ES2230179T3 - Nuevos sustratos cromogenos con base de alizarina. - Google Patents
Nuevos sustratos cromogenos con base de alizarina.Info
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Abstract
Uso de un sustrato cromógeno de fórmula general: en la que: - R1 es una parte diana o H y R2 es una parte diana o H, siendo al menos uno de R1 y R2 una parte diana, - R3 es H, SO3H, Cl, Br, F, I, NO2, NH2, NR9R10, acilamino, aminoarilo o aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo y aralquilo o un residuo de aminoácido a, como alanina, - R4 es H, SO3H, Cl, Br, F, I, NO2, NH2, NR9R10, OH, acilamino, aminoarilo o aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo, aralquilo o un residuo de aminoácido a, como alanina, - según una variante, R3 y R4 están unidos entre sí para formar un anillo de al menos cinco lados, y preferentemente de seis lados, - R5, R6, R7 y R8 están cada uno constituido por uno de los átomos o grupos de átomos siguientes: H, halógeno, en particular Cl o Br, OH, SO3H, alquilo o alcoxi, y - R9 y R10 están constituidos independientemente por metilo, alquilo, arilo, aralquilo o constituyen el uno, R9 o R10, un anillo (piperidina, pirrolidina, morfolina, etc.) y el otro, R10 o R9, un átomo de hidrógeno, para detectar la presencia de una actividad enzimática.
Description
Nuevos sustratos cromógenos con base de
alizarina.
La presente invención se refiere a la puesta de
manifiesto de enzimas de tipo hidrolasa, en particular osidasa,
esterasa o peptidasa, por el uso de sustratos cromógenos
eficaces.
Desde hace muchos años, se usan sustratos
particulares para permitir la determinación de la presencia o
ausencia de actividades enzimáticas características de
microorganismos. Por la elección de los sustratos, según exista o
no reacción, es posible caracterizar la naturaleza de un género de
microorganismos o diferenciar cepas y/o especies de un género
microbiano determinado.
Los sustratos sintéticos de enzimas están
constituidos por dos partes, una primera parte específica de la
actividad enzimática que ha de revelarse, en lo sucesivo denominada
parte diana, y una segunda parte que hace las veces de marcador, en
lo sucesivo denominada parte marcador.
Estos sustratos particulares pueden ser
fluorescentes o cromógenos. De hecho, es la segunda parte marcador
o el producto de su reacción con uno o varios compuestos
diferentes, véase a este respecto la solicitud de patente
PCT/FR99/00781 presentada a nombre de la Solicitante, la que es
fluorescente o cromógena, en el momento en que ya no está asociada
a la primera parte diana.
En el caso actual, se trata de sustratos
cromógenos con base de alizarinas o de antrarobinas que, en esta
forma de sustratos, están en general ligeramente coloreadas. No
obstante, la coloración debida a la parte marcador se refuerza y/o
modifica por la hidrólisis y así la separación de la parte diana
con respecto a dicha parte marcador. Preferentemente, la presencia
de un revelador, como una sal de metal, un pH alcalino, mejora aún
más las características coloreadas del producto obtenido.
La capacidad de las alizarinas para formar
quelatos metálicos coloreados se descubrió durante el siglo XIX.
Desde 1826, cuando se aislaron por primera vez las alizarinas a
partir de la planta Rubia tinctorum, su propiedad de materia
colorante se ha usado en el teñido de ropas.
La síntesis global de las alizarinas fue descrita
por Graebe y Liebermann en 1869. Ese mismo año, W.H. Perkin amplió
el número de alizarinas que pueden sintetizarse, proponiendo
diferentes sustituyentes en las posiciones R_{3}, R_{4},
R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} del núcleo de antraceno
siguiente:
Las alizarinas no son colorantes per se,
pero forman pigmentos insolubles con óxidos metálicos. Por ejemplo,
cuando la posición R_{3} se sustituye por un grupo sulfónico, la
quelación con una sal de aluminio da un color rojo escarlata
brillante, mientras que la quelación con una sal de cromo da un
rojo burdeos. Otro ejemplo, la 3-nitroalizarina y
la 4-nitroalizarina dan quelatos de diferentes
coloraciones en función de las sales metálicas que se le asocian.
El interés suscitado por las alizarinas en el teñido se debe en
gran parte a la estabilidad de los quelatos metálicos, así
formados, ya sean en jabones, ácidos e hidróxidos de metal
alcalino.
Entre los derivados de alizarina que pueden
sintetizarse fácilmente, se observa que a partir de
3-nitroalizarina y 4-nitroalizarina
se obtienen 3-aminoalizarina y
4-aminoalizarina. La
4-aminoalizarina se representa seguidamente:
Esta molécula es particularmente interesante, ya
que da un color púrpura en presencia de aluminio. Además, sirve
como punto de partida para la síntesis, por medio de una reacción
de Skraup bien conocida para el experto en la materia, de
alizarinas quinalinas, de la que a continuación se representa un
ejemplo, la alizarina \alpha-quinolina de color
verde:
Las reacciones de sustitución y de ciclación
permiten obtener un gran abanico de alizarinas modificadas que
tienen diferentes propiedades.
El estado de la técnica muestra igualmente que
existen ya aplicaciones biológicas y biomédicas. Debido a la
prontitud con que reaccionan las hidroxiantraquinonas en presencia
de quelatos, éstas han encontrado una aplicación preferente como
pruebas de detección de la presencia o de la ausencia de metales en
muestras biológicas.
Las antrarobinas, llamadas asimismo
desoxializarina o
antraceno-1,2,10-triol, que son
productos reducidos de alizarina, son ya bien conocidas por el
experto en la materia. Esta reducción se efectúa por la acción de
hidróxido de cinc o de solución amoniacal, de cloruro estannoso de
ácido, etc. La fórmula general de este compuesto es la
siguiente:
Sin embargo, hasta el momento ninguna información
ha puesto de manifiesto el uso que puede hacerse de las
alizarinas, los derivados antraquinoides o las antrarobinas como
sustratos de detección de una actividad enzimática. Esto necesita,
así, una síntesis de sustratos en la que se fije al menos una parte
diana en la alizarina. Estos sustratos tienen la ventaja de que no
reaccionan en presencia de iones metálicos, a partir del momento en
que la hidrólisis en dos partes, marcador y diana, no ha tenido
lugar. Con todo, la formación de quelatos insolubles presenta
ventajas sustanciales, que son las siguientes:
- gran sensibilidad, incluso a baja
concentración, de donde se necesita una pequeña cantidad de
sustrato,
- color del producto de la hidrólisis fácilmente
adaptable a las necesidades de la aplicación, por la composición
del medio de reacción y, principalmente, de los cationes
polivalentes (cuya definición se dará en los puntos específicos al
final de la descripción) y/o el o los pH usados,
- síntesis sencilla y baja cantidad de sustrato
necesaria (debido a la gran sensibilidad citada anteriormente), lo
que reduce los costes de fabricación,
- difusión de la coloración muy baja, lo que
permite aislar y diferenciar fácilmente las colonias, y
- baja inhibición, ya que se usa una baja
cantidad de sustrato (debida a la gran sensibilidad citada
anteriormente).
