ES2229362T3 - Procedimiento para preparar aminoalcoholes y sus derivados. - Google Patents
Procedimiento para preparar aminoalcoholes y sus derivados.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS MICROORGANISMOS, QUE SON CAPACES DE UTILIZAR DERIVADOS DEL CICLOPENTENO DE FORMULA GENERAL (VII), EN DONDE R 1 ES ALQUILO DE C 1 - C 4 , ALCOXI DE C1 - C 4 , ARILO O ARILOXI, COMO UNICA FUENTE DE NITR OGENO, COMO UNICA FUENTE DE CARBONO O COMO UNICA FUENTE DE CARBONO. LA INVENCION TRATA DE NUEVAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN LOS DERIVADOS DE CICLOPENTENO DE FORMULA GENERAL (VII). ADEMAS SE DESCRIBE UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE (1R,4S) O (1S,4R) - 1 - AMINO - 4 - (HIDROXIMETIL) - 2 CICLOPENTENOS DE FORMULAS (I), (II) Y/O DE UN (1S,4R) - O (1S,4R) - AMINOALCOHOL DE FORMULAS GENERALES (III), (IV), EN DONDE R 1 TIENE EL SIGNIFICADO CITADO.
Description
Procedimiento para preparar aminoalcoholes y sus
derivados.
La invención se refiere a un nuevo procedimiento
para la preparación de (1R,4S)- o
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroxi-
metil)-2-ciclopenteno de las fórmulas
metil)-2-ciclopenteno de las fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de derivados de (1S,4R)- o
(1R,4S)-aminoalcoholes de las fórmulas
generales
\vskip1.000000\baselineskip
así como a nuevos microorganismos
que están capacitados para aprovechar un derivado de ciclopenteno
de la fórmula
general
como única fuente de nitrógeno,
como única fuente de carbono o como única fuente carbono y de
nitrógeno.
La invención se refiere, además, a enzimas con
actividad de N-acetilaminoalcoholhidrolasa, que se
pueden obtener a partir de estos microorganismos.
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
de la fórmula I es un importante producto intermedio para la
preparación de nucleósidos carbocíclicos tales como, por ejemplo,
Carbovir® (Campbell et al., J. Org. Chem. 1995, 60,
4602-4616).
Por Campbell et al. (ibid) y por Park K.H.
y Rapoport H. (J. Org. Chem. 1994, 59, 394-399) se
describen procedimientos para la preparación de
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno.
En el caso de estos procedimientos, como educto
sirve
D-glucon-\delta-lactona
o D-serina, siendo necesarias aproximadamente 15
etapas de síntesis hasta la formación de
(1R,4S)-N-terc.-butoxicarbonil-4-hidroximetil-2-ciclopenteno
que luego se desprotege para formar
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno.
Estos dos procedimientos son costosos, complejos
y no son factibles a gran escala.
El documento WO 93/17020 describe un
procedimiento para la preparación de
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno,
reduciendo ácido
(1R,4S)-4-amino-2-ciclopenten-1-carboxílico
con hidruro de litio y aluminio para dar el producto deseado.
Es un inconveniente en el caso de este
procedimiento que también se reduce el doble enlace del anillo de
ciclopenteno, la mala manipulabilidad del hidruro de litio y
aluminio y que es costoso.
Taylor, S. J. et al. (Tetrahedron:
Asymmetry Vol. 4, Nº 6, 1993, 1117-1128) describen
un porcedimiento para la preparación de
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
partiendo de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
como educto. En este caso, el educto se transforma, mediante
microorganismos de las especies Pseudomonas solanacearum o
Pseudomonas fluorescens, en
(1R,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
que luego se hace reaccionar con dicarbonato de
di-terc.-butilo para formar la
(1R,4S)-N-terc.-butoxicarbonil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
que se reduce con borohidruro de sodio y ácido trifluoroacético en
el producto deseado. Este procedimiento es demasiado costoso.
Además, Martínez et al., (J. Org. Chem.
1996, 61, 7963-7966) describen una síntesis en 10
etapas de
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
partiendo de éster dietílico de ácido dialquilmalónico. También
este procedimiento tiene el inconveniente de que es complejo y no
es factible a gran escala.
Era misión de la presente invención poner a
disposición un procedimiento sencillo para la preparación de
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno.
Este problema se resuelve con el procedimiento de acuerdo con la
invención según la reivindicación 6. Los microorganismos según la
reivindicación 1, así como las enzimas según la reivindicación 2,
son asimismo objeto de la invención.
Microorganismos para uso en el procedimiento de
acuerdo con la invención pueden aislarse a partir de muestras de
suelo, lodo o aguas residuales con ayuda de técnicas
microbiológicas habituales.
De acuerdo con la invención, el aislamiento de
los microorganismos se efectúa de modo que éstos se cultivan, de
manera habitual, en un medio nutricio que contiene uno o varios
derivados de ciclopenteno de la fórmula general
en donde R^{1} significa alquilo
C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4}, arilo o
ariloxi,
\bullet como única fuente de carbono y
nitrógeno,
\bullet como única fuente de nitrógeno con una
fuente de carbono adecuada o
\bullet como única fuente de carbono con una
fuente de nitrógeno adecuada.
Como alquilo C_{1}-C_{4}
pueden utilizarse, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo
o butilo.
Como alcoxi C_{1}-C_{4}
pueden utilizarse, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi,
butoxi o terc.-butoxi.
Como arilo puede utilizarse, por ejemplo, fenilo
o bencilo. Preferiblemente, se utiliza bencilo.
Como ariloxi puede utilizarse, por ejemplo,
benciloxi o fenoxi.
Por consiguiente, como derivado de ciclopenteno
de la fórmula general VII son adecuados, por ejemplo:
N-acetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno,
N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno
o
N-fenilacetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno.
Convenientemente, a partir del cultivo se
seleccionan los microorganismos que aprovechan los isómeros (1R,4S)
del derivado de ciclopenteno de la fórmula VII como única fuente de
nitrógeno, como única fuente de carbono o como única fuente de
carbono y nitrógeno.
Como fuente de nitrógeno adecuada, los
microorganismos pueden aprovechar, por ejemplo, amonio, nitratos,
aminoácidos o ureas en calidad de sustrato de crecimiento. Como
fuente de carbono adecuada, los microorganismos pueden aprovechar,
por ejemplo, azúcar, azúcar-alcoholes, ácidos
carboxílicos C_{2}-C_{4} o aminoácidos en
calidad de sustrato de crecimiento. Como azúcares pueden utilizarse
hexosas tales como glucosa, o pentosas. Como
azúcar-alcohol puede utilizarse, por ejemplo,
glicerina. Como ácidos carboxílicos C_{2}-C_{4}
pueden utilizarse, por ejemplo, ácido acético o ácido propiónico.
Como aminoácidos pueden utilizarse, por ejemplo, leucina, alanina,
asparagina.
Como medio de selección y de cultivo pueden
utilizarse los habituales en el mundo científico tales como, por
ejemplo, el descrito en la Tabla I o un medio completo (medio que
contiene extracto de levadura), preferiblemente se utiliza el
descrito en la Tabla 1.
