JP2000512488A - アミノアルコールおよびその誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般式（VII）のシクロペンテン誘導体（式中、Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄アルコシキ、アリールまたはアリロキシである。）を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および炭素源として資化することのできる新規な微生物に関する。本発明はまた、一般式（VII）のシクロペンテン誘導体を加水分解することができる新規な酵素にも関する。さらに本発明は、一般式（I）および（II）の（１Ｒ、４Ｓ）−または（１Ｓ、４Ｒ）−１−アミノ−４（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンおよび／または一般式（III）および（IV）の（１Ｓ、４Ｒ）−または（１Ｒ、４Ｓ）−アミノアルコール誘導体（式中、Ｒ¹は上記した意味を有する。）を製造する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノアルコールおよびその誘導体の 製造方法 本発明は、下記の式の（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ− ４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン および（または）下記の一般式の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−アミ ノアルコール誘導体 の製造方法に関し、さらに、下記の一般式のシクロペンテン誘導体を、 唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および炭素源と して資化することのできる微生物に関する。 本発明はさらに、これらの微生物から得られる、Ｎ−アセチルアミノアルコー ルハイドロラーゼ活性を有する酵素および酵素エキストラクトにも関する。 式Ｉの（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロ ための、重要な中間体である（Cambell et al.，J．Org．Chem．1995，60，4602 -4616）。 （１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテ ンの製造方法は、キャンベルCambell et al．（前掲書）およびパークPark K.H ．およびラポポートRapoport H．(J．Org．Chem．1994，59，394-399）に記載さ れている。 これらの方法で使用する先駆体は、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンまたはＤ−セ リンであって、（１Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキ シメチル−２−シクロペンテンに至るまでに約１５の合成工程が必要であり、こ れを、次に保護基を離脱させて、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキ シメチル）−２−シクロペンテンとする。これら二つのプロセスはコストが高く 、労力を要し、工業的に実施できるものではない。 ＷＯ９３／１７０２０は、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメ チル）−２−シクロペンテンの製造方法を開示しており、その方法は、（１Ｒ， ４Ｓ）−４−アミノ−２−シクロペンテン−１−カルボン酸をリチウムアルミニ ウムハイドライドで還元して所望の製品とする。 このプロセスの欠点は、一方ではシクロペンテン環の二重結合もまた還元され ること、リチウムアルミニウムハイドライドは取り扱い難いこと、そして他方で は、あまりにコストが高いことである。 テイラーら（Taylor，S.J．et al.，Tetrahedron:Asymmetry Vol.4，No.6，19 93，1117-1128）は、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル） −２−シクロペンテンを、（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５ −エン−３−オンを前駆物質として、そこから出発する製造方法を記述している 。この場合、前駆物質は、シュードモナス・ソラナセアルムPseudomonas solana cearumまたはシュードモナス・フルオレッセンスP．fluorescens種の微生物を利 用して（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３ −オンに転化し、それを次にジ−tert−ブチルジカーボネートを用いて（１Ｒ， ４Ｓ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト −５−エン−３−オンに転化し、これをナトリウムボロハイドライド およびトリフルオロ酢酸によって還元し、所望の製品にする。このプロセスもま た、あまりにコストが高い。 このほかには、マルチネら（Martinez et al.，J．Org．Chem．1996，61，796 3-7966）は、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シ クロペンテンの、ジエチルジアルキルマロネートから出発する、１０段階の合成 法を記述している。このプロセスにも、工程が面倒であるという不利益があって 、工業的には実施し難い。 本発明の目的は、簡単なプロセスで（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒド ロキシメチル）−２−シクロペンテンを製造する技術を提供することにある。 この目的は、請求項１に従う本発明の微生物、およびそれから抽出した酵素す なわち請求項４に従う本発明の酵素、ならびに請求項７に従う本発明の方法によ って達成される。 本発明の微生物は、土壤のサンプルの中から、常用の微生物工学的方法によっ て、土壤、汚泥または排水のサンプルの中から分離することができる。 微生物は、本発明に従って、下記の一般式をもつシクロペンテン誘導体の１種 または２種以上を、 （式中、Ｒ¹はＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、アリールまたはアリロキシ基 をあらわす。） ・唯一の炭素源および窒素源として、 ・適当な炭素源とともに、唯一の窒素源として、または ・適当な窒素源とともに、唯一の炭素源として 含有する栄養培地中で、微生物を培養することによって単離される。 Ｃ_1-4アルキルとしては、たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル またはブチルが挙げられる。Ｃ_1-4アルコキシとしては、たとえばメトキシ、エ トキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシまたはtert−ブトキシが挙げ られる。アリールとしては、たとえばフェニルまたはベンジルが挙げられる。ベ ンジルが好適に使用される。アリロキシとしては、たとえばベンジロキシまたは フェノキシが挙げられる。従って、下記の例は、一般式VIIのシクロペンテン誘 導体として適当である。 １−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、 １−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、または １−フェニルアセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン。 培養によって得た培養物から、式VIIのシクロペンテン誘導体の（１Ｒ，４Ｓ ）異性体を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の炭素源お よび窒素源として資化する微生物を選択することが好都合である。 それらの微生物は、適当な窒素源として、たとえば、アンモニア、硝酸塩、ア ミノ酸または尿素を、成長の基質として使用することができる。微生物はまた、 適当な炭素源として、たとえば、糖類、糖アルコール、Ｃ_2-4カルボン酸または アミノ酸を、成長の基質として使用することができる。糖類として、グルコース のようなヘキソース、またはペントースが使用できる。糖アルコールとして、た とえばグリセロールが使用できる。Ｃ_2-4カルボン酸として、酢酸またはプロピ オン酸が使用できる。アミノ酸としては、ロイシン、アラニン、アスパラギンが 使用できる。 使用できる選択の培地および培養の培地は、当業者の間に常用されているもの であって、たとえば、表１に記載のもの、または完全培地（イーストエキスを含 有する培地）が使用できるが、表１に記載のものを使用することが好ましい。 培養および選択の間、微生物からの活性な酵素が好都合に誘導される。一般式 VIIのシクロペンテン誘導体が、酵素インデューサーとして使用できる。 培養および選択は、通常、２０℃から４０℃の温度で、好ましくは３０℃から ３８℃の温度で、５．５から８．０までのｐＨで、好ましくは６．８から７．８ までのｐＨで行なわれる。 好適な微生物は、ロドコッカスRhodococcus、ゴルドナGordona、アースロバク ターArthrobacter、アルカリゲネスAlcaligenes、アグロバクテリウム/リゾビウ ムAgrobacterium/Rhizobium、バチルスBacillus、シュードモナスPseudomon asまたはアルカリゲネス/ボルデテラAlcaligenes/Bordeteraなどの属、とりわけ 、ロドコッカス・エリスロポリスRhodococcus erythropolis ＣＢ１０１（ＤＳ Ｍ１０６８６）、アルカリゲネス/ボルデテラＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２） 、アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８），ロドコッカスｓｐ． ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アルカリゲネス・キシロソキシダンスAlcali genes xylosoxydans ssp．デニトリフィカンスdenitrificans ＨＳＺ１７（ＤＳ Ｍ１０３２９）、アグロバクテリウム・リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シン プレックスBacillus simplex Ｋ２、シュードモナス・プチダPseudomonas putid a Ｋ３２，またはゴルドナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）、およびその 機能的に等価な変異種および突然変異種である。ブダペスト条約に従う寄託を、 ドイッチェ・ザムルング・フォン・ミクロオーガニスメン・ウント・ツエルクル トゥーレン ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、マシュローダヴェク１ｂ，Ｄ−３８１２４ ，ブラウンシュヴァイクに、微生物ＤＳＭ１０６８６および１０６８７は１９９ ６年５月２０日に、微生物ＤＳＭ１０３２８および１０３２９は１９９５年１１ 月６日に、微生物ＤＳＭ１１２９１は１９９６年１０月８日に、そして微生物Ｄ ＳＭ１１１７２は１９９６年９月２０日に、それぞれ行なった。 「機能的に等価な変異種および突然変異種」は、当初の微生物と本質的に同じ 特性と機能を有する微生物を意味する。このような変異種および突然変異種は、 偶然に、たとえばＵＶ照射などによって作ることができる。 アルカリゲネス／ボルデテラ（Alcaligenes/Bordetella）ＦＢ １８８ （ＤＳＭ１１１７２）の分類学的記述 細胞の形 桿状 幅 μｍ ０．５−０．６ 長さ μｍ １．０−２．５ 運動性 ＋ べん毛 周毛状 グラム反応 ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（ツェルニー） ＋ 胞子 オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）− ＮＯ₃からのＮＯ₂ − 脱窒 − ウレアーゼ ゼラチンの加水分解 − 酸（ＯＦ試験） グルコース フラクトース − アラビノース アジピン酸塩 ＋ カプリン酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ マンニトール ロドコッカス・エリスロポリスRhodococcus erythropolis ＣＢ １０１（Ｄ ＳＭ１０６８６）の分類学的記述 １．コロニーの形態および色：短く分岐した線状で、成長すると桿状および球 状に分裂する。コロニーは光り輝き、部分的に合流していて，ピンク色がか ったベージュ色である。 ＲＡＬ １００１ ２．ペプチドグリカンの特性アミノ酸：メソジアミノピメリン酸 ３．菌類酸：ロドコッカス菌酸；菌酸の鎖長（Ｃ₃₂−Ｃ₄₄）の測定、およびＤＳ Ｍ菌酸データバンクに入っているデータとの比較により、ロドコッカス・エ リスロポリス株のパターンとの大きな類似性が見出された（類似度：０．５ ８８）。 ４．脂肪酸パターン：非分岐、飽和および不飽和の脂肪酸プラス結核菌ステアリ ン酸 ５．菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分的な配列は，ロドコッカス・エリスロポリス の特定の領域におけるそれとの間で、高度（１００％）の一致が見出された 。 同定の結果は、相互に独立な３種の方法（菌酸、脂肪酸、１６Ｓ ｒＤＮＡ） により、この菌株がロドコッカス・エリスロポリスとされたので，不明瞭ではな い。 ゴルドナGordona ｓｐ．ＣＢ １００（ＤＳＭ１０６８７）の分類学的記述 １．コロニーの形態および色：短く分岐した線状で、成長すると桿状および球 状に分裂する。コロニーは薄いオレンジ色である。（ＲＡＬ ２００８） ２．ペプチドグリカンの特性アミノ酸：メソジアミノピメリン酸 ３．メナキノン・パターン：ＭＫ−９（Ｈ₂）１００％ ４．菌類酸：ゴルドナ菌酸；菌酸の鎖長（Ｃ₅₀−Ｃ₆₀）は、高温ガスクロマトグ ラフィーにより測定された。このパターンは、ゴルドナ属の代表的なものに 見出されるパターンに対応する。 ５．脂肪酸パターン：非分岐、飽和および不飽和の脂肪酸プラス結核菌ステアリ ン酸 ６．菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列に関して、ゴルドナ・ルブロペルチン クタの特定の領域における配列との間で、比較的低い９８．８％の一致が見 出されただけであった。 入手できた結果（メナキノン、菌類酸、脂肪酸、１６Ｓ ｒＤＮＡ）に基づき 、菌の区分は不明瞭でなくゴルドナ属への帰属を与えたが、これらの結果に基づ いて，ゴルドナ属の既知の種に分類することは不可能であった。それゆえ、菌株 ＤＳＭ１０６８７は、ゴルドナ属の中で、新規であってこれまで記述されたこと のない種であると推測される。 アルカリゲネス・キシロソキシダンスAlcaligenes xylosoxydans ssp.デニトリ フィカンスdenitrificans ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）の分類学的記述 菌株の特性： 細胞の形 桿状 幅 μｍ ０．５−０．６ 長さ μｍ １．５−３．０ 運動性 ＋ べん毛 周毛状 グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（ツェルニー） ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 嫌気的増殖 − ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）＋ ＮＯ₃からのＮＯ₂ ＋ 脱窒 ＋ ウレアーゼ − 加水分解 ゼラチンの − ツイーン（Tween）８０の − 酸（ＯＦ試験） グルコースから好気的に − キシロース８０から − 基質の資化 グルコース − フラクトース − アラビノース − クエン酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ マンニトール − アースロバクターArthrobacter sp．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）の 分類学的記述 特徴付け： グラム陽性 不規則桿状で顕著な桿菌− 球菌の成長サイクル；厳格な好気性； グルコースから酸、ガスを発生しない。 運動性 − 胞子 − カタラーゼ ＋ 細胞壁中にメソ−ジアミノピメリン酸：なし ペプチドグリカンのタイプ：Ａ３α，L−Lys−L−Ser−L−Thr−L−Ala １６Ｓ ｒＤＮＡ配列の類似性：最大の変動可能性を有する範囲の配列は、アー スロバクター・パッセンスpascens，Ａ．ラモ ススA.ramosusおよびＡ．オキシダンスA．ox ydansとの間に最高９８．２％の値を与えた。 アグロバクテリウム／リゾビウムAgrobacterium/Rhjzobium ＨＳＺ３０の 分類学的記述 細胞の形 多形的桿状 幅 μｍ ０．６−１．０ 長さ μｍ １．５−３．０ グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 運動性 ＋ 嫌気的増殖 − 硝酸塩からの亜硝酸塩 − 脱窒 − ウレアーゼ ＋ ゼラチンの加水分解 − 酸 Ｌ−アラビノースから ＋ ガラクトースから − メレジトースから − フコースから ＋ アラビトールから − マンニトールから − エリスリトールから − リトマスミルクのアルカリ性化 ＋ ケトラクトース − １６Ｓ ｒＤＮＡの部分的配列は、アグロバクテリウム亜属およびリゾビウム 亜属の代表的なものに対する、比較的高い類似度約９６％を示した。これらの亜 属の範囲内で、不明瞭でない種の決定をすることは不可能であった。 バチルス・シンプレックスBacillus simplex Ｋ２の分類学的記述 細胞の形 桿状 幅 μｍ ０．８−１．０ 長さ μｍ ３．０−５．０ 胞子 − 楕円形 − 円形 − 胞子嚢 − カタラーゼ ＋ 嫌気的増殖 − ＶＰ反応 ｎ．ｇ． 最高温度 増殖陽性温度℃ ４０ 増殖陰性温度℃ ４５ 増殖培地中 ｐＨ５．７ − ＮａＣｌ ２％ ＋ ５％ − ７％ − １０％ − リゾチーム培地 ＋ 酸（ＡＳＳ） Ｄ−グルコースから ＋ Ｌ−アラビノースから ＋ Ｄ−キシロースから − Ｄ−マンニトールから ＋ Ｄ−フラクトースから ＋ フラクトースからのガスの発生 − レシチナーゼ − 加水分解 デンプン ＋ ゼラチン ＋ カゼイン − ツイーン８０ ＋ アエスクリン − 資化 クエン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − 硝酸塩からの亜硝酸塩 ＋ インドール − フェニルアラニン・デアミナーゼ − アルギニン・ジヒドロラーゼ − 細胞の脂肪酸を分析した結果、バチルス属への帰属が確認された。１６Ｓ ｒ ＤＮＡの部分配列は、バチルス・シンプレックスへの１００％の類似を示した。 シュードモナス・プチダPseudomonas putida Ｋ３２の分類学的記述 細胞の形 桿状 幅 μｍ ０．８−０．９ 長さ μｍ １．５−４．