Los derivados de alizarina se han sintetizado,
por tanto, asociados principalmente a glicósidos, por medio de un
procedimiento bastante clásico, denominado de
Koenigs-Knorr (Koenigs, W., y Knorr, E., Ber., 34,
957, 1901). En lo que concierne a los
\alpha-glicósidos, su síntesis se realiza
modificando el procedimiento Helferich (Helferich B. y col., Ber.,
66, 378 (1933) y Ber., 77, 194 (1944)). Otros derivados se asocian
a ésteres de cadenas cortas de ácidos grasos, y a ésteres de
ácidos fosfórico o sulfúrico.
En la actualidad, los sustratos usados son, por
ejemplo, el
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido,
que son objeto ulteriormente de un estudio comparativo con uno de
los sustratos según la invención, la
alizarina-\beta-D-galactósido.
Según la presente invención, los sustratos según
la invención son sensiblemente más eficaces que los descritos por
el estado de la técnica. Así, detectan un número superior de
especies y/o cepas de microorganismos para una misma actividad
enzimática estudiada.
En otros documentos se describen más o menos
sustratos según la invención.
Así, un artículo de Masawaki, Teruyuki y
col., "Selective solvent extraction of ruberythric acid from
madder roots and subsequent hydrolysis with
\beta-glucosidase", J. Ferment. Bioeng.
(1996), 81(6), 557-569, se refiere a una
extracción de antraquinonas de raíces de rubia por uso de un
disolvente selectivo, con vista a su uso como colorante. El
objetivo consiste en extraer entre otras las alizarinas de las
antraquinonas asociadas a azúcares, entre ellas la
alizarina-2-o-primeverósido.
Para esto, hidrolizan la
alizarina-2-o-primeverósido
por medio de la \beta-glucosidasa.
Otro artículo proviene de Van der Plas,
Linus H. W. y col., "Anthraquinone glycosylation and
hydrolysis in Morinda citrifolia cell suspensions. Regulation and
function", J. Plant. Physiol. (1998), 152 (2/3),
235-241, propone una explicación biológica para la
presencia de un azúcar, el primeverósido glicosilado, en células de
plantas (véase página 240, columna 1 3^{er} apartado). Esta
fuente se debe a la hidrólisis de ciertas antraquinonas.
Un último artículo emitido por Mateju J. y
col., "Microbial glucosidation if dihydroxyanthraquinones.
General properties of glucosidation system", Folia Microbiol.
(Praga) (1974), 19(4), 307-316, ha tratado de
la actividad de "glucosidación" de la especie mutante
Streptomyces aureofaciens B96.
No obstante, éstos no tienen más que una relación
lejana con la invención de la Solicitante. Ciertamente, los tres
hablan de sustratos con base de alizarina (u otras antraquinonas),
pero estos sustratos están limitados en su diversidad (pocas
moléculas citadas) y se obtienen por biosíntesis (sustratos que
asocian un primeverósido y productos de plantas para los dos
primeros artículos, sustratos que asocian diversos glucósidos y
productos de la bacteria Streptomyces griseus para el tercer
artículo). Además, estos sustratos no sirven para generar pruebas
de diagnóstico que se apoyen en la detección de enzimas.
A este efecto, la presente invención se refiere a
un sustrato cromógeno que permite detectar la presencia de una
actividad enzimática, de fórmula general:
en la
que:
- R_{l} es una parte diana o H y R_{2} es una
parte diana o H, siendo al menos uno de R_{1} y R_{2} una parte
diana,
- R_{3} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo y
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- R_{4} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{l0}, OH, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo,
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- según una variante, R_{3} y R_{4} están
unidos entre sí para formar un anillo de al menos cinco lados, y
preferentemente de seis lados,
- R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} están cada
uno constituido por uno de los átomos o grupos de átomos
siguientes: H, halógeno, en particular Cl o Br, OH, SO_{3}H,
alquilo o alcoxi, y
- R_{9} y R_{10} están constituidos
independientemente por metilo, alquilo, arilo, aralquilo o
constituyen el uno, R_{9} o R_{10}, un anillo (piperidina,
pirrolidina, morfolina, etc.) y el otro, R_{10} o R_{9}, un
átomo de hidrógeno.
En un caso particular, las cetonas del anillo
central se reducen bajo la forma de grupos hidróxido, en los que al
menos uno de los átomos de hidrógeno se sustituye en su caso por un
grupo metilo, alquilo, arilo, aralquilo.
La presente invención se refiere igualmente a un
sustrato cromógeno que permite detectar la presencia de una
actividad enzimática, de fórmula general:
en la
que:
- R_{1} es una parte diana o H y R_{2} es
una parte diana o H, siendo al menos uno de R_{1} y R_{2} una
parte diana,
- R_{3} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo,
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- R_{4} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, OH, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo,
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- según una variante, R_{3} y R_{4} están
unidos entre sí para formar un anillo de al menos cinco lados, y
preferentemente de seis lados.
- R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} están cada
uno constituido por uno de los átomos o grupos de átomos
siguientes: H, halógeno, en particular Cl o Br, OH, SO_{3}H,
alquilo o alcoxi,
- R_{9} y R_{10} están constituidos
independientemente por metilo, alquilo, arilo, aralquilo o
constituyen el uno, R_{9} o R_{10}, un anillo (piperidina,
pirrolidina, morfolina, etc.) y el otro, R_{10} o R_{9}, un
átomo de hidrógeno.
- R_{11} está constituido por uno de los
átomos o grupos de átomos siguientes: H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, alquilo, arilo, aralquilo,
acilamino, aminoarilo o aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual
a alquilo, arilo, aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha,
y
- R_{12} está constituido por H, metilo,
alquilo, arilo, aralquilo.
En un caso particular en el que uno de los
sustratos anteriores se hidroliza, la parte marcador está
constituida por alizarina, que comporta dos grupos hidroxilos en
posiciones 1 y 2. Esta molécula tiene como nombre alternativo
1,2-dihidroxiantraquinona-\beta-D-galactósido,
cuya fórmula general, asociada a una parte diana constituida por
galactosa, es la siguiente:
El producto de su hidrólisis por una
\beta-galactosidasa forma un quelato en presencia
de una sal de hierro que es el siguiente:
En todos los casos de libro desarrollados
anteriormente y preferentemente, R_{1} es H y R_{2} es la
parte diana.
Más en concreto, la parte diana está constituida
por una de las moléculas siguientes:
- un glicósido, constituido por unidades mono-,
di- y/o polisacáridos, unidas en \alpha o en \beta la función
hidroxilo,
- un aminoácido \alpha o un péptido,
- un ácido orgánico, como
-O-CO-(CH_{2})_{n}-CH_{3},
con n comprendido entre 0 y 20, o
- un sulfato, un fosfato, un pirosulfato, un
pirofosfato o un fosfodiéster.
