ES2298395T3 - Indicadores de la actividad enzimatica. - Google Patents
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Abstract
Método para detectar la actividad enzimática en un medio sólido que incluye: a) poner en contacto un sustrato enzimático, que comprende i) una porción cromógena que comprende un resto de catecol que es un resto que resulta de la eliminación de uno o ambos átomos de hidrógeno hidroxílicos de un 1, 2-dihidroxibenceno o un derivado sustituido del mismo en el que los sustituyentes no forman un sistema anular condensado con el anillo de 1, 2-dihidroxibenceno, y ii) un grupo escindible enzimáticamente, que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, teniendo el sustrato enzimático una de las siguientes fórmulas: en las que R1 y R2 son H o un grupo escindible enzimáticamente seleccionado de entre glucosilos y restos de fosfato, sulfato, aminoácidos, péptidos, proteínas, azúcares, ácidos grasos y nucleótidos, y R1 y R2 no pueden ser ambos H, R3 y R4 se seleccionan de entre el grupo que consiste en grupos H,alquilo de C1 a C6, alcoxi de C1 a C6 e hidroxialquilo de C1 a C6, halógeno, nitro, acilo, aciloxi, aralquilo, arilo y amido, y no están unidos para formar un anillo condensado; e Y es un resto orgánico que contiene menos de 40 átomos, que no interfiere con la escisión enzimática, y que comprende grupos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos que contienen 5 a 18 átomos anulares, con una sustancia sospechosa de contener una enzima capaz de escindir el grupo escindible enzimáticamente, para producir un compuesto escindido, b) poner en contacto el compuesto escindido, opcionalmente después de reacciones intermedias, con un ion metálico que se puede quelar por el compuesto escindido, o el producto de cualquiera de las etapas intermedias, para producir un precipitado coloreado sustancialmente no difusible que es visible en presencia del sustrato y del ion metálico, y c) detectar la presencia del precipitado no difusible.
Description
Indicadores de la actividad enzimática.
La presente invención se refiere a sustratos
enzimáticos que se usan para detectar la actividad enzimática.
Se ha descrito una amplia variedad de sustratos
enzimáticos que muestran una utilidad para detectar la actividad
microbiana y/o enzimática (S.F. Dealler, Reviews in Medical
Microbiology, 1993, 4, 198-206). Estos sustratos
pueden ser sustancias naturales (por ejemplo esculina y sulfato de
indoxilo) o moléculas sintéticas (por ejemplo
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactopiranósido,
4-nitrofenil-\beta-D-glucurónido).
Estos sustratos contienen restos que son fluorógenos o cromógenos
(o se convierten en tales después del desarrollo con otro reactivo),
y otra porción, tal como un hidrato de carbono, un ácido orgánico
(habitualmente un éster), un ácido inorgánico (típicamente un éster
de fosfato o de sulfato) o un aminoácido, la cual se puede escindir
mediante enzimas específicas en los sistemas en investigación. La
escisión del sustrato da como resultado la liberación de la porción
fluorógena o cromógena. Esta porción escindida, ya sea por sí misma
o después del tratamiento con un agente o agentes de desarrollo,
produce fluorescencia o color, y de este modo puede demostrar la
presencia de la actividad enzimática específica. En sistemas de
ensayo diseñados adecuadamente, esta actividad se puede usar para
identificar y enumerar
microorganismos.
microorganismos.
Una de las series más ampliamente usadas de
sustratos enzimáticos fluorógenos se basa en
4-metilumbeliferona (los sustratos MU). Por
ejemplo, el
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG) ha encontrado un amplio uso en medios microbiológicos para la
detección de cepas de E. coli positivas a
\beta-glucuronidasa (GUS) (M. Manafi et
al., Microbiological Reviews, 1991, 55,
335-348). Sin embargo, a pesar de su elevada
sensibilidad, éste y otros sustratos de 4-MU sufren
varias desventajas. Una desventaja es que la intensidad de la
fluorescencia depende del pH. Otra limitación importante de estos
sustratos sobre medios microbiológicos en placas es que la
4-metilumbeliferona liberada se difunde ampliamente
en los sistemas a base de agar usados habitualmente, y esto hace
difícil identificar colonias positivas procedentes de un cultivo
mixto. Otros marcadores fluorescentes habituales incluyen
resorrufina y fluoresceína. Estos sustratos también tienen
desventajas, incluyendo su diseminación. Otro problema es la
dificultad para prepararlos en una forma adecuadamente pura, a
escala industrial. Todos los marcadores fluorógenos están limitados
por la necesidad de utilizar luz incidente de UV para detectar su
presencia.
Los sustratos cromógenos a base de p- y
o-nitrofenol (sustratos de PNP y ONP,
respectivamente) también son indicadores muy bien consolidados para
las determinaciones de las actividades enzimáticas específicas. El
nitrofenolato amarillo generado en la escisión es muy adecuado para
los medios líquidos, pero, al igual que con los sustratos de
4-MU fluorescentes, la intensidad del color depende
del pH, y la difusión en medios de agar es considerable (M. Manafi,
Int. J. Food Microbiol., 1996, 31, 45-58).
El
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido
(X-gal) es uno de los sustratos más habituales, y
se usa para demostrar \beta-galactosidasa para
varios fines, por ejemplo en estudios de clonación que implican el
gen LacZ+, y en la detección de diversas bacterias
coniformes. La escisión enzimática de este sustrato producirá
inicialmente
5-bromo-4-cloroindoxilo.
Aunque éste no es propiamente cromógeno, puede reaccionar con otra
molécula de
5-bromo-4-cloroindoxilo
liberada, a través un proceso oxidativo, para formar un colorante
de tipo indigoide azul verdoso insoluble (S. Cotson y S.J. Holt,
Proc. Roy. Soc. B, 1958, 148, 506-519). Empleado en
medios a base de agar, las cepas microbianas positivas a
X-gal aparecen como colonias azul verdosas
fácilmente visibles, con una difusión mínima del colorante en los
medios circundantes. El sustrato
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\alpha-D-galactopiranósido
X-\alpha-gal) se usa para
detectar la actividad de \alpha-galactosidasa en
estudios de expresión génica con levadura.
El cromóforo indoxílico se puede modificar para
producir sombras más rojas o de color amatista mediante la
introducción de un átomo de halógeno en la posición 6 del anillo
indólico. De este modo, los sustratos derivados de
6-cloro-3-indolilo
se pueden usar como alternativas a los sustratos de X. Además,
cuando se unen diferentes hidratos de carbono u otras moléculas
escindibles de forma enzimática a los grupos X y
6-cloro-3-indolilo
respectivamente, ha sido posible producir medios microbiológicos que
tanto demuestran como diferencian entre al menos dos
microorganismos distintos en una mezcla (J.N. Roth y W.J. Ferguson,
patente US nº 5.210.022 [1993]; D.G. Flowers y M. Sternfeld,
patente US nº 5.364.767 [1994]). Sin embargo, los diferentes tipos
de sustrato indoxílico tienen velocidades diferentes de hidrólisis
y de oxidación. Como consecuencia, los sustratos
6-cloro-3-indoxílicos
producen colonias débilmente coloreadas, y también hay más difusión
en el medio circundante, cuando se comparan con el sustrato de X
correspondiente. Otra desventaja de los sustratos indoxílicos es
que, debido a que el colorante coloreado se genera en condiciones
oxidativas, no son adecuados para la detección de microbios que
requieren para el crecimiento condiciones estrictamente
anaerobias.
Otras clases de sustrato se basan en la
capacidad de una molécula liberada con la escisión para formar un
quelato coloreado insoluble, en presencia de un ión metálico
adecuado. Uno de dichos compuestos es
8-hidroxiquinolina (8HQ). El
8HQ-\beta-D-glucósido
se ha usado para identificar la actividad de
\beta-glucosidasa (A.L. James et al,
Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol., 1987, Ser A 267,
188-193), pero se han encontrado problemas de
toxicidad (A. Albert et al, Br. J. Exp. Pathol., 1953, 34,
119-130). Otro compuesto de esta naturaleza es
esculetina
(6,7-dihidroxi-2H-1-benzopiran-2-ona)
(1).
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La esculina
(esculetin-6-\beta-D-glucopiranósido)
es una sonda ampliamente usada para la detección de la actividad de
\beta-gucosidasa en sistemas microbianos (por
ejemplo en la identificación de Listeria). Cuando se usa en
un medio sólido conjuntamente con entre otras una sal de
hierro adecuada, la esculetina liberada forma un quelato que da
lugar a colonias marrones muy visibles para cepas que son positivas
a la \beta-glucosidasa. Sin embargo, aún existe
cierta difusión en los medios. El problema de la difusión sólo se
superó (A.L. James, et al, J. Appl. Microbiol., 1997, 82,
532-536; A.L. James y L. Armstrong, documento WO
97/41138) mediante la síntesis de nuevos derivados de esculetina, en
los que el sistema bicíclico se había sustituido en las posiciones
3 y/ó 4. El ejemplo principal dado a conocer se elaboró en un
sistema tricíclico, a saber, la
3,4-ciclohexenoesculetina (CHE) (2).
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Cuando se utilizan en un medio sólido que
contiene hierro, los sustratos de CHE producen quelatos de un color
negro intenso. Sin embargo, la concentración óptima requerida para
demostrar la actividad enzimática es más de tres veces la requerida
con un sustrato de X. CHE-Gal también ha sido
descrito por James et al en App. Env. Microbiol. (1996)
62(10), 3868-3870.
Otro ejemplo en el que se puede formar un
quelato coloreado insoluble a partir de un sistema
cis-dihidroxitricíclico se ha encontrado mediante el uso de
alizarin-\beta-D-galactopiranósido
(3) (A.L. James et al., Lettr. Appl. Microbiol., 2000, 30,
336-340).
