ES2256535T3 - Sustratos enzimaticos para detectar actividad de beta-d-ribofuranosidasa. - Google Patents
Sustratos enzimaticos para detectar actividad de beta-d-ribofuranosidasa.Info
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Abstract
Método para detectar actividad de -D-ribofuranosidasa en un medio sólido, que comprende: a) poner en contacto, en un medio sólido, un -D- ribofuranósido cromógeno, que comprende un grupo de -D- ribofuranosilo y una porción cromógena, siendo escindible dicha porción cromógena, mediante -D-ribofuranosidasa, del grupo de -D-ribofuranosilo, liberando un producto cromógeno y formando un indicador que es o que se forma a partir del producto cromógeno, y que no se difunde sustancialmente en el medio sólido, con una sustancia que se sospecha que contiene actividad de -D-ribofuranosidasa; b) detectar si hay actividad de -D-ribofuranosidasa determinando si se forma dicho indicador.
Description
Sustratos enzimáticos para detectar actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa.
La presente invención se refiere a sustratos
cromógenos enzimáticos.
Los sustratos enzimáticos indicadores comprenden
una parte escindible por enzima (p. ej., un monosacarilo) y una
parte que forma un indicador detectable en la escisión (p. ej., un
grupo cromógeno o fluorógeno). Se conoce un gran número de sustratos
enzimáticos a base de glicósidos, y se utilizan ampliamente en
microbiología, biología molecular y otros campos. Se han sintetizado
y utilizado con fines de detección glicósidos de muchos
carbohidratos diferentes. Las enzimas detectadas por estos
glicósidos son con frecuencia específicas de grupos (es decir,
presentan especificidad relativamente pequeña por una parte del
sustrato sobre el que actúan), y por consiguiente puede tolerarse
una amplia variedad de aglucones (es decir, partes de indicador). De
este modo, en el caso de la \beta-galactosidasa se
han utilizado muchos \beta-galactósidos
diferentes en la detección de la misma. Los ejemplos incluyen
o-nitrofenil-, p-nitrofenil-,
indoxil-
(5-bromo-4-cloro-3-indolilo
y
6-cloro-3-indolilo),
4-metilumbeliferil-,
2-naftil-,
6-bromo-2-naftil-, ciclohexenoesculetin- (CHE), alizarin-, naftol-ASBI- y fenil-\beta-D-galactósidos. Los glicósidos que contienen restos de ácido glucurónico, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, arabinosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, ácido siálico, xilosa, y de carbohidratos de celobiosa, están entre los que se encuentran más frecuentemente en aplicaciones de sustratos enzimáticos. Muchos de éstos, tal como los \beta-D-glucurónidos, \alpha- y \beta-D-galactopiranósidos y \alpha- y \beta-D-glucopiranósidos, han encontrado uso extendido en la identificación y enumeración de bacterias en áreas tales como la clínica, alimentación, veterinaria, medioambiente y microbiología del agua. En el momento presente existen numerosos medios comerciales y kits de ensayo disponibles que contienen sustratos enzimáticos, que muestran la presencia de bacterias mediante la generación de colonias o disoluciones colorea-
das.
6-bromo-2-naftil-, ciclohexenoesculetin- (CHE), alizarin-, naftol-ASBI- y fenil-\beta-D-galactósidos. Los glicósidos que contienen restos de ácido glucurónico, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, arabinosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, ácido siálico, xilosa, y de carbohidratos de celobiosa, están entre los que se encuentran más frecuentemente en aplicaciones de sustratos enzimáticos. Muchos de éstos, tal como los \beta-D-glucurónidos, \alpha- y \beta-D-galactopiranósidos y \alpha- y \beta-D-glucopiranósidos, han encontrado uso extendido en la identificación y enumeración de bacterias en áreas tales como la clínica, alimentación, veterinaria, medioambiente y microbiología del agua. En el momento presente existen numerosos medios comerciales y kits de ensayo disponibles que contienen sustratos enzimáticos, que muestran la presencia de bacterias mediante la generación de colonias o disoluciones colorea-
das.
Se conocen algunos compuestos que contienen un
resto de azúcar, el cual es ribosa. Por ejemplo, los ribofuranósidos
de DOPA (ácido
2-amino-3-(3,4-dihidroxifenil)propanoico)
y derivados de DOPA están descritos por Chavis et al. (1981),
Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 16(3),
219-227. Los compuestos tienen un uso potencial como
antihipertensivos.
Esta invención proporciona nuevos métodos para
usar \beta-D-ribofuranósidos y
nuevos sustratos enzimáticos de
\beta-D-ribofuranósidos
indicadores. Hasta el día de hoy, los sustratos a base de
\beta-D-ribofuranósido han tenido
poca aplicación como sustratos. Esta invención también proporciona
algunos compuestos nuevos de
\beta-D-ribofuranósidos.
Se conocen algunos sustratos potenciales o reales
basados en \beta-D-ribofuranósido
(BDRF). El p-nitrofenil-BDRF se dio
a conocer por primera vez en 1976 (K. Honma et al., Chem.
Pharm. Bull., 1976, 24, 394-399), pero su
uso como sustrato enzimático no se dio a conocer en ese momento.
El
4-metilumbeliferil-\beta-D-ribofuranósido
(4-MU-BDRF) está comercialmente
disponible en Glycosynth (Warrington, UK) desde 1995. El indicador
formado a partir de 4-MU se detecta
fluorimétricamente, y no usando luz incidente visible ni siendo
detectable por el ojo.
En el documento WO97/31008, Schramm et al
describen la síntesis y el uso de algunos sustratos de BDRF y de
fosfato de BDRF para la detección de parásitos en muestras
biológicas. Este método implica detectar la actividad de nucleósido
hidrolasa o nucleósido fosforilasa en la muestra. Los sustratos son
cromógenos o fluorógenos. Un ejemplo es
4-MU-BDRF. Schramm et al
también describen
p-nitrofenil-\beta-D-ribofuranósido.
Este sustrato no se ensayó frente a bacterias, levaduras o sus
enzimas. El
p-nitrofenil-\beta-D-ribofuranósido-5-fosfato
se ensayó frente a una N-ribohidrolasa de E.
coli, principalmente AMP nucleosidasa, y se encontró que era
inactivo.
Además, ninguno de los sustratos de BDRF
descritos previamente son adecuados de forma ideal para uso en
medios sobre placas (sólidos), debido a que se difunden ampliamente
o, en el caso de 1-naftil-BDRF,
requerirían una técnica de acoplamiento tras la incubación para
formar un precipitado coloreado. A fin de establecer la utilidad de
\beta-D-ribofuranósido para la
identificación de microbios en medios sólidos (por ejemplo, en
agar), se requirió por lo tanto un sustrato que mostrase una
actividad enzimática muy localizada.
Esta invención proporciona un método para
detectar actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa en un
medio sólido, que comprende:
a) poner en contacto, en un medio sólido, un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno,
que comprende un grupo de
\beta-D-ribofuranosilo y una
porción cromógena, siendo escindible dicha porción cromógena,
mediante \beta-D-ribofuranosidasa,
del grupo de
\beta-D-ribofuranosilo, liberando
el producto cromógeno y formando un indicador que es o que se forma
a partir del producto cromógeno, y que no se difunde sustancialmente
en el medio sólido, con una sustancia que se sospecha que contiene
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa;
b) detectar si hay actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa
determinando si se forma dicho indicador.
La actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa es una
actividad enzimática capaz de dar grupos de
\beta-D-ribofuranosilo.
Es una ventaja de esta invención que el
indicador, que sustancialmente no se difunde, se forme directamente
después de que el
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
se ponga en contacto con la sustancia que se sospecha que tiene
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa, es
decir, no se requiere una etapa de post-incubación.
La porción cromógena escindida, denominada el producto cromógeno,
puede formar el indicador. Como alternativa, sin embargo, puede ser
necesario poner en contacto el producto cromógeno con un revelador,
otra sustancia necesaria para facilitar la formación del indicador
coloreado que sustancialmente no se difunde. Por lo tanto, el método
descrito anteriormente también puede implicar poner en contacto el
producto cromógeno con un revelador requerido para la formación de
dicho indicador. La acción del revelador es preferiblemente rápida y
concurrente con el proceso de la etapa a) del método, y no requiere
un cambio en las condiciones.