En un caso particular, R_{3} y R_{4} están
constituidos y unidos entre sí por una cadena en C_{3}N,
sustituida o no, preferentemente con N adyacente a R_{3} o a
R_{4}, con el fin de formar un anillo de seis lados.
Según un primer modo de uso de al menos un
sustrato, según se describe anteriormente para permitir detectar la
presencia de una actividad enzimática, consiste en:
- poner al menos un sustrato, cuya parte diana
está relacionada con la actividad enzimática que se va a detectar,
en presencia de una muestra sospechosa de contener al menos un
microorganismo que tiene una actividad enzimática semejante, y al
menos un tipo de catión, y
- observar la formación de un quelato insoluble y
coloreado.
Preferentemente, el sustrato se pone en presencia
de al menos un tipo de catión apropiado con respecto a la parte
marcador liberada por la actividad enzimática.
Siempre preferentemente, un tipo de catión, que
puede usarse para formar un quelato insoluble, está constituido
por: Fe^{2+}, Al^{3+}, Mn^{2+}, Sn^{2+} o Cu^{2+}.
En el caso de un uso de al menos dos sustratos,
como los descritos anteriormente, para permitir detectar la
presencia de al menos dos actividades enzimáticas diferentes, el
uso consiste en:
- poner al menos dos sustratos, cuyas partes
diana estén en relación con al menos dos actividades enzimáticas
que se han de detectar, en presencia de una muestra sospechosa de
contener al menos un microorganismo que tiene tales actividades
enzimáticas, y al menos un tipo de catión,
- observar la formación de al menos dos
coloraciones diferentes o de una tercera coloración.
Según este último caso, los sustratos se ponen en
presencia de al menos un tipo de catión, preferentemente de un
solo tipo de catión, apropiado con respecto a las partes marcador
liberadas por las actividades enzimáticas.
En todos los casos de libro, el uso de al menos
un sustrato, como el descrito más arriba, para permitir detectar
la presencia de una actividad enzimática, o este uso en combinación
con un uso ya descrito anteriormente, consiste en:
- poner al menos un sustrato, cuya parte diana
está relacionada con la actividad enzimática que se va a detectar,
en presencia de una muestra sospechosa de contener al menos un
microorganismo que tiene una actividad enzimática semejante, en un
medio de reacción que tiene un pH apropiado, y
- observar la formación de al menos una
coloración. Preferentemente, dado que se usan al menos dos
sustratos, existe uso de un solo tipo de catión, apropiado con
respecto a las partes marcador liberadas por las actividades
enzimáticas.
Según un modo de uso preferente, los usos
anteriores incluyen una etapa intermedia que consiste en dejar
crecer el o los microorganismos en un medio de cultivo que contiene
el o los sustratos.
Si se desea detectar una actividad enzimática
glicosidasa se usa como parte diana, entre otros:
- glucosa,
- galactosa,
- mannosa,
- xilosa,
- ácido glucurónico, o
- N-acetilglucosamina.
Si se desea detectar una actividad enzimática
fosfatasa, se usa como parte diana, entre otros, ácido fosfórico o
un derivado sustituido.
Si se desea detectar una actividad enzimática
sulfatasa, se usa como parte diana, entre otros, ácido sulfúrico o
un derivado sustituido.
Si se desea detectar una actividad enzimática
lipasa o fosfolipasa o esterasa, se usa como parte diana, entre
otros:
- un ácido graso, saturado o no, o un derivado
sustituido,
- ácido acético o un derivado sustituido,
- ácido butírico o un derivado sustituido,
- ácido octanoico o un derivado sustituido, o
- un grupo fosfato esterificado, como
inosita-1-fosfato.
La invención se refiere igualmente a una
composición que permite la detección de al menos una cepa y/o una
especie de microorganismo que comprende al menos un sustrato, como
el definido anteriormente, y un medio de cultivo.
En el caso en que la composición comporta al
menos dos sustratos, los productos, después de reacción, son de
colores diferentes que permiten diferenciar diferentes actividades
enzimáticas reveladas de al menos una cepa y/o una especie de
microorganismos.
Preferentemente, la composición está constituida
por un medio de cultivo líquido, gelificado o sólido (por ejemplo,
seco que pueda tomarse en un líquido idóneo).
Siempre preferentemente, la concentración del
sustrato está comprendida entre 10 y 500 mg/l, preferentemente
entre 30 y 150 mg/l, siendo todavía más preferentemente de 50
mg/l.
La presente invención se refiere así a un nuevo
sustrato débilmente coloreado inicialmente que toma una coloración
particular en presencia, por una parte, de un microorganismo o de
una enzima cuya presencia se quiere detectar, y por otra parte y en
su caso, de un catión. La invención se refiere igualmente a los
usos que pueden hacerse de este sustrato, así como a una
composición que contiene este sustrato.
La presencia de cationes es particularmente
interesante, no obstante lo cual es posible obviarla: en este caso
puede usarse preferentemente una composición que tenga un pH
alcalino. Asimismo es posible acumular las dos condiciones, es
decir, la presencia de cationes y un pH alcalino.
Cuando el catión usado varía, las colonias de
microorganismos probadas dan coloraciones diferentes. Estos
cationes, como, por ejemplo, hierro, manganeso, estaño y aluminio,
se usan a concentraciones muy bajas con el fin de evitar o de
reducir al mínimo la inhibición debida a iones libres presentes en
la muestra probada.
Sin embargo, concentraciones más elevadas de
ciertos iones metálicos dan una inhibición selectiva que puede
usarse para seleccionar especies microbianas particulares, lo que
constituye una ventaja adicional.
Según Robertson y col. (J. Chem. Soc. (1930),
1136 y (1933), 1167), la alizarina se glicosila específicamente en
el grupo hidroxilo en posición 2, incluso si es posible realizar
esta fijación en la posición 1. No obstante, el acoplamiento en
posición 2 es más fácil.
Este sustrato se prepara usando el procedimiento
descrito por Robertson (1933), pero modificado. Se suspende una
muestra de 6 g de alizarina en 70 ml de acetona y se mezcla con 70
ml de hidróxido de potasio a 0,28 moles/l para formar una sal. A
ésta se le asocia una mezcla de 40 ml que contiene en una
proporción 1:1 éter y acetona, que contiene 6,6 g de
aceto-bromo-glucosa. Se agita
durante 14 horas aproximadamente. A continuación se añaden 7 ml de
hidróxido de potasio a 1,25 moles/l, seguido de la adición de 15 ml
a 0,6 moles/l de acetobromo-glucosa en acetona. A
continuación se agita la premezcla durante una decena de horas. El
éter y la acetona se retiran bajo presión reducida y se lleva el pH
a 5,5 aproximadamente por adición de ácido acético glacial. La
mezcla y la alizarina que no haya reaccionado se filtran y luego se
lava con agua, para a continuación secar durante toda la noche a
50°C.