Durante el cultivo y la selección se inducen
convenientemente las enzimas activas de los microorganismos. Como
inductor enzimático pueden utilizarse los derivados de ciclopenteno
de la fórmula general VII.
Habitualmente, el cultivo y la selección se
efectúan a una temperatura de 20ºC a 40ºC, preferiblemente de 30ºC
a 38ºC y a un pH entre 5,5 y 8,0, preferiblemente entre 6,8 y
7,8.
Microorganismos preferidos son los del género
Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter,
Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus,
Pseudomonas o Alcaligenes/Bordetella, en particular
de las especies Rhodococcus ery-thropolis CB 101 (DSM
10686), Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172),
Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB
387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp.
denitrificans HSZ 17 (DSM 10329) o Gordona sp. CB 100
(DSM 10687), así como sus variantes y mutantes funcionalmente
equivalentes. Los microorganismos DSM 10686 y 10687 fueron
depositados el 20.05.1996, los microorganismos DSM 10328 y 10329
fueron depositados en 6.11.1995, los microorganismos DSM 11291
fueron depositados el 8.10.1996 y los microorganismos DSM 11172
fueron depositados el 20.09.1996 en la Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ), Mascherorderweg
1b, D-38124 Braunschweig, de acuerdo con el Tratado
de Budapest.
Por "variantes y mutantes funcionalmente
equivalentes" se entienden microorganismos que esencialmente
poseen las mismas propiedades y funciones que los microorganismos
de origen. Variantes y mutantes de este tipo pueden formarse
aleatoriamente, por ejemplo por irradiación UV.
| Forma de la célula | bastoncillos |
| \hskip1cm Anchura \mum | 0,5-0,6 |
| \hskip1cm Longitud \mum | 1,0-2,5 |
| Movilidad | + |
| Disposición de los flagelos | peritrica |
| Reacción Gram | - |
| Lisis mediante KOH al 3% | + |
| Aminopeptidasa (Cerny) | + |
| Esporas | - |
| Oxidasa | + |
| Catalasa | + |
| ADH (alcoholdeshidrogenasa) | - |
| NO_{2} a partir de NO_{3} | - |
| Desnitrificación | - |
| Ureasa | - |
| Hidrolisis de gelatina | - |
| Ácido a partir de (ensayo OF): | |
| \hskip1cm Glucosa | - |
| \hskip1cm Fructosa | - |
| \hskip1cm Arabinosa | - |
| \hskip1cm Adipato | + |
| \hskip1cm Caprato | + |
| \hskip1cm Citrato | + |
| \hskip1cm Malato | + |
| \hskip1cm Manitol | - |
- 1.
- Morfología y color de las colonias: cortas hifas ramificadas que se descomponen con la edad en bastoncillos y en cocos, colonias brillantes, que se descomponen en parte, tonalidad beige y rosa, RAL 1001;
- 2.
- Aminoácido diagnosticado del péptidoglicano: ácido meso-diaminopimélico;
- 3.
- Ácidos micólicos: ácidos micólicos de Rhodococcus: la determinación de la longitud de cadena del ácido micólico (C_{32}-C_{44}) y la comparación de los datos con las inscripciones en el Banco de Datos del ácido micólico de DSM proporcionó una similitud muy elevada con los modelos de las cepas de Rhodococcus erythropolis (similitud 0,588).
- 4.
- Modelo de ácidos grasos: ácidos grasos no ramificados, saturados e insaturados, más ácido tuberculoesteárico.
- 5.
- En la secuenciación parcial del ADNr 16S de la cepa se encontró una elevada coincidencia (100%) con la secuencia de las regiones específicas de Rhodococcus erythropolis.
El resultado de la identificación es inequívoco,
ya que tres métodos independientes entre sí (ácidos micólicos,
ácidos grasos, ADNr 16S) asocian la cepa a la especie
Rhodococcus erythropolis.
- 1.
- Morfología y color de las colonias: hifas cortas ramificadas que se descomponen con la edad en bastoncillos y cocos, colonias naranja claras (RAL, 2008);
- 2.
- Aminoácido diagnosticado del péptidoglicano: ácido meso-diaminopimélico.
- 3.
- Modelo de menaquinona: MK-9 (H_{2}) 100%;
- 4.
- Ácidos micólicos: ácidos micólicos de Gordona; la determinación de la longitud de cadena del ácido micólico (C_{50}-C_{60}) se realizó con ayuda de cromatografía de gases a alta temperatura. Este modo corresponde al modelo que se encontró en los representantes del género Gordona.
- 5.
- Modelo de ácidos grasos: ácidos grasos no ramificados, saturados e insaturados, más ácido tuberculoesteárico.
- 6.
- En la secuenciación parcial del ADNr 16S de la cepa sólo pudo encontrarse una coincidencia relativamente baja de 98,8% con las secuencias de las regiones específicas de Gordona rubropertincta.
En virtud de los presentes resultados
(menaquinona, ácidos micólicos, ácidos grasos, ADNr 16S), el
material aislado puede asociarse ciertamente de forma inequívoca al
género Gordona, pero no es posible una asociación a una
especie de Gordona conocida en base a estos resultados. Por
lo tanto, se ha de suponer que en el caso de la cepa DSM 10687 se
trata de una nueva especie del género Gordona, hasta ahora
no descrita.
| Propiedades de la cepa | |
| Forma de la célula | bastoncillos |
| \hskip1cm Anchura \mum | 0,5-0,6 |
| \hskip1cm Longitud \mum | 1,5-3,0 |
| Movilidad | + |
| Disposición de los flagelos | eritrica |
| Reacción Gram | - |
| Lisis mediante KOH al 3% | + |
| Aminopeptidasa (Cerny) | + |
| Esporas | - |
| Oxidasa | + |
| Catalasa | + |
| Crecimiento anaerobio | - |
| ADH (alcoholdeshidrogenasa) | + |
| NO_{2} a partir de NO_{3} | + |
| Desnitrificación | + |
| Ureasa | - |
| Hidrolisis de | |
| \hskip1cm gelatina | - |
| \hskip1cm Tween 80 | - |
| Ácido a partir de (ensayo OF): | |
| \hskip1cm Glucosa aerobia | - |
| \hskip1cm Xilosa 80 | - |
| Aprovechamiento del sustrato | |
| \hskip1cm Glucosa | - |
| \hskip1cm Fructosa | - |
| \hskip1cm Arabinosa | - |
| \hskip1cm Citrato | + |
| \hskip1cm Malato | + |
| \hskip1cm Manitol | - |
| Caracterización: | \begin{minipage}[t]{90mm} Bastoncillos irregulares Gram-positivos con un ciclo de desarrollo acusado de bastoncillos- cocos; estrictamente aerobios; ninguna formación de ácido o de gas a partir de glucosa.\end{minipage} |
| Movilidad | - |
| Esporas | - |
| Catalasa | + |
| ácido meso-diaminopimélico en la pared celular: no | |
| Tipo de péptidoglicano: A3\alpha, L-Lys-L-Ser-L-Thr-Ala | |
| Similitud con la secuencia de ADNr 16S: | \begin{minipage}[t]{90mm} La secuenciación de la zona con la mayor variabilidad proporcionó, valor máximo 98,2% con Arthrobacter pascens, A. ramosus y A. oxydans\end{minipage} |
- 1.