Se prevé que el método de esta invención será
útil para sustancias que se sospecha que contienen actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa,
obtenidas a partir de una amplia variedad de fuentes. Se prevé
especialmente que se llevará a cabo el método descrito
anteriormente, en el que la sustancia que se sospecha que contiene
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa comprende
una sustancia de origen microbiano, preferiblemente de origen
bacteriano. En tal procedimiento, el método descrito anteriormente
puede incluir una etapa preliminar de hacer crecer microbios sobre
el medio sólido.
Generalmente es de esperar que el
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
esté presente en el medio sólido en una etapa preliminar de hacer
crecer los microbios en el medio sólido y en la etapa a). En una
realización que requiere que un revelador entre en contacto con la
porción cromógena escindida para formar un indicador coloreado que
sustancialmente no se difunde, generalmente es de esperar que
también esté presente en el medio sólido. Es posible que el
\beta-D-ribofuranósido cromógeno y
cualquier revelador requerido se añadan a la superficie del medio
sólido en el método de esta invención, pero preferiblemente se
distribuyen por todo el medio sólido.
Los indicadores que sustancialmente no se pueden
difundir, producidos mediante el método de esta invención, son
coloreados. Como resultado, el indicador es visible por el ojo,
usando preferiblemente luz incidente visible. Como entenderá la
persona experta, esto es una ventaja debido a que la etapa b) de
detección se puede llevar a cabo rápida y fácilmente.
Otro aspecto de esta invención proporciona un
método para detectar actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa, que
incluye:
a) poner en contacto un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno,
que comprende un grupo de
\beta-D-ribofuranosilo y una
porción cromógena o fluorógena, con una muestra que comprende una
sustancia de origen bacteriano que se sospecha que contiene
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa, y
b) detectar si hay actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa
detectando la presencia de un indicador formado a partir del
producto cromógeno escindido.
En este método, la porción cromógena puede
comprender cualquier grupo que proporcione una diferencia detectable
(en el aspecto visible) entre el resto escindido y el resto no
escindido. Se prefiere que este método se lleve a cabo en un medio
sólido, y que el indicador cromógeno no se pueda difundir
sustancialmente. Se prefiere que el producto sea detectado por el
ojo, pero se pueden usar otros medios espectroscópicos que detecten
la luz visible.
Para ambos aspectos de esta invención, cuando la
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa sea de
origen bacteriano, se prefiere que las bacterias se seleccionen del
género Yersinia, del género Shigella, del género
Vibrio, y Corynebacterium diphteriae y
Arcanobacterium haemolyticum. Es importante que estas
bacterias se puedan detectar con éxito, puesto que la Yersinia
enterocolitica puede provocar diarrea y, actualmente, no hay
medios comerciales que contengan sustratos enzimáticos que puedan
detectarla y diferenciarla de especies similares. La especie
Shigella puede provocar la disentería, la especie
Vibrio es importante en el envenenamiento por alimentos y
puede provocar el cólera, y Corynebacterium diphteriae
provoca difteria.
Tras la actividad enzimática, la porción
cromógena escindida forma directamente un indicador coloreado, por
ejemplo que no se difunde. La porción cromógena de estos compuestos
se selecciona de un 1,2-dihidroxibenceno,
preferiblemente un resto de catecol, un resto de
ciclohexenoesculetina u otro resto de esculetina, o un resto de
alizarina, un resto de indoxilo o un resto de
p-naftobenceína, y sus derivados. Un resto de
catecol para la presente memoria descriptiva es un resto que resulta
de eliminar uno o ambos átomos de hidrógeno hidroxílicos de un
1,2-dihidroxibenceno, o de un derivado sustituido
del mismo, preferiblemente sustituido con un resto derivatizante que
está enlazado al anillo aromático del catecol vía un enlace, pero
excluyendo compuestos con anillos condensados al anillo de
1,2-dihidroxibenceno, tal como en un compuesto de
esculetina o alizarina. Cuando la porción cromógena se forma a
partir de catecol o de un derivado de catecol en el que un resto
derivatizante está enlazado al anillo del catecol vía un enlace, la
porción cromógena se puede formar, por ejemplo, a partir de una
estructura de dihidroxibenzaldehído, dihidroxibenzofenona,
dihidroxiflavonoide, dihidroxieurona o dihidroxicalcona.
Los ribofuranósidos se producen mediante una
reacción de condensación entre la ribofuranosa, en forma
apropiadamente protegida, y el precursor de la porción cromógena que
tiene un grupo hidroxilo libre, para generar un enlace glicosídico.
Generalmente en la condensación de la
\beta-D-ribofuranosa y la porción
cromógena, el átomo de oxígeno que se retiene en el enlace formaba
parte originalmente del material de partida que da lugar a la
porción cromógena.
Cuando la porción cromógena del
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
se forma a partir de un 1,2-dihidroxibenceno,
especialmente un catecol o derivado de catecol, se puede usar como
revelador un ión metálico. El ión metálico es quelado por la porción
cromógena escindida, para producir un indicador coloreado que no se
difunde sustancialmente. Los compuestos de iones metálicos quelables
especialmente preferidos son sales de hierro, sales de aluminio y
sales de bismuto.
El sustrato enzimático cromógeno se puede
representar mediante las siguientes fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
en las que Y y R son restos que no
interfieren con la ruptura enzimática o formación del indicador, y
cada uno de Z^{1}, Z^{2}, Z^{3} y Z^{4} puede ser H o un
grupo \beta-D-ribofuranosilo, con
la condición de que Z^{1} y Z^{2}, o Z^{3} y Z^{4} no sean
simultáneamente
H.
Un grupo Z
\beta-D-ribofuranosílico tiene la
siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que 100 indica
el enlace al oxígeno fenólico anterior en la fórmula general I o
II.
En una realización, Y y R son restos orgánicos
que contienen menos de 40 átomos, preferiblemente menos de 30
átomos, y más preferiblemente menos de 20 átomos.
En las estructuras anteriores, Y puede ser un
resto orgánico. Preferiblemente, Y comprende un grupo arilo o
heteroarilo sustituido o no sustituido que contiene 5 a 18 átomos
anulares. En una realización preferida, Y es un resto orgánico con
una estructura central de V o VI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que las estructuras están
enlazadas al anillo del catecol como se
muestra.
Estructura central en esta memoria descriptiva
significa la cadena principal de Y, y ésta puede estar sustituida
adicionalmente.
Se prefiere que Y tenga la estructura de VII u
VIII
\vskip1.000000\baselineskip
en las que cada uno de
(R^{5})_{n}, (R^{6})_{n},
(R^{7})_{n}, (R^{8})_{n} pueden representar
más de un sustituyente que no es hidrógeno, e incluyen =O. R^{5},
R^{6}, R^{7} y R^{8} son sustituyentes que no interfieren con
la acción enzimática o con la quelación del ión metálico. El
subíndice n es preferentemente 0, 1 ó
2.
Las realizaciones más preferidas de Y están
representadas por las estructuras IX y X
en las que (R^{9})_{n} y
(R^{11})_{n} representan uno o más sustituyentes, y
R^{10} y R^{12} son cada uno hidrógeno o un sustituyente, todos
los cuales no interfieren con la acción enzimática o la quelación
del ión
metálico.
En realizaciones en las que
(R^{6})_{n}, (R^{8})_{n},
(R^{9})_{n} y (R^{11})_{n} representan más de
un sustituyente, incluyendo =O, los enlaces del anillo se colocan de
otra manera. R^{9} y R^{11} se seleccionan preferiblemente del
grupo que consiste en grupos hidroxilo, alquilo de
C_{1-24}, alquenilo de C_{2-24},
alcoxi de C_{1-6}, acilo, incluyendo -CHO y
COPhe, en el que Phe es fenilo, =O, halógeno, nitro, arilo y
aciloxi. Los grupos alquilo y arilo pueden estar sustituidos con
grupos amino, hidroxilo, péptido, aciloxi, alcoxi, -CONH_{2},
CONHR^{1} y NHCOR^{1}, en los que R^{1} es un grupo alquilo o
arilo, y grupos arilo. R^{10} y R^{12} se seleccionan de los
mismos grupos que R^{9} y R^{11}, y adicionalmente hidrógeno.