０ 運動性 ＋ べん毛 極性＞１ グラム反応 − ３％ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 嫌気的増殖 − 色素 蛍光 ＋ ピオシアニン − ＡＤＨ ＋ 硝酸塩から亜硝酸塩 − 脱窒 − ウレアーゼ − ゼラチンの加水分解 − 基質の資化 アジピン酸塩 − クエン酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ Ｄ−マンデル酸塩 ＋ フェニル酢酸塩 ＋ Ｄ−酒石酸塩 − Ｄ−グルコース ＋ トレハロース − マンニトール − ベンゾイルフォルメート − プロピレングリコール ＋ ブチルアミン ＋ ベンジルアミン ＋ トリプタミン − アセタミド ＋ 馬尿酸塩 ＋ 細胞の脂肪酸のプロフィールは、シュードモナス・プチダに典型的なものであ った。 １６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列は、シュードモナス・メンドキナおよびシュード モナス・アルカリゲネスへの約９８％の類似度を示した。シュードモナス・プチ ダへの類似度は、９７．４％であった。 ロドコッカスｓｐ．ＦＢ ３８７（ＤＳＭ１１２９１）の分類学的記述 １．コロニーの形態および色：短く分岐した線状で、成長すると桿状および球 状に分裂する。コロニーはつやが無く、薄い赤〜オレンジ色である。ＲＡＬ ２００８ ２．ペプチドグリカンの特性アミノ酸：メソジアミノピメリン酸 ３．菌類酸：ロドコッカス菌酸；菌酸の鎖長（Ｃ₃₂−Ｃ₄₄）およびＤＳＭＺ菌酸 データバンクに入っているデータとの比較により、ロドコッカス・ルーバー 株のパターンと、ごく小さな（類似度０．０１９）類似性が見出されただけ であった。この相関因子はあまりに低く、種の同定には使用できない。 ４．脂肪酸パターン：非分岐、飽和および不飽和の脂肪酸プラス結核菌ステア リン酸。この脂肪酸パターンは、ロドコッカス属のすべての代表的な菌およ びその近縁の菌、たとえばミコバクテリウム、ノカルディアおよびゴルドナ に関して決定可能なものであった。脂肪酸パターンの定性的および定量的な 差異を含めることにより、種のレベルにおける異同を決定しようとの企てが なされた。ロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７の脂肪酸パターンを、データバ ンクに入っているデータと比較するため、多くの方法が使用された。それら の方法によっても、類似度が小さい（０．０６３）ため、ロドコッカス ｓ ｐ．ＦＢ３８７を、すでに記述されているロドコッカスの種に分類すること は不可能であった。 ５．菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分的な配列に関して、９６−８１８は、ロドコ ッカス・オパクスに、相関度９７．９％をもって分類された。この配列の一 致は、この分類法が、不明瞭でない種の決定するためには必要であるとして いる、９９．５％の相関度よりは低い。 入手できた結果に基づけば、菌株ロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７は、ロドコ ッカスの、新規であってこれまで記述されたことのない種であると推測される。 本発明の酵素、すなわち前記の式VIIのシクロペンテン誘導体を加水分解する ことのできるＮ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼは、たとえば、本発 明の微生物の細胞を、当業者にとっては常用の手法で破壊することによって得る ことができる。このためには、たとえば、超音波やフレンチプレス法を使用する ことができる。これらの酵素は、たとえば、微生物ロドコッカス・エリスロポリ ス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）から得ることができる。本発明の微生物、 とくにロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）から得 ることができる酵素は、次の特性を有することが好ましい。 ａ）最適ｐＨが、ｐＨ７．０±１．０であること； ｂ）最適温度が、ｐＨ７．０において２５℃から３０℃の間にあること、および ｃ）基質１−アセチルアミノ−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンに対する Ｋ_Mの値が２２．５ｍＭ±７．５ｍＭ（３０℃、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐ Ｈ７．０）であること。 ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）から得られ る酵素の塩基配列を分析して、次のことがわかった。 ｄ）Ｎ−末端アミノ酸配列Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr- Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asnであること、 また、分子量の測定から、次のことがわかった。 ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は５０ｋＤであること。 本発明の微生物、たとえばロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳ Ｍ１０６８６）から得られるそのような酵素は、次のような物質を加水分解する 。たとえば、とりわけ、１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シク ロペンテン、１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン 、１−プロピオニルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンおよび １−イソブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンである。 本発明の、下記の式の（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ− ４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン および（または）下記の一般式の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−アミ ノアルコール誘導体 （式中、Ｒ¹は前記した意味を有する） の製造方法は、たとえば第一工程で、下記の一般式の（±）−２−アザビシクロ ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン をアシル化して、下記の一般式の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプ ト−５−エン−３−オン誘導体とすることによって行なわれる。（式中、Ｒ¹は上記した意味を有する。） 前駆体の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オ ンは、ＥＰ−Ｂ０５０８３５２に記載されているようにして、製造することがで きる。 アシル化は、下記の一般式のハロゲン化カルボニルを使用するか、 （式中、Ｘはハロゲン原子をあらわし、Ｒ¹は上記した意味を有する） または、下記の一般式のカルボン酸無水物を使用して実施することができる。 （式中、Ｒ¹は上記した意味を有する） ハロゲン原予Ｘとしては、Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩが使用できる。Ｃｌまたは Ｆが、好ましく使用される。 ハロゲン化カルボニルの例は、アセチルクロライド、クロロアセチルクロライ ド、ブチリルクロライド、イソブチリルクロライド、フェニルアセチルクロライ ド、ベンジルクロルホルメート（Ｃｂｚ−Ｃｌ）、プロピオニルクロライド、ベ ンゾイルクロライド、アリルクロロホルメートまたはtert−ブチルフルオロホル メートである。カルボン酸無水物の例は、ジ−tert−ブチルジカーボネート、ブ チリックアンハイドライド、アセチックアンハイドライドまたはプロピオニック アンハイドライドである。 アシル化は、溶媒なしでも実施できるし、またアプロティックな溶媒を用いて も実施できる。 アシル化は、アプロティックな溶媒の中で、好都合に実施できる。適切なアプ ロティック溶媒の例は、ピリジン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テ トラヒドロフラン、トルエン、メチレンクロライド、Ｎ−メチルピロリドンまた はこれらの混合物である。好ましく使用される溶媒は、ピリジンまたはアセトニ トリル、とくにピリジンとアセトニトリルとの混合物である。 アシル化は、−８０から５０℃の温度で好都合に実施でき、好ましくは、０か ら２５℃において実施される。 本発明の方法の第二工程では、式VIの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１ ］ヘプト−５−エン−３−オン誘導体を還元して、下記の一般式のシクロペンテ ン誘導体とする。 （式中、Ｒ¹は上記した意味を有する。） 還元は、アルカリ金属ボロハイドライドまたはアルカリ土類金属ボロハイドラ イドを用いて、またはアルカリ金属アルミニウムハイドライドまたはアルカリ土 類金属アルミニウムハイドライドまたはビトライドVitride、すなわちナトリウ ムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムハイドライドを用いて、好都合に 実施することができる。ナトリウムまたはカリウムのアルミニウムハイドライド が、アルカリ金属アルミニウムハイドライドとして使用できる。ナトリウムまた はカリウムのボロハイドライドが、アルカリ金属ボロハイドライドとして使用で きる。カルシウムボロハイドライドが、アルカリ土類金属ボロハイドライドとし て使用できる。 この還元は、プロティックな溶媒の中で好都合に実施することができる。使用 できるプロティックな溶媒は、低級脂肪族アルコール、たとえばメタノール、エ タノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、se c−ブタノール、tert−ブタノールもしくは水、またはこれらの混合物である。 