Se obtiene así un sólido amarillo que se pone en
suspensión en 70 ml de ácido acético glacial y se mantiene a
reflujo durante 5 minutos. Esto permite enfriar después de filtrar
y a continuación lavar con ácido acético. A continuación se pone
aparte el filtrado durante una hora y se separa la alizarina
restante. Este procedimiento se repite a 10°C para obtener un
filtrado amarillo oscuro.
Lo que se obtiene se seca y se disuelve en 200 ml
de metano diclórico y se añaden a continuación 2 ml de
trietilamina. Se premezcla un óxido de aluminio en la solución
hasta que una prueba de muestra revela que no queda alizarina por
cromatografía sobre capa fina (TLC). Se retira el óxido de aluminio
y se evapora la solución restante por puesta en rotación para
producir un sólido amarillo. Este sólido se recristaliza a partir
de etanol caliente en presencia de algunas gotas de ácido acético
para obtener 2,02 g de tetraacetil-glucósido de
alizarina.
Se pone en suspensión una cantidad de 1,1 g del
tetraacetil-glucósido de alizarina en 60 ml de
etanol, se añaden 30 ml de hidróxido de sodio acuoso a 0,125
moles/l para producir una solución roja. Este estado se mantiene
durante 10 minutos a 65°C y luego se enfría a 0°C. A continuación
se retira la sal de sodio de alizarina glicosilada por filtración
al vacío, se lava con éter y después se seca. Este procedimiento
permite obtener 0,9 g de sal de sodio de
alizarina-2-\beta-D-glucósido.
Se puede purificar este producto según técnicas conocidas por el
experto en la materia para obtener
alizarina-2-\beta-D-glucósido.
Este sustrato se prepara igualmente usando el
procedimiento descrito por Robertson (1933), pero modificado. Se
suspende una muestra de 6 g de alizarina en 70 ml de acetona y se
mezcla con 70 ml de hidróxido de potasio a 0,28 moles/l para formar
una sal. A ésta se le asocia una mezcla de 40 ml que contiene en
una proporción 1:1 éter y acetona, que contiene 6,6 g de
aceto-bromo-galactosa. Se agita
durante 14 horas aproximadamente. Se añaden a continuación 7 ml de
hidróxido de potasio a 1,25 moles/l, seguido de la adición de 15 ml
a 0,6 moles/l de aceto-bromo galactósido en
acetona. A continuación se agita la premezcla durante una decena de
horas. Se retiran el éter y la acetona bajo presión reducida y se
lleva el pH a 5,5 aproximadamente por adición de ácido acético
glacial. Se filtra la mezcla y la alizarina que no haya reaccionado
y después se lava con agua, para a continuación secar durante toda
la noche a 50°C.
Lo que se obtiene se disuelve en 200 ml de metano
diclórico y se añaden a continuación 2 ml de trietilamina. Se
añade a la solución un óxido de aluminio hasta que una prueba de la
muestra revela que no queda alizarina por TCL. Se retira el óxido
de aluminio y se evapora la solución restante por puesta en
rotación para producir un sólido amarillo. Este sólido se
recristaliza a partir de etanol caliente en presencia de algunas
gotas de ácido acético para obtener 1,96 g de
tetraacetil-galactósido de alizarina.
Se pone en suspensión una cantidad de 1,1 g de
tetraacetil-galactósido de alizarina en 60 ml de
etanol, se añaden 30 ml de hidróxido de sodio acuoso a 0,125
moles/l para producir una solución roja. Este estado se mantiene
durante 10 minutos a 65°C y luego se enfría a 0°C. A continuación
se retira la sal de sodio de alizarina glicosilada roja por
filtración al vacío, se lava con éter y después se seca. Este
procedimiento permite obtener 0,86 g de sal de sodio de
alizarina-2-\beta-D-galactósido
en forma de polvo rojo microcristalino.
Este sustrato se prepara por una técnica bien
conocida para el experto en la materia. Se disuelven 2 g de
alizarina en 5 ml de piridina y se trata con una mezcla de 2,5 ml
de anhidrido acético y 5 ml de piridina. Después de 16 horas a
temperatura ambiente, se vierte la solución amarilla en 100 ml de
ácido clorhídrico que contiene hielo. Se retira el precipitado de
acetato por filtración aspirante y se lava con agua. La
recristalización de acetona acuosa permite obtener 1,4 g de
alizarina-2-acetato en forma de
cristales amarillos.
Este sustrato se prepara por calentamiento de 2,4
g de alizarina, es decir 10 mmoles, en 10 ml de piridina que
contiene 4 g de un complejo piridina-trióxido de
azufre. Después de 2 horas a 60°C, se recoge la piridina bajo una
presión reducida. Se cristaliza el éster de sulfato, como sal de
potasio, por adición meticulosa de una potasa metanólica a un pH de
9. La sal de potasio se forma gradualmente y se recoge por
filtración aspirante y lavado con un éter para dar 1,2 g de un
polvo microcristalino blanco, la
alizarina-2-sulfato.
Este sustrato se prepara a partir de la
alizarina-2-sulfato, descrita
anteriormente en el apartado 3°). Estos 2,82 g de éster, es decir
10 mmoles, se mezclan en presencia de 75 ml de metano diclórico y
se añaden a la mezcla de 2 a 3 ml de 2,4,6-colidina
o 2,6-lutidina para obtener una solución de color
púrpura intenso. Al cabo de una hora, se añade carbonato de plata,
preparado según Wolfrom y Libenack, "Methods in Carbohydrate
Chemistry 2" (1963), 342-43, seguido de la
adición de 5 g, es decir 12,5 mmoles, de
aceto-bromo-galactosa. Se continúa
con la reacción a temperatura ambiente, es decir, de 10 a 15°C,
durante dos días con agitación en un recipiente. Una cromatografía
de capa fina revela una conversión progresiva en
tetraacetil-galactósido, que migra rápidamente en
la cromatografía. Se filtra la suspensión sobre lecho de sílice o
tierra de diatomeas gruesa y se lava el adyuvante de filtrado con
diclorometano en cantidad necesaria, es decir, 100 ml
aproximadamente. A continuación se lava la solución del compuesto
de diclorometano en presencia de 0,2 M de ácido clorhídrico (3 x
100 ml) en agua (x 2). Después de secado (MgSO_{4}), se evapora
el extracto marrón claro bajo presión reducida y luego se disuelve
de nuevo en metanol. Una cromatografía sobre capa fina (acetato de
etilo/tolueno 3:1) indica la presencia de un compuesto que migra
rápidamente y da una reacción positiva a los ultravioleta y al
ácido sulfúrico. A continuación se desacetila el galactósido
protegido, como se ha descrito ya usando metóxido de sodio en
metanol para dar 1,32 g de
alizarina-1-galactósido.
