみの形質転換体）を、炭素源として高マルトースシロップを有する標準供給バッチプロトコールを用いて、２ｌの発酵において増殖した。前記バッチ及び供給物を、FeCl₃により補充し、約0.4mMの濃度にした。陽性の溶解された酸素状態を、３日目から８日目まで約２ｇのサッカリド／ｌ／時の速度で添加される供給物により両培養物において維持した。このレベルは、２日目及び３日目で段階的に達成された。両培養物におけるバイオマスは、発酵の期間、ほぼ等しかった。ペルオキシダーゼ活性の対照株SE05-18に対する２倍の上昇率がSE01-28により観察された。対照株SE05-18に対する、SE01-28のためのポリペプチドレベルの２倍の上昇率がまた存在した。それらの全体の結果は、hemA遺伝子の過剰発現がペルオキシダーゼ生成において２倍の上昇率をもたらしたことを示した。データは、hemAが、遺伝子操作に基づいて、ヘミン補充の不在下でヘムタンパク質生成を改良することができる糸状菌におけるヘム生合成の間キー調節点を示すことができることをさらに示唆した。例10 ：PCR によるゲノムhemBプローブの生成縮重PCRプライマーを、アスペルギラスオリザエからの126bpのhemBフラグメント(Jesper Vind，1994，Ph．D．Dissertation，University of Copenhagen，Cop enhagen，Denmark)及び酵母及びヒトhemBクローンの相同領域(Myersなど.，1987 ，Journal of Biological Chemistry 262：16822-16829；Wetmurなど.，1986，P roceedings of the National Academy of Science USA 83：7703-7707)を端に有するアミノ酸配列に基づいて企画した。オリゴヌクレオチドプライマーを、Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthes izerを用いて合成した。センス5’-GT(AGCT)GC(AGCT)CC(AGCT)(AT)(CG)(AGCT)GA(CT)ATGATG GA-3’（配列番号18）及びアンチセンス5’-GC(AG)TC(AGCT)CG/T(AG)AA(AGCT)CC (AG)TA-3’（配列番号19）プライマーが、鋳型としてpJVi60（Vind，1994、前記）を用いてhemBフラグメントをPCR増幅するために使用された。そのPCR反応物（ 50μl）は、10mMのトリス−HCl，pH8.3，50mMのKCl，1.5mMのMgCl₂，0.01％（ｗ／ｖ）のゼラチン、200μＭの個々のdATP，dCTP，dGTP及びdTTP，500ngのpJVi60 及び50ｐモルの上記の個々のPCRプライマーから構成された。反応物を95℃で３分間インキュベートし、そして80℃に冷却した。次に、５単位のTaqポリメラーゼを添加した。反応物を、それぞれ95℃で30秒間、45℃で１分間及び72℃で１分間、35サイクルの間プログラムされたPerkin-Elmer 9600Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。最後のサイクルに続いて、反応物を72℃で５分間インキュベートした。予測される126bpのhemB PCR生成物をPCRIIベクター中にクローン化し、プラスミドpAJ005−１（図11）を生成した。例11 ：アスペルギラス・オリザエ株A1560DNAライブラリー、及びポルホビリノーゲンシンターゼ（hemB）クローンの同定アスペルギラス・オリザエ株Ａ1560ゲノムDNAライブラリーを、例３に記載のようにして構成した。約８×10⁴個のプラークからのバクテリオファージDNAを、二重環状Nytran Plu s膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)に移し、そしてMertz and Rashtchian(1 994，Analytical Biochemistry221：160-165)に従って、pAJ005−１（例10を参照のこと）のhemBフラグメントを増幅することによって誘導された³²Ｐ−ラベルされたPCR生成物によりプローブした。増幅反応物（50μl）は次の成分を含んだ：10mMのトリス−HCl，pH8.3，50mMのKCl，1.5mMのMgCl₂，0.01％（ｗ／ｖ）のゼラチン、0.04mMの個々のdATP，dCTP，dGTP、及びdTTP，５μｌの³²Ｐ −dCTP(3000Ci／ｍモル、3.3μＭ；Amersham，Arlington Heights，IL)、及び50 ｐモルの個々のセンスプライマー5'-GTGGCTCCGAGTGATAT-3'（配列番号20）及びアンチセンスプライマー5'-GCATCGCGAAAAGGACCG-3'（配列番号21）。反応物を95 ℃に３分間加熱し、続いて５単位のTaqポリメラーゼを添加した。次に、反応物を、95℃で１分間、55℃で１分間及び72℃で１分間、30サイクルプログラムされたPerkin-Elmer Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。反応溶液をSepha dex G50カラム（Pharmacia，Alameda，CA）に通し、組込まれていないヌクレオチドを除去し、そして次に、変性し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。変性されたプローブ（10⁶cpm／ml）をハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、そしてプレハイブリダイズされた膜と共に一晩インキュベートした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを42℃で、５×SSC，50m Mのリン酸ナトリウムpH７，５×Denhardts溶液、0.1％（ｗ／ｖ）のSDS，５mMの EDTA，pH８，10μｇ／mlの変性されたサケ精子DNA、及び50％ホルムアミド溶液において実施した。膜を0.1×SSC，0.1％SDSにより42℃で15分間、４度洗浄した。陽性シグナルを付与する一次プラークを２度スクリーンし、そして製造業者の説明書に従って精製した。陽性シグナルを生成する10のゲノムクローンを、製造業者の説明書（Bethesda Research Laboratories，Inc.