還元は、−４０から４０℃の温度で好都合に実施でき、好ましくは、０から２ ０℃において実施される。 本発明の従う、一般式VIIのシクロペンテン誘導体の、下記の式の（１Ｒ，４ Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シ クロペンテン への転化は、微生物またはそれから抽出した酵素を手段としてもよいし、ペニシ リンＧアシラーゼを手段としてもよいし、また、Ｎ−アセチルアミノアルコール ハイドロラーゼ活性を有する酵素を手段としてもよい。このバイオ変換は、上記 の式ＩおよびIIの（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンをもたらす（適切であればそれを単離 する）だけでなく、下記の一般式の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−ア ミノアルコール誘導体 （式中、Ｒ¹は上記した意味を有する） をも与える。後者の物質も、適切であれば同様に単離する。 一般式VIIのシクロペンテン誘導体を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源と して、または唯一の窒素源および炭素源として資化することのできる、すべての 微生物が、本発明に適する。バイオ変換は、シクロペンテン誘導体の（ＩＲ，４ Ｓ）−異性体を唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源 および炭素源として資化することのできる微生物を用いて、好都合に実施するこ とができる。 このバイオ変換は、好ましくは、アルカリゲネス／ボルデテラ、ロドコッカス 、アースロバクター、アルカリゲネス、アグロバクテリウム／リゾビウム、バチ ルス、シュードモナスまたはゴルドナ属から選んだ微生物、とりわけ、アルカリ ゲネス／ボルデテラ ＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）、ロドコッカス・エリス ロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）、アースロバクター ｓｐ．ＨＳＺ ５（ＤＳＭ１０３２８）、ロドコッカス ｓｐ．ＦＰ３８７（ＤＳＭ１１２９１ ）、アルカリゲネス・キシロソキシダンス ｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ １７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチ ルス・シンプレックスＫ２、シュードモナス・プチダＫ３２、またはゴルドナｓ ｐ．（ＤＳＭ１９６８７）、またはこれらの機能的に等価な変異種または突然変 異種を使用して行なう。これらの微生物は、すでに述べたように、ブダペスト条 約に従って寄託済みである。 本発明の方法にとってきわめて適当な微生物の種は、アルカリゲネス／ボルデ テラ ＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）、ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１ ０１（ＤＳＭ１０６８６）およびゴルドナ ｓｐ．（ＤＳＭ１０６８７）である 。 バイオ変換は、これらの微生物の常法に従った当初の培養の後、静止状態の細 胞（もはや炭素源もエネルギー源も要求しない、非成長細胞）を用いて、または 成長している細胞を用いて、行なうことができる。バイオ変換は、好ましくは静 止状態の細胞を用いて行なう。 本発明の方法にとって好適な酵素であるＮ−アセチルアミノアルコールハイド ロラーゼは、上述した方法により得ることができ、かつすでに上述した特性を有 する。 適切なペニシリンＧアシラーゼは、多種類の微生物たとえば、バクテリアまた はアクチノミセテスactinomycetesから得ることができる。とくに、下記の微生 物から得ることができる：エシェリチア・コリEscherichia coli ＡＴＣＣ９６ ３７、バチルス・メガテリウムBacillus megaterium、ストレプトミセス・ラベ ンデュリStreptomyces lavendulae ＡＴＣＣ１３６６４、ノカルディア ｓｐ． ＡＴＣＣ１３６３５、プロビデンシア・レットゲリProvidencia rettgeri ＡＴ ＣＣ９９１８、アースロバクター・ビスコススArthrobacter viscosus ＡＴＣＣ １５２９４、ロドコッカス・ファシアンスRhodococcus fascians ＡＴＣＣ１２ ９７５、ストレプトミセス・フェオクロモゲネスStreptomyces phaeochromogene s ＡＴＣＣ２１２８９、アクロモバクターAchromobacter ＡＴＣＣ２３５８４お よびミクロコッカス・ロゼウスMicrococcusu roseus ＡＴＣＣ４１６である。市 場で入手できるペニシリンＧアシラーゼ、とくにエシェリチア・コリから得たペ ニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１（ベーリンガー・マンハイム）、ま たはバチルス・メガテリウムから得たものが使用できる。 固定化したペニシリンＧアシラーゼは、好ましい態様において使用される。 バイオ変換は、当業技術において通常の媒体、たとえば、低モル濃度のリン酸 塩、クエン酸塩またはヘペスHepes緩衝溶液の中で、水の中で、完全培地たとえ ば栄養イーストブロスNutrient Yeast Broth（ＮＹＢ）または表に示したそれの 中で行なうことができる。このバイオ変換は、好ましくは表１に示した培地また は低モル濃度のリン酸緩衝液を使用して実施する。 本発明のバイオ変換は、シクロペンテン誘導体（式VII）を、１回で添加して も実施できるし、連続的に添加して濃度が重量で１０％、好ましくは２％を超え ないようにして、好都合に実施することができる。 バイオ変換の間、ｐＨは、５ないし９の範囲、好ましくは６ないし８の範囲と することができる。このバイオ変換は、温度２０ないし４０℃、好ましくは２５ ないし３０℃で、好都合に実施できる。 （１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテ ンがバイオ変換の間に生成するときは、これを、酸たとえば塩酸を用いた酸加水 分解により、（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シ クロペンテンに転化させることができる。 ［実施例１］ （±）−２−アセチル-２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３ −オンの製造 （±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの１０ ０ｇを、アセトニトリル（８００ml）およびピリジン（１６１．２６ml）中に、 窒素ガス雰囲気下に溶解した。１２℃において、アセチルクロライド１０４．５ ｇを、２時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で４．５時間 攪拌した。混合物に水８００mlを添加し、アセトニトリルを、真空下に蒸発させ た。水性相を３回、酢酸エチル４００mlで抽出した。一体にした有機相を１Ｎ− ＨＣｌ（４００ml）、水（４００ml）、飽和ＮａＣｌ（４００ml）で洗浄し、硫 酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。残渣をメチレンクロライドに取 り、シリカゲルで濾過した。濾液を濃縮し、生成物を蒸留により精製した。製品 １０７．７６ｇが、透明な液体として得られた。収率は７１％であった。 沸点（０．０７Torr）：５１℃¹ Ｈ ＮＭＲ(CDCl₃):δ[ppm] 2.25(AB syst.，2H); ４００ＭＨｚ 2.8(s，3H); 3.42(m，1H); 5.30(m，1H); 6.89(m，1H); 6.92(m．1H)． ［実施例２］ （±）−２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３ −オンの製造 （±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの１０ ０．３ｇを、アセトニトリル（７２０ml）およびピリジン（１４２ml）中に、窒 素ガス雰囲気下に溶解した。１２℃において、ブチリルクロライド１４１．８ｇ を、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で３時間攪拌し た。混合物に、水７２０mlを添加した。アセトニトリルを真空下に蒸発させ、 水性相を３回、酢酸エチル（３００ml）で抽出した。一体にした有機相を１Ｎ− ＨＣｌ（３５０ml）、飽和ＮａＣｌ（４００ml）および水（５００ml）で洗浄し 、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。生成物を蒸留により精製し た。製品１０７．７６ｇが、透明な液体として得られた。収率は８５％であった 。 沸点（０．０５Torr）：７０℃¹ Ｈ ＮＭＲ(CDCl₃):δ[ppm] 0.98(t，J=8.5Hz，3H); ４００ＭＨｚ 1.58-1.65(2H); 2.23(AB syst.，2H); 2.82-2.90(2H); 3.42(m，1H); 5.30(m，1H); 6.62(m，1H); 6.90(m，1H)． ［実施例３］ （±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５− エン−３−オンの製造 （±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの３３ ．４ｇを、アセトニトリル（２４０ml）およびピリジン（４８．３ml）中に窒素 ガス雰囲気下に溶解した。