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Con la hidrólisis mediante enzimas bacterianas,
este sustrato generó colonias de color violeta brillante o de color
rojo brillante en presencia de sales de hierro y de aluminio
respectivamente. Las colonias también estaban muy localizadas sobre
placas de agar Columbia. La concentración necesaria para la
visualización fue menos de un quinto de la requerida para
CHE-gal.
Antes de que se llevase a cabo la actual
invención, se pudo utilizar un sistema
cis-dihidroxibicíclico, tal como aquel en la esculetina,
como la base para un tipo quelante de sustrato enzimático, pero los
problemas con la difusión sólo se pudieron superar mediante la
elaboración de este sistema a través la sustitución o mediante
extensión hasta un sistema tricíclico tal como el presente en CHE y
alizarina.
Antes de que se desarrollase la actual
invención, los 1,2-dihidroxibencenos simples, como
catecol y sus derivados (4), habían recibido poca atención como
sustratos enzimáticos.
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Se ha dado a conocer que los glucósidos de
catecol (4, R = H) se escinden en diversos grados por las enzimas
(B. Helferich et al., J prakt. Chem., 1933, 138,
275-280; K. Bock y S. Refn, Acta Chem. Scand., 1989,
43, 373-380). El catecol es incoloro, y por lo
tanto el progreso de la hidrólisis enzimática se ha de monitorizar
convenientemente mediante análisis espectrofotométrico, o midiendo
la cantidad de hidrato de carbono liberado. El anión de
4-nitrocatecol (4, R = NO2) es amarillo, y este
compuesto, como una sal de monosulfato (5), se ha usado como un
sustrato cromógeno de manera análoga al sustrato de
p-nitrofenilo (W.D. Bostick et al. Clin.
Chem., 1978, 24, 1305-1316; A.L. Fluharty et
al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1974, 59,
455-461). Además, la capacidad de este compuesto
para reducir ferricianuro cúprico a ferrocianuro cúprico (conocido
como marrón de Hatchett) permitió que se emplease para detectar la
actividad de arilsulfatasa por este medio (J.S. Hanker et
al., Histochemistry, 1975, 41, 207-225). Otros
compuestos fenólicos que no poseen un sistema
cis-1,2-dihidroxi también se pueden utilizar
para la producción de marrón de Harchett.
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Luukkanen, L., et al, en Bioconjugate
Chem. (1999) 10, 150-154 describen la síntesis de
una serie de O-glucurónidos de nitrocatecol
asistida mediante enzimas. Se cree que los glucósidos son
hidrolizados mediante \beta-glucuronidasa
microsómica, y posiblemente también mediante
\beta-glucuronidasa de E. coli en el
intestino. Luukkanen, et al, no describen ningún ensayo de
hidrólisis. De hecho, intentaron inhibir la hidrólisis incluyendo
un inhibidor en la enzima que contiene el medio de síntesis. Tampoco
los autores indican si los glucósidos o las agliconas son
colorea-
das.
das.
Shiozaki, M. en Tetrahedron:Asymmetry (1999) 10,
1477-1482 y Watanabe, Y., et al en
Carbohydrate Res. (2001) 335, 283-289, describen la
síntesis y propiedades de
4',8-dihidroxi-isoflavon-7-il-\alpha-D-arabinósido
(A-76202) y cuatro análogos de hexopiranósidos. Los
glucósidos están unidos a la posición 7, es decir, al anillo que
está condensado. Se afirma que los glucósidos son inhibidores de
\alpha-glucosidasa, una enzima del retículo
endoplásmico. La actividad e inhibición enzimáticas se determinaron
mediante el uso de
4-nitrofenil-\alpha-D-glucopiranósido,
un sustrato enzimático cromógeno para la enzima, en un sistema de
reacción en fase líquida.
El documento
WO-A-00486076 describe derivados de
fosfato de compuestos fenólicos, incluyendo derivados de catecol
basados en 1,2-dihidroxibenceno, usados como
profármacos. Aunque el catecol puede ser un flavonoide, no se
describen ejemplos de flavonoides.
Muchos glucósidos de flavonoides son compuestos
de origen natural, y/o se han sintetizado. Por ejemplo, el
3,3',4'-trihidroxiflavona-4'-\beta-D-glucopiranósido
y el
3',4'-hidroxiflavona-4'-\beta-D-glucopiranósido
son compuestos conocidos. Muchos de dichos compuestos se han usado
como sustratos enzimáticos de glucosidasa. Por ejemplo, en Lambert,
N., et al (1999) Biochim. Biophys. Acta 1435,
110-116, se usan glucósidos de diversos flavonoides
para investigar la actividad de una
\beta-glucosidasa citosólica procedente de hígado
de cerdo. La escisión se lleva a cabo en un medio líquido, y los
productos se identifican mediante HPLC. En Day, A.J., et al
(1998) FEBS Letters 436, 71-75 se usan otros
glucósidos de flavonoides y de isoflavonoides como sustratos para
extractos libres de células procedentes del intestino delgado y del
hígado humanos que contienen diferentes enzimas de glucosidasa. Las
reacciones se llevan a cabo en medios líquidos, y los productos se
analizan, nuevamente, mediante HPLC.
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La presente invención proporciona un método para
detectar la actividad enzimática en un medio sólido, que
incluye:
- a)
- poner en contacto un sustrato enzimático, que comprende
- i)
- una porción cromógena que comprende un resto de catecol, y
- ii)
- un grupo escindible mediante enzima, el cual está unido a través de una unión de éster o de éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol con una sustancia que se sospecha que contiene una enzima capaz de escindir el grupo escindible enzimáticamente, para producir un compuesto escindido
- b)
- poner en contacto el compuesto escindido, opcionalmente después de reacciones intermedias, con un ion metálico que se puede quelar mediante el compuesto escindido, o el producto de cualquiera de las etapas intermedias, para producir un precipitado coloreado sustancialmente no difusible que es visible en presencia del sustrato y del ion metálico; y
- c)
- detectar la presencia del precipitado no difusible.
Un resto de catecol, para la presente memoria
descriptiva, es un resto que resulta de la eliminación de uno o
ambos átomos de hidrógeno hidroxílicos de un
1,2-dihidroxibenceno o un derivado sustituido del
mismo, preferentemente sustituido con un resto derivatizante que
está unido al anillo aromático del catecol a través de un enlace.
En el sustrato, se usa uno o ambos átomos de oxígeno hidroxílicos
del resto para unirlo a un grupo escindible enzimáticamente. El
anillo aromático puede estar no sustituido, o puede estar sustituido
con uno o más restos derivatizantes, con la condición de que los
sustituyentes no formen un sistema anular condensado al anillo de
1,2-dihidroxi-
benceno.
benceno.
Un compuesto escindido es la porción cromógena
del sustrato después de que la acción enzimática haya eliminado los
grupos escindibles enzimáticamente. El quelato precipitado debe ser
visible en presencia del sustrato y del ion metálico, de forma que
su presencia se puede detectar visualmente. El sustrato y el ion
metálico pueden, juntos (por ejemplo como un quelato) o
separadamente, estar coloreados, con la condición de que el color
sea diferente al del mencionado quelato precipitado.
En los sustratos enzimáticos de la presente
invención se puede usar una amplia variedad de grupos escindibles
mediante enzimas. Los ejemplos de los tipos de enlaces formados
entre los hidroxilos catecólicos y los grupos escindibles
enzimáticamente incluyen uniones de tipo éster cuando el hidroxilo
catecólico está unido a un grupo acilo, por ejemplo derivado de un
aminoácido o de un ácido graso, y uniones de ésteres de fosfato,
sulfonato o sulfato, cuando los grupos escindibles enzimáticamente
son fosfatilo, sulfonilo o sulfatilo respectivamente. Cuando el
grupo escindible enzimáticamente es un resto de azúcar unido a
través de una unión de tipo éter, éste forma parte de la estructura
del acetal cíclico. Cuando el grupo escindible enzimáticamente es un
resto de azúcar, el azúcar puede estar unido en \alpha o \beta
al resto del catecol, y puede ser la forma L o D del azúcar excepto
que se establezca de otro modo. Generalmente, el átomo de oxígeno,
que se retiene cuando el grupo escindible enzimáticamente y el
hidroxilo catecólico están unidos, queda parte originalmente del
catecol.
En un sistema de detección enzimático tal como
se prevé por la actual invención, es posible controlar el estado de
esta reacción añadiendo el sustrato enzimático cuando se requiera, y
añadiendo después posteriormente el ion metálico quelable. Esto
puede tener ventajas en ciertas situaciones. Sin embargo, se
prefiere que el método descrito anteriormente tenga lugar con el
ion metálico quelable presente durante la etapa (a). Esto permitirá
que la porción cromógena escindible forme un quelato con el ion
metálico según se produzca, evitando de ese modo cualquier difusión
del compuesto escindido que pueda ocurrir si el compuesto escindido,
en su estado no quelado, es
difusible.
difusible.
El ion metálico quelable, mencionado en la etapa
(b) del método, puede ser cualquier ion metálico con el que se
pueda quelar el compuesto escindido. Cuando el ion metálico está
presente en el medio sólido, o durante la etapa (a) del método, el
ion metálico debería de ser el que se tolere por cualesquiera
microorganismos diana que crezcan en los medios. Se observará que
dentro de la presente invención se puede usar un amplio intervalo
de compuestos de iones metálicos quelables. Los compuestos de iones
metálicos quelables especialmente preferidos son sales de hierro,
sales de aluminio y sales de bismuto.
Los precipitados coloreados sustancialmente no
difusibles formados en la presente invención se forman mediante
quelación de un ion metálico quelable mediante el compuesto
escindido, y significan que el sitio de la actividad enzimática es
detectado mediante una coloración específica del sitio distinta. La
presencia del precipitado no difusible se usa como una indicación
directa de la presencia de la actividad enzimática a detectar.