，Bethesda，MD）に従って、pZL誘導体としてλZipLoxベクターから切除し、そしてHattori and Sakaki( 1986，Analytical Biochemistry152：232-237)の方法に従って配列決定した。pZ L誘導体はpAJ007−１からpAJ007−10まで命名した。クローンＥ．コリDH５αpAJ 007−６は、制限マッピングに基づいて3.7kbのゲノムフラグメントを含み、そしてさらに分析した。例12 ：ポルホビリノーゲンシンターゼ（hemB）遺伝子の特徴化例11に記載されるＥ．コリDH５αpAJ007−６を、例11に記載される方法に従ってDNA配列決定にゆだねた。クローン化されたアスペルギラスオリザエA1560hemB遺伝子のヌクレオチド配列は、図12（配列番号４）に示されるような40kDaの推定される分子量を有する3 74個のアミノペプチドをコードする、図12（配列番号３）に示されるような1308 個のヌクレオチドの読取り枠を示した。前記ヌクレオチドは、スプライス部位コンセンサス配列を端に有する１つの48bpの推定上のイントロンを含み、そしてUn kles，1992，Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi，Chapter2，J ．R．Kinghorn and G．Turner，editors，Black ie Academic and Professional Publicationsにより推定されるような内部コンセンサス配列を含む。前記３’ スプライス部位(TAG)はMetの254bp下流に位置し、５’スプライス部位（GTCCGC ）は前記３’スプライス部位の46bp下流に位置し、そして内部コンセンサス配列（TCTAAC）は前記５’スプライス部位の30bp下流に位置する。５’未翻訳領域は、位置−377及び−233で２つのCAATモチーフを含み、そして転写調節において重要な役割を果たすことができる（Gurrなど.,1987、前記）。さらに、いくつかの推定上のTATA様ボックスが３’未翻訳領域(−117，−208，−650)に見出される。予測されるように、hemBは、植物を除く他の生物の細胞質に存在するので、そのＮ−末端でリーダー配列を含むように思われない（Bottemley and Muller-Ebe rhard，1988，Seminars in Hematology 25：282-302）。他のhemB遺伝子に対するアスペルギラスオリザエhemB遺伝子（配列番号４）のアミノ酸配列が図13に示される。酵母（配列番号31；Myersなど.,1 987、前記）、ヒト（配列番号27；Wetmurなど.,1986、前記）、ラット（配列番号29；Bishopなど.，1989，Nucleic Acids Research14：10115）及びＥ．コリ（配列番号26；Liなど.，2989，Gene75：177-184）からの推定されるhemBアミノ酸配列は、アスペルギラスオリザエhemBアミノ酸配列に対してそれぞれ、63％，55 ％，55％及び40％の同一性を有する。エンドウ（配列番号28；Bseseなど.，1991 ，Journal of Biological Chemistry266：17060-17066）、バシラススブチリス（配列番号25；Hanssonなど.，1991，Journal of Bacteriology173：2590-2599 ）及びホウレンソウ(配列番号30；Scharmburg and Schneider-Poetsch，1991，E MBL Data Library)からの推定されるhemBアミノ酸配列は低い類似性を有する（それぞれ、40％，39％及び33％の同一性）。しかしながら、エンドウ及びホウレンソウhemBアミノ酸配列の両者はＮ−末端クロロプラストシグナル配列を含むので、アスペルギラスオリザエhemBに対するそれらの類似性は、それらが成熟ポリペプチドとして整列される場合、有意に上昇するであろう。それらの整列に基づけば、アスペルギラスオリザエhemBの活性リシン部位はアミノ酸299に位置し(Ja ffe，1995，Journal of Bioenergetics and Biomembranes 27：169-179)、そしてBerg（1986，Nature319：264-265）により推定されるような保存された亜鉛− フィンガー様ドメインはアミノ酸166-180に位置する。亜鉛−フィンガーは、Zn² ⁺ を結合することによってその活性部位でのスルフヒドリル基の酸化を妨げることが示されている（Jaffe，1995、前記）。植物hemBにおけるその対応するドメインは、Zn²⁺よりもむしろMg²⁺を結合すると思われる（Bseseなど.,1991、前記）。興味あることには、hemBフインガードメインの最初の残基は、植物金属−結合ドメインのこの位置に保存されるThr(位置166での)である。しかしながら、hemB亜鉛フィンガードメインにおける残りの位置は保存される。例13 ：pAJ023 の構成プラスミドpAJ023（図14）を、アスペルギラス・オリザエhemBコード領域をPC R増幅し、そしてそれをアスペルギラス・オリザエ発現ベクターpBANE6中にサブクローニングすることによって構成した。増幅生成物を、pBANe6中へのクローニングを促進するために５’SwaＩ及び３’PacＩ制限部位を含むように企画した。増幅反応物（50μｌ）は、次の成分を含んだ：10mMのトリス−HCl，pH8.3，50mM のKCl，1.5mMのMgCl₂，0.01％（ｗ／ｖ）のゼラチン、200μＭの個々のdATP，dC TP，dGTP及びdTTP，200ngのpAJ007−６ DNA、及び50ｐモルの下記に示される個々のPCRプライマー：PBG10(センス)：5'-GCATATTTAAATGATGTCCTTTTCTAATCTCGT-3 '（配列番号38）及びPBG11A（アンチセンス）：5'-ATATTAATTAATCCATCTAGCTAAAT CATT-3'（配列番号39）。PBG10及びPBG11の下線領域は、それぞれクローニング制限配列SwaＩ及びPacＩを含んだ。反応物を95℃で３分間インキュベートし、そして80℃に冷却した。５単位のPWO(BM)ポリメラーゼを添加した。