１２℃において、フェニルアセチルクロライド６８． ６ｇを、３０分間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で３．５ 時間攪拌した。混合物に水２４０mlを添加した。アセトニトリルを真空下に蒸発 させ、水性相を３回、酢酸エチル（１５０ml）で抽出した。一体にした有機相を 、１Ｎ−ＨＣｌ（１５０ml）、飽和ＮａＣｌ（１５０ml）および水（１５０ml） で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。粗生成物をシリカ ゲルで濾過した（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）。粗製品６８．３４ｇが、黄 色い液体として得られた。 ［実施例４］ （±）−２−プロピオニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン −３−オンの製造 （±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの４７ ｇを、アセトニトリル（３２５ml）およびピリジン（４１ml）中に、窒素ガス雰 囲気下に溶解した。１２℃において、プロピオニルクロライド４３．９ｇを、１ 時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を、室温で５時間攪拌した。 混合物に水１４５mlを添加し、アセトニトリルを真空下に蒸発させた。水性相を ３回、酢酸エチル１１５mlで抽出した。一体にした有機相を、１Ｎ−ＨＣｌ（１ ４０ml）、飽和ＮａＨＣＯ₃（４０ml）溶液およびＮａＣｌ（４０ml）溶液で洗 浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。残留物を蒸留により生 成した。表題化合物５５．８ｇが得られ、放置したところ固化した。収率は８１ ．６％であった。 ２．８mbarにおける沸点：７５−８０℃ 融点：５４−５６℃¹ Ｈ ＮＭＲ(DMSO-d₆):δ[ppm］ 0.95(t，3H); ４００ＭＨｚ 2.10(quart.，1H); 2.28(quart.，1H); 2.64(m，2H); 3.42(s，1H); 5.16(s，1H); 6.78(m，1H); 6.96(m，1H)． ［実施例５］ （±）−２−イソブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン −３−オンの製造 （±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの４５ ．１ｇを、アセトニトリル（３１０ml）およびピリジン（３９ml）中に、窒素ガ ス雰囲気下に溶解した。１０℃において、イソブチリルクロライド５４．１ｇを 、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。ついで混合物を室温で５時間攪拌した 。混合物に水１４０mlを添加し、アセトニトリルを真空下に蒸発させた。水性相 を、４×１２０mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を、１Ｎ−ＨＣ ｌ（５０ml）、飽和ＮａＨＣＯ₃（５０ml）溶液およびＮａＣｌ（５０ml）溶液 で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、完全に蒸発させた。残留物を、活性炭 とともに、ｎ−ヘキサン（２４０ml）中で還流下に沸騰させた。活性炭を濾過し て分離したのち、濾液を０℃に冷却し、表題化合物を濾過して取得した。５４． ５ｇの製品がえられた。収率は７６％であった。 融点：４１−４２℃¹ Ｈ ＮＭＲ(DMSO-d₆):δ[ppm］ 0.92(d，3H); ４００ＭＨｚ 1.06(d，3H); 2.10(m，1H); 2.28(m，1H); 3.40(m，1H); 5.16(s，1H); 6.78(m，1H); 7.92(m，1H)． ［実施例６］ （±）−２−クロロアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エ ン−３−オンの製造 （±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの１０ ．１ｇを、ジクロロメタン（１０ml）、ピリジン（８．４ml）および４−Ｎ，Ｎ −ジメチルアミノピリジンの０．２２ｇの混合物中に、窒素ガス雰囲気下に溶解 した。クロロアセチルクロライド１３．５ｇを、１時間を費やしてこの溶液に滴 下した。温度は４４℃に上昇した。ついで混合物を、室温でさらに２時間攪拌し た。混合物に水１００mlを添加した。相分離ののち、水性相を１００mlのジクロ ロメタンで抽出した。一体にした有機相を、硫酸ナトリウムで乾燥して、完全に 蒸発させた。残留物を、活性炭１ｇとともに、ジイソプロピルエーテル１００ml 中で還流下に１０分間沸騰させた。熱時濾過して得た濾液を室温に冷却し、固体 を濾過して分離したのち、乾燥した。表題化合物１０．３５ｇが得られた。収率 は６０％であった。 融点：８６−８８℃¹ Ｈ ＮＭＲ(CDCl₃):δ[ppm] 2.28(d，1H); ４００ＭＨｚ 2.40(d，1H); 3.48(s，1H); 4.56(d，2H); 5.30(s，1H); 6.70(d，1H); 6.94(m，1H)． ［実施例７］ （±）−２−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製 造 （±）−２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン− ３−オンの７９．５６ｇを、エタノール（４５０ml）中に、窒素ガス下に溶解し 、−１０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライド１９．８ｇを分割して、４ ５分間を費やして、この溶液に滴下した。 混合物を０℃で３時間攪拌し、ついで濃硫酸を用いて、ｐＨを１．８に調整し た。酢酸エチル（２００ml）をこの混合物に添加し、固体分を濾過分離した。つ いで、完全に蒸発させた。残渣を水に取り、メチレンクロライドで洗浄し、完全 に蒸発させた。粗生成物を、酢酸エチル／メタノール５：１を溶媒として用いた シリカゲル濾過により精製した。濾液を濃縮した。５１．８３ｇの生成物が、白 色固体として得られた。収率は、使用した２−アセチル−２−アザビシクロ［２ ．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン基準で、６４％であった。 融点：９１−９３℃¹ Ｈ ＮＭＲ(DMSO-d₆):δ[ppm] 1.18(m，1H); ４００ＭＨｚ 1.78(s，3H); 2.29(m，1H); 2.66(m，1H); 3.35(s，2H); 4.58(s，1H); 4.72(m，1H); 5.61(d，1H); 5.85(d，1H); 7.83(d，1H)． ［実施例８］ （±）−１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製 造 （±）−２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン− ３−オンの７３．８７ｇを、エタノール（４００ml）中に、窒素ガス雰囲気下に 溶解し、−１０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライド１５．６８ｇを、分 割して、４５分間を費やしてこの溶液に滴下した。混合物を０℃で３時間攪拌し 、ついで濃硫酸を用いてｐＨを１．５に調整した。酢酸エチル（２００ml）をこ の混合物に添加し、固体分を濾過分離した。ついで完全に蒸発させた。残渣を水 に取り、メチレンクロライドで洗浄し、完全に蒸発させ他のち、高真空下に乾燥 した。６０．５５ｇの生成物が得られた。収率は、使用した（±）−２−ブチリ ル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン基準で、８０ ％であった。 融点：７１−７２℃¹ Ｈ ＮＭＲ(CDC₃):δ[ppm] 0.98(t，J=8.5Hz，3H); ４００ＭＨｚ 1.40-1.50(1H); 1.58-1.68(2H); 2.10-2.18(2H); 2.42-2.55(1H); 2.85(m，1H); 3.62(AB syst.，2H); 4.98(m，1H); 5.78-5.82(2H); 6.38(m，1H)． ［実施例９］ （±）−１−フェニルアセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペン テンの製造 （±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５ −エン−３−オンの６７ｇを、エタノール（４５０ml）中に、窒素ガス雰囲気下 に溶解し、−１０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライド１３．２ｇを、分 割して、１時間を費やしてこの溶液に滴下した。混合物を室温で３．５時間攪拌 したのち、濃硫酸を用いて、ｐＨを３．８に調整した。ついで完全に蒸発させた 。残渣を乾燥したのち、シリカゲル濾過（ヘキサン：酢酸エチル＝１：９）によ り精製した。酢酸エチルからの再結晶の後、５４．６ｇの白色固体が得られた。 収率は、使用した（±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２． １］ヘプト−５−エン−３−オン基準で、８０％であった。¹ Ｈ ＮＭＲ(CDCl₃):δ[ppm］ 1.28-1.35(1H); ４００ＭＨｚ 1.40(m，1H); 2.38-2.45(1H); 2.79(m，1H); 3.50(AB syst.