Preferiblemente, R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se
seleccionan de alcoxi de C_{1-4}.
En las estructuras anteriores, R puede ser grupos
H, alquilo de C_{1} a C_{6}, alcoxi de C_{1} a C_{6}, e
hidroxialquilo de C_{1} a C_{6}, halógeno, nitro, acilo, arilo y
amido; o dos grupos adyacentes R pueden estar unidos para formar un
sistema de anillo condensado, con el anillo mostrado en las fórmulas
I y II, tal como un anillo condensado que tiene generalmente un
carácter aromático, y que incluye opcionalmente uno o más
heteroátomos. Preferiblemente, cada grupo R es monofuncional, es
decir no está unido a ningún otro grupo R, esto es, el compuesto es
un catecol.
El
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
se selecciona preferiblemente de
catecol-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
quercetin-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxicalcona-4-\beta-D-ribofuranósido,
4-nitrocatecol-1-\beta-D-ribofuranósido,
3,3',4'-trihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxi-3-metoxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxiaurona-4'-\beta-D-ribofuranósido
y
3-indolil-\beta-D-ribofuranósido,
que tienen uno o más sustituyentes de tipo halógeno o nitro y/o
sustituyentes de tipo L-alquilo inferior.
Un aspecto adicional de esta invención
proporciona nuevos sustratos enzimáticos de
\beta-D-ribofuranósidos
cromógenos, en los que el resto cromógeno es un resto de
1,2-dihidroxibenceno. En el sustrato, uno o ambos
átomos de oxígeno hidroxílicos del resto se usan para el enlace a un
grupo de \beta-D-ribofuranosilo.
Estos nuevos compuestos se pueden representar mediante las fórmulas
I y II anteriores, con la condición de que Y no sea un grupo alquilo
sustituido cuando todos los grupos R sean H. En una clase preferida
de nuevos sustratos, los compuestos son catecoles, en los que dos
grupos R no están condensados.
Los nuevos
\beta-D-ribofuranósidos cromógenos
preferidos tienen la fórmula estructural I o II como se describe
anteriormente, en las que Y puede tener las fórmulas estructurales
de V, VI, VII, VIII, IX o X.
Los nuevos
\beta-D-ribofuranósidos cromógenos
preferidos tienen un resto de catecol formado a partir de un
catecol, nitrocatecol, dihidroxiflavonoide tal como
dihidroxiflavona, dihidroxiisoflavona, dihidroxiflavanona,
dihidroxiisoflavanona, dihidroxiflavano, trihidroxiflavano o
dihidroxiisoflavano, dihidroxiaurona, dihidroxicalcona,
dihidroxibenzaldehído, dihidroxibenzofenona, o semicarbazona de
dihidroxibenzadehído, o quercetina y sus derivados. Las quercetina
también se denomina
3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavona.
Los nuevos compuestos especialmente preferidos
incluyen
catecol-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
quercetin-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxicalcona-4-\beta-D-ribofuranósido,
4-nitrocatecol-1-\beta-D-ribofuranósido,
3,3',4'-trihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxi-3-(alcoxiC_{1-6})flavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
y
3',4'-dihidroxiaurona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
y semicarbazona de
3,4-dihidroxibenzadehído-4-\beta-D-ribofuranósido,
y sus derivados.
Un esquema general para la síntesis de un
sustrato que comprende un resto de catecol implica mezclar
\beta-D-ribofuranosa, que tiene
grupos hidroxilo protegidos, con catecol, o con un derivado de
catecol, y con un catalizador para formar el catecol
(derivado)-\beta-D-ribofuranósido.
Opcionalmente, se pueden añadir al resto de catecol otros restos
derivatizantes. El producto se desprotege, y el sustrato enzimático
cromogénico se purifica. Los indoxil-ribofuranósidos
se pueden obtener mediante un procedimiento análogo. En el Ejemplo
4, más abajo, se da un ejemplo específico.
Los
\beta-D-ribofuranósidos a base de
restos de 1,2-dihidroxibenceno se pueden producir
como el hidrato, o en forma de una sal adecuada. Las sales podrían
derivar de iones metálicos u orgánicos.
Los componentes requeridos para llevar a cabo los
métodos de esta invención se pueden presentar como un kit de
componentes. Tal kit incluiría un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
que comprende un grupo de
\beta-D-ribofuranosilo y una
porción cromógena que, cuando se escinde, forma directamente un
indicador coloreado, que no se difunde sustancialmente. Como
alternativa, tal kit incluiría un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
que, cuando es escindido por bacterias o por una sustancia de origen
bacteriano, produce un indicador detectable.
Tal kit de componentes también puede comprender
un revelador. La persona experta apreciará que sería útil producir
un medio sólido que pueda soportar el crecimiento de microbios, y
que comprenda los componentes del kit mencionados anteriormente. Por
lo tanto, los kits descritos anteriormente también pueden incluir
componentes necesarios para producir dicho medio sólido. Los
componentes del kit se pueden envasar de forma separada o en
diversas combinaciones, dependiendo de los requisitos del
procedimiento de análisis que se va a llevar a cabo.
Puede ser útil que los medios usados para
detectar la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa contengan
otros componentes que detecten otra actividad enzimática, o que
seleccionen microbios específicos. Por lo tanto, los kits de esta
invención también pueden incluir tales compuestos.
Las limitaciones de uso de un sustrato que genera
un producto final difundible después de la hidrólisis sobre un medio
sólido son conocidas por los expertos en la materia. Se ha
demostrado la utilidad de los indicadores que no se pueden difundir,
de esta invención. Por ejemplo, se preparó una placa de cultivo que
contiene medio sólido y el sustrato enzimático cromógeno
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
junto con ión férrico. Se hizo crecer en el medio un cultivo que
contiene casi el mismo número de Escherichia coli
(\beta-D-ribofuranosidasa
positiva) y Acinetobacter lwoffii
(\beta-D-ribofuranosidasa
negativa). La E. coli produjo colonias de color negro
intenso, debido a la hidrólisis de
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
y no hubo, o casi no hubo, difusión del indicador coloreado lejos de
estas colonias. Las colonias de A. lwoffii fueron incoloras.
Fue posible diferenciar las dos especies incluso cuando las colonias
fueron virtualmente coincidentes.
Este ejemplo proporciona métodos sintéticos para
varios \beta-D-ribofuranósidos
cromógenos.
Ejemplo
1.1
Se cargó un matraz de fondo redondo de 50 ml,
equipado con un tapón y un agitador magnético, con
3',4'-dihidroxiflavona (DHF) (Lancaster Synthesis
Ltd, Lancashire, UK) (500 mg), tetraacetato de
\beta-D-ribofuranosa (640 mg),
tamices moleculares 3 \ring{A} (5,2 g) y diclorometano (20 ml). La
mezcla se agitó durante 15 min.; después se añadió, de una sola vez,
el catalizador de trifluoruro de boro-eterato de
dietilo (2,0 ml). La agitación se continuó durante otros 20 min.;
después, la mezcla de reacción se vertió en una disolución de
bicarbonato de sodio saturado (150 ml). La capa orgánica se diluyó
mediante adición de más diclorometano (30 ml), y después se separó
de la capa acuosa amarilla en un embudo de separación. La capa
orgánica se lavó entonces once veces con un volumen igual de
disolución de bicarbonato sódico saturado, y después se secó durante
una hora sobre sulfato de magnesio. Después de la eliminación del
agente secante, la evaporación del diclorometano produjo el
triacetato de glicósido como una goma oscura (390 mg). A esta goma
(315 mg) se añadió disolución de metóxido sódico que se había
obtenido disolviendo sodio (50 mg) en metanol (5 ml). Después de
agitar durante unos pocos minutos, la goma se disolvió, y la
disolución se dejó a temperatura ambiente durante 16 horas. La
disolución se concentró entonces hasta un volumen de aproximadamente
2 ml mediante evaporación, después de lo cual la adición de éter
dietílico (10 ml) provocó la precipitación de producto. Se recogió
mediante filtración a vacío y, después de lavar con éter dietílico
(20 ml) en cuatro porciones, se transfirió inmediatamente a un
secador, y se seco sobre pentóxido de fósforo a vacío durante 2
horas. El producto así obtenido fue un polvo amarillo (201 mg).