反応物を、それぞれ95℃で30秒間、57℃で１分間及び72℃で１分間、30サイクルの間プログラムされたPerkin-Elmer9600Thermo-Cyclerにおいてインキュベートした。最後のサイクルに続いて、反応物を72℃で５分間インキュベートした。最終PCR生成物を、ゲル精製し、SwaＩ及びPacＩにより消化し、そしてSwaＩ及びPacＩにより消化されているベクターpBANe6中に連結し、pAJO23を創造した。例14 ：pAJ023 によるアスペルギラス・オリザエJRoC50．３．18Ａの形質転換アスペルギラス・オリザエ株JRoC50．３．18ＡをpAJ023により形質転換し、アスペルギラス・オリザエhemB遺伝子の過剰発現がペルオキシダーゼ生成を高めるかどうかを決定した。対照として、pBANe6がまた、アスペルギラス・オリザエJRoC50．３．18Ａを形質転換するために使用された。形質転換を、１ ml当たり２×10⁷個のプロトプラストの濃度でプロトプラストにより行なった。1 00μｌのプロトプラストを、10μｇのDNAと共に30分間、氷上に配置した。１ml のSPTCを添加し、そしてプロトプラストを34℃で20分間インキュベートした。形質転換物0.25mlのアリコートを、COVE形質転換プレート上にプレートする前、15 mlのCOVE寒天被膜（例８を参照のこと）に添加した。プレートを室温で５〜７日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地のプレートに移し、そして37℃で３〜５日間インキュベートした。例15 ：hemB 一次形質転換体によるペルオキシダーゼ生成合計20のアスペルギラス・オリザエhemB形質転換体及び42の対照形質転換体（アスペルギラスオリザエhemBを伴わないでアスペルギラスオリザエ発現ベクターによるJRoC50．３．18Ａの形質転換体）を、24ウェルプレートにおいて増殖し、そして例７に記載のようにしてペルオキシダーゼ生成についてアッセイした。ペルオキシダーゼアッセイの結果は、対照の形質転換体に対してより高いレベルのペルオキシダーゼ活性を生成する形質転換体の数の上昇を示さなかった。例16 ：pSE37 及びpSE38の構成 pSE7t1（図15）を、PCRII(Invitrogen，SanDiego，CA)中にアスペルギラス・オリザエＡ1560hemA読取り枠のPCR増幅された領域を製造業者の説明書に従って連結することによって構成した。hemA読取り枠を、例６に記載される同じPCR条件（但し、個々のdNTPの濃度は50μＭであった）に従って、pSE17(例３)からの例４に記載されるプライマーhemA５’（配列番号７）及びhemA３’（配列番号８）を用いてPCR増幅した。プラスミドpSE37(図16)を、pSE7t1からのhemAコード領域を含む 1940bpのSwaＩ−PacＩフラグメントをSwaＩ−PacＩにより切断されたpSE39(図17 )中に連結することによって構成した。 pSE39を、Bastaに対する耐性を付与するbar選択マーカーによりpyrG選択マーカーを置換されたpBANe13(図19)のブラント化されたNsiＩフラグメントのpMT161 2(図18)からのブラント化された2033bpのHindII−EcoRＩフラグメントの連結により構成した。プラスミドpSE38(図20)を、pAJ23(図14)からのhemB読取り枠を含む1137bpのSwaＩ−PacＩフラグメントを、SwaＩ−PacＩにより切断されたpSE39( 図17)中に連結することによって構成した。例17 ：コプリナス・シネレウスペルオキシダーゼ生成に対するhemA及びhemB同時過剰発現の効果例９に記載されるアスペルギラス・オリザエ株SEO1−28を、例８に記載される方法に従って、アスペルギラス・オリザエSE27と称する新しい形質転換体を創造するためにpSE38により形質転換したが、但し、Basta耐性が選択のために使用され、そして２〜８μｇのNdeＩ消化されたpSE38が、約５単位の酵素が形質転換混合物に含まれるように反応から直接的に形質転換当たり添加された。Basta選択のための培地は、20mlのCOVE塩、１Ｍのスクロース、25ｇ／ｌのNoble寒天、10m Mの尿素、及び形質転換のための５mg／mlのBasta(Hoechst Schering，Rodovre， Denmark)又は形質転換体を維持するための10mg／mlのBastaのいづれかを含んだ。COVE塩は、脱イオン水１ｌ当たり、26ｇのKCl，26ｇのMgSO₄・7H₂O，76ｇのKH₂ PO₄、及び50mlのCOVE微量元素から構成された。COVE微量元素は、脱イオン水１ｌ当たり、0.04ｇのNa₂B₄O₇・10H₂O，0.4ｇのCuSO₄・５H₂O，1.2ｇのFeSO₄・７H₂O，0.7ｇのMnSO₄・H₂O，0.8ｇのNa₂MoO₂・H₂O，10ｇのZnSO₄・７H₂Oから構成された。マルトースを、指摘される場合、添加し、2.5 ％の最終濃度にした。Basta選択層培地は上記と同じであったが、但し、Bastaを使用の前、添加した。２種の対照集団、すなわちhemA過剰発現集団（pSE39により形質転換されたアスペルギラス・オリザエSEO1−28＝アスペルギラスオリザエSE28株）及びベクター形質転換された集団（pSE39により形質転換されたアスペルギラス・オリザエJ RoC50．３．18Ａ＝アスペルギラスオリザエSE22株）をまた、上記と同じ方法を用いて構成した。次に、形質転換体を、1／4強度のMY25培地１mlを含む24−ウェルマイクロタイタープレートのウェル当たり約１×10⁵個の胞子で個々のウェル中に接種した。マイクロタイタープレートを、保湿チャンバーにおいて34℃及び100rpmで５日間インキュベートした。ペルオキシダーゼ生成レベルを、例７に記載される酵素アッセイを用いて決定した。前記結果は、２種の対照集団、すなわちアスペルギラス・オリザエSE28株（he mA過剰発現集団）及びアスペルギラス・オリザエSE22株（ベクター形質転換された集団）に比較される場合、アスペルギラス・オリザエSE27株の集団によるペルオキシダーゼ活性の分布において高レベルの方への劇的なシフトを示した。hemA ／hemB同時過剰発現株は、非構築株（SE22）よりも約４倍の平均上昇率を示し、そしてhemA過剰発現株（SE28）よりも1.8倍の平均上昇率を示した。