La ventaja de que el precipitado coloreado de la
etapa (c) sea detectable por el ojo, y preferentemente usando luz
incidente visible, significa que el resultado de los ensayos se
puede determinar rápidamente a simple vista, sin la necesidad de
otro equipo tal como una lámpara de UV o un espectrofotómetro, y el
método de detección global es más simple.
Un glucósido (6) del propio catecol se produjo y
se ensayó con respecto a su capacidad para generar un quelato
insoluble en presencia de una sal de hierro y los microorganismos
productores de glucosidasa apropiados.
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Se encontró que este compuesto produjo un
quelato de color púrpura que fue aproximadamente equivalente a la
esculetina con respecto tanto a la intensidad del color como al
grado de difusión en una placa de agar. Sin embargo, la difusión es
bastante considerable, y el catecol es inferior a CHE a este
respecto. No obstante, se ha demostrado que el sistema cis-
o 1,2-dihidroxi no necesita formar parte de un
sistema bicíclico o tricíclico condensado, tal como es el caso con
la esculetina, CHE o alizarina para producir un tipo quelante útil
de sustrato enzimático. El catecol es más barato que la esculetina,
y por lo tanto, usado de esta manera, los sustratos catecólicos
como (6) podrían proporcionar alternativas más fácilmente
disponibles a la esculina o a otros sustratos a base de
esculetina.
Los sustratos enzimáticos preferidos en el
método anterior son aquéllos en los que el resto de catecol tiene
un grupo derivatizante unido al anillo aromático, preferentemente en
posición meta, o más preferentemente en posición para, con respecto
al átomo sustituido por el grupo escindible enzimáticamente. Lo más
preferido es que el grupo derivatizante comprenda al menos 4
átomos. Se prefiere particularmente que el sustituyente sea arilo,
heteroarilo, cicloheterilo o cicloalquilo. En una clase de los
sustratos enzimáticos preferidos, el resto de catecol comprende una
estructura de dihidroxiflavonoide, dihidroxiaurona o
dihidroxicalcona. Más abajo se dan algunos ejemplos de restos de
catecol a partir de los cuales se forman las porciones cromógenas
(mediante sustitución de uno de los átomos de hidrógeno hidroxílicos
por un grupo escindible). En las estructuras 8 a 13, el catecol es
un dihidroxiflavonoide; en la estructura 14, es una dihidroxiaurona;
y en la estructura 15 es una dihidroxicalcona; y en 16 es un
flavonol. La presente invención también puede emplear glucósidos
naturales de otros miembros de la serie de flavonoides, tales como
espiraeósido, en el que la porción cromógena tiene una estructura
(17) a base de quercetina.
En las estructuras, la estructura de anillo
central está indicada con los dos grupos hidroxilo en la posición
3' y 4' que son esenciales en los compuestos derivatizables. Los
nombres son los compuestos centrales sin los grupos hidroxilo en 3'
y en 4'. Un resto particularmente preferido se basa en
3',4'-dihidroxiflavona o su derivado
3'-alcoxídico inferior. La quercetina ya posee los
grupos hidroxilo en 3' y en 4', a diferencia de las otras
estructuras indicadas.
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Los sustratos enzimáticos de uso en el método de
la presente invención también se pueden describir según las
siguientes fórmulas estructurales:
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en las que R^{1} y R^{2} son H o cualquier
grupo escindible enzimáticamente, y R^{1} y R^{2} no pueden ser
ambos H.
Y, R^{3} y R^{4} son restos que no
interfieren con la escisión enzimática ni con la formación del
quelato.
Los compuestos de las fórmulas I, II, III y IV
pueden tener un grupo escindible enzimáticamente, el cual puede
estar colocado en R^{1} o en R^{2}. Como alternativa, estos
compuestos pueden tener dos grupos escindibles enzimáticamente, los
cuales están colocados en R^{1} y en R^{2}.
Los compuestos de la presente invención se
pueden derivatizar completamente, en los que Y, R^{3} y R^{4}
son restos orgánicos que contienen menos de 40 átomos,
preferentemente menos de 30 átomos, y más preferentemente menos de
20 átomos. En otra forma de realización, los compuestos de la
presente invención se pueden derivatizar sólo parcialmente, en los
que R^{4} es H. En aún otra forma de realización, los compuestos
de la presente invención pueden tener sólo un resto derivatizante,
que se une al anillo del catecol en el que R^{3} y R^{4} son H;
en dichas formas de realización se prefiere que Y contenga cuatro o
más átomos. En otra clase de compuestos, Y es acilo, por ejemplo
COPhe, en el que Phe es fenilo o -CHO.
Y puede comprender grupos arilo o heteroarilo
sustituidos o no sustituidos, que contienen 5 a 18 átomos anulares.
En algunas formas de realización, Y puede contener sólo un grupo
anular, tal como
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\newpage
Y tiene preferentemente una estructura central
de V o VI,
en las que las estructuras están
unidas al anillo de catecol según se
muestra.
"Estructura central" significa el esqueleto
de Y que puede estar sustituido adicionalmente. Los ejemplos de
sustituyentes son hidroxilo, alquilo de C_{1-24},
alquenilo de C_{2-12}, alcoxi de
C_{1-4}, acilo, incluyendo -CHO y COPhe en el que
Phe es fenilo, =O, halógeno, nitro, grupos arilo y aciloxi. Los
grupos alquilo y arilo, que son sustituyentes, pueden estar
sustituidos con grupos amino, hidroxilo, peptídicos, aciloxi, alcoxi
y arílicos. El enlace que termina con un zigzag se une al resto de
la molécula, es decir, al anillo de catecol.
Preferentemente, R^{1} es un grupo escindible
enzimáticamente. Preferentemente, Y está en una posición para con
respecto a OR^{1}, esto es, el compuesto tiene la fórmula I.
Se prefiere que Y tenga la estructura de VII u
VIII:
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en las que cada uno de
(R^{5})_{n}, (R^{6})_{n},
(R^{7})_{n} y (R^{8})_{n} puede representar
más de un sustituyente, e incluiría =O. R^{5}, R^{6}, R^{7} y
R^{8} son sustituyentes que no interfieren con la acción
enzimática ni con la quelación con el ion metálico, seleccionados
preferentemente de entre el grupo que consiste en grupos hidroxilo,
alquilo de C_{1-24}, alquenilo de
C_{2-12}, alcoxi de C_{1-4},
acilo que incluye -CHO y COPhe en el que Phe es fenilo, =O,
halógeno, nitro, arilo y aciloxi. Los grupos alquilo y arilo, que
son sustituyentes, pueden estar sustituidos por grupos amino,
hidroxilo, peptídicos, aciloxi, alcoxi y arílicos, o dos grupos
R^{6} y R^{8} sobre el mismo carbono son
=O.
Las formas de realización más preferidas de Y
están representadas por las estructuras IX y X
en las que (R^{9})_{n} y
(R^{11})_{n} representan uno o más sustituyentes, y
R^{10} y R^{12} son cada uno hidrógeno o un sustituyente,
cualquiera o todos estos sustituyentes no interfieren con la
escisión enzimática ni con la quelación con iones metálicos.
R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se seleccionan
preferentemente de entre el grupo que consiste en grupos hidroxilo,
alquilo de C_{1-24}, alquenilo de
C_{2-12}, alcoxi de C_{1-4},
acilo que incluye -CHO y COPhe en el que Phe es fenilo, =O,
halógeno, nitro, arilo y aciloxi. Los grupos alquilo y arilo, que
son sustituyentes, pueden estar sustituidos por grupos amino,
hidroxilo, peptídicos, aciloxi, alcoxi y arilo. Lo más preferible,
Y es IX, y R^{10} es hidrógeno, hidroxilo, alcoxi de
C_{1-4}, u OR^{x}, en el que R^{x} es un grupo
escindible
enzimáticamente.
En formas de realización en las que
(R^{6})_{n}, (R^{8})_{n},
(R^{9})_{n} y (R^{11})_{n} representan más de
un sustituyente, incluyendo =O, los dobles enlaces en el anillo
sustituido están transpuestos. Preferentemente, n es 0, 1 ó 2.
R^{3} y R^{4} se pueden seleccionar de entre
el grupo que consiste en grupos H, alquilo de C_{1} a C_{6},
alcoxi de C_{1} a C_{6} e hidroxialquilo de C_{1} a C_{6},
halógeno, nitro, acilo, aciloxi, aralquilo, arilo y amido. R^{3}
y R^{4} no están unidos para formar un anillo condensado.
Para que el método de la presente invención
funcione, sólo es necesario sustituir uno de R^{1} y R^{2} por
un grupo escindible enzimáticamente. De este modo, con la escisión
enzimática y la liberación del grupo escindible enzimáticamente, se
exponen los grupos hidroxilo adyacentes necesarios para la quelación
del ion metálico quelable, y se puede formar el precipitado
coloreado sustancialmente no difusible. En una forma de realización
diferente, tanto R^{1} como R^{2} pueden ser sustituidos por un
grupo escindible enzimáticamente. Estos grupos escindibles
enzimáticamente pueden ser opcionalmente idénticos o diferentes. Si
estos grupos son idénticos, entonces es necesario un tipo de
actividad enzimática para provocar la escisión y producción del
precipitado coloreado sustancialmente no difusible. Si R^{1} y
R^{2} representan grupos escindibles enzimáticamente diferentes,
entonces se requieren dos actividades enzimáticas antes de que se
forme el precipitado coloreado sustancialmente no difusible. Esto
puede dar como resultado casos en los que el microbio diana o el
extracto enzimático de interés contenga dos actividades enzimáticas,
y los microbios comensales u otros extractos enzimáticos contienen
sólo una de estas actividades
enzimáticas.
enzimáticas.
Los métodos de la presente invención descansan
en la acción enzimática para eliminar el grupo o grupos escindibles
enzimáticamente para revelar grupos hidroxi adyacentes (es decir,
cis) en el compuesto escindido.