Este sustrato se prepara haciendo reaccionar 2,4
g, es decir, 10 mmoles, en 100 ml de diclorometano y 3 ml de
trietilamina. Además, se añaden lentamente durante 30 minutos a
esta solución en curso de mezcla a temperatura ambiente 1,62 g de
cloruro de octanoílo, es decir, 10 mmoles. El octanoato se purifica
tratándolo con alúmina, como ya se ha descrito, y se aísla
retirando el disolvente y la cristalización en metanol. Después de
enfriar a -12°C, una cantidad de 1,84 g de octanoato, es decir, 5
mmoles, en 30 ml de acetonitrilo seco, se trata sucesivamente
con:
- 3,6 g de tetracloruro de carbono,
- 1,6 g de diisopropiletilamina, y
- 80 mg de
4-dimetilaminopiridina.
Después de 2 minutos aproximadamente a bajas
temperaturas, se añade una solución que contiene 2,2 g de
dibencilfosfito en 8 ml de acetonitrilo, lo que evita un ascenso de
temperatura significativo. Al cabo de una hora, se explota la
mezcla como describen Silverberg L.J., Dillon J.L. y Vermeshetti
P., Tet. Lett., 37 n° 6 (1996), y se destruye el éter de
bencil-fosforilo con hidrógeno usando 30 ml de
etilo de acetato como disolvente, con 0,4 g de un catalizador de
paladio-carbono (10% en peso). A continuación se
aísla el éster de fosfato, como sal de potasio, y después se retira
etilo de acetato por puesta en solución en metanol y adición
cuidadosa de una solución de carbonato de potasio en metanol acuoso
a pH 8. Se recoge el precipitado de sal de potasio de
alizarina-1-ácido
fosfórico-2-octanoato, se lava con
metanol, y se secan los 2,05 g de éster al vacío y se usan sin más
purificación.
Este tipo de sustrato se prepara según la
síntesis expuesta en Liebermann - Ber., 21 444 (1888). Para
la síntesis de los derivados 9- y
10-O-metilo de antraquinonas
reducidas, el conjunto de los 1,2-dioles está
protegido previamente a la metilación por un procedimiento
apropiado, conocido por el experto en la materia, es decir, por
complejo con borato, según describe Scheline - Acta Chem. Scand.
20 1182 (1966) o por el uso de acetaldehído dimetil acetato
(protección por etilideno).
Son posibles numerosas aplicaciones.
1. Detección y localización de especies
microbianas específicas en un medio sólido o sobre membrana.
2. Detección de actividades enzimáticas en
solución a partir de extractos tisulares o celulares, o a partir de
suspensión de células de eucariotas o procariotas.
3. Identificación de organismos atendiendo a la
presencia de actividades enzimáticas.
4. Visualización y localización de una reacción
específica entre antígeno y anticuerpo, como la técnica ELISA. Es
posible, por ejemplo, usar
alizarina-\beta-galactósido o
alizarina-fosfato para tecnologías destinadas a
revelar las actividades \beta-galactosidasa o
fosfatasa alcalina como enzimas indicadoras. En este caso, los
sustratos enzimáticos se usan en primer lugar en reacciones de
detección en las que tiene lugar una actividad enzimática
(principalmente, la fosfatasa alcalina o la
\beta-galactosidasa), como las reacciones de
detección de anticuerpo o antígeno con un formato de tipo ELISA
como, por ejemplo, "Les immunodosages de la théorie á la
pratique", coordinado por Y. Barbier, en las ediciones de
ACOMEN, Lyon, páginas 109 a 133 (1988); o incluso en la detección
de ácidos nucleicos como, por ejemplo, "DNA probes", 2ª
edición, Keller G.H., Manak M.M., Stockton Press, secciones 5 a 9
(1993).
5. Técnicas de biología molecular en las que
tiene lugar la demostración de la presencia de un gen, por ejemplo
de la \beta-galactosidasa, y su uso, "Molecular
cloning a laboratory manual", 2ª edición, Sambrook, Fritsch,
Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, secciones 16.56 y
sección 1.85 (1989).
6. Técnicas histoquímica, citoquímica o de
citometría de flujo. El luso de estos sustratos en relación con
actividades enzimáticas específicas tiene aplicaciones en el
diagnóstico médico y en otros dominios, como el análisis de aguas,
medio ambiente, alimentos, etc.
7. Revelación de enzimas en perfiles de geles de
poliacrilamidas u otros materiales usados para efectuar
electroforesis u otros procedimientos de separación.
En el medio mostrado a continuación, base
Columbia con una concentración de 46,37 g/l, se ha añadido bien
alizarina-2-\beta-D-galactósido
a 0,01 g/l, 0,03 g/l, 0,05 g/l y 0,08 g/l en presencia de citrato
de hierro amoniacal a 0,05 g/l o bien
6-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido
a 0,2 g/l sin citrato de hierro amoniacal. Estos cuatro medios se
han repartido en placa de Petri a razón de 20 ml de medio por
placa. Se han sembrado microorganismos en este medio por
aislamiento en tres discos a partir de una suspensión al 0,5 de
McFarland. Las placas se han incubado a 37°C durante 48 horas. Las
colonias formadas se han examinado visualmente después de 18, 24 y
48 horas de incubación. Se ha anotado la coloración de estas
colonias, así como la intensidad de esta coloración. Los resultados
se presentan en la tabla 1 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El símbolo " - " significa, en esta tabla 1,
una ausencia de coloración. Las cepas así probadas, al no tener
más que resultados negativos, hacen las veces de control
negativo.
Según esta tabla 1, es posible resaltar que las
intensidades obtenidas con la
alizarina-2-\beta-D-galactósido
desde 0,03 g/l son casi equivalentes a las observadas con el
6-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido,
cuya concentración es aproximadamente siete veces superior. La
concentración en
alizarina-2-\beta-D-galactósido
que permite obtener intensidades de coloración interesantes está
comprendida entre 0,03 g/l y 0,08 g/l, preferentemente 0,05 g/l.
Los sustratos con base de alizarina son, pues, más sensibles que
los sustratos con base de indoxilo.
Se prepara del modo siguiente un medio gelificado
que comprende
alizarina-2-\beta-D-galactósido:
se añaden 46,37 g de agar Columbia a 1 litro de agua destilada con
50 mg de
alizarina-2-\beta-D-galactósido,
500 mg de citrato de hierro amoniacal y 30 mg de
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
para facilitar la inducción de la actividad
\beta-galactosidasa. El agar se esteriliza en
autoclave a 116°C durante 10 min. El medio se enfría lentamente a
55°C antes de repartirlo en placas de Petri de 20 ml. Este medio se
compara con un medio sólido preparado de la misma forma y que
contiene 46,37 g de agar Columbia con 80 mg de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido
y 30 mg de
isopropil-\beta-D-tiogalactósido.
Se han recogido trescientas sesenta y siete cepas
(367) a partir de muestras clínicas y ambientales y se han
identificado por la galería API (marca registrada) 20E (BioMérieux,
Francia) como procedimiento de referencia. Las cepas se cultivan en
un medio Columbia agar a 37°C durante 24 horas y luego se realiza
un inóculo de 108 organismos/ml aproximadamente (equivalente a un
McFarland estándar de 0,5) para cada cepa. Mediante el uso de un
inoculador Denley, se inocula 1 microlitro de cada suspensión en
una placa de cada uno de los medios: el medio que contiene
alizarina-2-\beta-D-galactósido
preparado anteriormente y el medio que contiene
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido.