次に、いくつかの最高のペルオキシダーゼ生成形質転換体（アスペルギラスオリザエ形質転換体SE27−３，SE27−８，SE27−12及び SE27−13）を、振盪フラスコにおいて培養した。約５×10⁶個の胞子を25mlのMY2 5培地中に接種し、そして34℃，20Orpmで５日間インキュベートした。他方では、菌子体プラグを、25mlのMY25培地及び0.002％のNovozyme234を含むフラスコ中に接種し、そして34℃，200rpmで２日間インキュベートした。この培養物４mlを用いて、25mlのMY25培地を含む三重振盪フラスコを接種し、34℃，200rpmで５日間インキュベートした。次に、サンプルを除き、そしてMiraclothを通して濾過し、菌子体フラグメントを除去し、その後、ペルオキシダーゼ活性についての酵素アッセイを実施した。アスペルギラス・オリザエ形質転換体SE27−３，SE27−８，SE27−12及びSE27 −13の振盪フラスコ培養物のペルオキシダーゼアッセイは、対照株アスペルギラスオリザエSE22及びSE28に比較される場合、すべてが高いペルオキシダーゼ活性を生成したことを示した。株SE27−12及びSE27−８は、SE22対照株よりも４倍高い活性及びSE28対照株よりも２倍高い活性を示した。アスペルギラスオリザエSE27−12及び対照としてアスペルギラス・オリザエSE 22を、炭素源として高マルトースシロップを有する標準の供給−バッチプロトコールを用いて、ヘモグロビンの添加を伴って及び伴わないで、２ｌの発酵において増殖した。バッチ−供給物を、FeCl₃により補充し、約0.4mMにした。陽性の溶解された酸素状態を、約２ｇのサッカリド／ｌ／時の速度で添加される供給物により両培養物において３日目から８日目まで維持した。このレベルは、２日目及び３日目にわたって段階的態様で達成された。両培養におけるバイオマスは、発酵の期間、ほぼ等しかった。発酵をまた、ヘモグロビンの存在下で行なった。ヘモグロビンを添加し、30mg／mlバッチ培地の濃度にした。その結果は、192時間の発酵の後、SE22よりもペルオキシダーゼ生成において６倍の上昇率が存在したことを示した。SE22に比較してSE27−12からのペルオキシダーゼ生成におけるさらなる３倍の上昇率が、発酵培地にヘモグロビンが添加される場合に観察された。添加されるヘモグロビンを伴わないでの非構築株に比較して、ヘモグロビンの存在下で増殖されたhemA／hemB構築された株を用いてのペルオキシダーゼ生成における全体の上昇率は10倍であった。それらの結果は、hemA及びhemBの過剰発現がペルオキシダーゼ生成を相乗的に改良したことを示した。例18 ：スシタリジウム・サーモフィラムカタラーゼ生成に対するhemA/hemB同時過剰発現の効果スシタリジウム・サーモフィラムカタラーゼ遺伝子（WO96/34962）を含み、そしてDLM14.24と命名されたアスペルギラス・オリザエ株How B411を、hemA及びhe mBを同時過剰発現するよう構築し、その同時過剰発現がカタラーゼ生成を高めるかどうかを決定した。アスペルギラス・オリザエ株DLM14.24をそれぞれ10μｇの pSE37及びpSE38により、例17に記載されるのと同じ条件下で同時形質転換し、アスペルギラス・オリザエSE32と称する形質転換体を創造した。アスペルギラス・オリザエSE24と称する対照株を、例17に記載される同じ条件下でpSE39によりアスペルギラスオリザエDLM14.24を形質転換することによって生成した。 SE32形質転換体及び対照株を、50ｇのマルトデキストリン、２ｇのMgSO₄・７H₂ O，２ｇのKH₂PO₄・４ｇのクエン酸、８ｇの酵母抽出物、２ｇの尿素、0.5ｇのC aCl₂・２H₂O及び１mlの微量元素を１ｌ当たりに含んで成るM400Da（pH6.0）培地１mlを含む24−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェル中に約１×10⁵ 個の胞子／ウェルで接種した。微量金属溶液は、11当たり13.9ｇのFeSO₄・７H₂O ，8.5ｇのMnSO₄・H₂O，14.28ｇのZnSO₄・７H₂O，1.63 ｇのCuSO₄，0.24ｇのNiCl₂・６H₂O及び3.0ｇのクエン酸から構成された。マイクロタイタープレートを34℃及び100rpmで保湿チャンバーにおいて５日間インキュベートした。カタラーゼ生成レベルを、WO96/34962に記載される酵素アッセイを用いて決定した。CIUは、25℃で12mMの過酸化水素−50mMのリン酸カリウム(pH7. 0)緩衝液において１μモルの過酸化水素を１分当たりに分解するカタラーゼの量として定義される。最初に分析されるアスペルギラス・オリザエSE32 hemA／hemB同時形質転換体の集団は、より高いカタラーゼ生成の方にわずかにシフトされるカタラーゼ分布を示した。同時形質転換体集団の平均CIU／mlは、対照集団の平均CIU／mlよりも 1.3倍高かった。次に、最良のアスペルギラス・オリザエ同時形質転換体SE32−３ａ，SE32−４ａ，SE32−６ｂ及びSE32−32ａを、25mlのM400Da培地を含む振盪フラスコにおいて34℃及び200rpmで６日間培養し、そして前記のようにしてカタラーゼ活性について分析した。最良の株、すなわちアスペルギラス・オリザエSE32−32aは、対照株に比較してカタラーゼ生成において1.8培の上昇率を示した。例19 ：アスペルギラスオリザエHowB430の構成 pBANe8を、TAKA／NA２−tpiリーダーハイブリッドプロモーター、Lipolase^TM 遺伝子、AMGターミネーター、及び選択マーカーとしての十分な長さのアスペルギラス・ニジュランスamdS遺伝子を含むように構成した。Lipolase^TM（Novo Nor disk A/S，Bagsvaerd，Denmark）は、ヒューミコラ・ラヌギノサスからのリパーゼである。 PCRが、製造業者の説明書に従って、Applied Biosystems Model 394DNA／RNA Synthesizerにより合成された下記に記載されるプライマー１〜４を用いて、所望する制限部位を挿入するために使用された：プライマー１：5'-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3'（配列番号32）プライマー２：5'-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3'（配列番号33）プライマー３：5'-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3'（配列番号34）プライマー４：5'-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3'（配列番号35）。