- Morfología y color de las colonias: cortas hifas ramificadas que con la edad se descomponen en bastoncillos y cocos; colonias romas, rojo claro-naranja RAL 2008;
- 2.
- Aminoácido diagnosticado del péptidoglicano: ácido meso-diaminopimélico;
- 3.
- Ácidos micólicos: ácidos micólicos de Rhodococcus;
La determinación de la longitud de cadena del
ácido micólico (C_{32}-C_{44}) y la comparación
de los datos con las inscripciones en el Banco de Datos del ácido
micólico DSMZ proporcionó sólo una muy escasa similitud con
respecto a los modelos de cepas de Rodococcus ruber
(similitud 0,019). Este factor de correlación es demasiado escaso
como para poder recurrir a la identificación de las especies.
- 4.
- Modelo de ácidos grasos: ácidos grasos no ramificados, saturados e insaturados más ácido tuberculoesteárico.
- Este modelo de ácidos grasos es diagnóstico para todos los representantes del género Rhodococcus y sus parientes próximos tales como Mycobacterium, Nocardia y Gordona. Se intentó llevar a cabo una diferenciación a nivel de especie incorporando las diferencias cualitativas y cuantitativas en el modelo de ácidos grasos. Con ayuda de métodos numéricos se comparó el modelo de ácido graso de Rodococcus sp. FB 387 con las inscripciones del Banco de Datos. Tampoco con este método pudo asociarse Rodococcus sp. FB 387 a ninguna especie de Rodococcus descrita en virtud de la escasa similitud (0,063).
- 5.
- En la secuenciación parcial de ADNr 16S de la cepa, 96-818 se asoció con una correlación de 97,9% a Rhodococcus opacus. Esta coincidencia de la secuencia se encuentra muy por debajo del 99,5% tal y como se exige en este taxón para una inequívoca asociación de la especie.
- En virtud de los presentes resultados, se puede partir del hecho de que en el caso de la cepa Rhodococcus sp. FB 387 se trata de una nueva especie de Rhodococcus hasta ahora no descrita.
Enzimas para uso en el procedimiento de acuerdo
con la invención, las
N-acetilaminoalcohol-hidrolasas, que
están capacitadas para hidrolizar derivados de ciclopenteno de la
fórmula VII anterior, pueden obtenerse, por ejemplo, por
disgregación habitual por los expertos de las células de
microorganismos descritas. Para ello, puede utilizarse, por
ejemplo, el método de ultrasonidos o el de la prensa French. Por
ejemplo, estas enzimas se pueden obtener a partir de los
microorganismos Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686).
Enzimas de este tipo se caracterizan preferiblemente por:
- a)
- una secuencia de aminoácidos N-terminal de Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn;
- b)
- un peso molecular de 50 kD, determinado por SDS-PAGE;
- c)
- un óptimo de pH de pH 7,0? \pm 1,0;
- d)
- un óptimo de temperatura entre 25ºC y 30ºC a un valor del pH de 7,0; y
- e)
- un valor K_{M} para el sustrato N-acetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno de 22,5 mM \geq7,5 mM (30ºC, tampón fosfato 100 mM, pH 7,0).
Enzimas como se pueden obtener a partir de los
microorganismos de acuerdo con la invención, por ejemplo
Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), hidrolizan, por
ejemplo, en particular
N-acetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno,
N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno,
N-propionil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno
y
N-isobutiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno.
El procedimiento de acuerdo con la invención para
la preparación de (1R,4S)- o
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
de las fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de derivados de (1S,4R)- o
(1R,4S)-aminoalcoholes de las fórmulas
generales
en donde R^{1} tiene el
significado mencionado, puede llevarse a cabo, por ejemplo, de modo
que en una primera etapa
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
de la
fórmula
se acila para formar un derivado de
(\pm)-2-azabiciclo-[2.2.1]hept-5-en-3-ona
de la fórmula
general
en donde R^{1} tiene el
significado
mencionado.
El educto
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
puede prepararse de acuerdo con el documento EP-B 0
508 353.
La acilación puede llevarse a cabo con un
halogenuro de ácido carboxílico de la fórmula general
VIIIR^{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
X
en donde X significa un átomo de
halógeno y R^{1} tiene el significado mencionado, o con un
anhídrido de ácido carboxílico de la fórmula
general
en donde R^{1} tiene el
significado
mencionado.
Como átomo de halógeno pueden utilizarse F, Cl,
Br o I. Preferiblemente, se utiliza Cl o F.
Ejemplos de halogenuros de ácidos carboxílicos
son: cloruro de acetilo, cloruro de cloroacetilo, cloruro de ácido
butírico, cloruro de ácido isobutírico, cloruro de ácido
fenilacético, éster bencílico de ácido clorofórmico
(Cbz-Cl), cloruro de ácido propiónico, cloruro de
benzoílo, éster alquílico de ácido clorofórmico o fluoruro de
terc.-butiloxicarbonilo. Ejemplos de anhídridos de ácidos
carboxílicos son anhídrido de terc.-butoxicarbonilo, anhídrido de
ácido butírico, anhídrido de ácido acético o anhídrido de ácido
propiónico.
La acilación puede llevarse a cabo sin disolvente
o con un disolvente aprótico.
Convenientemente, la acilación se lleva a cabo en
un disolvente aprótico. Como disolvente aprótico son adecuados, por
ejemplo, piridina, acetonitrilo, dimetilformamida,
tetrahidrofurano, tolueno, cloruro de metileno,
N-metilpirrolidona o mezclas de estos.
Preferiblemente, como disolvente se utiliza piridina o
acetonitrilo, en particular una mezcla a base de piridina y
acetonitrilo.
Convenientemente, la acilación se lleva a cabo a
una temperatura de -80 a 50ºC, preferiblemente de 0 a 25ºC.
En una segunda etapa del procedimiento, el
derivado de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
de la fórmula VI se reduce en un derivado de ciclopenteno de la
fórmula general
en donde R^{1} tiene el
significado
mencionado.
La reducción se lleva a cabo convenientemente con
un borohidruro de metal alcalino o de metal alcalinotérreo o con un
hidruro de aluminio y metal alcalino o metal alcalinotérreo con
Vitrid (hidruro de
sodio-bis-(2-metoxietoxi)aluminio).
Como hidruro de aluminio y metal alcalino puede utilizarse hidruro
de sodio o potasio y aluminio. Como borohidruro de metal alcalino
puede utilizarse borohidruro de sodio o potasio. Como borohidruro
de metal alcalinotérreo puede utilizarse borohidruro de calcio.
Convenientemente, la reducción se lleva a cabo en
un disolvente prótico. Como disolvente prótico pueden utilizarse
alcoholes alifáticos inferiores tales como metanol, etanol,
propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, sec.-butanol,
terc.-butanol o agua, o bien mezclas de estos.
La reducción se lleva a cabo convenientemente a
una temperatura de -40 a 40ºC, de preferencia de 0 a 20ºC.