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Ejemplo
1.2
Se cargó un matraz de fondo redondo de 500 ml,
equipado con un agitador magnético, con catecol (33 g), tamices
moleculares 3 \ring{A} (20 g) y diclorometano (200 ml). La
disolución que se formó se agitó durante 10 minutos, y después se
añadió, de una sola vez, trifluoruro de
boro-eterato de dietilo (10 ml). Después de 1 hora,
la mezcla de reacción se filtro, después se lavó en un embudo de
separación secuencialmente con volúmenes iguales de bicarbonato
sódico saturado (cinco veces) y agua desionizada (dos veces), y
después se seco sobre sulfato de magnesio. La eliminación del agente
secante y la evaporación dieron un aceite amarillo pálido que
solidificó lentamente. El sólido se disolvió en espíritus metilados
industriales (IMS) calientes (50 ml), y después se almacenó a 4ºC
durante 16 horas para permitir que terminará la cristalización. El
sólido blanco se recogió mediante filtración a vacío, y se lavó con
IMS (20 ml) en dos porciones. Después de secar un día al aire, el
rendimiento del ribósido protegido fue 17,1 g. El ribósido protegido
(15 g) se suspendió en metanol (150 ml), y se añadió al mismo una
disolución formada por sodio (2 g) en metanol (50 ml). Inicialmente,
el sólido se disolvió, pero éste se sustituyó pronto por un denso
precipitado. La mezcla de reacción se dejó aparte durante 16 horas.
El sólido se recogió entonces mediante filtración a vacío, y se lavó
con metanol (5 ml). El sólido higroscópico se transfirió entonces
inmediatamente a un secador y se secó a vacío sobre pentóxido de
magnesio durante 6 horas. El rendimiento del polvo blanco fue 4,3
g.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.3
Se añadió a un matraz de fondo redondo de 3 l,
provisto de un agitador magnético,
3,4-dihidroxibenzaldehído (50 g), tetraacetato de
\beta-D-ribofuranosa (47 g),
tamices moleculares 3 \ring{A} (350 g) y diclorometano (1,4 l).
Después de agitar esta mezcla durante 5 minutos, se añadió, de una
sola vez, trifluoruro de boron-eterato de dietilo
(75 ml), y después la agitación se continuó durante otros 20
minutos, con lo que después los tamices moleculares se eliminaron
por filtración. El filtrado se lavó cuatro veces con un volumen
igual de bicarbonato sódico saturado, se secó sobre sulfato de
magnesio durante una hora, y después se evaporó hasta sequedad. El
sólido amarillo pálido residual se disolvió en IMS caliente (70 ml),
y se almacenó a 4ºC durante 6 horas. El producto se cosechó por
filtración. El secado sobre pentóxido de fósforo a vacío dio 12,4 g
de un sólido blanquecino.
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Ejemplo
1.4
Se añadió una disolución de sodio (0,5 g) en
metanol (20 ml) a una mezcla de triacetato de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(procedente del Ejemplo 1.3) (5,0 g) en metanol (25 ml). El
triacetato se disolvió, y fue sustituido por un denso precipitado.
Después de 5 horas, éste se separó mediante filtración a vacío, y se
lavó sobre el filtro con metanol (5 ml) y éter dietílico (10 ml). El
secado durante 4 horas a vacío sobre pentóxido de fósforo dio el
producto como un sólido de color crema pálido (3,1 g).
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Ejemplo
1.5
Se añadió una disolución de hidrocloruro de
semicarbazida (1 g) y acetato potásico (1,5 g) en agua (5 ml) a una
disolución de la sal sódica de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(procedente del Ejemplo 1.4) (0,5 g) en agua desionizada (5 ml). La
mezcla se calentó durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo, y
después se dejó enfriar. Después de concentrar la disolución hasta
la mitad de su volumen original por evaporación, el producto
cristalizó. Se recogió mediante filtración a vacío y, después de
lavar con agua (2 ml), se secó en un secador a vacío sobre pentóxido
de fósforo. El producto fue un sólido blanco (300 mg).
Ejemplo
1.6
Se añadió hidróxido sódico (0,1 g) en agua
desionizada (3 ml) y acetofenona (0,1 g) a una disolución de la sal
sódica de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(procedente del Ejemplo 1.4) (0,25 g) en IMS. La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante nueve días, después de lo cual la
reacción se evaporó hasta sequedad. El producto se obtuvo como un
sólido rojo.
Ejemplo
1.7
Se añadió una disolución de IMS saturado con
cloruro de hidrógeno gaseoso (0,05 ml) a una mezcla de triacetato de
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido
(procedente del Ejemplo 1.3) (0,4 g) y 3-cumaranona
(0,17 g) en IMS (20 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 3 días, y después se evaporó hasta sequedad. El sólido
resultante se disolvió en metanol (2 ml) y se añadió una disolución
de sodio (50 mg) en metanol (0,5 ml), dando una disolución de color
rojo sangre. Esta disolución se evaporó hasta sequedad, y se
repartió entre agua desionizada (25 ml) y diclorometano (50 ml). La
capa acuosa se extrajo con dos lavados adicionales de diclorometano
(50 ml), antes de evaporarla hasta sequedad. El producto se obtuvo
como un sólido rojo.
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Este ejemplo proporciona una evaluación del
ribofuranósido de 3',4'-dihidroxiflavona (producido
en el Ejemplo 1.1) (DHF-ribósido).
El derivado ribofuranosídico de dihidroxiflavona
se ensayó con 194 cepas distintas de bacterias. La elección de las
bacterias incluyó un amplio intervalo, muchas de las cuales son
patógenas o comensales importantes aisladas habitualmente a partir
de muestras patológicas.
El sustrato de
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
se añadió a agar Columbia a una concentración de sustrato de 300
mg/l. El citrato férrico amónico se incluyó a 500 mg/l. Todos los
ingredientes se sometieron a autoclave a 116ºC durante 20 minutos
para asegurar la esterilización. Las placas de agar se prepararon
entonces en cápsulas de Petri de 90 mm. El sustrato provocó una
coloración amarilla del agar.
Para cada cepa ensayada, se preparó una
suspensión bacteriana en agua desionizada estéril, a un inóculo de
aproximadamente 1,5 x 10^{8} unidades formadoras de colonia por
ml. Esto se logró usando un densitómetro. Seguidamente, se inoculó 1
\mul de cada suspensión bacteriana sobre cada placa, usando un
inoculador de múltiples puntos. Las cepas se inocularon en paralelo
sobre agar Columbia que contiene citrato férrico amónico sin
sustrato (control negativo).
Después de 18 horas de incubación, las cepas se
examinaron visualmente para determinar la presencia de color.
Cualquier cepa productora de una coloración negra sobre placas de
sustrato que contiene el medio, pero no sobre las placas de control
negativo, se considera que hidroliza al sustrato.
De las 120 bacterias
gram-negativas ensayadas, el 68,3% hidrolizó
DHF-ribósido. Aquellas que fueron positivas
produjeron un quelato negro, claramente visible, de
3',4'-dihidroxiflavona y citrato férrico amónico,
que permaneció restringido a las colonias bacterianas sin difusión
al agar circundante. La detección de la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa permitió
que se hicieran distinciones entre géneros o especies estrechamente
relacionadas. La mayoría de las enterobacteriaceas ensayadas
fueron muy positivas para la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa. Una
excepción fue Yersinia enterocolitica, un patógeno que es la
causa de la enteritis. Este sustrato podría tener un papel útil par
la diferenciación de esta especie a partir de bacterias
estrechamente relacionadas. También fue notorio el hecho de que el
género de Shigella fue uniformemente positiva para la
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa. Ninguna
de las glicosidasas buscadas habitualmente en microbiología de
diagnóstico se producen uniformemente por especies de
Shigella, y esto es un factor limitante a la hora de diseñar
métodos para su detección. Esta invención puede permitir la
distinción entre Shigella y especies estrechamente
relacionadas, tales como Proteus.