，2H); 3.52(s，3H); 4.98(m，1H); 5.75(m，2H); 5.98(m，1H); 7.20-7.38(5H)． ［実施例１０］ （±）−１−ＢＯＣ−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの製 造 （±）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンハイドロク ロライドの１５ｇを、水１５０mlとジオキサン１５０mlとの混合溶媒中に、室温 で窒素ガス雰囲気下に溶解した。溶液のｐＨを１Ｎ−ＮａＯＨで１４に調整し、 tert−ブチロキシカルボニルフルオライド（ＢＯＣ−Ｆ，２０％過剰）のジエチ ルエーテル溶液を加え、混合物をさらに３時間室温で攪拌した。（ＢＯＣ−Ｆは 、Synthesis 1975，599に従って用意した。）ｐＨを、濃ＨＣｌで２に調節した 。 有機溶媒を蒸留除去し、残渣に水５０mlを加えてから、混合物を３×１００mlの 酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を完全に蒸発させた。残渣を、ジイソ プロピルエーテル１１０mlとｎ−ヘキサン８０mlとの混合物から再結晶させた。 表題化合物１１．９５ｇが得られた。収率は５６％であった。 融点：６８−７０℃¹ Ｈ ＮＭＲ(DMSO-d₆):δ[ppm] 1.18(m，1H); ４００ＭＨｚ 1.38(s，9H); 2.26(m，1H); 2.65(m，1H); 3.33(t，2H); 4.45(m，1H); 4.55(t，1H); 5.62(m，1H); 5.79(m，1H); 6.73(d，1H)． ［実施例１１］ （±）−１−プロピオニルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン の製造 （±）−２−プオピオニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エ ン−３−オンの１６．６ｇを、水（１４０ml）と２−ブタノール（６６ml）との 混合溶媒中に、窒素ガス雰囲気下に溶解し、−５℃に冷却した。３ｇのナトリウ ムボロハイドライドを、分割して２時間にわたって添加した。混合物を１０℃で ２．５時間で攪拌し、ついで、濃塩酸と水との混合物（１：１）で、ｐＨを２． ２に調節した。溶液を４０ｇになるまで蒸発させ、２Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを６． ２に調節した。混合物を５×５０mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有 機相を完全に蒸発させ、残渣を、トルエン（１５０ml）から再結晶させた。表題 化合物１１．１ｇが得られた。収率は６５％であった。 融点：６７−６８℃¹ Ｈ ＮＭＲ(DMSO-d₆):δ[ppm] 0.96(t，3H); ４００ＭＨｚ 1.16(quint.，1H); 2.04(quart.，2H); 2.26(m，1H); 2.66(m，1H); 3.34(m，2H); 4.58(t，1H); 4.72(m，1H); 5.61(m，1H); 5.84(m，1H); 7.72(d，1H)． ［実施例１２］ （±）−１−イソブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン の製造 （±）−２−イソブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エ ン−３−オンの９ｇを、水（３２ml）と２−ブタノール（８４ml）との混合溶媒 中に、窒素ガス雰囲気下に溶解し、０℃に冷却した。ナトリウムボロハイドライ ド１．３７ｇを、分割して３．５時間にわたって添加した。混合物を３時間、２ ０℃で攪拌し、ついで濃塩酸と水との混合物（１：１）でｐＨを２．５に調節し たのち、２Ｎ−ＮａＯＨで中和した。溶液を４０ｇになるまで蒸発させた。濃縮 液を、３×８０mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有機相を完全に蒸発 させた。その結果生じた固体を、トルエン２５mlから再結晶させた。表題化合物 ６．８ｇが得られた。収率は７３．６％であった。 融点：８０−８１℃¹ Ｈ ＮＭＲ(DMSO-d₆):δ[ppm］ 0.98(d，6H); ４００ＭＨｚ 1.16(quint.，1H); 2.30(m，2H); 2.68(m，1H); 3.32(t，2H); 4.58(t，1H); 4.70(m，1H); 5.61(m，1H); 5.82(m，1H); 7.68(d，1)． ［実施例１３］ ペニシリンＧアシラーゼを使用した（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロ キシメチル）−２−シクロペンテンの製造 Ｅ．ｃｏｌｉから得たペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１（ベーリ ンガー・マンハイム）１６５Ｕ（単位）／ｇまたはバチルス・メガテリウムから 得たペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１を、バイオ変換に使用した。 この目的で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５−９，４ml）に１ −フェニルアセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの非ラ セミ体を１重量％、適切なペニシリンＧアシラーゼ４００mgを、３７℃で接種し た。 所定の時間間隔でサンプルを採取し、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６ ０、ブタノール：水：氷酢酸＝３：１：１、ニンヒドリンで検出）、ガスクロマ トグラフィー（キャピラリーカラム、ＨＰ−５、５％フェニルメチルシロキサン ）またはＨＰＬＣにより分析した。酵素が、フェニルアセチル基を高い活性をも って除去し、それによって４０％までの対応するアミノアルコールを放出した。 遊離のアミノアルコールが、８０％のｅｅをもって得られた。 ［実施例１４］ 微生物を使用した（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２ −シクロペンテンの製造 １４．１ ヴィスプにあるARA水処理プラントから得た下水汚泥（２０％）を、１−アセ チル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリル−、または１−ブチリルアミノ −４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを０．５重量％含有するA+N培地 （表１を参照）に接種して、３７℃において、振とうしながら培養した。（１Ｒ ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの生成 を、 薄層クロマトグラフィーにより確認した。 １−３転移は、これら成分の１％の富化によって実施され、単離は固体（表１ の培地中における板状計数寒天：２０ｇ／ｌ）媒体上で行なった。微生物アルカ リゲネス／ボルデテラ ＦＢ１８８（ＤＳＭ１１７２）、ロドコッカス・エリス ロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）、ゴルドナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳ Ｍ１０６８７）およびロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）を 、このようにして単離した。 １４．２ 上記のようにして単離した微生物を、１−アセチル−、１−プロピオニル−、 １−イソブチリル−、または１−ブチリル−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２ −シクロペンテンを０．５％含有する培地（表１）で培養した。微生物は、２４ ないし３６時間後に、光学密度（ＯＤ）２ないし３に成長した。このようにして 得た細胞を、成長の遅い指数関数相において収穫し、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液 中で洗浄した。 これに続くバイオ変換を、１−アセチル−、１−イソブチリル−、または１− ブチリルーアミノ−４−ヒドロキシメチル-２−シクロペンテンを１重量％含有 する５０ｍＭリン酸塩緩衝液中（ｐＨ４．５−９）で実施した。薄層クロマトグ ラフィーにより、基質の５０％が加水分解されて（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ− ４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンになったことが見出された。Ｈ ＰＬＣ分析により、ｅｅ値は８０ないし９３％であることが判明した。 基質として１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン を使用したとき、バイオ変換の速度は、ＤＳＭ１０６８６株をA+N培地上で培養 した場合は０．１４（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）、１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキ シメチル−２−シクロペンテンを含有するＮＹＢ（栄養イーストブロス）培地上 で培養した場合は０．０３（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）であった。 同じ変換を、ＤＳＭ１０６８７株を用い、基質（１−ブチリルアミノ−４−ヒ ドロキシメチル−２−シクロペンテン）濃度２００ｍＭで実施した場合、バイオ 変換速度は０．１６１（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）であった。 表 １ Ａ＋Ｎ培地 ＭｇＣｌ₂ ０．４ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂ ０．０１４ｇ／ｌ ＦｅＣｌ₃ ０．