La reacción del derivado de ciclopenteno de la
fórmula general VII para dar (1R,4S)- o
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
de las fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
se lleva a cabo, de acuerdo con la
invención, mediante microorganismos, mediante penicilina G acilasa o
mediante enzimas con actividad de
N-acetilaminoalcoholhidrolasa. En el caso de esta
biotransformación, junto al (1R,4S)- o
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
conforme a la fórmula I o II, que eventualmente se aísla, resulta
el derivado de (1S,4R)- o (1R,4S)-aminoalcohol de
las fórmulas
generales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{1} tiene el
significado mencionado. Estos últimos pueden eventualmente
aislarse.
En principio, son adecuados todos los
microorganismos que aprovechen un derivado de ciclopenteno de la
fórmula general VII como única fuente de nitrógeno, como única
fuente de carbono o como única fuente de carbono y nitrógeno.
Convenientemente, la biotransformación se lleva a cabo con
microorganismos que aprovechan el isómero (1R,4S) del derivado de
ciclopenteno como única fuente de carbono, como única fuente de
carbono y nitrógeno o como única fuente de nitrógeno.
Preferiblemente, la biotransformación se lleva a
cabo con microorganismos del género Alcaligenes/Bordetella,
Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes,
Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas
o Gordona, en particular de las especies
Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus
erythropolis CB 101 (DSM 10686),
Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329) o Gordona sp. (DSM 10687), así como con sus variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. Como ya se ha descrito, estos microorganismos han sido depositados de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329) o Gordona sp. (DSM 10687), así como con sus variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. Como ya se ha descrito, estos microorganismos han sido depositados de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Para el procedimiento son muy particularmente
adecuadas las especies de microorganismos
Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus
erythropolis CB 101 (DSM 10686) y Gordona sp. CB 100 (DSM
10687).
La biotransformación puede llevarse a cabo según
cultivos habituales de estos microorganismos con células en reposo
(células en no crecimiento que no requieren ya ninguna fuente de
carbono ni de energía) o con células en crecimiento.
Preferiblemente, la biotransformación se lleva a cabo con células
en reposo.
Las enzimas de acuerdo con la invención,
adecuadas para el procedimiento, las
N-acetilaminoalcohol-hidrolasas,
pueden obtenerse según los métodos precedentemente descritos y
poseen las propiedades ya precedentemente descritas.
Penicilina G acilasas adecuadas se obtienen a
partir de muchos microorganismos tales como, por ejemplo, bacterias
o actinomicetos, en especial a partir de los siguientes
microorganismos: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus
megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 15664,
Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC
9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus
fascians ATCC 12975, Streptomyces phaeochromogenes ATCC
21289, Achromobacter ATCC 23584 y Micrococcus roseus
ATCC 416. En particular, se utilizan penicilina G acilasas
adquiribles en el comercio tales como penicilina G acilasa EC
3.5.1.11 a partir de E. coli (Boehringer Mannheim) o a
partir de Bacillus megaterium.
En una forma de realización preferida, se
utilizan penicilina G acilasas inmovilizadas.
La biotransformación puede llevarse a cabo en
medios habituales para el experto en la materia tales como, por
ejemplo, en tampón fosfato, citrato o Hepes de bajo peso molecular,
en agua, en medios completos tales como, por ejemplo, "Nutrient
Yeast Broth" (NYB) (caldo nutriente de levaduras) o en el
descrito en la Tabla. Preferiblemente, la biotransformación se lleva
a cabo en el medio de acuerdo con la Tabla 1 o en tampón fosfato de
bajo peso molecu-
lar.
lar.
Convenientemente, la biotransformación se lleva a
cabo bajo la adición de una sola vez o continua del derivado de
ciclopenteno (fórmula VII), de manera que la concentración no
supere el 10% en peso, preferentemente el 2% en peso.
El pH puede oscilar durante la biotransformación
en un intervalo de 5 a 9, preferiblemente de 6 a 8.
Convenientemente, la biotransformación se lleva a cabo a una
temperatura de 20 a 40ºC, preferiblemente de 25 a 30ºC.
Si en la biotransformación se forma el
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno,
éste se puede transformar mediante hidrólisis ácida, por ejemplo
con ácido clorhídrico, en el
(1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopen-
teno.
teno.
100 g de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en acetonitrilo (800 ml) y piridina
(161,26 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota, a lo largo de 2
horas, 104,5 g de cloruro de acetilo. La mezcla se agitó todavía
durante 4,5 horas a la temperatura ambiente. La mezcla se combinó
con 800 ml de agua y el acetonitrilo se concentró por evaporación en
vacío. La fase acuosa se extrajo 3 veces con 400 ml de acetato de
etilo. Las fases orgánicas reunidas se lavaron de nuevo con HCl 1N
(400 ml), agua (400 ml), NaCl saturado (400 ml), se secaron con
sulfato de magnesio y se concentraron por completo por evaporación.
El residuo se recogió en cloruro demetileno y se filtró sobre gel
de sílice. El filtrado se concentró y el producto se purificó por
destilación. Se obtuvieron 107,76 g de producto en forma de un
líquido transparente. El rendimiento ascendió a 71%.
| Kp_{0,07 torr} : 51ºC | |
| ^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \delta [ppm] | 2,25 (sist. AB, 2H); |
| 400 MHz | 2,8 (s, 3H); |
| 3,42 (m, 1H); | |
| 5,30 (m, 1H); | |
| 6,89 (m, 1H); | |
| 6,92 (m, 1H). |
100,3 g de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en acetonitrilo (720 ml) y piridina
(142 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota 141,8 g de cloruro de
ácido butírico a lo largo de 1 hora. La reacción se agitó todavía
durante 3 horas a la temperatura ambiente. La mezcla se combinó con
720 ml de agua. El acetonitrilo se concentró por evaporación en
vacío y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo (300
ml). Las fases orgánicas reunidas se lavaron de nuevo con HCl 1N
(350 ml), NaCl saturado (400 ml) y agua (500 ml), se secaron con
sulfato de magnesio y se concentraron por completo por evaporación.
El producto se purificó por destilación. Se obtuvieron 107,76 g de
producto en forma de un líquido transparente. El rendimiento
ascendió a 85%.
\newpage
| Kp_{0,05 torr} : 70ºC | |
| ^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \delta [ppm] | 0,98 (t, J = 8,5 Hz, 3H); |
| 400 MHz | 1,58-1,65 (2H); |
| 2,23 (sist. AB, 2H); | |
| 2,82-2,90 (2H); | |
| 3,42 (m, 1H); | |
| 5,30 (m, 1H); | |
| 6,62 (m, 1H); | |
| 6,90 (m, 1H). |
33,4 g de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en acetonitrilo (240 ml) y piridina
(48,3 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota, a lo largo de 30
minutos, 68,6 g de cloruro de ácido fenilacético La mezcla se agitó
todavía durante 3,5 horas a la temperatura ambiente. La mezcla se
combinó con 240 ml de agua. El acetonitrilo se concentró por
evaporación en vacío y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato
de etilo (150 ml). Las fases orgánicas reunidas se lavaron otra vez
con HCl 1N (150 ml), NaCl saturado (150 ml) y agua (150 ml), se
secaron con sulfato de magnesio y se concentraron por completo por
evaporación. El producto bruto se separó por filtración sobre gel
de sílice (hexano:acetato de etilo = 1:1). Se obtuvieron 68,34 g de
producto bruto en forma de un aceite amarillo.