Un punto de interés adicional entre las
actividades de bacterias gram-negativas se refiere a
las vibrionáceas. Actualmente, los medios de cultivos
disponibles para la detección de especies de Vibrio no
permiten la diferenciación de especies de Aeromonas que se
encuentran habitualmente en el medioambiente, y que están
estrechamente muy relacionadas con Vibrio. La mayoría de las
especies de Vibrio ensayadas aquí, incluyendo los dos
patógenos principales V. cholerae y V.
parahaemolyticus, no expresan
\beta-D-ribofuranosidasa. Esto
contrasta con las especies de Aeromonas, que son muy activas.
Esta invención puede permitir un medio simple para diferenciar entre
estas dos especies estrechamente relacionadas.
Entre las bacterias
gram-positivas ensayadas, sólo el 30,8% fueron
activas con este sustrato. Todos los estafilococos fueron positivos,
pero no hubo diferenciación entre las diferentes especies de
estafilococos ensayadas. Los estreptococos fueron casi todos
negativos, mientras que los enterococos ("estreptococos
fecales") tuvieron una actividad variable. El punto principal de
interés fue que Corynebacterium diphtheriae y
Arcanobacterium haemolyticum fueron activas con este
sustrato. Estas dos especies se encuentran en la garganta de seres
humanos infectados, y por lo tanto se llevaron a cabo cultivos de
garganta para aislar e identificar estos patógenos. La flora
comensal aerobia de la garganta esta dominada por estreptococos, y
el DHF-ribósido de esta invención puede
proporcionar un medio para diferenciar estos dos patógenos de la
flora comensal normal de la garganta.
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-ribósido |
| E. coli 0157 | NCTC 12079 | ++ |
| E. coli 0157 | NCTC 12080 | ++ |
| E. coli 0157 | NCTC 12900 | ++ |
| E. coli 0157 | NCTC 13125 | ++ |
| E. coli 0157 | NCTC 13126 | ++ |
| E. coli 0157 | NCTC 13127 | ++ |
| E. coli 0157 | NCTC 13128 | ++ |
| E. coli | NCTC 10418 | ++ |
| E. coli | ECO 2 | ++ |
| E. coli | ECO 3 | ++ |
| E. coli | ECO 4 | ++ |
| E. coli | ECO 5 | ++ |
| E. coli | ECO 6 | ++ |
| E. coli | ECO 7 | ++ |
| E. coli | ECO 8 | ++ |
| E. coli | ECO 9 | ++ |
| E. coli | ECO 10 | ++ |
| E. coli | ECO 11 | ++ |
| E. coli | ECO 12 | ++ |
| Shigella boydii | NCTC 9327 | ++ |
| Shigella boydii | NCTC 9732 | ++ |
| Shigella boydii | NCTC 9850 | ++ |
| Shigella dysenteriae (tipo 4) | NCTC 9759 | ++ |
| Shigella dysenteriae (tipo 2) | NCTC 9952 | ++ |
| Shigella dysenteriae (tipo 3) | NCTC 9720 | ++ |
| Shigella flexneri | NCTC 8192 | ++ |
| Shigella flexneri | NCTC 9723 | ++ |
| Shigella flexneri | NCTC 9780 | ++ |
| Shigella sonnei | NCTC 9774 | ++ |
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-ribósido |
| Shigella sonnei | NCTC 8574 | ++ |
| Shigella sonnei | NCTC 10352 | ++ |
| Shigella sonnei | NCTC 8219 | ++ |
| Shigella sonnei | NCTC 8586 | ++ |
| Hafnia alvei | NCTC 8105 | ++ |
| Hafnia alvei | HAL 2 | ++ |
| K. pneumoniae | NCTC 10896 | ++ |
| K. pneumoniae | KPN 2 | ++ |
| K. pneumoniae | KPN 3 | ++ |
| K. pneumoniae | KPN 4 | ++ |
| K. oxytoca | KOX 1 | ++ |
| K. oxytoca | KOX 2 | ++ |
| C. freundii | NCTC 9750 | ++ |
| C. freundii | CFR 1 | ++ |
| C. freundii | CFR 2 | ++ |
| C. freundii | CFR 3 | ++ |
| C. freundii | CFR 4 | ++ |
| C. diversus | CDI 1 | ++ |
| C. diversus | CDI 2 | ++ |
| Serratia marcescens | NCTC 10211 | ++ |
| Serratia spp. | SEX 1 | ++ |
| Serratia spp. | SEX 2 | ++ |
| Serratia spp. | SEX 3 | ++ |
| Serratia spp. | SEX 4 | ++ |
| Aeromonas hydrophila | NCTC 8049 | ++ |
| Aeromonas caviae | NCTC 10852 | ++ |
| Aeromonas sobria | NCTC 11215 | ++ |
| E. cloacae | NCTC 11936 | ++ |
| E. cloacae | ECL 1 | ++ |
| E. cloacae | ECL 2 | ++ |
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-ribósido |
| E. cloacae | ECL 3 | ++ |
| E. cloacae | ECL 4 | ++ |
| E. aerogenes | NCIMB 10102 | ++ |
| E. aerogenes | EAE 1 | ++ |
| Salmonella typhimurium | NCTC 74 | ++ |
| Salmonella typhi | NCTC 8385 | ++ |
| Salmonella montevideo | SAX 55 | ++ |
| Salmonella oranienburg | SAX 56 | ++ |
| Salmonella hadar | SAX 57 | ++ |
| Salmonella panama | SAX 58 | ++ |
| Salmonella orthmarchen | SAX 59 | ++ |
| Salmonella alachia | SAX 60 | ++ |
| Y. enterocolitica | NCTC 11176 | - |
| Y. enterocolitica | NCTC 11177 | - |
| Y. enterocolitica | NCTC 11600 | - |
| Y. enterocolitica | NCTC 10460 | - |
| A. Iwoffii | ATCC 15309 | - |
| A. baumanii | ATCC 19606 | - |
| A. calcoaceticus | ATCC 7844 | - |
| P. aeruginosa | NCTC 10662 | + |
| P. aeruginosa | ATCC 10145 | + |
| M. morganii | NCTC 235 | - |
| M. morganii | MMO 1 | + |
| M. morganii | MMO 2 | + |
| P. rettgeri | NCTC 7475 | + |
| Providencia stuartii | PST 1 | + |
| Providencia stuartii | PST 2 | + |
| Providencia alcalifaciens | PAL 1 | + |
| Providencia alcalifaciens | PAL 2 | - |
| P. mirabilis | NCTC 10975 | - |
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-ribósido |
| P. mirabilis | PMI 1 | - |
| P. mirabilis | PMI 2 | - |
| P. vulgaris | PVU 4 | - |
| P. vulgaris | PVU 2 | - |
| P. vulgaris | PVU 5 | - |
| P. penneri | PPE 1 | - |
| Vibrio parahaemolyticus | NCTC 12205 | - |
| Vibrio parahaemolyticus | NCTC 11344 | - |
| Vibrio furnissii | NCTC 11218 | - |
| Vibrio hollisae | NCTC 11640 | - |
| Vibrio cholera | NCTC 12945 | - |
| Vibrio cholera | NCTC 10732 | - |
| Vibrio cholera | NCTC 7270 | - |
| Vibrio cholera | NCTC 6585 | - |
| Vibrio cholera | NCTC 8021 | - |
| Vibrio parahaemolyticus | NCTC 10903 | - |
| Vibrio cincinnatiensis | NCTC 12012 | - |
| Vibrio parahaemolyticus | NCTC 10441 | - |
| Vibrio harveyi | NCTC 11346 | ++ |
| Vibrio vulnificus | NCTC 11067 | - |
| Vibrio metschnikovii | NCTC 8443 | ++ |
| Vibrio cholerae | NCTC 8042 | - |
| Vibrio cholerae | NCTC 10255 | - |
| Vibrio cholerae | NCTC 10954 | - |
| Vibrio mimicus | NCTC 11435 | - |
| Vibrio anguillarum | NCTC 12159 | - |
| Vibrio vulnificus | NCTC 11066 | - |
| Vibrio fluvialis | NCTC 11327 | ++ |
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-ribósido |
| Vibrio parahaemolyticus | NCTC 10884 | - |
| Vibrio cholerae | NCTC 7254 | - |
| Vibrio alcaligenes | NCTC 12160 | - |
| Abreviaturas: | ||
| NCTC: Colección Nacional de Cultivos Tipo (UK) | ||
| ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo | ||
| Clave: | ||
| + reacción positiva con el sustrato | ||
| ++ fuerte reacción positiva con el sustrato | ||
| - sin reacción detectable |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-Ribofuranósido |
| Streptococcus oralis | NCTC11427 | - |
| Streptococcus sanguis | NCTC 7863 | - |
| Streptococcus constellatus | NCTC 11325 | - |