Todas las placas se incuban a 37°C durante 18 horas.
Después de incubación, las colonias formadas se
examinan visualmente. En el medio que contiene
alizarina-2-\beta-galactósido,
las colonias que presentan una actividad
\beta-galactosidasa son de color púrpura y en el
medio que contiene
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido,
son de color turquesa. Toda cepa que presenta uno de estos colores
de considera positiva para la actividad
\beta-galactosidasa con el sustrato
correspondiente. Los resultados se presentan en la tabla 2 a
continuación.
Las cifras presentes en las columnas asociadas a
alizarina-2-\beta-D-galactósido
y
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido
corresponden a los porcentajes de cepas positivas. La gran mayoría
de las cepas, es decir, el 96,5%, tiene una reactividad idéntica, ya
sea positiva o negativa, para los dos sustratos. Ocho cepas sólo
hidrolizan la
alizarina-2-\beta-D-galactósido.
Ahora bien, esas ocho cepas tienen una actividad
\beta-galactosidasa por el hecho de la detección
de una fluorescencia en presencia del sustrato
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactósido.
Esta tabla muestra así una buena eficacia del sustrato como
indicador de la actividad \beta-galactosidasa con
una sensibilidad superior a la observada con el sustrato de
referencia, el
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido.
Estos sustratos son, pues, muy sensibles y utilizables a baja
concentración.
En el medio, base Columbia (46,37 g/l) y
alizarina-2-\beta-D-glucósido
(50 mg/1), se han añadido a la concentración de 50 mg/1 bien
cloruro de manganeso, bien citrato de hierro amoniacal, bien
cloruro de estaño, bien sulfato de aluminio. Se ha estudiado
asimismo un medio testigo sin sal de metales. Estos diferentes
medios se han repartido después de paso a autoclave en placas de
Petri a razón de 20 ml de medio por placa. Se han sembrado
microorganismos tomados de la colección de la solicitante en cada
uno de los medios por aislamiento en tres discos a partir de una
suspensión al 0,5 de McFarland. Las placas se han incubado a 37°C
durante 48 horas. Las colonias formadas se han examinado
visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. Se ha anotado
la coloración de estas colonias, así como la intensidad de esta
coloración. Los resultados se presentan en la tabla 3 a
continuación. Conviene advertir que los valores de intensidad se
dan arbitrariamente, con el único objetivo de permitir comparar las
intensidades de unas cepas con otras. Lo anterior también es cierto
para los ejemplos que siguen. Igualmente, las cepas probadas
tomadas de la colección de la solicitante comportan un número
interno de esta colección. Esta numeración interna se usa
igualmente en algunos de los ejemplos que se expondrán a
continuación.
\newpage
Siguiendo la sal de metal probada, el color
obtenido después de hidrólisis del sustrato es diferente. También
es posible observar una coloración incluso en ausencia de sales de
metales (medio testigo). Sin embargo, la intensidad de la
coloración obtenida es inferior a la observada, por ejemplo con la
sal de hierro, sal que no modifica el color.
Esto puede permitir adaptar el color y su
intensidad en función de las necesidades (asociación de otros
sustratos enzimáticos, indicadores de pH).
En los dieciocho tubos que contienen 5 ml de agua
osmotizada a pH 7 se ha añadido
alizarina-2-\beta-D-galactósido
a 0,05 g/l, citrato de hierro amoniacal a 0,05 g/l en la mitad de
los tubos y 5 \mul de \beta-galactosidasa (EC
3.2.1.23 Sigma) en cada tubo. Estos dieciocho tubos se han incubado
a 37°C durante 4 H. Después de la incubación, la coloración
obtenida es rosa claro para los tubos que no contienen citrato de
hierro amoniacal y rosa más intenso para los tubos que contienen
citrato de hierro amoniacal. Finalmente, estos diferentes tubos se
han ajustado a diferentes pH
(2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 - 9 - 10) a 24°C. Las coloraciones obtenidas después de ajuste se presentan en la tabla 4 a continuación:
(2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 - 9 - 10) a 24°C. Las coloraciones obtenidas después de ajuste se presentan en la tabla 4 a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
El color varía en función del pH. En general, es
amarillo para un pH ácido y de rosa a púrpura para un pH alcalino.
Esto puede permitir adaptar el color según las necesidades o poner
de manifiesto varios metabolismos (hidrólisis enzimática y
variación de pH). Esto prueba igualmente que es posible usar una
gran paleta de pH.
El medio siguiente:
- base Columbia a una concentración de 46,37
g/1,
-
alizarina-2-13-D-glucósido
a 0,05 g/l,
- citrato de hierro amoniacal a 0,05 g/1,
-
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido
a 0,05 g/l, y
-
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
a 30 mg/1 para facilitar la inducción de la actividad
\beta-galactosidasa,
se ha repartido en placas de Petri a razón de 20
ml de medio por placa. Se han sembrado microorganismos tomados de
la colección de la solicitante en este medio por aislamiento en
tres discos a partir de una suspensión al 0,5 de McFarland. Las
placas se han incubado a 37°C durante 48 horas.
Las colonias formadas se han examinado
visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. Se ha anotado
la coloración de estas colonias, así como la intensidad de esta
coloración. Los resultados se presentan en la tabla 5 a
continuación:
El símbolo " - " significa, en esta tabla 5,
una ausencia de coloración. Las cepas así probadas, al no tener
más que resultados negativos, hacen las veces de control
negativo.
Gracias a una asociación de estos dos sustratos
es posible detectar cuatro grupos de microorganismos
diferentes:
- el primero, que presenta una coloración
turquesa, corresponde a especies que sólo poseen la actividad
\beta-galactosidasa,
- el segundo, que presenta una coloración
púrpura, corresponde a especies que sólo poseen la actividad
\beta-glucosidasa,
- el tercer grupo, que presenta una mezcla de dos
coloraciones precedentes, es decir, variante de azul a malva,
corresponde a especies que poseen las dos actividades enzimáticas
detectadas, y
- el cuarto grupo, incoloro, corresponde a
especies que no poseen ninguna de las actividades anteriormente
citadas.
Por tanto, es posible con estos sustratos con
base de alizarina asociar otros sustratos enzimáticos con el fin
de diferenciar uno o varios grupos de microorganismos en función de
las actividades bioquímicas presentes en estos microorganismos.
En una cúpula de galería de tipo API (marca
registrada, BioMérieux, Francia), se han depositado 3 \mul de una
mezcla de
alizarina-2-\beta-D-glucósido
a 0,12 g/l y de citrato de hierro amoniacal a 0,05 g/l y después se
ha secado. Se ha realizado una cúpula testigo, que contiene
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido
con concentración final de 0,4 g/l. Estas dos cúpulas se han
inoculado entonces con 50 \mul de una base Columbia sin agar y
100 de una suspensión bacteriana al 2 de McFarland. Al cabo de 4 y
24 horas de incubación a 37°C, se ha anotado la coloración obtenida
en la cúpula. Los resultados se presentan en la tabla 6 a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El símbolo " - " significa, en esta tabla 6,
una ausencia de coloración. Las cepas así probadas, al no tener
más que resultados negativos, hacen las veces de control
negativo.