Las moléculas no preferibles a la hora de formar
el resto de catecol de la actual invención son las que tienen un
par de grupos hidroxilo adyacentes en cualquier parte de la cadena
principal, es decir, dos hidroxilos adyacentes como R^{6},
R^{8}, R^{9} o R^{10}; la posesión de estos grupos puede dar
como resultado que se forme el quelato en ausencia de hidrólisis
enzimática, provocando de este modo el oscurecimiento de los medios
en las placas. Otras moléculas no preferibles tienen un grupo que no
es escindible enzimáticamente, tal como -CH_{3}, en cualquiera de
R^{1} o
R^{2}.
R^{2}.
Un esquema general para la síntesis de un
sustrato compuesto de un resto de azúcar y un resto de catecol
conectado a través de una unión de tipo éter implica un azúcar con
grupos hidroxilo protegidos que se mezcla junto con catecol o un
derivado del catecol y un catalizador para formar el glucósido (del
derivado) de catecol. Opcionalmente, se pueden añadir al resto de
catecol otros restos derivatizantes. El resto de azúcar se
desprotege, y el sustrato enzimático cromógeno se purifica. Un
esquema general para producir sustratos enzimáticos cromógenos que
comprenden un resto de catecol y un fosforilo unido a través de un
enlace de éster de fosfato puede implicar hacer reaccionar el
derivado de catecol y un equivalente molar de oxicloruro de fósforo
u otro agente fosforilante mezclado en un disolvente aprótico.
Después de que la reacción está terminada, el sustrato se puede
purificar.
Cuando la sustancia sospechosa de contener
actividad enzimática comprende microbios, el método de la invención
puede comprender una etapa preliminar del método que haga crecer los
microbios en un medio sólido. En dicha forma de realización, cuando
el sustrato está presente en el medio durante el crecimiento
microbiano, la presencia de la actividad enzimática se detecta
mediante colonias microbianas fuertemente coloreadas. La coloración
permanece sustancialmente en la colonia, y no se difunde hacia el
interior o a lo largo del medio sólido, habitualmente
agar.
agar.
El método de la presente invención se puede usar
con bacterias anaerobias que se hacen crecer en el medio sólido en
condiciones anaerobias. Esto puede ser útil en situaciones en las
que son necesarios estudios bacterianos del intestino, o estudios
sobre otras bacterias anaerobias tales como bacterias del suelo, por
ejemplo Clostridia. En dicha situación, puede ser preferido
que los grupos escindibles enzimáticamente sean fosfatos.
A fin de llevar a cabo fácilmente el método de
la presente invención, se prevé que el sustrato enzimático
cromógeno y el ion metálico quelable estén presentes en un medio
sólido que ayuda al crecimiento de microbios. Se entenderá que los
microbios que se pueden estudiar usando el método de la presente
invención pueden ser fúngicos, bacterianos o víricos, aunque son
muy preferentemente bacterias.
El método de la presente invención se puede
llevar a cabo con los sustratos enzimáticos del método actualmente
descrito como el único sistema de detección. El experto en la
materia también apreciará que el medio sólido puede contener uno o
más sistemas de selección o de detección adicionales. Los ejemplos
no limitativos de sistemas de selección o de detección adicionales
son antibióticos, sustratos enzimáticos, indicadores cromógenos o
fluorógenos, inductores enzimáticos, factores de crecimiento e
inhibidores del crecimiento, según sean apropiados para el
procedimiento de ensayo requerido.
El experto en la materia también apreciará que
los grupos escindibles enzimáticamente de los compuestos de este
método pueden ser cualquier grupo que sea escindible mediante la
actividad enzimática que es necesario detectar. Por lo tanto, una
lista no limitativa de posibilidades incluiría restos de fosfatos,
sulfatos, aminoácidos, azúcares, grupos de ácidos grasos,
proteínas, nucleótidos y péptidos. Las formas de realización
preferidas tienen glucosilos como los grupos escindibles
enzimáticamente.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona nuevos compuestos que comprenden
- i)
- una porción cromógena que comprende un resto de catecol, y
- ii)
- un grupo escindible enzimáticamente que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, y los grupos escindibles enzimáticamente se seleccionan de entre el grupo fucosilo, riboxilo, arabinosilo, manosilo, xilosilo, glucosilo unido mediante unión \alpha-\beta, glucuronilo unido en \beta, \alpha- o \beta-galactosilo, fosfatilo, y acilo.
Los compuestos de una clase de la invención
tienen un grupo
\beta-D-ribofuranosilo como el
grupo escindible enzimáticamente. Otras formas de realización
preferidas tienen grupos fosfatilo, \alpha- o
\beta-galactosilo, \alpha- o
\beta-glucosilo, mío-inositolfosfatilo,
octanoilo o decanoilo.
Cuando los grupos escindibles enzimáticamente
son restos de azúcar, se pueden unir a través de uniones \alpha o
\beta, y se puede usar el azúcar L o D, excepto que se establezca
de otro modo.
Los nuevos compuestos de la presente invención
se pueden producir como el hidrato o en forma de una sal
adecuada.
Generalmente se espera que los compuestos de la
presente invención, que tienen uno o más restos derivatizantes,
tendrán al menos uno de los restos derivatizantes unidos al anillo
de catecol en posición para con respecto a un grupo escindible
enzimáticamente.
En la siguiente descripción, cuando los nuevos
compuestos se basen en una estructura flavonoide, se usa el
siguiente sistema de numeración
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los nuevos compuestos forman una forma de
realización preferida cuando al menos uno de los grupos escindibles
enzimáticamente es
\beta-D-ribofuranosilo. Aún otros
compuestos preferidos se seleccionan de entre
catecol-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxicalcona-4-\beta-D-ribofuranósido,
4-nitrocatecol-1-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxiaurona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
semicarbazona de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido,
3,3',4'-trihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxi-3-metoxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido
y sus derivados. Estos compuestos se reivindican en la Solicitud
PCT de los Solicitantes, en trámite junto con la presente, que
reivindica la prioridad del documento GB 0125528.0.
Las formas de realización especialmente
preferidas de nuevos compuestos incluyen sustratos enzimáticos de
fórmula estructural I en la que R^{2}, R^{3} y R^{4} son H, e
Y tiene la fórmula estructural IX, en la que R^{10} es H, no hay
sustituyentes R^{9} (n = 0), y R^{1} se selecciona de entre la
lista que se da a continuación. Alternativamente descrito, el
sustrato enzimático comprende un resto cromógeno formado por un
resto de catecol que es 3',4'-dihidroxiflavona y un
grupo escindible enzimáticamente que está unido a través de una
unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo
hidroxilo del resto de catecol. Los grupos escindibles
enzimáticamente, o R^{1}, se seleccionan de entre
4'-\beta-D-glucuronilo,
4'-\beta-D-galactopiranosilo,
4'-\alpha-D-galactopiranosilo,
4'-decanoilo, 4'-octanoilo,
4'-inositol-1-fosfatilo,
4'-fosfatilo,
4'-\beta-D-ribofuranosilo,
4'-\alpha-L-arabinopiranosilo,
4'-butirilo, 4'-nonanoilo,
4'-palmitoilo, 4'-lignoceroilo,
4'-\alpha-L-fucopiranosilo,
4'-\beta-L-fucopiranosilo,
4'-\alpha-D-fucopiranosilo,
4'-\beta-D-fucopiranosilo,
4'-\alpha-D-manopiranosilo,
4'-\beta-D-manopiranosilo,
4'-oleoilo, 4'-sulfatilo,
4'-\alpha-D-xilopiranosilo
y
4'-\beta-D-xilopiranosilo,
y derivados de estos grupos escindibles enzimáticamente.
Un segundo grupo de formas de realización
especialmente preferidas de nuevos compuestos incluye sustratos
enzimáticos de fórmula estructural I en la que R^{2}, R^{3} y
R^{4} son H e Y tiene la fórmula estructura IX, en la que
R^{10} es -OH y no hay sustituyentes R^{9}, y R^{1} se
selecciona de entre la lista dada anteriormente y
4'-\alpha-D-glucopiranosilo
y derivados de estos grupos escindibles enzimáticamente.
Alternativamente descrito, el sustrato enzimático comprende un
resto cromógeno formado por un resto de catecol que es
3,3',4'-trihidroxiflavona y un grupo escindible
enzimáticamente que está unido a través de una unión de tipo éster o
éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto
de catecol. Los grupos escindibles enzimáticamente o R^{1} se
seleccionan de entre la lista dada anteriormente y
4'-\alpha-D-glucopiranosilo
y derivados de estos grupos escindibles enzimáticamente.
Un tercer grupo de formas de realización
especialmente preferidas de nuevos compuestos incluyen sustratos
enzimáticos de fórmula estructural en la que R^{2}, R^{3} y
R^{4} son H, R^{1} se selecciona de entre la lista dada
anteriormente, e Y tiene la fórmula estructural IX, en la que
R^{10} es un grupo alcoxi de C_{1-6} y no hay
sustituyentes R^{9}. Alternativamente descrito, el sustrato
enzimático comprende un resto cromógeno formado por un resto de
catecol, que es
3,4'-dihidroxi-3-alcoxi
de C_{1-6}-flavona. Un cuarto
grupo de formas de realización preferidas incluye sustratos
enzimáticos de fórmula estructural I en la que R^{2}, R^{3} y
R^{4} son H, e Y tiene la fórmula estructura IX, en la que
R^{10} es -OCH_{3} y hay dos sustituyentes R^{9}, -OH y
-OCH_{3} sustituidos en las posiciones 5 y 7 respectivamente.