| Streptococcus mitis | NCTC 12261 | - |
| Streptococcus salivarius | NCTC 8618 | - |
| Streptococcus crista | NCTC 12479 | - |
| Streptococcus vestibularis | NCTC 12166 | - |
| Streptococcus gordonii | NCTC 7865 | - |
| Streptococcus pneumoniae | NCTC 7465 | - |
| Streptococcus agalactiae | NCTC 8181 | - |
| Streptococcus milleri | natural | - |
| Haemolytic streptococcus A | 1 | - |
| Haemolytic streptococcus A | 2 | - |
| Haemolytic streptococcus A | 3 | - |
| Haemolytic streptococcus B | 1 | - |
| Haemolytic streptococcus B | 2 | - |
| Haemolytic streptococcus B | 3 | - |
| Haemolytic streptococcus C | 1 | - |
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-Ribofuranósido |
| Haemolytic streptococcus C | 67736 | - |
| Haemolytic streptococcus C | 68350 | - |
| Haemolytic streptococcus G | 1 | - |
| Haemolytic streptococcus G | 2 | - |
| Haemolytic streptococcus G | 3 | + |
| Listeria seerigeri | PHLS natural | - |
| Listeria innocua | PHLS natural | - |
| Listeria ivanovii | PHLS natural | + |
| Arcanobacterium haemolyticus | NCTC 52 | + |
| Bacillus licusniforms | NCIMB 9375 | - |
| Bacillus cereus | NCTC | - |
| Corynebacterium diphtheria | NEQAS | ++ |
| C.diphtheriae | NCTC 10356 | ++ |
| C.diphtheriae | NCTC 11397 | ++ |
| C.diphtheriae | NCTC 3987 | + |
| Staphylococcus aureus | 1 | ++ |
| Staphylococcus aureus | 2 | ++ |
| Staphylococcus aureus | 3 | ++ |
| Staphylococcus aureus | 4 | ++ |
| Staphylococcus aureus | 5 | ++ |
| Staphylococcus haemolyticus | RB 66 | + |
| Staphylococcus haemolyticus | RB 67 | + |
| Staphylococcus haemolyticus | RB 68 | + |
| Staphylococcus haemolyticus | RB 69 | + |
| Staphylococcus haemolyticus | RB 70 | + |
| Staphylococcus epidermidis | RB60 | ++ |
| Staphylococcus epidermidis | RB62 | + |
| Staphylococcus epidermidis | RB63 | + |
| Staphylococcus epidermidis | RB64 | + |
| Staphylococcus epidermidis | RB65 | + |
| Cepa | Nº de Referencia | \beta-Ribofuranósido |
| Staphylococcus saprophyticus | 1 | ++ |
| Staphylococcus saprophyticus | 2 | ++ |
| Staphylococcus saprophyticus | 3 | ++ |
| Staphylococcus saprophyticus | 4 | ++ |
| Staphylococcus saprophyticus | 5 | ++ |
| Enterococcus raffinosis | NCTC 13192 | + |
| Enterococcus mundtii | NCTC 12363 | + |
| Enterococcus duran | NCTC 8307 | - |
| Enterococcus gallinarum | NCTC 11428 | + |
| Enterococcus faecium | 121285 - natural '99 | - |
| Enterococcus casseflavus | NCTC 12361 | - |
| Enterococcus faecalis | 1 | - |
| Enterococcus faecalis | 2 | + |
| Enterococcus faecalis | 3 | + |
| Enterococcus faecalis | 4 | + |
| Enterococcus faecalis | 5 | + |
| Enterococcus faecalis | 6 | + |
| Enterococcus faecalis | 7 | - |
| Enterococcus faecium | 1 | - |
| Enterococcus faecium | 2 | - |
| Enterococcus faecium | 3 | - |
| Enterococcus faecium | 4 | + |
| Enterococcus faecium | 5 | - |
| Enterococcus faecium | 6 | + |
| Enterococcus faecium | 7 | - |
| Control negativo | - | |
| Clave: | ||
| + reacción positiva con el sustrato | ||
| ++ fuerte reacción positiva con el sustrato | ||
| - sin reacción detectable |
\newpage
Se ensayaron otros sustratos para la detección de
la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa.
Se utilizó el mismo método de evaluación como se
describe en el Ejemplo 2.
Fueron visibles colonias de color pardo oscuro,
indicativo de actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa, para
S. sonnei y K. pneumoniae. Se observó una reacción más
débil, y por lo tanto colonias más pálidas, para E. coli y
E. aerogenes. Se observó una pequeña zona de difusión
alrededor de todas las colonias positivas. Las cepas negativas a
\beta-D-ribofuranosidasa no
mostraron señales de actividad, y formaron colonias de color
crema.
Como en ensayos previos, se inoculó una selección
de cepas positivas y negativas a
\beta-D-ribofuranosidasa sobre
placas de agar, y se incubaron. Las cepas positivas produjeron
colonias de color marrón pálido, que indican sólo una reacción
débil.
Como en ensayos previos, se inoculó una selección
de cepas positivas y negativas a
\beta-D-ribofuranosidasa sobre
placas de agar, y se incubaron. Después de la incubación, todos los
organismos positivos a
\beta-D-ribofuranosidasa crecieron
como colonias de color pardo difuso, y los organismos que no
producen \beta-D-ribofuranosidasa
crecieron como colonias de color crema.
Los resultados de los ensayos se muestran en la
Tabla 3 a continuación.
Se realizó la reacción en un matraz de dos bocas
de 500 ml equipado con un agitador magnético.
A una mezcla de
2,3,5-tri-O-acetil-\alpha/\beta-D-ribofuranosil-tricloroacetimida
[I. Chiu-Machado et al., (1995), J.
Carbohydrate. Chem. 14, 551 y sig.] (145,0 g) y tamices moleculares
de 3 \ring{A} (2,0 g) en diclorometano anhidro (300 ml) se añadió
1-acetil-5-bromo-4-cloroindoxilo
(X-OH) anhidro (82,9 g), y la mezcla total se agitó
a temperatura ambiente durante 10 min. El triflato de TMS (8 ml) se
añadió a continuación de una sola vez mediante jeringuilla, y la
reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 1 hora. La
mezcla se vertió a continuación en diclorometano (3 l), y se lavó
con hidróxido de sodio 1 M (4 x 2 l). La capa orgánica se separó, se
filtró a través de celite y se concentró, a vacío, para reducir el
volumen (aprox. 1 l). La capa orgánica se lavó adicionalmente
después con hidróxido de sodio 1 M (6 x 1 l) y agua desionizada (1
l). Después del secado (sulfato de magnesio), se filtró a través de
celite y se concentró, a vacío, para dar el producto en bruto
protegido, como un sólido marrón oscuro (87,4 g).
El sólido marrón oscuro se examinó mediante tlc,
y se observó que contenía dos productos principales con valores de
R_{f} de aproximadamente 0,37 (el
\beta-ribofuranósido protegido) y 0,43. [Placas de
gel de sílice, éter de petróleo 60/80, acetato de etilo 1:1 v/v, UV
a 254 nm]. La cromatografía ultrarrápida del producto en bruto sobre
gel de sílice C60 (600 g), utilizando como disolvente eluyente éter
de petróleo 60/80/acetato de etilo/trietilamina 1:1:0,05 v/v/v, dio
el producto protegido como un aceite marrón (55 g). El aceite fue
principalmente una mezcla del tetraacetato de
X-\beta-D-ribofuranósido
y del contaminante con R_{f} 0,43. Este aceite se recogió en
metanol caliente (30 ml) y, después de dejarlo a temperatura
ambiente, se formó un precipitado. Tras 16 horas, se eliminó por
filtración el sólido de color crema que consiste casi enteramente en
material con un valor de R_{f} 0,43, y el filtrado se concentró a
40ºC a vacío para dar el tetraacetato de
X-\beta-D-ribofuranósido
como un aceite marrón
(33,6 g).