El sustrato con base de alizarina permite
detectar una actividad para siete (7) especies de ocho (8)
probadas, mientras que el
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido
sólo permite detectar una actividad para seis (6) de estas
especies. Por otra parte, para dos cepas (Bacillus
thurigiensis y Listeria seeligeri) la actividad se
detecta más precozmente con el sustrato con base de alizarina. Estos
sustratos son, pues, por una parte, utilizables en medio líquido y,
por otra, más sensibles que los sustratos con base de indoxilo.
En el medio, que contiene base Columbia a una
concentración de 46,37 g/l, se han añadido:
- alizarina
2-\beta-D-glucósido
a 0,05 g/l y citrato de hierro amoniacal a 0,05 g/l,
-
alizarina-1-\beta-D-glucósido
a 0,05 g/l o 0,1 g/l y, para estas dos concentraciones, citrato de
hierro amoniacal a 0,05 g/l,
-
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido
a 0,15 g/l sin citrato de hierro amoniacal.
Estos cuatro medios se han repartido en placas de
Petri a razón de 20 ml de medio por placa. Se han sembrado
microorganismos en este medio por aislamiento en tres discos a
partir de una suspensión al 0,5 de McFarland. Se han incubado las
placas a 37°C durante 48 horas. Las colonias formadas se han
examinado visualmente después de 18, 24 y 48 horas de incubación.
Se ha anotado la coloración de estas colonias, así como la
intensidad de esta coloración. Los resultados se presentan en la
tabla 7 a continuación:
El símbolo " - " significa, en esta tabla 7,
una ausencia de coloración. Las cepas así probadas, al no tener
más que resultados negativos, hacen las veces de control
negativo.
Para la misma concentración de 0,05 g/l, los dos
sustratos no permiten obtener las mismas intensidades de coloración
para dos (2) cepas de tres (3) que presentan una actividad. La
alizarina-2-\beta-D-glucósido
es ligeramente más sensible que la
alizarina-1-\beta-D-glucósido.
Pero para 0,1 g/l, la
alizarina-1-\beta-D-glucósido
permite obtener intensidades de coloración superiores a las
observadas con la
alizarina-2-\beta-D-glucósido.
Según esta tabla es posible también subrayar que
las intensidades obtenidas con la
alizarina-1-\beta-D-glucósido
a 0,05 g/l son, para todas las cepas probadas, superiores a las
observadas con
6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido,
cuya concentración es tres veces superior a la de la
alizarina-1-\beta-D-glucósido.
Los sustratos con base de alizarina son, por
tanto, más sensibles que los sustratos con base de indoxilo.
La elección entre
alizarina-1-\beta-D-glucósido
y
alizarina-2-\beta-D-glucósido
podrá estar dictada por otros criterios, como el coste de síntesis,
la especificidad en la aplicación, la estabilidad, etc.
Un procedimiento de visualización y, por tanto,
de identificación de especies bacterianas, en colonias, se efectúa
en un medio con base de agar por incorporación de al menos un
sustrato como el sintetizado anteriormente en presencia de bajas
cantidades de al menos un catión yodo. Las colonias reveladas
forman entonces entidades muy coloreadas (rojo, púrpura, azul,
etc.) según la elección del sustrato y del catión que se le asocia.
Cuando esta proporción entre el sustrato y el catión existe, está
comprendida entre 1/100 y 100/1, preferentemente entre 1/10 y 10/1,
y más preferentemente entre 1/2 y 2/1.
En ciertas condiciones, la presencia de un
sustrato de SO_{3}H en R_{3} permite evitar los problemas de
inestabilidad y de insolubilidad ligados a este tipo de
sustratos.
Como "cationes polivalentes" hay que incluir
cationes metálicos polivalentes, de forma X^{n+}, con n = 2, 3 ó
4. Los metales utilizables son: Mg, Al, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co,
Ni, Cu, Zn, Sr, Zr, Sn, Sb, Ba, La, Hf, así como los lantánidos Ce,
Sm, Eu, Gd y Tb.
Las antrarobinas, también denominadas
desoxializarina o
antraceno-1,2-10-triol,
que son productos reducidos de alizarinas, son ya bien conocidas
por el experto en la materia. Esta reducción se efectúa por la
acción de hidróxido de cinc o de solución amoniacal, de cloruro
estannoso de ácido, etc. La fórmula general de este compuesto es la
siguiente:
Por la ausencia del anillo quinodoidal central de
la antraquinona, los quelatos metálicos del sistema
1,2-diol tienen una reactividad diferente; por
ejemplo, el quelato ferroso es de color negro. Como el quelato
ferroso de las alizarinas es de color rojo, es posible utilizar dos
sustratos diferentes con el mismo tipo de catión, lo que permite
detectar dos actividades enzimáticas diferentes. Estos dos
sustratos pueden ser, por ejemplo:
-
alizarina-2-\beta-D-glucósido
para detectar una actividad osidasa, y
-
desoxializarina-2-\beta-D-fosfatasa
para detectar una actividad fosfatasa.
Igualmente es posible proteger el grupo hidroxilo
en posición 10 de las antrarobinas, en la que el átomo de
hidrógeno puede sustituirse por un grupo metilo, por ejemplo, lo
que da una molécula de la forma siguiente:
Análogamente, las alizarinas pueden también
protegerse reduciendo las cetonas en forma de alcohol
9,10-diol, funciones alcohólicas que a continuación
se alquilan, por ejemplo bajo la forma de
1,2-dihidroxi-9,10-dimetoxiantraceno,
como se representa a continuación:
Estas antrarobinas y alizarinas alquiladas no
pueden transformarse espontáneamente a continuación en alizarinas
por oxidación al aire libre, y por este hecho son buenas candidatas
para glicosidaciones de sustratos, preferentemente en posición
2.
Claims (22)
1. Uso de un sustrato cromógeno de fórmula
general:
en la
que:
- R_{1} es una parte diana o H y R_{2} es
una parte diana o H, siendo al menos uno de R_{1} y R_{2} una
parte diana,
- R_{3} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo y
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- R_{4} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, OH, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo,
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- según una variante, R_{3} y R_{4} están
unidos entre sí para formar un anillo de al menos cinco lados, y
preferentemente de seis lados,
- R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} están cada
uno constituido por uno de los átomos o grupos de átomos
siguientes: H, halógeno, en particular Cl o Br, OH, SO_{3}H,
alquilo o alcoxi, y
- R_{9} y R_{10} están constituidos
independientemente por metilo, alquilo, arilo, aralquilo o
constituyen el uno, R_{9} o R_{10}, un anillo (piperidina,
pirrolidina, morfolina, etc.) y el otro, R_{10} o R_{9}, un
átomo de hidrógeno, para detectar la presencia de una actividad
enzimática.