Alternativamente descrito, el sustrato enzimático comprende un
resto cromógeno formado por un resto de catecol, que es
3,7-dimetil-quercetina. Tanto para
el tercer como para el cuarto grupo, el grupo escindible
enzimáticamente o R^{1} se puede seleccionar de entre la lista
dada para el segundo grupo de nuevos sustratos enzimáticos y
4'-\beta-D-glucopiranósido
y derivados de estos grupos escindibles enzimáticamente.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona un kit de componentes para uso en la detección de la
actividad enzimática en un medio sólido que incluye un sustrato
enzimático, que comprende
- i)
- una porción cromógena que comprende un resto de catecol, y
- ii)
- un grupo escindible enzimáticamente que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo de un resto de catecol, y
un compuesto de un ion metálico que
está quelado por la porción cromógena
escindida.
En este aspecto de la invención, el ion metálico
se selecciona, por ejemplo, de entre el grupo que consiste en
Zn^{2+}, Co^{2+}, Mn^{2+}, Cu^{2+}, Sn^{2+}, Ba^{2+},
Al^{3+}, Sr^{2+}, Bi^{2+} y Fe^{3+}. Zn^{2+} y Co^{2+}
son menos preferidos, ya que su presencia puede inhibir el
crecimiento de algunos microbios interesantes. Fe^{3+}, Al^{3+}
y Bi^{2+} son particularmente adecuados.
El sustrato enzimático del kit se puede definir
adicionalmente como se describe más arriba.
Un experto en la materia entenderá que dicho kit
de componentes tendrá un amplio intervalo de usos. Por lo tanto,
dichos kits tendrán los componentes opcionalmente ya mezclados, o en
recipientes separados. Cuando los componentes se presentan ya
mezclados, esto proporciona una facilidad de uso. Cuando los
componentes están en recipientes separados, el usuario puede
determinar las proporciones óptimas para el procedimiento de
detección que se lleve a cabo.
Cuando la sustancia sospechosa de contener
actividad enzimática comprende microbios que se han de hacer crecer
sobre un medio sólido, se usará un medio sólido que apoye el
crecimiento de microbios que comprende los componentes del kit
enumerados anteriormente. En una forma de realización
correspondiente de los kits descritos anteriormente, el kit
comprende los constituyentes del medio sólido que apoya el
crecimiento de microbios, y comprende los componentes de los kits
descritos anteriormente. Dicho kit puede tener sus constituyentes en
una forma no hidratada, que opcionalmente ya están mezclados o
están en recipientes separados.
La presente invención se ilustrará ahora
adicionalmente por medio de ejemplos.
\newpage
Ejemplo
1
Un matraz de fondo redondo de 50 ml, provisto de
un tapón y un agitador magnético, se cargó con tamices moleculares
3 \ring{A} (3,7 g), 3',4'-dihidroxiflavona (DHF)
(750 mg), diclorometano (20 ml), y después esta mezcla se agitó
durante 5 minutos. Posteriormente se añadió pentaacetato de
\beta-D-glucosa (1,0 g), y la
mezcla se agitó durante otros 10 minutos antes de la adición, en
una porción, de trifluoruro de boro-eterato de
dietilo (3,0 ml). Después de agitar durante una hora, la mezcla de
reacción se filtró, y el filtrado se transfirió a un embudo de
separación en el que se lavó cinco veces con un volumen igual de
disolución de bicarbonato sódico saturada. Después de la
separación, la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio
durante 16 horas antes de eliminar el agente secante y antes de la
evaporación para dar el tetraacetato de glucósido como una espuma
de color ámbar (480 mg). El tetraacetato de glucósido (100 mg) se
suspendió en metanol (0,2 ml), y se añadió en un lote una
disolución que contiene sodio (10 mg) en metanol (0,1 ml). Al
agitar, se formó un precipitado amarillo. Al dejar reposar a
temperatura ambiente durante 16 horas, se añadió éter dietílico (3
ml) a la mezcla, y el sólido se recogió por filtración. Después de
lavar con éter dietílico (4 ml) en cuatro porciones, el sólido se
transfirió inmediatamente a un secador y se secó a vacío sobre
pentóxido de fósforo durante 2 horas. El producto tomó la forma de
un polvo amarillo brillante
(30 mg).
(30 mg).
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El derivado glucosídico de DHF se ensayó con 194
cepas distintas de bacterias. La elección de las bacterias incluyó
un amplio intervalo, muchas de las cuales son patógenos importantes
y comensales aislados habitualmente de muestras patológicas.
El sustrato se añadió a agar Columbia, a una
concentración de sustrato de 300 mg/l. Se incluyó citrato férrico
amónico a 500 mg/l. Todos los ingredientes se sometieron a un
autoclave a 116ºC durante 20 minutos, para asegurar la
esterilización. Después, las placas de agar se prepararon en
cápsulas de Petri de 90 mm. Los sustratos provocaron una coloración
amarilla del agar.
Para cada cepa ensayada, se preparó una
suspensión bacteriana en agua desionizada estéril, a un inóculo de
aproximadamente 1,5 x 10^{8} unidades formadoras de colonias por
ml. Esto se logró usando un densitómetro. Después se inoculó 1
\mul de cada suspensión bacteriana en cada placa, usando un
inoculador de múltiples puntos. Las cepas se inocularon en paralelo
sobre agar Columbia que contiene citrato férrico amónico sin
sustrato (control nega-
tivo).
tivo).
Después de 18 horas de incubación, las cepas se
examinaron visualmente para determinar la presencia de color.
Cualquier cepa que produzca una coloración negra en las placas de
los medios que contienen el sustrato, pero no en las placas del
control negativo, se considera que hidroliza el sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
De las 120 bacterias
Gram-negativas ensayadas, el 20% hidrolizó
DHF-glucósido. Las cepas que fueron "positivas"
produjeron generalmente una coloración marrón/negra que no mostró
difusión en agar. Generalmente se espera que las cepas positivas
sean positivas basándose en hallazgos previos usando sustratos
indoxílicos. Hubo 11 cepas, que se sabe que son productoras de
\beta-glucosidasa, que no parecieron hidrolizar
DHF-glucósido. Se ha demostrado previamente que
estas cepas son reactivas con sustratos análogos, tales como
X-glucósido y CHE-glucósido. Si se
usa DHF-glucósido para detectar específicamente
bacterias Gram-negativas que producen glucosidasa,
entonces esto sería una debilidad obvia en su comportamiento. Los
resultados se muestran en la Tabla 1 más
abajo.
abajo.
En microbiología de diagnóstico, los glucósidos
cromógenos se emplean generalmente para detectar bacterias
Gram-positivas, y habitualmente se emplean, por
ejemplo, para la detección de enterococos y de listeria. De las 74
bacterias Gram-positivas ensayadas, 22,5%
hidrolizaron DHF-glucósido. Las bacterias
Gram-positivas ensayadas en la presente memoria,
que se sabe que son productoras de glucosidasa, mostraron todas una
excelente actividad con DHF-glucosidasa. Las cepas
de listeria y enterococos produjeron colonias de un color negro
intenso, sin difusión del quelato negro. El
DHF-glucósido muestra un excelente potencial para la
detección de estas cepas, y a este respecto tiene una comparación
favorable con CHE-glucósido. Los resultados se
muestran en la Tabla 2 más
abajo.
abajo.
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Ejemplo
2
Un matraz de fondo redondo de 50 ml, equipado
con un tapón y un agitador magnético, se cargó con
3',4'-dihidroxiflavona (Lancaster Synthesis Ltd.,
Lancashire, UK) (500 mg), tetraacetato de
\beta-D-ribofuranosa (640 mg),
tamices moleculares 3 \ring{A} (5,2 g) y diclorometano (20 ml).
La mezcla se agitó durante 15 minutos, y después se añadió en una
porción el catalizador de trifluoruro de
boro-eterato de dietilo (20 ml). La agitación se
continuó durante otros 20 minutos, y después la mezcla de reacción
se vertió en una disolución de bicarbonato sódico saturado (150
ml). La capa orgánica se diluyó mediante adición de más
diclorometano (30 ml), y después se separó de la capa acuosa
amarilla en un embudo de separación. La capa orgánica se lavó
entonces once veces con un volumen igual de disolución de
bicarbonato sódico saturada, y después se secó durante una hora
sobre sulfato de magnesio. Después de eliminar el agente secante,
la evaporación del diclorometano produjo el triacetato de glucósido
como una goma oscura (390 mg). A esta goma (315 mg) se añadió una
disolución de metóxido sódico que se había obtenido disolviendo
sodio (50 mg) en metanol (5 ml). Después de agitar durante unos
pocos minutos, la goma se disolvió y la disolución se dejó a
temperatura ambiente durante 16 horas. La disolución se concentró
entonces hasta un volumen de aproximadamente 2 ml mediante
evaporación, después de lo cual la adición de éter dietílico (10
ml) provocó que precipitase el producto. Éste se recogió mediante
filtración a vacío, y, después de lavar con éter dietílico (20 ml)
en cuatro porciones, se transfirió inmediatamente a un secador y se
secó sobre pentóxido de fósforo a vacío durante 2 horas. El
producto obtenido fue un polvo amarillo (201 mg).
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Se usó el mismo método que en el Ejemplo 1.
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De 120 bacterias Gram-negativas
ensayadas, 68,3% hidrolizaron DHS-ribósido. Las que
fueron positivas produjeron un quelato negro claramente visible,
que permaneció restringido a las colonias bacterianas sin difusión
en el agar circundante. La detección de la actividad capaz de
escindir el grupo
\beta-D-ribofuranosilo (denominado
en la presente memoria \beta-ribofuranosidasa)
permitió hacer distinciones entre géneros o especies estrechamente
relacionados. La mayoría de las Enterobacteriáceas ensayadas
fueron muy positivas para la actividad de
\beta-ribofuranosidasa. Una excepción fue
Yersinia enterocolitica, un patógeno que es una causa de
enteritis. Este sustrato podría tener un papel útil para la
diferenciación de esta especie de bacterias estrechamente
relacionadas. También fue notable el hecho de que el género Shigella
fue uniformemente positivo para la actividad de ribofuranosidasa.