47 g de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en acetonitrilo (325 ml) y piridina
(41 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota, a lo largo de 1 h, 43,9 g
de cloruro de ácido propiónico. La reacción se agitó todavía
durante 5 h a la temperatura ambiente. La mezcla se combinó con 145
ml de agua, y el acetonitrilo se concentró por evaporación en vacío.
La fase acuosa se extrajo 3 veces con 115 ml de acetato de etilo.
Las fases orgánicas reunidas se lavaron todavía con soluciones de
HCl 1N (140 ml), NaHCO_{3} saturado (40 ml) y NaCl saturado (40
ml), se secaron con sulfato de sodio y se concentraron por completo
por evaporación. El residuo se purificó por destilación. Se
obtuvieron 55,8 g del compuesto del título que consolidaron al
reposar. El rendimiento ascendió a 81,6%.
| Kp 2,8 mbar 75-80ºC | |
| P.f.: 54-56ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 0,95 (t,3H); |
| 400 MHz | 2,10 (cuad.,1H); |
| 2,28 (cuad., 1H); | |
| 2,64 (m, 2H); | |
| 3,42 (m, 1H); | |
| 5,16 (s, 1H); | |
| 6,78 (m, 1H); | |
| 6,96 (m, 1H). |
45,1 g de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en acetonitrilo (310 ml) y piridina
(39 ml). A 10ºC se añadieron gota a gota, a lo largo de 1 h, 54,1 g
de cloruro de ácido isobutírico. La reacción se agitó todavía
durante 5 h a la temperatura ambiente. La mezcla se combinó con 140
ml de agua, y el acetonitrilo se concentró por evaporación en vacío.
La fase acuosa se extrajo 4 veces con 120 ml de acetato de etilo.
Las fases orgánicas reunidas se lavaron todavía con soluciones de
HCl 1N (50 ml), NaHCO_{3} saturado (50 ml) y NaCl saturado (50
ml), se secaron con sulfato de sodio y se concentraron por completo
por evaporación. El residuo se hirvió en n-hexano
(240 ml) con carbón activo a reflujo. Después de la filtración del
carbón activo, el filtrado se enfrió a 0ºC y el compuesto del título
se filtró. Se obtuvieron 54,5 g de producto. El rendimiento
ascendió a 76%.
\newpage
| P.f.: 41-42ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 0,95 (d,3H); |
| 400 MHz | 1,06 (d,3H); |
| 2,10 (m, 1H); | |
| 2,28 (m, 1H); | |
| 3,40 (m, 2H); | |
| 5,16 (s, 1H); | |
| 6,78 (m, 1H); | |
| 7,92 (m, 1H). |
10,1 g de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno y a 10ºC en una mezcla de
diclorometano (10 ml), piridina (8,4 ml) y 0,22 g de
N,N-4-dimetilamino-piridina.
13,5 g de cloruro de cloroacetilo se añadieron gota a gota, a lo
largo de 1 h. La temperatura ascendió hasta 44ºC. La mezcla se
continuó agitando durante 2 h a la temperatura ambiente. La solución
se añadió con 100 ml de agua. Después de la separación de fases, la
fase acuosa se extrajo con 100 ml de diclorometano. Las fases
orgánicas reunidas se secaron con sulfato de sodio y se
concentraron por completo por evaporación. El residuo se hirvió en
100 ml de diisopropiléter a reflujo en presencia de 1 g de carbón
activo a lo largo de 10 minutos. Después de la filtración en
caliente, el filtrado se enfrió hasta la temperatura ambiente, el
sólido se filtró y se secó. Se obtuvieron 10,35 g del compuesto del
título. El rendimiento ascendió a 60%.
| P.f.: 86-88ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 2,28 (d,1H); |
| 400 MHz | 2,40 (d,1H); |
| 3,48 (s, 1H); | |
| 4,56 (d, 2H); | |
| 5,30 (s, 1H); | |
| 6,70 (d, 1H); | |
| 6,94 (m, 1H). |
79,56 g de
(\pm)-2-acetil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en etanol (450 ml) y se enfriaron
hasta -10ºC. A lo largo de 45 minutos se añadieron en porciones
19,8 g de borohidruro de sodio. La reacción se agitó a 0ºC todavía
durante 3 horas y luego el pH se ajustó a 1,8 con ácido sulfúrico
concentrado. Esta mezcla se combinó con acetato de etilo (200 ml) y
los sólidos se separaron por filtración. Después, se concentró por
completo por evaporación. El residuo se recogió en agua, se lavó
con cloruro de metileno y se concentró por completo por
evaporación. El producto bruto se purificó todavía con una
filtración en gel de sílice con acetato de etilo/metanol 5:1 como
disolvente. El filtrado se concentró. Se obtuvieron 51,83 g de
producto en forma de un sólido blanco. El rendimiento ascendió al
64%, referido a la
2-acetil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
empleada.
| P.f.: 91-93ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 1,18 (m,1H); |
| 400 MHz | 1,78 (s,3H); |
| 2,29 (m, 1H); | |
| 2,66 (m, 1H); | |
| 3,35 (s, 2H); | |
| 4,58 (s, 1H); | |
| 4,72 (m, 1H). | |
| 5,61 (d, 1H); | |
| 5,85 (d, 1H); | |
| 7,83 (d, 1H). |
73,87 g de
(\pm)-2-butiril-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en etanol (400 ml) y se enfriaron
hasta -10ºC. 15,68 g de borohidruro de sodio se añadieron en
porciones a lo largo de 45 minutos. La reacción se agitó a 0ºC
todavía durante 3 horas y luego el pH se ajustó a 1,5 con ácido
sulfúrico concentrado. Esta mezcla se combinó con acetato de etilo
(200 ml) y los sólidos se separaron por filtración. Después, se
concentró por completo por evaporación. El residuo se recogió en
agua, se lavó con cloruro de metileno, se concentró por evaporación
y se secó en alto vacío. Se obtuvieron 60,55 g de producto. El
rendimiento ascendió al 80% referido a la
(\pm)-2-butiril-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
empleada.
| P.f.: 71-72ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 0,98 (t, J=8,5 Hz,3H); |
| 400 MHz | 1,40-1,50 (1H); |
| 1,58-1,68 (2H); | |
| 2,10-2,18 (2H); | |
| 2,42-2,55 (1H); | |
| 2,85 (m, 1H); | |
| 3,62 (sist. AB, 2H). | |
| 4,98 (m, 1H); | |
| 5,78-5,82 (2H); | |
| 6,38 (m, 1H). |
67 g de
(\pm)-2-fenilacetil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
bruta se disolvieron bajo nitrógeno en etanol (450 ml) y se
enfriaron hasta -10ºC. 13,2 g de borohidruro de sodio se añadieron
en porciones a lo largo de 1 hora. La reacción se agitó a la
temperatura ambiente todavía durante 3,5 horas y luego el pH se
ajustó a 3,8 con ácido sulfúrico concentrado. La mezcla se concentró
por completo por evaporación. El residuo se secó y se purificó con
una filtración en gel de sílice (hexano:acetato de etilo = 1:9).
