ES2230598T3 - Procedimiento de determinacion cuantitativa de los colesteroles de la lipoproteinas de baja densidad. - Google Patents

Abstract

PROCEDIMIENTOS PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DEL COLESTEROL LDL, QUE INCLUYE LOS PASOS DE AÑADIR AL SUERO UN TENSOACTIVO SELECCIONADO ENTRE FENIL ETERES DE POLIOXIETILENO- ALQUILENO Y ETERES TRIBENCILFENIL DE POLIOXIETILENEALQUILENO Y UN COLESTEROL- ENSAYANDO UN REACTIVO ENZIMATICO QUE PREFERENTEMENTE HAGA REACCIONAR COLESTEROLES CON ALTA DENSIDAD- Y COLESTEROLES DE MUY BAJA DENSIDAD ENTRE LIPOPROTEINAS, Y A CONTINUACION DETERMINANDO LA CANTIDAD DE COLESTEROL QUE REACCIONA POSTERIORMENTE. ESTE PROCEDIMIENTO PUEDE ELIMINAR LA POSIBILIDAD DE PRETRATAMIENTOS TALES COMO CENTRIFUGACION Y ELECTROFORESIS, PERMITIENDO QUE LA DETERMINACION CUANTITATIVA SEA REALIZADA DE UNA FORMA EFICIENTE Y SIMPLE, Y PUDIENDO SER APLICADO CON VARIOS ANALIZADORES AUTOMATICOS.

Description

Procedimiento de determinación cuantitativa de los colesteroles de las lipoproteínas de baja densidad.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para determinar cuantitativamente colesterol de LDL (lipoproteína de baja densidad) de una manera sencilla y eficaz, que requiere una pequeña cantidad de muestras y no requiere ningún tratamiento para la separación, como centrifugado o electroforesis.

Antecedentes de la invención

Los lípidos, como por ejemplo los colesteroles, se unen a apoproteínas en suero para formar lipoproteínas. Las lipoproteínas se clasifican típicamente en quilomicrones, lipoproteínas de densidad muy baja (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de alta densidad (HDL), etc. según las propiedades físicas. Entre ellas, se sabe que LDL es una sustancia causal que induce a la arteriosclerosis.

Diversos estudios epidemiológicos han aclarado que el nivel de colesterol LDL está fuertemente relacionado con la frecuencia del inicio de enfermedades arterioscleróticas. Por lo tanto, la realización de medidas del colesterol LDL a través de un método de rutina sencillo podría ser muy útil clínicamente.

En lo que se refiere a los métodos convencionales para medir el colesterol LDL, se conoce por ejemplo un método en el que se separa LDL de otras lipoproteínas por ultracentrifugado para medir el colesterol, y un método en el que se manchan los lípidos tras la separación por electroforesis con el fin de medir la intensidad del color revelado. Sin embargo, la mayoría de estos métodos no se utilizan rutinariamente como consecuencia de las complicadas operaciones y limitaciones que suponen el manejo de los diversos espécimenes. Se conoce asimismo un método en el que se sensibiliza un vehículo con un anticuerpo que se une a una lipoproteína distinta a LDL, después se mezcla con una muestra, y se fracciona una fracción no unida al vehículo para medir los colesteroles que contiene. Aunque este método es más adecuado para un ensayo de rutina, en comparación con los dos métodos anteriores, el procedimiento de ensayo implica etapas manuales, lo que hace que la automatización de los procedimientos de ensayo sea difícil. Así pues, sigue sin contarse con un método adecuado para manejar un amplio número de espécimenes.