８ｍｇ／ｌ Ｎａ₂ＳＯ₄ ０．１ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇ／ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２．５ｇ／ｌ ＮａＣｌ ３ｇ／ｌ ビタミン溶液 １ｍｌ／ｌ 痕跡元素溶液 １ｍｌ／ｌ ｐＨ ７．５ １４．３ ロドコッカス・エリスロポリスＤＳＭ１０６８６を、唯一の炭素および窒素源 として酢酸アンモニウム（３ｇ／ｌ）を加えた最小培地（表２参照）中、６リッ トルの発酵器を用いて、３０℃において、細胞密度がＯＤ６５０＞２５となるま で培養した。細胞の成長の間、追加の炭素源として、５０％酢酸を連続的に添加 した。ついで、酵素活性を誘起するため、６０ｇの（＋／−）−１−アセチルア ミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを添加し、培養をさらに数時 間続けた。最後に、さらに４０ｇの（＋／−）−１−アセチルアミノ−４−ヒド ロキシメチル−２−シクロペンテンを添加し、さらに１０時間、培養を続けた。 バイオ変換の進行は、オンラインでＨＰＬＣにより追跡した。使用した基質ラセ ミ体基準での分析値が４０％、ｅｅ値が８５％に到達したとき、酸を加えること により発酵を停止した。 表 ２ 培地組成 成分 濃 度 イーストエキス ０．５ｇ／ｌ ペプトンＭ６６ ０．５ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ ４．０ｇ／ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ／ｌ Ｋ₂ＳＯ₄ ２．０ｇ／ｌ 酢酸ＮＨ₄ ３．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂ ０．２ｇ／ｌ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １．０ｇ／ｌ 痕跡元素溶液（下記参照） １．５ｍｌ／ｌ ＰＰＧ（ポリプロピレングリコール） ０．１ｇ／ｌ 痕跡元素溶液 ＫＯＨ １５．１ｇ／ｌ ＥＤＴＡ・Ｎａ₂・２Ｈ₂Ｏ １００．０ｇ／ｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ９．０ｇ／ｌ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ ４．０ｇ／ｌ Ｈ₃ＢＯ₃ ２．７ｇ／ｌ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １．８ｇ／ｌ ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ １．５ｇ／ｌ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．１８ｇ／ｌ Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．２７ｇ／ｌ １４．４ 実施例１４．３と同様にして、微生物アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳ Ｍ１０３２８）、ロドコッカス ｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アル カリゲネス・キシロソキシダンス ｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７（Ｄ ＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シ ンプレックスＫ２およびシュードモナス・プチダＫ３２を、酢酸ナトリウム上、 前記培地（表１）上で、１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリ ル−、または１−ブチリル−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテ ン（以下「アミノアルコール」と略称）の存在下または不存在下に培養した。 アミノアルコールの存在下に培養した指数関数細胞に関して、下記の結果が得 られた。（ＨＰＬＣ分析） 菌 株 速度［mmol/OD.h］ ｅｅ／転化率［％］ ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８） ０．０５ ８８．７／１６ ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９） ０．００５ ９５／２３ Ｋ３２ ０．０５ ５４／１ ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６） ０．１ ８４／３９ 菌株Ｋ２およびＫ１７を培養し、収穫して、６０時間のバイオ変換にかけた 。 菌 株 速度［mmol/OD.h］ ｅｅ／転化率［％］ Ｋ２ − ９２／１０ ＨＳ２３０ − ９３／３．５ すべてのバッチから指数関数成長細胞および定常状態細胞を収穫し、バイオ変 換の静止細胞として使用した。ＴＬＣ分析の結果からは、アミノアルコールで誘 導した細胞と、誘導しなかった細胞との間に、差異は認められなかった。 ［実施例１５］ ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−ア セチルアミノ−アルコールハイドロラーゼの精製 酵素を、下記のようにして、分子量５０ｋＤにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ファ ルマシア・ファストゲル、１０−１５％勾配）蛋白質バンドが単一になるまで精 製した。 ロドコッカス・エリスロポリス ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）の細胞を、 ５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ6.2）の中で洗い、光学密度ＯＤ_650nmが１９０に なるまで濃縮した。最終濃縮物１ｍＭおよびＤＮＡｓｅにフェニルメタンスルホ ニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を添加した後、粗生成物を得るため、細胞をフレ ンチプレスで処理した。遠心分離を行なって、２００mlの細胞を含まないエキス トラクトを、蛋白質濃度４．８mg/mlで得た。 細胞を含まないエキストラクト９６０mgを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１ ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡にして おいた、ハイロードHiLoad２６／１０Ｑ−セファロースSepharoseイオン交換ク ロマトグラフィーカラム（ファルマシア）に載せた。 カラムを同じ緩衝溶液で洗浄したのち、蛋白質を直線的な緩衝溶液勾配（１５ ００ｍｌ；勾配は、ＤＴＴの１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８ ．０）−ＤＴＴの１ｍＭおよび１Ｍ−ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶 液 （ｐＨ７．０）である）で溶離した。酵素は、３７０および４３０ｍＭ−ＮａＣ ｌの間、ｐＨ７．６において、カラムから溶出した。活性な画分を集め、９mlに 濃縮した。蛋白質の含有量は４１mgであった。 さらに精製するため、この蛋白質溶液を、５０ｍＭのＮａＣｌおよびＤＴＴの １ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液であらかじめ平衡にしてある、ハイロ ード２６／６０スーパーデックスSuperdex ７５ゲル濾過クロマトグラフィーカ ラム（ファルマシア）に載せた。活性な成分を一体にしたところ、全蛋白質含有 量は１０．９mgであった。 この蛋白質溶液を、ＤＴＴの１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ ８．５）であらかじめ平衡にしてある、モノMonoＱＨＲ５／５カラム（ファルマ シア）に載せた。蛋白質を、ＤＴＴの１ｍＭを含有する５０ｍＭトリス緩衝溶液 （ｐＨ８．５）−ＤＴＴの１ｍＭおよび１Ｍ−ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリ ス緩衝溶液（ｐＨ８．５）という、直線的な勾配（４０ml）で溶離した。酵素は 、３９０および４４０ｍＭ−ＮａＣｌの間で溶出した。活性な画分は、蛋白質１ ．４mgを含んでいた。 最後の精製段階では、上記と同じ緩衝溶液で平衡にした、同じカラムを使用し た。使用した溶離の勾配は、同じ緩衝溶液で、０−５００ｍＭ−ＮａＣｌおよび ｐＨ７．０−８．５とした。このようにして、４３０μｇの純粋な酵素を得るこ とができた。 この酵素のＮ−末端配列が、プロテイン・ブロットから直接決定された。下記 の２０個のアミノ酸配列が得られた：Thr−Glu−Gln−Asn−Leu−His−Trp−Leu −Ser−Ala−Thr−Glu−Met−Ala−Ala−Ser−Val−Ala−Ser−Asn この配列は、既知の蛋白質のいずれに対しても、同族関係を示さなかった。 ［実施例１６］ 酵素の特性の決定 酵素の特性の決定を、精製した酵素と、細胞を含まないエキストラクトであっ て、セファデックスSephadex Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０，ファルマシア）を 使用して脱塩したものとの、両方について行なった。 細胞を含まないエキストラクト中の蛋白質濃度は７．３mg/mlであり、精製し た酵素の中の蛋白質濃度は１３５μｇ/mlであった。この細胞を含まないエキス トラクトに、ＰＭＳＦは加えなかった。 １６．１ Ｋｍ測定 細胞を含まないエキストラクトについて、Ｋｍ測定を行なった。ｐＨ７．