Ninguna de las glucosidasas buscadas habitualmente en microbiología
de diagnóstico se producen uniformemente por la especie de
Shigella, y esto es un factor limitativo a la hora de diseñar
métodos para su detección. Esto puede permitir la distinción entre
Shigella y especies estrechamente relacionadas, tales como
Proteus.
Un punto de interés adicional entre las
actividades de las bacterias Gram-negativas se
refiere a las Vibrionáceas. Los medios de cultivo para la
detección de la especie Vibrio no permiten la diferenciación
de la especie Aeromonas, que se encuentra habitualmente en
el medioambiente y está muy relacionada con Vibrio. La
mayoría de las especies de Vibrio ensayadas en la presente memoria,
incluyendo los dos patógenos principales V. cholerae y V.
parahaemolyticus, no expresan
\beta-ribofuranosidasa. Esto contrasta con las
especies de Aeromonas, que son muy activas. Esto puede
permitir un medio simple para diferenciar entre estas dos especies
estrechamente relacionadas. En la Tabla 1 se muestra los resultados
de estos ensayos.
Entre las bacterias
Gram-positivas ensayadas, sólo 30,8% fueron activas
con este sustrato. Todos los estafilococos fueron positivos, pero
no hubo ninguna diferenciación entre las diferentes especies de
estafilococos ensayadas. Los estreptococos fueron casi
universalmente negativos, mientras que los enterococos
("estreptococos fecales") tuvieron una actividad variable. El
punto de interés principal fue que Corynebacterium
diphtheriae y Arcanobacterium haemolyticum fueron
activas con este sustrato. Estas dos especies se encuentran en la
garganta de seres humanos infectados, y por lo tanto se realizan
cultivos de garganta para aislar e identificar estos patógenos. La
flora comensal aerobia de la garganta está dominada por
estreptococos, y el DHF-ribósido puede proporcionar
un medio para diferenciar estos dos patógenos de la flora comensal
normal de la garganta. En la Tabla 2 se muestran los resultados de
estos
ensayos.
ensayos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
3
Se disolvió hidróxido de sodio (0,08 g) en agua
desionizada (2,33 g), y la disolución resultante se enfrió hasta
4ºC en un frigorífico. Mientras tanto, se añadieron
3',4'-dihidroxiflavona (0,5 g), acetobromogalactosa
(0,918 g) y acetona (5,57 ml) a un matraz de fondo redondo de 25 ml
equipado con un agitador magnético, y se agitaron durante 5
minutos. La disolución enfriada de hidróxido sódico se añadió a la
suspensión de 3',4'-dihidroxiflavona, y la mezcla
cambió de una suspensión amarillo/marrón a una disolución rojo
intensa/marrón. Después de agitar a temperatura ambiente durante
5-10 minutos, la mezcla de reacción se había
convertido en una suspensión naranja/marrón. La agitación se
continuó toda la noche a temperatura ambiente. La
3',4'-dihidroxiflavona precipitada se separó por
filtración, lavando con acetona (5-10 ml), y el
filtrado se evaporó usando un evaporador giratorio para formar dos
fases distintas. La capa superior (acuosa) se desechó, y la capa
inferior se trituró con diclorometano (2 ml), precipitando de ese
modo 3',4'-dihidroxiflavona sin reaccionar. Después
de separar el precipitado por filtración, la disolución de
diclorometano se lavó con una disolución saturada de bicarbonato
sódico (3 x 10 ml), y después con agua desionizada (5 ml). La capa
de diclorometano se separó de la capa de agua, se secó (sulfato de
magnesio) y se evaporó hasta sequedad para dar 311 mg del acetato
del producto. Se añadió metanol al acetato (310 mg), y todo se
disolvió. La disolución se basificó mediante adición de una
disolución de metóxido sódico saturada en metanol. A pH 9, se formó
un precipitado espeso, y la mezcla se basificó adicionalmente hasta
pH 10-11, y después se dejó toda la noche. El
producto se separó por filtración, lavando con acetona
(aproximadamente 10 ml). Rendimiento 80 mg (sólido rojo/
marrón).
marrón).
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Ejemplo
4
Se suspendió
3',4'-dihidroxiflavona (127 mg) en acetonitrilo (15
ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml con una entrada de
nitrógeno y un brazo lateral. Después de inundar con nitrógeno
durante 10 minutos, la suspensión se enfrió hasta -10ºC, y se
añadieron tetracloruro de carbono (0,26 ml), diisopropiletilamina
(0,2 ml) y dimetilaminopiridina (6 mg) a través del brazo lateral.
Después de agitar durante 1 minuto, se añadió fosfito de dibencilo
(290 mg) gota a gota. Después de 1 h, se añadió una mezcla
compuesta de una disolución de dihidrogenofosfato potásico (0,5
moles) en agua (3 ml) y acetonitrilo (20 ml), y la disolución se
extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml). Después de secar sobre
sulfato de magnesio, la disolución se filtró, y el filtrado se
concentró a vacío. El aceite naranja así obtenido se
disolvió en metanol (15 ml), y se añadió catalizador de paladio al
10% sobre carbón (25 mg). Después de inundar con nitrógeno, los
grupos bencílicos se eliminaron haciendo pasar hidrógeno a través
de la disolución durante 1 h a presión atmosférica. Después, la
disolución se filtró, y el metanol se eliminó por evaporación. El
residuo se repartió entonces entre cloroformo (50 ml) y agua (50
ml). Después de la separación de la capa orgánica, la capa acuosa
se lavó con porciones adicionales de cloroformo (2 x 50 ml) antes
de evaporarla hasta sequedad. La trituración con la mínima cantidad
de éter dietílico dio el producto como un sólido (87 mg).
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Ejemplo
5
Un matraz de fondo redondo de 500 ml, equipado
con un agitador magnético, se cargó con catecol (33 g), tamices
moleculares 3 \ring{A} (20 g), y con diclorometano (200 ml). La
disolución que se formó se agitó durante 10 minutos, y después se
añadió en una porción trifluoruro de boro-eterato de
dietilo (10 ml). Después de 1 hora, la mezcla de reacción se
filtró, después se lavó secuencialmente en un embudo de separación
con volúmenes iguales de bicarbonato sódico saturado (cinco veces)
y agua desionizada (dos veces), y después se secó sobre sulfato de
magnesio. La eliminación del agente secante y la evaporación dieron
un aceite amarillo pálido que solidificó lentamente. El sólido se
disolvió en alcoholes metilados industriales (IMS) calientes (50
ml), y después se almacenó a 4ºC durante 16 horas para permitir la
total cristalización. El sólido blanco se recogió mediante
filtración a vacío, y se lavó con IMS (20 ml) en dos porciones.
Después de secar al aire durante un día, el rendimiento del
ribósido protegido fue 17,1 g. El ribósido protegido (15 g) se
suspendió en metanol (150 ml), y se le añadió una disolución
formada por sodio (2 g) en metanol (50 ml). Inicialmente, el sólido
se disolvió, pero esto se vio sustituido pronto por un precipitado
abundante. La mezcla de reacción se dejó aparte durante 16 horas.
El sólido se recogió entonces mediante filtración a vacío, y se lavó
con metanol (5 ml). El sólido higroscópico se transfirió entonces
inmediatamente a un secador y se secó a vacío sobre pentóxido de
fósforo durante 6 horas. El rendimiento de polvo blanco fue 4,3
g.
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Ejemplo
6
A un matraz de fondo redondo de 3 l provisto con
un agitador magnético se añadieron
3,4-dihidroxibenzaldehído (50 g), tetraacetato de
\beta-D-ribosa (47 g), tamices
moleculares 3 A (350 g) y diclorometano (1,4 l). Después de agitar
esta mezcla durante 5 minutos, se añadió trifluoruro de
boro-eterato de dietilo (75 ml) en un lote, y la
agitación se continuó entonces durante otros 20 minutos, después de
lo cual los tamices moleculares se eliminaron mediante filtración.
El filtrado se lavó cuatro veces con un volumen igual de bicarbonato
sódico saturado, se secó sobre sulfato de magnesio durante 1 hora,
y después se evaporó hasta sequedad. El sólido amarillo pálido
residual se disolvió en IMS caliente (70 ml), y se almacenó a 4ºC
durante 6 horas. El producto se recogió por filtración. El secado
sobre pentóxido de fósforo a vacío produjo 12,4 g de un sólido
blanquecino.
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Ejemplo
7
A una mezcla de triacetato de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(5,0 g) producido como en el Ejemplo 6, en metanol, se añadió una
disolución de sodio (0,5 g) en metanol. El triacetato se disolvió y
se sustituyó por un precipitado denso. Después de 5 horas, éste se
separó por filtración a vacío y se lavó en el filtro con metanol (5
ml) y éter dietílico (10 ml). El secado durante 4 horas a vacío
sobre pentóxido de fósforo dio el producto como un sólido de color
crema pálido (3,1 g).
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Ejemplo
8
A una disolución de la sal sódica de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(0,5 g) producida como en el Ejemplo 7, en agua desionizada (5 ml),
se añadió una disolución de hidrocloruro de semicarbazida (1 g) y
acetato de potasio (1,5 g) en agua (5 ml). La mezcla se calentó en
un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, y después se dejó
enfriar. Después de concentrar la disolución hasta la mitad de su
volumen original mediante evaporación, el producto cristalizó. Se
recogió mediante filtración a vacío, y, después de lavar con agua
(2 ml), se secó en un secador a vacío sobre pentóxido de
fósforo. El producto fue un sólido blanco (300 mg).
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Ejemplo
9
A una disolución de la sal sódica de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(0,25 g) producida como en el Ejemplo 7, en IMS, se añadió
hidróxido sódico (0,1 g) en agua desionizada (3 ml) y acetofenona
(0,1 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 9 días,
después de lo cual la reacción se evaporó hasta sequedad. El
producto se obtuvo como un sólido rojo.