増幅反応物(100μｌ)を、鋳型として次のプラスミドの１つ約0.2μｇを用いて調製した：pToC90プラスミドDNA(Christensenなど.,1988，Biotechnology６：14 19-1422)を、十分な長さのamdS遺伝子上にNsiＩフランキング部位を挿入するためにプライマー１及び２と共に鋳型として使用した。pJaL292プラスミドDNA(図2 1)を、NA２−tpiリーダーハイブリッドプロモーターの５’末端でEcoRＩ部位及び３’末端でSwaＩ部位を挿入するためにプライマー３及び４と共に鋳型として使用した。個々の反応物は次の成分を含んだ：0.2μｇのプラスミドDNA，48.4ｐモルの前方向プライマー、48.4ｐモルの逆方向プライマー、１μＭの個々のdATP ，dCTP，dGTP及びdTTP，１×Taqポリメラーゼ緩衝液、及び2.5ＵのTaqポリメラーゼ。反応物を、95℃で５分間の１サイクル、続いて、95℃で１分間、55℃で１分間及び72℃で２分間、30サイクルについてプログラムされたEricomp Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。 PCR生成物を続いて、TA Cloning Kit(Invitrogen，SanDiego，CA)を用いて、製造業者の説明書に従ってPCRII中にサブクローン化した。次に、形質転換体を、QIA well−８Plasmid Kit(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)を用いて製造業者の説明書に従って、形質転換体からプラスミドを抽出し、正しい大きさのフラグメントの存在を確かめるためにプラスミドDNAを制限消化し、そしてPCR生成物を確かめるために次の方法に従ってDNAを配列決定することによってスクリーンした。DNA配列決定を、M13逆方向（−48）及びＭ 13前方向（−20）プライマー（New England Biolabs，Beverly，MA）及び配列決定されるDNAに対してユニークであるプライマー用いて、色素−ターミネーター化学と共にプライマーウォーキング技法（Gieseckeなど.,1992、前記）を用いて、両鎖に対してApplied Biosystems Model373A Automated DNA Sequencerにより実施した。次に、正しい形質転換体からのプラスミドを、それらが消化される制限酵素により消化し、１％アガロースゲル上で分離し、そしてFMC SpinBind Kit (FMC，Rockland，ME)を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。 NA２−tpiリーダーを、それらの末端上に配置されるEcoRＩ及びSwaＩ制限部位を有するpJaL292(図21)からPCR増幅した。TAKAプロモーター、ポリリンカー、AM Gターミネーター及びアスペルギラスニジュランスpyrG遺伝子を含むpKS6（図22 ）を、TAKAプロモーターの一部を除去するために、EcoRＩ及びSwaＩにより消化した。この領域をNA２−tpi PCR生成物により置換し、pBANe13(図19)を生成した。両端上にNsiＩ部位を有する十分な長さのamdS遺伝子をPCR増幅した。pBANe13 をNsiＩにより消化し、アスペルギラスニジュランスpyrG遺伝子を除去した。この領域を十分な長さのamdS遺伝子により置換し、pBANe6（図６）を生成した。下記に示されるオリゴヌクレオチドプライマーを、PCR増幅によりリパーゼ遺伝子を端に有する制限部位を挿入するために、Applied Biosystems Model394DNA ／RNA Synthesizerを用いて、製造業者の説明書に従って合成した：プライマー５：5'-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3'（配列番号36）プライマー６：5'-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3'（配列番号37）。増幅反応物(100μｌ)を、プライマー５及び６と共に約0.2mgのpMHan37(図23) を用いて調製した。その反応物は次の成分を含んだ：0.2μｇのpMHan37，48.4ｐモルのプライマー５，48.4ｐモルのプライマー６，１μＭの個々のdATP，dCTP， dGTP及びdTTP，１×Taqポリメラーゼ緩衝液、及び2.5ＵのTaqポリメラーゼ。反応物を、95℃で５分間、１サイクル、続いて、95℃で１分間、55℃で１分間及び 72℃で２分間、30サイクルに関してプログラムされたEricomp Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。２mlの反応物をアガロースゲル上で電気泳動し、約 900bpのリパーゼ生成物の増幅を確認した。 PCR増幅されたリパーゼ遺伝子を、TA Cloning Kitを用いて、製造業者の説明書に従って、pCRII中にサブクローン化した。次に、形質転換体を、QIA well− ８Plasmid Kitを用いて製造業者の説明書に従って、形質転換体からプラスミドD NAを抽出し、プラスミドDNAを制限消化し、そしてPCR生成物を確認するために上記方法に従ってDNAを配列決定することによってスクリーンした。リパーゼ遺伝子を、SwaＩ及びPacＩにより消化することによってpCRIIから切出し、そして続いて、pBANe6中にサブクローン化し、pBANe8（図24）を得た。形質転換体を、QIA well−８ Plasmid Kitを用いて製造業者の説明書に従って形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、プラスミドDNAを制限消化し、そして生成物を確かめるために上記方法に従ってDNAを配列決定することによってスクリーンした。