Después de la recristalización en acetato de etilo se obtuvieron
54,6 g en forma de un sólido blanco. El rendimiento ascendió al 80%
referido a la
(\pm)-2-fenilacetil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
empleada.
| ^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \delta [ppm] | 1,28-1,35 (1H); |
| 400 MHz | 1,40 (m, 1H); |
| 2,38-2,45 (1H); | |
| 2,79 (m, 1H); | |
| 3,50 (sist. AB, 2H); | |
| 3,52 (s, 3H); | |
| 4,98 (m, 1H); | |
| 5,75 (m, 2H); | |
| 5,98 (m, 1H); | |
| 7,20-7,38 (5H). |
15 g de hidrocloruro de
(\pm)-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno
bruto se disolvieron, bajo nitrógeno y a temperatura ambiente, en
una mezcla de 150 ml de agua y 150 ml de dioxano. La solución se
ajustó a pH 14 con NaOH 1 N, después se mezcló con una solución en
dietiléter de fluoruro de terc.-butiloxicarbonilo
(BOC-F, exceso del 20%) y se continuó agitando
todavía durante 3 h a la temperatura ambiente
(BOC-F preparado de acuerdo con Synthesis 1975,
599). El pH se ajustó a 2 con HCl concentrado. Después de la
destilación de los disolventes orgánicos, se añadieron al residuo
50 ml de agua y la mezcla se extrajo 3 veces con 100 ml de acetato
de etilo. Las fases orgánicas reunidas se concentraron por completo
por evaporación. El residuo se cristalizó en una mezcla de 110 ml
de diisopropiléter y 80 ml de n-hexano. Se
obtuvieron 11,95 g del compuesto del título. El rendimiento
ascendió a 56%.
\newpage
| P.f.: 68-70ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 1,18 (m, 1H); |
| 400 MHz | 1,38 (s, 9H); |
| 2,26 (m, 1H); | |
| 2,65 (m, 1H); | |
| 3,33 (t, 2H); | |
| 4,45 (m, 1H); | |
| 4,55 (t, 1H); | |
| 5,62 (m, 1H); | |
| 5,79 (m, 1H); | |
| 6,73 (d, 1H). |
16,6 g de
(\pm)-2-propionil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en agua (140 ml) y
2-butanol (66 ml) y se enfriaron hasta -5ºC. 3 g de
borohidruro de sodio se añadieron en porciones a lo largo de 2 h.
La mezcla se agitó a 10ºC durante todavía 2,5 h y luego se ajustó a
pH 2,2 con una mezcla de ácido clorhídrico y agua (1/1). La
solución se concentró por evaporación hasta 40 g y se ajustó a pH
6,2 con NaOH 2 N. La mezcla se extrajo 5 veces con 50 ml de
diclorometano. Las fases orgánicas reunidas se concentraron por
completo por evaporación y el residuo se recristalizó en tolueno
(150 ml). Se obtuvieron 11,1 g del compuesto del título. El
rendimiento ascendió al 65%.
| P.f.: 67-68ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 0,96 (t, 3H); |
| 400 MHz | 1,16 (quint., 1H); |
| 2,04 (cuad., 2H); | |
| 2,26 (m, 1H); | |
| 2,66 (m, 1H); | |
| 3,34 (m, 2H); | |
| 4,58 (t, 1H); | |
| 4,72 (m, 1H); | |
| 5,61 (m, 1H); | |
| 5,84 (m, 1H); | |
| 7,72 (d, 1H). |
9 g de
(\pm)-2-isobutiril-3-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
se disolvieron bajo nitrógeno en agua (32 ml) y
2-butanol (84 ml) y se enfriaron hasta 0ºC. 1,37 g
de borohidruro de sodio se añadieron en porciones a lo largo de 3,5
h. La mezcla se continuó agitando a 20ºC durante 3 h, luego se
ajustó a pH 2,5 con una mezcla de ácido clorhídrico y agua (1/1) y
después se neutralizó con NaOH 2 N. La solución se concentró por
evaporación hasta 40 g. El residuo se extrajo 3 veces con 80 ml de
diclorometano. Las fases orgánicas reunidas se concentraron por
completo por evaporación. El sólido obtenido se cristalizó en 25 ml
de tolueno. Se obtuvieron 6,8 g del compuesto del título. El
rendimiento ascendió al 73,6%.
| P.f.: 80-81ºC | |
| ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] | 0,98 (d, 6H); |
| 400 MHz | 1,16 (quint, 1H); |
| 2,30 (m, 2H); | |
| 2,68 (m, 1H); | |
| 3,32 (t, 2H); | |
| 4,58 (t, 1H); | |
| 4,70 (m, 1H); | |
| 5,61 (m, 1H); | |
| 5,82 (m, 1H); | |
| 7,68 (d, 1H). |
Para la biotransformación se empleó penicilina G
acilasa EC 3.5.1.11 de E. coli (Boehringer Mannheim) 165 U
(unidades)/g o penicilina G acilasa EC 3.5.1.11 de Bacillus
megaterium.
Para ello, tampón fosfato de sodio 50 mM (pH
5-9; 4 ml) se incubó con 1% en peso de
N-fenacetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno
no racémico y 400 mg de la correspondiente penicilina G acilasa a
37ºC.
Después de determinados intervalos de tiempo, se
tomaron muestras y se analizaron mediante cromatografía en capa fina
(gel de sílice 60, butanol:agua:ácido acético glacial = 3:1;
detección con ninhidrina), cromatografía de gases (columna capilar,
HP-5, 5% de fenilmetilsiloxano) o HPLC. La enzima
separó el grupo fenacetilo con una elevada actividad, y en este
caso liberó hasta un 40% al correspondiente aminoalcohol. El
aminoalcohol libre se obtuvo con un valor ee de 80%.
- 14.1
- Lodo de clarificación (20%) de la Instalación de Clarificación ARA en Visp se incubó, a 37ºC y con sacudimiento, en el medio A + N (véase la Tabla 1), que contenía 0,5% en peso de N-acetil-, N-propionil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno. La formación de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno se vigiló mediante cromatografía en capa fina.
- 1% de estas acumulaciones se inocularon 1-3 veces y se individualizaron en medios sólidos (agar Plate Count en medio de la Tabla 1; 20 g/l). De este modo se aislaron los microorganismos Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM, 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) y Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291).
- 14.2
- Los microorganismos aislados de esta manera se cultivaron en medio (Tabla 1) que contenía 0,5% de N-acetil-, N-propionil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno. Se desarrollaron durante 24 a 36 horas hasta una densidad óptica (DO) de 2 a 3. Las células obtenidas en este caso se recolectaron en la fase de crecimiento exponencial tardía y se lavaron en tampón fosfato 10 mM.
- La subsiguiente biotransformación se llevó a cabo en tampón fosfato 50 mM (pH 4,5-9) que contenía 1% en peso de N-acetil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno. Después de cromatografía en capa fina se comprobó que el 50% del sustrato se había hidrolizado en (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno. Los análisis por HPLC proporcionaron valores ee entre 80 y 93%.