(33,6 g).
Se disolvió el tetraacetato de
X-\beta-D-ribofuranósido
(30 g) en metanol (200 ml), y se añadió gota a gota una disolución
de metóxido de sodio (preparada a partir de 1 g de sodio en 20 ml de
metanol) hasta que la disolución alcanzó pH 10. Se dejó que la
disolución reposará a temperatura ambiente durante 90 min., a
continuación se concentró, a vacío, hasta un aceite
alquitranado marrón. El aceite se trituro en acetona (500 ml).
Precipitó un sólido gris, y éste se eliminó por filtración a vacío.
Se descartó el sólido, y el filtrado se concentró a vacío hasta un
aceite marrón (19,3 g). El aceite se trituró con metanol (80 ml), y
el producto precipitó como un sólido azul pálido que se recuperó por
filtración (2,57 g). El filtrado se concentró a vacío, y se trituró
con metanol (30 ml) para obtener una segunda recogida como un sólido
de color crema pálido que se recuperó también por filtración (4,04
g). Se combinaron ambas recogidas, y se lavaron con acetona fría
(aprox. 20 ml), seguido de la filtración, para recuperar el
compuesto del título como un sólido blanco (aprox. 2,5 g).
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron los medios siguientes para
demostrar la utilidad de los compuestos de la presente
invención.
| Medio A (componentes por litro) | |
| \hskip0.5cm Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| \hskip0.5cm 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido | |
| \hskip0.5cm 6-cloro-3-indolil \beta-D-glucopiranósido | 200 mg |
| Medio B (componentes por litro) | |
| \hskip0.5cm Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| \hskip0.5cm 3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido | 300 mg |
| \hskip0.5cm 6-cloro-3-indolil \beta-D-glucopiranósido | 200 mg |
| \hskip0.5cm Citrato férrico amónico | 500 mg |
| Medio C (componentes por litro) | |
| \hskip0.5cm Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| \hskip0.5cm 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido | 80 mg |
| \hskip0.5cm 3,4-ciclohexenoesculetin-\beta-D-galactopiranósido | 300 mg |
| \hskip0.5cm isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido | 30 mg |
| \hskip0.5cm Citrato férrico amónico | 500 mg |
(Continuación)
| Medio D (componentes por litro) | |
| \hskip0.5cm Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| \hskip0.5cm 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido | 80 mg |
| \hskip0.5cm 3',4'-dihidroxi-3-metoxiflavona-4'-\beta-D-galactopiranósido | 300 mg |
| \hskip0.5cm isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido | 30 mg |
| \hskip0.5cm Citrato férrico amónico | 500 mg |
| Medio E (componentes por litro) | |
| \hskip0.5cm Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| \hskip0.5cm 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido | 80 mg |
| Medio F (componentes por litro) | |
| \hskip0.5cm Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| \hskip0.5cm 3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido | 300 mg |
| \hskip0.5cm Citrato férrico amónico | 500 mg |
Todos los componentes se añadieron a 1 litro de
agua desionizada y se esterilizaron en autoclave a 116ºC durante 10
minutos. Se prepararon placas de cultivo de
agar-agar fundido a 50ºC, y se secaron. Se
prepararon varias cepas de referencia con características
enzimáticas conocidas en una suspensión de aproximadamente 10^{8}
cfu/ml, utilizando un densitómetro. Se inocularon 10 \mul de esta
suspensión en cada uno de los diferentes tipos de medios, y se
incubaron toda la noche a 37ºC. En la Tabla 4 se muestra el aspecto
del cultivo de las diversas cepas ensaya-
das.
das.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
El sustrato mostrado en el encabezamiento se
sintetizó a partir de
3',4'-dihidroxi-3-metoxiflavona
(F.A.A. Van Acker et al., J. Med. Chem., 43,
3752-3760, (2000)), mediante un método análogo al
ejemplo 1.1.
El sustrato se evaluó usando el método general
del ejemplo 2, pero usando un intervalo de sales metálicas
diferentes y un cultivo de E. coli sola. Las sales metálicas
mostradas en la Tabla 5, a continuación, se usaron a una
concentración de 500 mg/l.
| Metal | Color de las colonias |
| Zn | Sin crecimiento |
| Co | Sin crecimiento |
| Mn | Naranja pálido |
| Sn | Amarillo |
| Ba | Amarillo |
| Al | Amarillo |
| Sr | Amarillo |
| Bi | Naranja oxidado |
| Fe | Marrón |
| Sin metal | Amarillo difuso |
Cuando se usó el medio que contiene la sal de
aluminio con un cultivo mixto de E. coli y Yersinia
enterocolitica, las colonias de E. coli tuvieron un color
amarillo brillante y sobresalieron muy claramente. No hubo
sustancialmente ninguna difusión en las colonias de Y.
enterocolitica (negativas para este sustrato, y de este modo
incoloras), incluso cuando las colonias fueron casi
coincidentes.
Claims (39)
1. Método para detectar actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa en un
medio sólido, que comprende:
a) poner en contacto, en un medio sólido, un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno,
que comprende un grupo de
\beta-D-ribofuranosilo y una
porción cromógena, siendo escindible dicha porción cromógena,
mediante \beta-D-ribofuranosidasa,
del grupo de
\beta-D-ribofuranosilo, liberando
un producto cromógeno y formando un indicador que es o que se forma
a partir del producto cromógeno, y que no se difunde sustancialmente
en el medio sólido, con una sustancia que se sospecha que contiene
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa;
b) detectar si hay actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa
determinando si se forma dicho indicador.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la
sustancia que se sospecha que contiene actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa comprende
una sustancia de origen microbiano.
3. Método según la reivindicación 2, que incluye
una etapa preliminar de hacer crecer microbios sobre el medio
sólido.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el
que la sustancia que se sospecha que contiene actividad enzimática
comprende una sustancia de origen bacteriano.
5. Método para detectar actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa, que
incluye:
a) poner en contacto un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno,
que comprende un grupo de
\beta-D-ribofuranosilo y una
porción cromógena o fluorógena, con una muestra que comprende una
sustancia de origen bacteriano que se sospecha que contiene
actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa, y
b) detectar si hay actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa
detectando la presencia de un indicador formado a partir del
producto cromógeno escindido.
6. Método según la reivindicación 4 ó 5, en el
que la fuente de actividad bacteriana se selecciona del género
Yersinia, del género Shigella, del género
Vibrio, Corynebacterium diphteriae y
Arcanobacterium haemolyticum.
7. Método según la reivindicación 5, en el que el
método se lleva a cabo en un medio sólido, y el indicador no se
difunde sustancialmente.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
incluye una etapa preliminar de hacer crecer bacterias sobre el
medio sólido.
9. Método según la reivindicación 1, en el que el
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
está presente en el medio sólido durante la etapa de crecimiento
preliminar.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que también implica poner en contacto
el producto cromógeno con un revelador, para formar dicho
indicador.
11. Método según la reivindicación 3 u 8, que
también implica poner en contacto el producto cromógeno con un
revelador para formar dicho indicador, en el que dicho revelador
está presente en el medio sólido en la etapa de crecimiento
preliminar.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el indicador que
sustancialmente no se difunde es visible en la etapa de crecimiento
preliminar.
13. Método según la reivindicación 1, en el que
el sustrato es un derivado ribofuranosílico, enlazado a través de
oxígeno, de un compuesto hidroxílico seleccionado de derivados
1,2-dihidroxibencénicos, indoxilos y
p-naftolbenzeína, y sus derivados.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
el sustrato es un derivado
O-\beta-D-ribofuranosílico
de 1,2-dihidroxibenceno.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
el \beta-D-ribofuranósido
cromógeno se representa mediante una de las siguientes fórmulas:
en las que Y y R son hidrógeno o
grupos orgánicos que no interfieren con la ruptura enzimática o
formación del indicador, y cada uno de Z^{1}, Z^{2}, Z^{3} y
Z^{4} puede ser H o un resto
\beta-D-ribofuranosílico, con la
condición de que Z^{1} y Z^{2}, o Z^{3} y Z^{4}, no sean
simultáneamente
H.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
Y y R son restos orgánicos que contienen menos de 40 átomos,
preferiblemente menos de 30 átomos, y más preferiblemente menos de
20 átomos.