０お よび温度３０℃における反応のＫｍは、基質１−アセチルアミノ−４−ヒドロキ シメチル−２−シクロペンテンに関し、２２．５ｍＭであった。 １６．２ 最適ｐＨ １−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン（２５ｍＭ ）の加水分解に最適なｐＨを、精製した酵素および細胞を含まないエキストラク トについて、ｐＨ６．２−９．０のｐＨ範囲において、下記の緩衝溶液中で決定 した。 トリス緩衝溶液１００ｍＭ ｐＨ９．０；８．５；８．０；７．５；７．０ クエン酸／リン酸緩衝溶液１００ｍＭ ｐＨ７．０；６．５５；６．２ 活性は、２４時間測定した。 反応の最適ｐＨは、１Ｒ，４Ｓおよび１Ｓ，４Ｒエナンチオマーを製造する反 応に関して、ｐＨ７．０からｐＨ７．５の間にあった。 細胞を含まないエキストラクトの活性に対し最適なｐＨは、ｐＨ７．０であっ た。選択性は、しかし、ｐＨ６．０からｐＨ７．０の間で、より高かった。 第１図は、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）か らのＮ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼ(細胞を含まないエキストラ クト)の活性を、ｐＨの関数として示す。 １６．３ 最適温度 実施例１６．２に示した反応にとって最適な温度は、２５ないし３０℃であっ た。 第２図は、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）か らのＮ−アセチルアミノーアルコールハイドロラーゼ（細胞を含まないエキスト ラクト）の活性を、温度の関数として示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｃ 233/23 Ｃ０７Ｃ 233/23 Ｃ０７Ｄ 487/08 Ｃ０７Ｄ 487/08 (31)優先権主張番号 ９０８／９７ (32)優先日 平成９年４月18日(1997．4．18) (33)優先権主張国 スイス（ＣＨ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ブリーデン，ヴァルター スイス国 グリス ＣＨ―3902 グルント ビールシュトラーセ ９ (72)発明者 ブルックス，フランク スイス国 ラロン ＣＨ―3942 ハウス フォルメス（番地なし) (72)発明者 ブルグドルフ，クヌート スイス国 リート・ブリック ＣＨ―3911 リングヴルム 23 (72)発明者 デュク，ローラン スイス国 ＣＨ―3971 シェルミニヨン （番地なし) (72)発明者 エッター，ケイ―サラ スイス国 ニーダーガンペル ＣＨ―3945 オーベルドルフ（番地なし) (72)発明者 グッギスベルク，イヴ スイス国 シエール ＣＨ―3960 アヴェ ニュー ドゥ ロトーン 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の一般式の化合物から選んだシクロペンテン誘導体 （式中、Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、アリールまたはアリロ キシである。） を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および炭 素源として資化することのできる微生物、ならびにこの微生物からの酵素エキス トラクト。 ２．微生物が、ロドコッカス、ゴルドナ、アースロバクター、アルカリゲネス、 アグロバクテリウム／リゾビウム、バチルス、シュードモナスまたはアルカリゲ ネス／ボルデテラ属から選んだものであることを特徴とする請求の範囲第１項の 微生物およびエキストラクト。 ３．微生物が、アルカリゲネス／ボルデテラＦＢ１８８(ＤＳＭ１１１７２)、ロ ドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１(ＤＳＭ１０６８６)、アースロバクター ｓｐ．ＨＳＺ５(ＤＳＭ１０３２８)、ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７(ＤＳＭ１ １２９１)、アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンス ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０ 、バチルス・シンプレックスＫ２、シュードモナス・プチダＫ３２またはゴルド ナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）の種、およびその機能的に等価な変異 種または突然変異種から選んだものであることを特徴とする請求の範囲第１項ま たは第２項の微生物およびエキストラクト。 ４．Ｎ−アセチルアミノアルコールハイドロラーゼ活性を有する酵 素であって、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの微生物およびその機能 的に等価な変異種または突然変異種から得られ、かつ下記の一般式の化合物から 選んだシクロペンテン誘導体 （式中、Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、アリールまたはアリ ロキシである。） を加水分解する能力を有する酵素。 ５．請求の範囲第４項に記載の微生物およびその機能的に等価な変異種または突 然変異種から得られる、下記の事項を特徴とする酵素： ａ）ｐＨ７．０±１．０を最適ｐＨとすること、 ｂ）ｐＨ７．０において２５℃から３０℃の間の温度を最適温度とすること、 および ｃ）基質として１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペン テンを用いたときのＫ_Mが、２２．５ｍＭ±７．５ｍＭ（３０℃、１００ｍＭリ ン酸緩衝液）であること。 ６．請求の範囲第４項または第５項に記載の微生物およびその機能的に等価な変 異種または突然変異種から得られる、さらに下記の事項を特徴とする酵素： ｄ）Ｎ−末端アミノ酸配列が、Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Th r-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asnであること、および ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される分子量が５０ｋＤであること。 ７．下記の一般式ＩおよびIIの（１Ｒ，４Ｓ）−および／または（１Ｓ，４Ｒ） −１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２− シクロペンテン および（または）下記の一般式IIIまたはIVの（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ， ４Ｓ）−アミノアルコール誘導体 （式中、Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、アリールまたはアリ ロキシである。） を製造する方法であって、一般式 （式中、Ｒ¹は上記した意味を有する。） のシクロペンテン誘導体を、請求の範囲第１項の微生物および／または酵素製品 、請求の範囲第４項の酵素、および／またはペニシリンＧアシラーゼを使用して 、式Ｉおよび／またはIIの化合物に転化し、適切であれば、この転化の結果生成 したそれらの化合物および／または式IIIおよび／またはIVのアミノアルコール 誘導体を単離することからなる製造方法。 ８．一般式 （式中、Ｒ¹は上記した意味を有する。） のシクロペンテン誘導体を、第一工程で、下記の一般式の（±）−２−アザビシ クロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン をアシル化して、下記の一般式の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプ ト−５−エン−３−オン誘導体とし、 （式中、Ｒ¹は上記した意味を有する。） 第二工程で、この化合物を還元して一般式VIIのシクロペンテン誘導体とするこ とを特徴とする請求の範囲第７項の製造方法。 ９．第一工程のアシル化を、下記の一般式のカルボン酸ハロゲン化物 （式中、Ｘはハロゲン原子をあらわし、Ｒ¹は上記した意味を有する。） を使用して行なうか、審たは下記の一般式のカルボン酸無水物 （式中、Ｒ¹は上記した意味を有する。） を使用して行なうことを特徴とする請求の範囲第８項の製造方法。 １０．第一工程のアシル化を、アプロティックな溶媒の中で実施することを特徴 とする請求の範囲第８項または第９項の製造方法。 １１．第二工程の還元を、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のボロハイドラ イド、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のアルミニウムハイドライドおよび ／またはビトライドVitrideを用いて実施することを特徴とする請求の範囲第８ 項ないし第１０項のいずれかの製造方法。 １２．第二工程の還元を、プロティックな溶媒の中で実施することを特徴とする 請求の範囲第８項ないし第１１項のいずれかの製造方法。 １３．一般式VIIのシクロペンテン誘導体の反応を、ロドコッカス、ゴルドナ、 アースロバクター、アルカリゲネス、アグロバクテリウム／リゾビウム、バチル ス、シュードモナスまたはアルカリゲネス／ボルデテラ属から選んだ微生物を使 用して行なうことを特徴とする請求の範囲第７項ないし第１２項のいずれかの製 造方法。 １４．一般式VIIのシクロペンテン誘導体の反応を、バチルス・メガテリウムま たはエシェリチア・コリの種の微生物から得たペニシリンＧアシラーゼを使用し て行なうことを特徴とする請求の範囲第７項ないし第１３項のいずれかの製造方 法。 １５．第三工程の反応を、温度２０ないし４０℃、ｐＨ５ないし９において実施 することを特徴とする請求の範囲第７項ないし第１４項のいずれかの製造方法。