- Si como sustrato se empleó N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno, la tasa de biotransformación ascendió a 0,14 (g/l/h/DO) para la cepa DSM 10686, cuando el cultivo se realizó en medio A + N, y a 0,03 (g/l/h/DO) cuando el cultivo se realizó en medio NYB ("Nutrient Yeast Broth") que contenía N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno.
- Si la misma reacción se llevó a cabo con la cepa DSM 10687 a una concentración del sustrato (N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno) de 200 mM, la tasa de biotransformación ascendió a 0,161 (g/l/h/DO).
| MgCl_{2} | 0,4 g/l | |
| CaCl_{2} | 0,014 g/l | |
| FeCl_{3} | 0,8 mg/l | |
| Na_{2}SO_{4} | 0,1 g/l | |
| KH_{2}PO_{4} | 1 g/l | |
| Na_{2}HPO_{4} | 2,5 g/l | |
| NaCl | 3 g/l | |
| Solución de vitamina | 1 ml/l | |
| Solución de elementos traza | 1 ml/l | |
| pH 7,5 |
- 14.3
- Rhodococcus erythropolis DSM 10686 se cultivó en un fermentador de 6 l en medio mínimo (véase la Tabla 2) con acetato de amonio (3 g/l) como fuente de carbono o de nitrógeno a 30ºC hasta una densidad de células de DO 650 > 25. Durante el desarrollo de las células se añadió continuamente ácido acético al 50% como fuente de C adicional. Con el fin de inducir la actividad enzimática, se añadieron luego 60 g de (\pm)-N-acetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno y se continuó incubando durante algunas horas. Por último, se añadieron de nuevo 40 g de (\pm)-N-acetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno y luego se incubó durante otras diez horas. El transcurso de la biotransformación se vigiló en línea con HPLC. Al alcanzar un rendimiento analítico de 40%, referido al sustrato racémico empleado, y un valor de ee de 85%, la fermentación se interrumpió mediante la adición de ácido.
| Componente | Concentración | |
| Extracto de levadura | 0,5 g/l | |
| Peptona M66 | 0,5 g/l | |
| KH_{2}PO_{4} | 4,0 g/l | |
| Na_{2}HPO_{4} \cdot 2H_{2}O | 0,5 g/l | |
| K_{2}SO_{4} | 2,0 g/l | |
| Acetato de NH_{4} | 3,0 g/l | |
| CaCl_{2} | 0,2 g/l | |
| MgCl_{2} \cdot 6H_{2}O | 1,0 g/l | |
| Solución de elementos traza (véase más abajo) | 1,5 ml/l | |
| PPG (polipropilenglicol) | 0,1 g/l | |
| Solución de elementos traza | ||
| KOH | 15,1 g/l | |
| EDTA.Ma_{2} \cdot 2H_{2}O | 100,0 g/l | |
| ZnSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 9,0 g/l | |
| MnCl_{2} \cdot 4H_{2}O | 4,0 g/l | |
| H_{3}BO_{3} | 2,7 g/l | |
| CoCl_{2} \cdot 6H_{2}O | 1,8 g/l | |
| CuCl_{2} \cdot 2H_{2}O | 1,5 g/l | |
| NiCl_{2} \cdot 6H_{2}O | 0,18 g/l | |
| Na_{2}MoO_{4} \cdot 2H_{2}O | 0,27 g/l |
- 14.4
- Análogamente al Ejemplo 14.3 se cultivaron los microorganismos Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp FB387 (DSM 11291) y Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329) en acetato de sodio en el medio (Tabla 1) con y sin N-acetil-, N-propionil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno, abreviado en los que sigue como aminoalcoholes.
- Se consiguieron los siguientes resultados con células exponenciales que se cultivaron sin aminoalcoholes (analizado por HPLC):
| Cepa | Tasa[mmol/DO \cdot h] | Valor ee/conversión[%] | |
| HSZ 5 (DSM 10328) | 0,05 | 88,7/16 | |
| HSZ 17 (DSM 10329) | \; 0,005 | 95/23 \; | |
| CB 101 (DSM 10686) | 0,1 \; | 84/39 \; |
- De todas las tandas se recolectaron células exponenciales y estacionarias y se emplearon como células en reposo para la biotransformación. En virtud del análisis por CCF no se pudo observar ninguna diferencia en la tasa de inicio de células inducidas o no inducidas con aminoalcohol.
La enzima se purificó como se describe
seguidamente hasta que ya sólo pudo observarse una banda de
proteínas en SDS-PAGE (Pharmacia Phast Gel,
gradiente 10-15%) a un peso molecular de 50 kD.
Células de Rhodococcus erythropolis CB101
(DSM 10686) se lavaron en tampón Tris 50 mM (pH 6,2) y se
concentraron hasta una densidad óptica de 190 a DO_{650 \ nm}.
Después de la adición de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)
hasta una concentración final de 1 mM y ADNasa, las células se
trataron con la prensa French con el fin de obtener un extracto
bruto. Después de la centrifugación se obtuvieron 200 ml de
extracto exento de células con una concentración proteínica de 4,8
mg ml^{-1}.
960 mg del extracto exento de células se
recogieron en una columna de cromatografía de intercambio de iones
Q-Sepharose HiLoad 26/10 (Pharmacia) que había sido
equilibrada con un tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía
ditiotreitol (DTT) 1 mM.
Después de lavar la columna con el mismo tampón,
las proteínas se eluyeron con un gradiente de tampón lineal (1500
ml; gradiente: tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía DTT 1
mM-tampón Tris 50 mM (pH 7,0) que contenía DTT 1 mM
y NaCl 1 mM). La enzima eluyó de la columna entre NaCl 370 y 430 mM
y a un pH de 7,6. Las fracciones activas se recolectaron y se
concentraron hasta 9 ml. El contenido proteínico ascendió a 41 mg.
Para la purificación ulterior, la solución de proteínas se
incorporó en una columna de cromatografía por filtración en gel
HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia) que había sido equilibrada con
un tampón Tris 50 mM que contenía NaCl 50 mM y DTT 1 mM. Las
fracciones activas se reunieron y tenían un contenido total en
proteínas de 10,9 mg.
Esta solución proteíca se incorporó en una
columna Mono Q HR5/5 (Pharmacia) que había sido equilibrada con
tampón Tris 50 mM (pH 8,5) que contenía DTT 1 mM. Las proteínas se
eluyeron con un gradiente lineal (40 ml) de tampón Tris 50 mM (pH
8,5) que contenía DTT 1 mM-tampón Tris 50 mM (pH
8,5) que contenía DTT 1 mM y NaCl 1 M. La enzima eluyó entre NaCl
390 mM y NaCl 440 mM. Las fracciones activas contenían 1,4 mg
de
proteína.
proteína.
En la última etapa de purificación se utilizó la
misma columna, equilibrada con el mismo tampón. Como gradiente de
elución servía el mismo tampón con NaCl 0-500 mM y
pH 7,0-8,5. De este modo pudieron aislarse 430
\mug de enzima pura.
La secuencia N-terminal de la
enzima se determinó directamente del "borrón de proteínas". Se
obtuvo una secuencia de los siguientes 20 aminoácidos:
Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn.
Esta secuencia no mostró ninguna homología con
las proteínas conocidas.