17. Método según la reivindicación 15, en el que
cada R se selecciona de los grupos H, alquilo de C_{1} a C_{6},
alcoxi de C_{1} a C_{6} e hidroxialquilo de C_{1} a C_{6},
halógeno, nitro, acilo, arilo y amido; o dos grupos adyacentes R
pueden estar unidos para formar un sistema de anillo condensado, con
el anillo mostrado en las fórmulas I y II, tal como un anillo
condensado que tiene opcionalmente un carácter aromático, y que
incluye opcionalmente uno o más heteroátomos.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, en el que la porción cromógena es un resto
de catecol.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
la porción cromógena comprende una estructura de
dihidroxibenzaldehído, dihidroxibenzofenona, dihidroxiflavonoide,
dihidroxieurona o dihidroxicalcona.
20. Método según la reivindicación 17, en el que
cada R se selecciona de los grupos H, alquilo de C_{1} a C_{6},
alcoxi de C_{1} a C_{6} e hidroxialquilo de C_{1} a C_{6},
halógeno, nitro, acilo, arilo y amido, grupos R los cuales no están
enlazados entre sí.
21. Método según la reivindicación 20, en el que
Y comprende un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido
que contiene 5 a 18 átomos anulares.
22. Método según la reivindicación 21, en el que
Y tiene la estructura de IX o X
en las que (R^{9})_{n} y
(R^{11})_{n} representan uno o más sustituyentes, y
R^{10} y R^{12} son H o sustituyentes, todos los cuales no
interfieren con la acción enzimática o la quelación del ión
metálico.
23. Método según la reivindicación 22, en el que
cada uno de R^{9} y R^{11} se selecciona independientemente del
grupo que consiste en grupos hidroxilo, alquilo de
C_{1-24}, alquenilo de C_{2-24},
alcoxi de C_{1-6}, acilo, incluyendo -CHO y COPhe,
en el que Phe es fenilo, =O, halógeno, nitro, arilo y aciloxi, y n
es 0, 1 ó 2.
24. Método según la reivindicación 23, en el que
R^{9} y R^{11} son alcoxi de C_{1-4}.
25. Método según la reivindicación 22, en el que
R^{10} y R^{12} se seleccionan del grupo que consiste en grupos
hidrógeno, hidroxilo, alquilo de C_{1-24},
alquenilo de C_{2-24}, alcoxi de
C_{1-6}, acilo, incluyendo -CHO y COPhe, en el que
Phe es fenilo, =O, halógeno, nitro, arilo y aciloxi.
26. Método según la reivindicación 13, en el que
el \beta-D-ribofuranósido
cromógeno se selecciona de
catecol-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
quercetin-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxicalcona-4-\beta-D-ribofuranósido,
4-nitrocatecol-1-\beta-D-ribofuranósido,
3,3',4'-trihidroxi-flavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxi-3-(alcoxi
C_{1-6})flavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
y
3',4'-dihidroxiaurona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3-metoxi-3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
y
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-ribofuranósido.
27. Método según la reivindicación 10, en el que
la porción cromógena del
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
es como se define según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 26,
en el que el revelador es un ión metálico, preferiblemente hierro,
aluminio o bismuto.
28.
\beta-D-Ribofuranósido cromógeno
representado mediante una de las siguientes fórmulas
en las que Y y R son hidrógeno o
grupos orgánicos, y cada uno de Z^{1}, Z^{2}, Z^{3} y Z^{4}
puede ser H o un resto
\beta-D-ribofuranosílico, con la
condición de que Z^{1} y Z^{2}, o Z^{3} y Z^{4}, no sean
simultáneamente H, e Y no sea un grupo alquilo sustituido cuando
todos los grupos R sean
H.
29.
\beta-D-Ribofuranósido cromógeno
según la reivindicación 28, en el que Y y R son restos orgánicos que
contienen menos de 40 átomos, preferiblemente menos de 30 átomos, y
más preferiblemente menos de 20 átomos.
30.
\beta-D-Ribofuranósido cromógeno
según la reivindicación 29, en el que cada R se selecciona de los
grupos H, alquilo de C_{1} a C_{6}, alcoxi de C_{1} a C_{6}
e hidroxialquilo de C_{1} a C_{6}, halógeno, nitro, acilo, arilo
y amido; o dos grupos adyacentes R pueden estar unidos para formar
un sistema de anillo condensado, con el anillo mostrado en las
fórmulas I y II, tal como un anillo condensado que tiene
opcionalmente un carácter aromático, y que incluye opcionalmente uno
o más heteroátomos.
31.
\beta-D-Ribofuranósido cromógeno
según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en el que cada R
es H o un grupo omonofuncional.
32.
\beta-D-Ribofuranósido cromógeno
según la reivindicación 31, en el que Y comprende un grupo arilo o
heteroarilo sustituido o no sustituido que contiene 5 a 18 átomos
anulares.
33.
\beta-D-Ribofuranósido cromógeno
según la reivindicación 32, en el que Y tiene la estructura de IX o
X
en las que cada uno de R^{9} y
R^{11} se selecciona independientemente del grupo que consiste en
grupos hidroxilo, alquilo de C_{1-24}, alquenilo
de C_{2-24}, alcoxi de C_{1-6},
acilo, incluyendo -CHO y COPhe, en el que Phe es fenilo, =O,
halógeno, nitro, arilo y aciloxi; R^{10} y R^{12} se seleccionan
del grupo que consiste en grupos hidrógeno, hidroxilo, alquilo de
C_{1-24}, alquenilo de C_{2-24},
alcoxi de C_{1-6}, acilo, incluyendo -CHO y
COPhe, en el que Phe es fenilo, =O, halógeno, nitro, arilo y
aciloxi; y n es 0, 1 ó
2.
34. Compuesto según la reivindicación 31, que
comprende:
- i)
- una porción cromógena que comprende un resto de catecol formado a partir de catecol, nitrocatecol, dihidroxiflavonoide tal como dihidroxiflavona, dihidroxiisoflavona, dihidroxiflavanona, dihidroxiisoflavanonas, dihidroxiflavano, trihidroxiflavano o dihidroxiisoflavano, dihidroxiaurona, dihidroxicalcona, dihidroxibenzaldehído, dihidroxibenzofenona, o semicarbazona de dihidroxibenzadehído, o quercetina;
- ii)
- un grupo escindible mediante enzima, que es \beta-D-ribofuranosilo enlazado al átomo de oxígeno derivado de un grupo hidroxilo del resto de catecol, mediante un enlace de tipo éter.
35.
\beta-D-Ribofuranósido cromógeno
según la reivindicación 34, en el que el
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
se selecciona de
catecol-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
quercetin-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxibenzaldehído-4-\beta-D-ribofuranósido,
3,4-dihidroxicalcona-4-\beta-D-ribofuranósido,
4-nitrocatecol-1-\beta-D-ribofuranósido,
3,3',4'-trihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
3',4'-dihidroxi-3-(alcoxiC_{1-6})flavona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
y
3',4'-dihidroxiaurona-4'-\beta-D-ribofuranósido,
y semicarbazona de
3,4-dihidroxibenzadehído-4-\beta-D-ribofuranósido.
36. Kit de componentes para uso en la detección
de la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa sobre
medio sólido, que es capaz de mantener el crecimiento de microbios,
que comprende un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
que comprende un grupo de
\beta-D-ribofuranosilo y una
porción cromógena, siendo escindible dicha porción cromógena,
mediante \beta-D-ribofuranosidasa,
del grupo de
\beta-D-ribofuranosilo, liberando
el producto cromógeno que forma un indicador, que es o que se forma
a partir del producto cromógeno, y que no se difunde sustancialmente
en el medio sólido, y componentes capaces de formar el medio
sólido.
37. Kit según la reivindicación 36, que también
comprende un revelador.
38. Kit según la reivindicación 37, en el que la
porción cromógena del
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
es según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, y el revelador
es un ión metálico, preferiblemente una sal de hierro o una sal de
aluminio o una sal de bismuto.
39. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
36 a 38, en el que el
\beta-D-ribofuranósido cromógeno,
los componentes del medio de crecimiento sólido y cualquier
revelador están en mezcla.
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