アスペルギラス・オリザエHow B430を、pBANe8と称するNA２−tpiプロモーター／Lipolase^TM遺伝子／AMGターミネーターを含む線状フラグメントによりアスペルギラス・オリザエHow B425を形質転換することにより生成した。pBANe8をPmeＩにより消化し、そして線状発現カセットを、40mMのトリス一酢酸塩−１mMのジナトリウムEDTA(TAE)緩衝液を用いて分離用アガロース電気泳動により単離した。 amdSのためのアスペルギラス・オリザエHow B425の形質転換を、１ml当たり２ ×10⁷個のプロトプラストの濃度で、プロトプラストにより実施した。10μｇのD NAを100μｌのプロトプラストに添加した。次に、250μｌの体積のPEG(60％のPE G4000−10mMのCaCl₂−10mMのトリス−HCl，pH8.0)を添加し、そしてその混合物を37℃で30分間、放置した。３mlのSTC培地を添加し、そしてその混合物を、10m Mのウリジンにより補充されたCOVEプレート上にプレートし、amdSを選択する。プレートを、34℃で７〜10日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地のプレートに移し、そして37℃で３〜５日間インキュベートした。形質転換体を、同じ条件下で、スクロースを有さない同じ培地の同じプレートを用いて、胞子を画線培養し、そして単離されたコロニーを採取することによって精製した。例20 ：ヘムタンパク質生成に対するhemA／hemB同時過剰発現の特異性ヘムは細胞増殖及び代謝のためのエネルギーの供給に関与されるので、高められたヘムタンパク質生成がアポー酵素との会合のためへのヘムの高められた利用性によるものであって、高められた細胞代謝及び増殖による単純な高められたアパータンパク質生成によるものではないことを示すことが重要である。この仮説を試験するための間接的な方法は、ヘムタンパク質ではない異種酵素、すなわちリパーゼを生成する株においてhemA及びhemBを同時発現することであった。増強されたエネルギー利用性が高められたヘムタンパク質生成の原因であるなら、類似する結果がリパーゼ発現に基づいて観察されるべきである。逆に言えば、高められたヘムタンパク質生成が特に、成熟酵素アセンブリーのためのヘムの高められた利用性によるものであるなら、リパーゼ発現に対する効果はほとんど観察されるべきでない。例19に記載されるアスペルギラス・オリザエ株How B430を、例18に記載されるようにしてpSE37及びpSE38により同時形質分解し、非−ヘムタンパク質hemA／he mB同時過剰発現株アスペルギラスオリザエ株SE33を生成した。再び、SE34と称する対照形質転換体を、pSE39による同じ株の形質転換により生成した。形質転換体を、１／４の強度のMY25培地１mlを含む24−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェル中に約１×10⁵個の胞子／ウェルで接種した。マイクロタイタープレートを、保湿チャンバーにおいて34℃及び100rpmで４日間インキュベートした。Lipolase^TM標準（Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark）に対するリパーゼ生成レベルを、次の方法に従って決定した。アッセイ基質を、使用の直前、原液基質(21μｌのｐ−ニトロフェニル酪酸／ml DMSO)を、MC緩衝液(4m MのCaCl₂−100mMのMOPS，pH7.5)中に１：50で希釈することによって調製した。L ipolase^TM標準を、MC緩衝液及び0.02％α−オレフィンスルホネート(AOS)界面活性剤において40LU／mlを含むように調製し、４℃で貯蔵し、そして次に、使用の直前、MC緩衝液に1／20で希釈した。両サンプルを、0.02％のAOS界面活性剤を含むMC緩衝液に希釈し、そして20μｌのアリコートを、96−ウェルプレートのウェルに、次に200mlの希釈基質を分散した。プレートリーダーを用いて、405nmでの吸光度を、約１分間隔で取られる２回の読取りの差異として記録した。リパーゼ単位／ml（LU／ml)を、Lipolase^TM標準に対して計算した。リパーゼアッセイの結果は、集団としてのhemA／himB同時形質転換体が対照形質転換と比べて、1.25倍のリポラーゼを生成したことを示している。対照集団に対するリパーゼhemA／himB同時過剰発現のわずかだが、有意義な相違は、細胞増殖や代謝作用への増大したヘムの利用率のわずかな効果によるものでありうる。例21 ：ヘム経路中間体の蓄積に対するhemA／hemB同時過剰形質転換の効果例17に記載される24−ウェルプレートにおいて増殖されたアスペルギラスオリザエSE27株の大部分の菌子体及び培養ブイヨンの両者は、ピンク又は赤色に出現した。Centricon10カラム(Amicon，Beverly，MA)を用いてのアスペルギラスオリザエSE27株の濾過は、赤色が濾液に存在することを示し、これはその色彩が小さな分子によるものであったことを示唆する。濾液は、ポルフィリンと適合する40 5nmの波長で光を吸収することが観察された。アスペルギラスオリザエSE27培養物ブイヨンにおける赤色がヘミ生合成に関与される１又は複数のポルフィリンの存在によるものであったことを確かめるために、培養物ブイヨンを、C．A．Burtis and E．R．Ashwood（editors）In the Ti etz Textbook of Clinical Chemistry，1994，Chapter38により記載される方法に従ってHPLCにより分析した。HPLC分析は、培養物ブイヨンがウロポルフィリン（ウロ）、七−、六−及び五−カルボキシル化されたポルフィリン及びコプロポルフィリン（コプロ）と同じ保持時間を有する高レベルの化合物を含むことを示した。対照株アスペルギラスオリザエSE36（pSE39により形質転換されたアスペルギラスオリザエ）からのブイヨンは、それらの中間体の少々の蓄積を示した。ウロポルフィリン化合物：コプロポルフィリンの比は、すべてのhemA／hemB同時過剰発現株において少なくとも３：１であった。 hemA／hemB同時過剰発現株の個々はまた、ポルフィリン化合物の高レベルの螢光特徴を示すが、ところが対照株は螢光を示さなかった。SE27−３株からの菌糸体（420-450で励起、520でバリアーフィルター）の螢光顕微鏡は、対照株SE28−１又は22−１に存在しなかった、螢光の明白なパッチ及び顆粒を示した。