La caracterización enzimática se llevó a cabo
tanto con enzima purificada como también con extracto exento de
células que había sido desalado mediante una columna Sephadex
G-25 (PD-10, Pharmacia).
La concentración de proteínas en el extracto
exento de células ascendía a 7,3 mg\cdotml^{-1}, y la
concentración de proteínas de la enzima purificada ascendía a 135
\mug\cdotml^{-1}. No se añadió PMSF al extracto exento de
células.
- 16.1
- Determinación de K_{m}
- La determinación de K_{m} se llevó a cabo en el extracto exento de células. El valor K_{m} de la reacción ascendió, a pH 7,0 y a una temperatura de 30ºC, a 22,5 mM para el sustrato N-acetil-1-amino-4-hidroximetilciclopenteno.
- 16.2
- Óptimo de pH
- El óptimo de pH para la hidrólisis de N-acetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno (25 mM) se determinó con la enzima purificada y en extracto exento de células en un intervalo de pH de 6,2-9,0 en las siguientes soluciones tampón.
- Tampón Tris 100 mM pH 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0
- Tampón citrato-fosfato 100 mM pH 7,0; 6,55; 6,2
- La actividad se midió durante 24 h.
- El óptimo de pH para la reacción oscilaba entre pH 7,0 y pH 7,5 para la producción del enantiómero 1R,4S y del enantiómero 1S,4R.
- En el extracto exento de células, el óptimo del pH para la actividad se encontraba en pH 7,0. Sin embargo, la selectividad era mejor entre pH 6,0 y pH 7,0.
- La figura 1 muestra la actividad de la N-acetilaminoalcoholhidrolasa (extracto exento de células) de Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) en función del valor del pH.
- 16.3
- El óptimo de temperaturas para la reacción indicada en el Ejemplo 16.2 se encontraba entre 25 y 30ºC.
- La figura 2 muestra la actividad de la N-acetilaminoalcoholhidrolasa (extracto exento de células) de Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) en función de la temperatura.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: LONZA AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Muenchensteinerstrasse 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 4002
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento para preparar un aminoalcohol
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: extremo N
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CEPA: Rhodococcus erythropolis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INDIVIDUO/MATERIAL AISLADO: Rhodococcus erythropolis CB101
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Glu Gln Asn Leu His Trp Leu Ser Ala Thr
Glu Met Ala}
\sac{Ala Ser Val Ala Ser Asn}
Claims (14)
1. Microorganismos que están capacitados para
aprovechar derivados de ciclopenteno, elegidos de compuestos de la
fórmula general
en donde R^{1} significa alquilo
C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4}, arilo o ariloxi, como única fuente
de nitrógeno, como única fuente de carbono o como única fuente de
carbono y nitrógeno, caracterizados porque los
microorganismos se eligen de las especies
Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus
erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ 5
(DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291),
Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17
(DMS 10329) o Gordona sp. CB 100 (DSM
10687).
2. Enzima con actividad de
N-acetilaminoalcoholhidrolasa, que se puede obtener
de microorganismos que están capacitados para aprovechar al menos un
derivado de ciclopenteno elegido de los compuestos de la fórmula
general
en donde R^{1} tiene el
significado indicado en la reivindicación 1, como única fuente de
nitrógeno, como única fuente de carbono o como única fuente de
carbono y nitrógeno, estando la enzima capacitada para hidrolizar
el compuesto de la fórmula VII y estando caracterizada
por
- a)
- una secuencia de aminoácidos N-terminal de Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn; y
- b)
- un peso molecular, determinado según SDS-PAGE al 10-15%, de 50 kD.
3. Enzima según la reivindicación 2,
caracterizada además, por
- c)
- un óptimo de pH de pH 7,0 \pm 1,0,
- d)
- un óptimo de temperatura entre 25ºC y 30ºC a un valor del pH de 7,0; y
- e)
- un valor K_{M} para el sustrato N-acetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno de 22,5 mM 7,5 mM (30ºC, tampón fosfato 100 mM).
4. Enzima según la reivindicación 2 ó 3,
obtenible de microorganismos del género Rhodococcus,
Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes,
Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas
o Alcaligenes/Bordetella.
5. Enzima según una de las reivindicaciones 2 a
4, obtenible de microorganismos que se eligen de las especies
Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus
erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ 5
(DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291),
Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17
(DMS 10329) o Gordona sp. CB 100 (DSM 10687).
6. Procedimiento para la preparación de (1R,4S)-
o
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
de las fórmula I y II
y/o de derivados de (1S,4R)- o
(1R,4S)-aminoalcohol de las fórmulas generales II y
IV
en donde R^{1} significa alquilo
C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4}, arilo o ariloxi, que abarca la
reacción de un derivado de ciclopentano de la fórmula
general
en donde R^{1} tiene el
significado mencionado, mediante un microorganismo que está
capacitado para aprovechar el compuesto de la fórmula general VII
anterior como única fuente de nitrógeno, como única fuente de
carbono o como única fuente de carbono y nitrógeno, de una enzima
con actividad de acetilaminohidrolasa que se puede obtener de
microorganismos de este tipo y que está capacitada para hidrolizar
el compuesto de la fórmula VII anterior, y/o de una penicilina G
acilasa para dar el (1R,4S)- o
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
conforme a la fórmula I o II, así como eventual aislamiento de
estos compuestos y/o de los derivados de (1S,4R)- o
(1R,4S)-aminoalcohol de las fórmulas III o IV que
resultan junto al (1R,4S)- o el
(1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el derivado de ciclopenteno de la
fórmula general
en donde R^{1} tiene el
significado mencionado, se prepara acilando en una primera etapa
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
de la
fórmula
para dar un derivado de
(\pm)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
de la fórmula
general
en donde R^{1} tiene el
significado mencionado, y este compuesto se reduce en una segunda
etapa en el derivado de ciclopenteno de la fórmula general
VII.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la acilación se lleva a cabo en la
primera etapa con un halogenuro de ácido carboxílico de la fórmula
general
VIIIR^{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
Xen donde X significa un átomo de
halógeno y R^{1} tiene el significado mencionado, con un
anhídrido de ácido carboxílico de la fórmula
general
en donde R^{1} tiene el
significado
mencionado.
\newpage
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque la acilación en
la primera etapa se lleva a cabo en un disolvente aprótico.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la reducción se
lleva a cabo en la segunda etapa con un borohidruro de metal
alcalino o de metal alcalinotérreo, un hidruro de metal alcalino o
de metal alcalinotérreo y aluminio y/o con Vitrid.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la reducción
en la segunda etapa se lleva a cabo en un disolvente prótico.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 6 a 11, caracterizado porque la reacción
del derivado de ciclopenteno de la fórmula general VII se efectúa
mediante microorganismos del género Rhodococcus,
Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes,
Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas
o Alcaligens/Bordetella.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque la reacción
del derivado de ciclopenteno de la fórmula general VII se efectúa
mediante una penicilina G acilasa de microorganismos de las especies
Bacillus megaterium o Escherichia coli.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 6 a 13, caracterizado porque la reacción en
la tercera etapa se lleva a cabo a una temperatura de 20 a 40ºC y a
un valor del pH de 5 a 9.
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