Ejemplo
10
A una mezcla de triacetato de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(0,4 g) producido como en el Ejemplo 6 y
3-cumaranona (0,17 g), en IMS (20 ml), se añadió una
disolución de IMS saturado con cloruro de hidrógeno gaseoso (0,05
ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, y
después se evaporó hasta sequedad. El sólido resultante se disolvió
en metanol (2 ml), y se añadió una disolución de sodio (50 mg) en
metanol (0,5 ml), dando una disolución de color rojo sangre. Esta
disolución se evaporó hasta sequedad y se repartió entre agua
desionizada (25 ml) y diclorometano (50 ml). La capa acuosa se
extrajo con dos lavados adicionales de diclorometano (50 ml) antes
de evaporarla hasta sequedad. El producto se obtuvo como un sólido
rojo.
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Ejemplo
11
Se suspendió
3',4'-dihidroxi-3-metoxiflavona
(F.A.A. van Acker et al., J. Med. Chem., 43,
3752-3760, (2000)), (143 mg) en acetonitrilo (15
ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml con una entrada de
nitrógeno y un brazo lateral. Después de inundar con nitrógeno
durante 10 minutos, la suspensión se enfrió hasta -10 grados C, y
se añadieron tetracloruro de carbono (0,26 ml), diisopropiletilamina
(0,2 ml) y dimetilaminopiridina (6 mg), a través del brazo lateral.
Después de agitar durante 1 minuto, se añadió fosfito de dibencilo
(152 mg) gota a gota. Después de 1 h, se añadió una mezcla
compuesta de una disolución de dihidrogenofosfato potásico (0,5
moles) en agua (3 ml) y acetonitrilo (20 ml), y la disolución se
extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml). Después de secar sobre
sulfato de magnesio, la disolución se filtró, y el filtrado se
concentró a vacío. El aceite naranja así obtenido se
disolvió en metanol (20 ml), y se añadió catalizador de paladio al
10% sobre carbón (30 mg). Después de inundar con nitrógeno, los
grupos bencílicos se eliminaron haciendo pasar hidrógeno a través
de la disolución durante 1 h a presión atmosférica. La disolución se
filtró entonces, y el metanol se eliminó por evaporación. El
residuo se repartió entonces entre cloroformo (50 ml) y agua (50
ml). Después de la separación de la capa orgánica, la capa acuosa
se lavó con porciones adicionales de cloroformo (2 x 50 ml) antes
de evaporarla hasta sequedad. La trituración con la cantidad mínima
de acetona dio el producto como un sólido (90 mg).
Cuando se evaluó, se usó el mismo método que en
el Ejemplo 1, y se incubó de forma anaerobia C. perfringens,
el color de fondo del agar fue verde oliva, y los organismos que
mostraban actividad enzimática produjeron colonias de un color
verde oscuro. No hubo difusión del color desde las colonias. Todas
las especies ensayadas crecieron bien en este medio. Los resultados
se muestran en la tabla 3 más abajo.
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Ejemplo
12
El compuesto mostrado en el título se sintetizó
a partir de
3',4'-dihidroxi-3-metoxiflavona
(como se usó en el Ejemplo 11) mediante un método análogo al
Ejemplo 3. El compuesto se evaluó mediante el método descrito en el
Ejemplo 1 con K. pneumoniae, en presencia de un intervalo de
diferentes sales metálicas. Las sales metálicas se incluyeron todas
en el medio a una concentración de 500 mg/l. El medio incluyó además
isopropil-D-tiogalactopiranósido
(IPTG), a una concentración de 30 mg/l. La Tabla 4 indica el color
de las colonias formadas.
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Ejemplo
13
El compuesto del título, sintetizado como se
describe en el Ejemplo 3, se evaluó mediante el método descrito en
el Ejemplo 1, en presencia de un intervalo de sales metálicas, con
un inóculo de K. pneumoniae. Las sales metálicas se usaron a
una concentración (como sal) de 500 mg/l, y el medio también
contenía 30 mg/l de IPTG. Los cultivos formaron colonias coloreadas
según se indica en la tabla 5.
Ejemplo
14
El sustrato mostrado en el encabezamiento se
sintetizó a partir del mismo material de partida de flacona como en
el Ejemplo 11, mediante un método análogo al del Ejemplo 2. El
sustrato se evaluó mediante el mismo método como se describe en el
Ejemplo 1, en presencia de sales metálicas. La especie ensayada fue
E. coli. Los precipitados tuvieron un color casi idéntico a
los productos correspondientes citados en la Tabla 4. Cuando se usó
el medio que contiene una sal de aluminio con un cultivo mixto de
E. coli y Yersinia enterocolitica, las colonias de
E. coli tuvieron un color amarillo brillante, y destacaban
muy claramente. No hubo sustancialmente ninguna difusión en las
colonias de Y. enterocolitica (negativas para este
\hbox{sustrato, y de este modo incoloras), incluso cuando las
colonias fueron casi coincidentes.}
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Ejemplo
15
El compuesto del título se sintetizó a partir de
3,4-dihidroxi-2-metoxibenzofenona
y acetobromoglucosa, mediante un método análogo al Ejemplo 3. Se
obtuvo como un polvo de color amarillo pálido. La
3,4-dihidroxi-2-metoxibenzofenona
se obtuvo de la siguiente manera. A una disolución de tetraborato
de sodio (16 g) en agua (200 ml) se añadió
2,3,4-trihidroxibenzofenona (4,6 g). A la suspensión
agitada se añadió una disolución de hidróxido potásico (4,5 g) en
agua (20 ml), para dar una disolución a aproximadamente pH 13. Se
añadió sulfato de dimetilo (10 ml) gota a gota durante 2 horas,
mientras se mantenía el pH a 12-13 con más
disolución de hidróxido potásico según fuese necesario. Después de
dejar durante un día a 5ºC, la disolución se acidificó hasta pH 3
mediante adición de ácido clorhídrico 4 M, para producir un
precipitado amarillo. Este sólido se recogió mediante filtración
por succión, se lavó con agua y se secó. La recristalización en
etanol hirviendo dio
3,4-dihidroxi-2-metoxibenzofenona
como cristales amarillos finos.
El compuesto se evaluó en un conjunto de
bacterias Gram-negativas seleccionadas, usando el
método descrito en el Ejemplo 1, en presencia de nitrato férrico
amónico a 500 mg/l. Los resultados se muestran en la tabla 6. El
agar de fondo fue beige. Las colonias que estaban coloreadas
mostraron poca difusión. Cuando se ensayaron con organismos
Gram-positivos, el compuesto pareció inhibir el
crecimiento.
Ejemplo
16
Se produjeron dos medios de crecimiento, uno de
los cuales (B) contenía una mezcla de sustratos, siendo uno según
la presente invención, y el otro de los cuales (A) contenía una
mezcla comparativa de sustratos. Los medios se evaluaron usando
seis cepas bacterianas. Los resultados se muestran en la Tabla 7. La
síntesis de
X-\beta-D-ribofuranósido
se describe en el documento
WO-A-03035896.
\vskip1.000000\baselineskip
| Agar Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-ribofuranósido | 80 mg |
| (también conocido como X-\beta-D-ribofuranósido) | |
| 6-Cloro-3-indolil-\beta-D-glucopiranósido | 200 mg |
| (glucósido rosa) |
\vskip1.000000\baselineskip
| Agar Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 3'4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido | 300 mg |
| 6-Cloro-3-indolil-\beta-D-glucopiranósido | 200 mg |
| Citrato férrico amónico | 500 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo de referencia que usa el medio A
muestra que el glucósido rosado (también usado en el medio de la
invención, medio B) es hidrolizado por algunas de las especies de
bacterias, y que algunas de las especies son positivas para
\beta-D-ribofuranosidasa. El medio
B muestra que el producto de la escisión del compuesto de la
presente invención, en presencia de hierro, enmascara el producto de
la escisión formando un precipitado negro. Esta habilidad para
enmascarar puede ser de utilidad para algunas aplicaciones.
Claims (36)
1. Método para detectar la actividad enzimática
en un medio sólido que incluye:
- a)
- poner en contacto un sustrato enzimático, que comprende
- i)
- una porción cromógena que comprende un resto de catecol que es un resto que resulta de la eliminación de uno o ambos átomos de hidrógeno hidroxílicos de un 1,2-dihidroxibenceno o un derivado sustituido del mismo en el que los sustituyentes no forman un sistema anular condensado con el anillo de 1,2-dihidroxibenceno, y
- ii)
- un grupo escindible enzimáticamente, que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, teniendo el sustrato enzimático una de las siguientes fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que R^{1} y R^{2} son H o un grupo
escindible enzimáticamente seleccionado de entre glucosilos y
restos de fosfato, sulfato, aminoácidos, péptidos, proteínas,
azúcares, ácidos grasos y nucleótidos, y
R^{1} y R^{2} no pueden ser ambos H,
R^{3} y R^{4} se seleccionan de entre el
grupo que consiste en grupos H, alquilo de C_{1} a C_{6},
alcoxi de C_{1} a C_{6} e hidroxialquilo de C_{1} a C_{6},
halógeno, nitro, acilo, aciloxi, aralquilo, arilo y amido, y no
están unidos para formar un anillo condensado; e
Y es un resto orgánico que contiene menos de 40
átomos, que no interfiere con la escisión enzimática, y que
comprende grupos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos
que contienen 5 a 18 átomos anulares,
con una sustancia sospechosa de contener una
enzima capaz de escindir el grupo escindible enzimáticamente, para
producir un compuesto escindido,
- b)
- poner en contacto el compuesto escindido, opcionalmente después de reacciones intermedias, con un ion metálico que se puede quelar por el compuesto escindido, o el producto de cualquiera de las etapas intermedias, para producir un precipitado coloreado sustancialmente no difusible que es visible en presencia del sustrato y del ion metálico, y
- c)
- detectar la presencia del precipitado no difusible.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la presencia del precipitado no difusible es una indicación directa
de la presencia de la actividad enzimática a detectar.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
el ion metálico quelable está presente durante la etapa a).