それらの結果は、hemA／hemB同時過剰発現株が多量のウロポルフィリンを生成したことを示唆した。それらの中間体の蓄積は、ヘムの生合成において速度−制限段階になるウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ(Uro D)に起因する。例22 ：アスペルギラス・オリザエ株SE27及びSE32のサザン分析アスペルギラス・オリザエ株SE27及びSE32のサザン分析を実施し、ヘムタンパク質生成株による赤色の生成がhemA及びhemBの両発現カセットの複数のコピーを必要とするかどうかを決定した。例１に記載のように調製された個々の株についての全細胞DNAを、サザンハイブリダイゼーションにより分析した（Maniatisなど.,1982，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，New York）。約10μｇの個々のDNAサンプルをPstＩ又はPvuＩにより消化し、そして１％アガロースゲル上でサイズにより分別した。ゲルを短い波長のUV光下で写真を取り、そして0.25ＮのHClにおいて30分間、続いて0.4ＮのNaOHにおいて30分間ソークした。ゲルにおけるDNAを、Turboブロット装置（Schleicher & Schleiche r，Keene，NH）を用いて、製造業者の説明書に従って、0.4ＮのNaOHにおける細管ブロットによりHybond Ｎハイブリダイゼーション膜(Amersham，Arlington He ights，IL)上に移した。膜をUV架橋し、そして例４に記載のようにしてプレハイブリダイズしたが、但し、５％のVistra Liqnidブロッキング剤(Amersham，Arli ngton Heights，IL)を、Geniusブロッキング剤の代わりに使用した。螢光ラベルされたプローブを、Vistra Kit(Amersham ，Arlington Heights，IL)を用いて、例３に記載されるDNAフラグメントをランダム−プライミングすることによって調製した。ハイブリダイゼーション及び洗浄段階を例４に記載のようにして実施した。螢光プローブのシグナルを、Vistra Kitを用いて、製造業者の説明書に従って増幅した。螢光は、Storm Imaging Sy stem(Molecular Dynamics，Sunnyrale，CA)上での走査により検出した。アスペルギラス・オリザエ株SE27及びSE32のサザンブロット分析は、両発現プラスミドpSE37及びpSE38の複数のコピーが存在し、そして赤色の生成が両発現カセットの存在を必要としたことを示した。微生物の寄託次の株は、Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL )，Northern Regional Research Laboratory，1815University Street，Peoria ，Illinols61604，USAに、ブダペスト条約に従って寄託されている。株名受託番号寄託日Ｅ．コリDH５α（pSE17） NNRLB-21563 1996年４月22日Ｅ．コリDH５α（pAJ007-6） NNRLB-21564 1996年４月22日菌株は、培養物へのアクセスが、37C．F．R．§1.14及び35U．S．C．§122下で、Commissioner of Patent and Trademarksにより決定される条件に従って、この特許出願の係属の間、利用できるであろうことを保証する条件下で寄託されている。寄託物は個々の寄託された菌株の実質的に純粋な培養物を表わす。寄託物は、対象の出願の相対物又はその結果物が出願される国々における外国特許法により必要とされる場合、利用できる。しかしながら、寄託物の利用性は、政府の決定により許可される特許権利の逸脱においては、対象発明を実施する許可を構成しないことが理解されるべきである。本明細書に記載され、そして請求される発明は、本明細書に開示される特定の態様が本発明のいくつかの観点の例示として意図されるので、それらの態様により限定されるものではない。いづれかの同等の態様は本発明の範囲内に存在することが意図される。実際、本明細書に示され、そして記載される態様の他に、本発明の種々の修飾が前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた、本発明の範囲内である。種々の文献が本明細書に引用され、それらの開示は、引用により本明細書に組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジョーンズ，オウブレイアメリカ合衆国，カリフォルニア 95695, ウッドランド，マッキンレイアベニュ 547

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘムタンパク質の製造方法であって、（ａ）糸状菌細胞中に、（ｉ）前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令することができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作用可能に連結されており；そして／又は（ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを導入し；（ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のために適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そして（ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク質を回収する；ことを含んで成る方法。２．１つ又は複数の第１制御配列が前記糸状菌中に導入される請求の範囲第１項記載の方法。３．前記第１制御配列が、リーダー、ポリアデニル化配列、プロモーター、プロペプチドコード領域、シグナルペプチドコード領域、及び転写ターミネーターから成る群から選択される請求の範囲第２項記載の方法。４．前記１又は複数の第１制御配列が糸状菌株から得られるものである請求の範囲第２項記載の方法。５．１又は複数の第２核酸配列のいずれか１つ又は複数のコピーが糸状菌細胞中に導入される請求の範囲第１項記載の方法。