2. Uso, según la reivindicación 1,
caracterizado porque las cetonas del anillo central están
reducidas en forma de grupos hidróxido en el cual al menos un átomo
de hidrógeno está sustituido en su caso por un grupo metilo,
alquilo, arilo, aralquilo.
3. Uso de un sustrato cromógeno de fórmula
general:
en la
que:
- R_{1} es una parte diana o H y R_{2} es
una parte diana o H, siendo al menos uno de R_{1} y R_{2} una
parte diana,
- R_{3} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo,
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- R_{4} es H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, OH, acilamino, aminoarilo o
aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual a alquilo, arilo,
aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha, como alanina,
- según una variante, R_{3} y R_{4} están
unidos entre sí para formar un anillo de al menos cinco lados, y
preferentemente de seis lados,
- R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} están cada
uno constituido por uno de los átomos o grupos de átomos
siguientes: H, halógeno, en particular Cl o Br, OH, SO_{3}H,
alquilo o alcoxi,
- R_{9} y R_{10} están constituidos
independientemente por metilo, alquilo, arilo, aralquilo o
constituyen el uno, R_{9} o R_{10}, un anillo (piperidina,
pirrolidina, morfolina, etc.) y el otro, R_{10} o R_{9}, un
átomo de hidrógeno,
- R_{11} está constituido por uno de los
átomos o grupos de átomos siguientes: H, SO_{3}H, Cl, Br, F, I,
NO_{2}, NH_{2}, NR_{9}R_{10}, alquilo, arilo, aralquilo,
acilamino, aminoarilo o aminoacilamino del tipo NHCOX, con X igual
a alquilo, arilo, aralquilo o un residuo de aminoácido \alpha,
como alanina, y
- R_{12} está constituido por H, metilo,
alquilo, arilo, aralquilo, para detectar la presencia de una
actividad enzimática.
4. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque R_{1} es H y
R_{2} es una parte diana.
5. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la parte diana
está constituida por una de las moléculas siguientes:
- un glicósido, constituido por unidades mono-,
di- y/o polisacáridos, unidas en \alpha o en \beta a la función
hidroxilo,
- un aminoácido \alpha o un péptido,
- un ácido orgánico, como -O-CO-
(CH_{2}) n-CH_{3}, con n comprendido entre 0 y
20, ó
- un sulfato, un fosfato, un pirosulfato, un
pirofosfato o un fosfodiéster.
6. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque R_{3} y
R_{4} están constituidos y unidos entre sí por una cadena en
C_{3}N, sustituida o no, preferentemente con N adyacente a
R_{3} o R_{4}, con el fin de formar un anillo de seis
lados.
7. Uso de al menos un sustrato, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para permitir detectar la
presencia de una actividad enzimática, caracterizado porque
consiste en:
- poner al menos un sustrato, cuya parte diana
está relacionada con la actividad enzimática que se va a detectar,
en presencia de una muestra sospechosa de contener al menos un
microorganismo que tiene una actividad enzimática semejante, y al
menos un tipo de catión, y
- observar la formación de un quelato insoluble y
coloreado.
8. Uso, según la reivindicación 7,
caracterizado porque el sustrato se pone en presencia de al
menos un tipo de catión apropiado con respecto a la parte marcador
liberada por la actividad enzimática.
9. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque un tipo de
catión, que puede usarse para formar un quelato insoluble, está
constituido por: Fe^{2+}, Al^{3+}, Mn^{2+}, Sn^{2+} o
Cu^{2+}.
10. Uso de al menos dos sustratos, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para permitir detectar la
presencia de al menos dos actividades enzimáticas diferentes,
caracterizado porque consiste en:
- poner al menos dos sustratos, cuyas partes
diana estén en relación con al menos dos actividades enzimáticas
que se han de detectar, en presencia de una muestra sospechosa de
contener al menos un microorganismo que tiene tales actividades
enzimáticas, y al menos un tipo de catión, y
- observar la formación de al menos dos
coloraciones diferentes o de una tercera coloración.
11. Uso, según la reivindicación 10,
caracterizado porque los sustratos se ponen en presencia de
al menos un tipo de catión, preferentemente un solo tipo de catión,
apropiado con respecto a las partes marcadores liberadas por las
actividades enzimáticas.
12. Uso de al menos un sustrato, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para permitir detectar la
presencia de una actividad enzimática, o en combinación con un uso
según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11,
caracterizado porque consiste en:
- poner al menos un sustrato, cuya parte diana
está relacionada con la actividad enzimática que se va a detectar,
en presencia de una muestra sospechosa de contener al menos un
microorganismo que tiene una actividad enzimática semejante, en un
medio de reacción que tiene un pH apropiado, y
- observar la formación de al menos una
coloración.
13. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque el uso de al
menos dos sustratos entraña el uso de un solo tipo de catión,
apropiado con respecto a las partes marcadores liberadas por las
actividades enzimáticas.
14. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 ó 10, caracterizado porque consiste en
efectuar una etapa intermedia consistente en dejar crecer el o los
microorganismos en un medio de cultivo que contiene el o los
sustratos.
15. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14, caracterizado porque se detecta una
actividad enzimática glicosidasa que usa, entre otros, como parte
diana:
- glucosa,
- galactosa,
- mannosa,
- xilosa,
- ácido glucurónico, o
- N-acetilglucosamina.
16. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14, caracterizado porque se detecta una
actividad enzimática fosfatasa que usa como parte diana, entre
otros, ácido fosfórico o un derivado sustituido.
17. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14, caracterizado porque se detecta una
actividad enzimática sulfatasa que usa como parte diana, entre
otros, ácido sulfúrico o un derivado sustituido.
18. Uso, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14, caracterizado porque se detecta una
actividad enzimática lipasa, fosfolipasa o esterasa que usa como
parte diana, entre otros:
- un ácido graso, saturado o no, o un derivado
sustituido,
- ácido acético o un derivado sustituido,
- ácido butírico o un derivado sustituido,
- ácido octanoico o un derivado sustituido, o
- un grupo fosfato esterificado, como
inosita-1-fosfato.
19. Composición que permite la detección de al
menos una cepa y/o una especie de microorganismos que comprende al
menos un sustrato, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6, y un medio de cultivo.
20. Composición, según la reivindicación 19,
caracterizada porque comporta al menos dos sustratos, los
sustratos, después de reacción, son de colores diferentes que
permiten diferenciar diferentes actividades enzimáticas reveladas
por al menos una cepa y/o una especie de microorganismos.
21. Composición, según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 ó 20, caracterizada porque está
constituida por un medio de cultivo líquido, gelificado o
sólido.
22. Composición, según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, caracterizada porque la
concentración del sustrato está comprendida entre 10 y 500 mg/l,
preferentemente entre 30 y 150 mg/l, siendo todavía más
preferentemente de 50 mg/l.
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