4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en
el que el compuesto de ion metálico quelable de la etapa b) es una
sal de hierro, una sal de aluminio o una sal de bismuto.
5. Método según las reivindicaciones 1 a 4, en
el que el precipitado coloreado de la etapa c) es detectable por el
ojo.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
la detección se realiza usando luz incidente visible.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
el catecol tiene un grupo derivatizante unido en posición para con
respecto al hidroxilo catecólico sustituido con el grupo escindible
enzimáticamente.
\newpage
8. Método según la reivindicación 1, en el que
la porción cromógena comprende una estructura de
dihidroxibenzaldehído, dihidroxiflavonoide, dihidroxiaurona,
dihidroxicalcona o dihidroxibenzofenona.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
R^{4} es H.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
R^{4} y R^{3} son H.
11. Método según la reivindicación 1, en el que
Y es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y sus derivados
sustituidos.
12. Método según la reivindicación 1, en el que
Y es un grupo arilo.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
Y tiene la estructura IX o X
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\vskip1.000000\baselineskip
en la que (R^{9})_{n} y
(R^{11})_{n} representan uno o más sustituyentes, y
R^{10} y R^{12} son sustituyentes, todos los cuales no
interfieren con la acción enzimática ni con la quelación del ion
metálico.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
R^{9} y R^{11} se seleccionan de entre el grupo que consiste en
grupos hidroxilo, alquilo de C_{1-24}, alquenilo
de C_{2-12}, alcoxi de C_{1-4},
acilo que incluye -CHO y COPhe en el que Phe es fenilo, =O,
halógeno, nitro, arilo y aciloxi, y R^{10} y R^{12} se
seleccionan de entre el grupo que consiste en grupos hidrógeno,
hidroxilo, alquilo de C_{1-24}, alquenilo de
C_{2-12}, alcoxi de C_{1-4},
acilo que incluye -CHO y COPhe en el que Phe es fenilo, =O,
halógeno, nitro, arilo y aciloxi.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
Y es IX, y R^{10} es hidrógeno, hidroxilo, alcoxi de
C_{1-4} o OR^{x}, en el que R^{x} es un grupo
escindible enzimáticamente.
16. Método según la reivindicación 1, en el que
R^{3} y R^{4} se seleccionan de entre los grupos H, alquilo de
C_{1-6}, alcoxi de C_{1-6} o
hidroxialquilo de C_{1-6}, halógeno, nitro,
aldehído, arilo y amido.
17. Método según la reivindicación 1, en el que
R^{1} es un grupo escindible enzimáticamente, y R^{2} es H.
18. Método según la reivindicación 1, en el que
tanto R^{1} como R^{2} son grupos escindibles enzimáticamente,
los cuales pueden ser opcionalmente idénticos o diferentes.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia sospechosa de
contener actividad enzimática comprende microbios, y una etapa
preliminar del método implica hacer crecer los microbios en un
medio sólido.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
los microbios son anaerobios.
21. Método según la reivindicación 20, en el que
los grupos escindibles enzimáticamente son fosfatos.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en el que los microbios son bacterias.
23. Método según la reivindicación 22, en el que
los microbios son bacterias del suelo.
24. Método según la reivindicación 23, en el que
las bacterias son Clostridia.
25. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato enzimático
cromógeno y el ion metálico están presentes en un medio sólido que
ayuda al crecimiento de los microbios.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
el medio sólido ayuda al crecimiento bacteriano.
27. Método según la reivindicación 26, en el que
el medio sólido contiene uno o más sistemas de selección o de
detección adicionales.
28. Sustrato enzimático cromógeno, que
comprende
- i)
- una porción cromógena formada por un resto de catecol que es 3',4'-dihidroxiflavona, y
- ii)
- un grupo escindible enzimáticamente que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, en el que el grupo escindible enzimáticamente se selecciona de entre 4'-\beta-D-glucuronilo, 4'-\beta-D-galactopiranosilo, 4'-\alpha-D-galactopiranosilo, 4'-decanoilo, 4'-octanoilo, 4'-inositol-l-fosfatilo, 4'-fosfatilo, 4'-\beta-D-ribofuranosilo, 4'-\alpha-L-arabinopiranosilo, 4'-butirilo, 4'-nonanoilo, 4'-palmitoilo, 4'-lignoceroilo, 4'-\alpha-L-fucopiranosilo, 4'-\beta-L-fucopiranosilo, 4'-\alpha-D-fucopiranosilo, 4'-\beta-D-fucopiranosilo, 4'-\alpha-D-manopiranosilo, 4'-\beta-D-manopiranosilo, 4'-oleoilo, 4'-sulfatilo, 4'-\alpha-D-xilopiranosilo y 4'-\beta-D-xilopiranosilo, y derivados de los mismos.
29. Sustrato enzimático cromógeno, que
comprende
- i)
- una porción cromógena formada por un resto de catecol que es 3,3',4'-trihidroxiflavona, y
- ii)
- un grupo escindible enzimáticamente que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, en el que el grupo escindible enzimáticamente se selecciona de entre 4'-\beta-D-glucuronilo, 4'-\beta-D-galactopiranosilo, 4'-\alpha-D-galactopiranosilo, 4'-decanoilo, 4'-octanoilo, 4'-inositol-l-fosfatilo, 4'-fosfatilo, 4'-\beta-D-ribofuranosilo, 4'-\alpha-L-arabinopiranosilo, 4'-butirilo, 4'-nonanoilo, 4'-palmitoilo, 4'-lignoceroilo, 4'-\alpha-L-fucopiranosilo, 4'-\beta-L-fucopiranosilo, 4'-\alpha-D-fucopiranosilo, 4'-\beta-D-fucopiranosilo, 4'-\alpha-D-manopiranosilo, 4'-\beta-D-manopiranosilo, 4'-oleoilo, 4'-sulfatilo, 4'-\alpha-D-xilopiranosilo, 4'-\beta-D-xilopiranosilo, 4'-\alpha-glucopiranosilo, y derivados de los mismos.
30. Sustrato enzimático cromógeno, que
comprende
- i)
- una porción cromógena formada por un resto de catecol que se forma a partir de 3',4'-dihidroxi-3-alcoxi de C_{1-6}-flavona, o 3,7-dimetilquercetina, y
- ii)
- un grupo escindible enzimáticamente que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, en el que el grupo escindible enzimáticamente se selecciona de entre 4'-\beta-D-glucuronilo, 4'-\beta-D-galactopiranosilo, 4'-\alpha-D-galactopiranosilo, 4'-decanoilo, 4'-octanoilo, 4'-inositol-l-fosfatilo, 4'-fosfatilo, 4'-\beta-D-ribofuranosilo, 4'-\alpha-L-arabinopiranosilo, 4'-butirilo, 4'-nonanoilo, 4'-palmitoilo, 4'-lignoceroilo, 4'-\alpha-L-fucopiranosilo, 4'-\beta-L-fucopiranosilo, 4'-\alpha-D-fucopiranosilo, 4'-\beta-D-fucopiranosilo, 4'-\alpha-D-manopiranosilo, 4'-\beta-D-manopiranosilo, 4'-oleoilo, 4'-sulfatilo, 4'-\alpha-D-xilopiranosilo, 4'-\beta-D-xilopiranosilo, 4'-\alpha-D-glucopiranosilo, y 4'-\beta-D-glucopiranosilo, y derivados de los mismos.
31. Compuesto según las reivindicaciones 28 a
30, en forma de una sal adecuada o un hidrato.
32. Kit de componentes para uso en la detección
de actividad enzimática en un medio sólido, que incluye:
- a)
- un sustrato enzimático, que comprende
- i)
- una porción cromógena que comprende un resto de catecol que es un resto que resulta de la eliminación de uno o ambos átomos de hidrógeno hidroxílicos de un 1,2-dihidroxibenceno o un derivado sustituido del mismo en el que los sustituyentes no forman un sistema anular condensado con el anillo de 1,2-dihidroxibenceno, y
- ii)
- un grupo escindible enzimáticamente que está unido a través de una unión de tipo éster o éter al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, teniendo el sustrato enzimático una de las siguientes fórmulas:
en las que R^{1} y R^{2} son H
o un grupo escindible enzimáticamente seleccionado de entre
glucosilos y restos de fosfato, sulfato, aminoácidos, péptidos,
proteínas, azúcares, ácidos grasos y nucleótidos,
y
R^{1} y R^{2} no pueden ser ambos H,
R^{3} y R^{4} se seleccionan de entre el
grupo que consiste en grupos H, alquilo de C_{1} a C_{6},
alcoxi de C_{1} a C_{6} e hidroxialquilo de C_{1} a C_{6},
halógeno, nitro, acilo, aciloxi, aralquilo, arilo y amido, y no
están unidos para formar un anillo condensado; e
Y es un resto orgánico que contiene menos de 40
átomos, que no interfiere con la escisión enzimática, y que
comprende grupos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos
que contienen 5 a 18 átomos anulares; y
- b)
- un compuesto de ion metálico que es quelable por el compuesto que se forma a partir de la porción cromógena escindida.
33. Kit según la reivindicación 32, en el que el
sustrato enzimático tiene las características adicionales de
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18.
34. Kit según la reivindicación 32 ó 33, en el
que los componentes ya están mezclados, o están en recipientes
separados.
35. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
32 a 34, que comprende un medio sólido que ayuda al crecimiento de
microbios, y que contiene el sustrato y el ion metálico.
36. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
32 a 35, en el que el compuesto del ion metálico es una sal de
hierro, aluminio o bismuto.
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