６．前記１又は複数の第２核酸配列が、その第２核酸配列の発現を方向づけることができる１又は複数の第２制御配列に作用可能に連結される請求の範囲第５項記載の方法。７．前記１又は複数の第２核酸配列が糸状菌株から得られる請求の範囲第５項記載の方法。８．前記１又は複数の第２核酸配列が５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。９．前記１又は複数の第２核酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記１又は複数の第２核酸配列が、配列番号１に示される核酸配列を有する請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記１又は複数の第２核酸配列が、ポルホビリノーゲンシンターゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。 12．前記１又は複数の第２核酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲンシンターゼをコードする請求の範囲第11項記載の方法。 13．前記ポルホビリノーゲンシンターゼが、配列番号３に示される核酸配列を有する請求の範囲第12項記載の方法。 14．前記１又は複数の第２核酸配列が、ポルホビリノーゲンデアミナーゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。 15．前記１又は複数の第２核酸配列が、ウロポルフィリノーゲンシンターゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。 16．前記１又は複数の第２核酸配列が、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。 17．前記１又は複数の第２核酸配列が、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。 18．前記１又は複数の第２核酸配列が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。 19．前記１又は複数の第２核酸配列が、フェロケラーゼをコードする請求の範囲第５項記載の方法。 20．前記制御配列の１又は複数のコピー及び前記第２核酸配列の１又は複数のコピーが前記糸状菌細胞中に導入される請求の範囲第１項記載の方法。 21．前記ヘムタンパク質をコードする第３核酸配列の１又は複数のコピーを、段階ａ又は段階ｂの前、前記糸状菌細胞中に導入することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 22．ヘム又はヘム類似体源を、栄養培地中に導入することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 23．鉄源を、栄養培地中に導入することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 24．前記ヘムタンパク質がオキシドレダクターゼである請求の範囲第１項記載の方法。 25．前記オキシドレダクターゼが、カタラーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼである請求の範囲第24項記載の方法。 26．前記オキシドレダクターゼがカタラーゼである請求の範囲第25項記載の方法。 27．前記オキシドレダクターゼがオキシダーゼである請求の範囲第25項記載の方法。 28．前記オキシドレダクターゼがオキシゲナーゼである請求の範囲第25項記載の方法。 29．前記オキシドレダクターゼがハロペルオキシダーゼである請求の範囲第25 項記載の方法。 30．前記オキシドレダクターゼがペルオキシダーゼである請求の範囲第25項記載の方法。 31．前記ペルオキシダーゼが、コプリナス、アルトロミセス又はファネロカエトの種から得られる請求の範囲第30項記載の方法。 32．前記ペルオキシダーゼがコプリナスの株から得られる請求の範囲第31項記載の方法。 33．前記ペルオキシダーゼがコプリナス・シネレウスの株から得られる請求の範囲第32項記載の方法。 34．前記ペルオキシダーゼがコプリナス・マクロリゾスの株から得られる請求の範囲第32項記載の方法。 35．前記ヘムタンパク質が前記糸状菌細胞に対して内因性である請求の範囲第１項記載の方法。 36．前記ヘムタンパク質が前記糸状菌細胞に対して外来性である請求の範囲第１項記載の方法。 37．前記糸状菌細胞が、アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒューミコラ、マイセリオプソラ、ムコル、ニューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム又はトリコダーマの種の細胞である請求の範囲第１項記載の方法。 38．前記糸状菌細胞がアスペルギラス細胞である請求の範囲第37項記載の方法。 39．前記アスペルギラス細胞が、アスペルギラス・オリザエ細胞である請求の範囲第38項記載の方法。 40．前記アスペルギラス細胞が、アスペルギラス・ニガー細胞である請求の範囲第38項記載の方法。 41．（ｉ）糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を方向づけることができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に操作可能的に連結され；及び／又は（ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成る、ヘムタンパク質を生成することができる組換え糸状菌細胞。 42．（ｉ）糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を方向づけることができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に操作可能的に連結され；及び／又は（ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複数のコピーを、組換え糸状菌細胞中に導入することを含んで成る、組換え糸状菌細胞を生成するための方法。