Al mismo tiempo, en lo que se refiere a un método para determinar cuantitativamente y fraccionadamente lipoproteínas en una muestra sin utilizar medios de separación como ultracentrifugado o electroforesis, se conoce un método según el cual, tras la determinación fraccionada de colesteroles en HDL y otras lipoproteínas (es decir, quilomicrón, VLDL y LDL), se emplea la reactividad de enzimas (típicamente colesterol oxidasa y colesterol esterasa) para inducir exclusivamente colesterol HDL a la reacción de enzima. Por ejemplo, en la solicitud de patente japonesa abierta (kokai) Nº 7-301636 se describe un método para medir exclusivamente colesterol HDL mediante el uso de un agente tensioactivo y un compuesto de azúcar, y en la solicitud de patente japonesa abierta (kokai) Nº 6-242110 se describe un método para medir exclusivamente colesterol en una lipoproteína objetivo aglutinando lipoproteínas distintas a la lipoproteína que se va a medir con el fin de controlar la reactividad con una enzima. Estos métodos son significativamente útiles en lo que se refiere a su aplicabilidad para analizadores automáticos que llevan a cabo la automatización de todas las etapas. Sin embargo, estos métodos presentan limitaciones ya que sólo pueden determinar cuantitativamente HDL fraccionadas de lipoproteínas distintas a HDL, y no tienen capacidad de determinar LDL cuantitativamente y fraccionadamente a partir de una mezcla de VLDL y quilomicrón. Por lo tanto, estos métodos no pueden satisfacer el objetivo de medir el colesterol LDL sin recurrir a medios de separación.

En la solicitud de patente japonesa abierta (kokai) Nº 7-280812 se describe un método para determinar colesterol LDL que comprende las etapas de aglutinación de LDL; eliminación de colesteroles en otras lipoproteínas a través de un sistema que difiere del sistema para determinar LDL; disolución de la aglutinación de LDL; y reacción del colesterol LDL. Sin embargo, al igual que los métodos de las dos publicaciones mencionadas, la solicitud de patente japonesa abierta (kokai) Nº 7-280812 no propone ninguna solución para determinar cuantitativa y fraccionadamente LDL y VLDL y/o quilomicrón, siendo esto absolutamente esencial para determinar el colesterol LDL. Este método supone un problema más; no puede aplicarse a los analizadores automáticos comúnmente utilizados debido al gran número de etapas requeridas para el ensayo, lo que hace que este método tenga un uso limitado.

Así pues, con las técnicas convencionales, nunca se ha podido realizar un ensayo eficaz del colesterol LDL sin realizar una operación de separación y, además, no existe información que indique la posibilidad de realizar dicha medida.

Por consiguiente, uno de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar un método para determinar cuantitativamente el colesterol LDL eficazmente y de una manera sencilla al mismo tiempo que se elimina la necesidad de tratamientos previos como centrifugado o electroforesis y que se puede aplicar a diversos analizadores automáticos.

Descripción de la invención

Teniendo en cuenta todo lo anterior, los autores de la presente invención han llevado a cabo exhaustivos estudios y han observado que la reacción con un reactivo de enzima de ensayo de colesterol llevada a cabo en presencia de un agente tensioactivo específico que disuelve las lipoproteínas acelera la reacción del colesterol HDL y el colesterol VLDL y retarda considerablemente la reacción del colesterol LDL; que la reacción del colesterol HDL y el colesterol VLDL se terminan antes de la reacción de colesterol LDL; y que el colesterol LDL se puede medir cuantitativamente y fraccionadamente a través de una selección apropiada de un punto de medida, permitiendo la aplicación en analizadores automáticos. La presente invención ha sido completada en función de estos hallazgos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para determinar cuantitativamente colesterol LDL, que consiste en las etapas de adición al suero de un agente tensioactivo seleccionado entre éteres polioxietilenalquilen fenílicos y ésteres polioxietilenalquilen tribencilfenílicos y un reactivo de enzima de ensayo de colesterol, para inducir así reacciones preferenciales de colesteroles entre lipoproteínas de alta densidad y lipoproteínas de densidad muy baja, y determinar a continuación la cantidad de colesterol que reacciona después.

La presente invención proporciona asimismo un método para determinar cuantitativamente el colesterol LDL, que se caracteriza por comprender las etapas de adición al suero de un agente tensioactivo seleccionado entre éteres polioxietilenalquilen fenílicos y éteres polioxietilenalquilen tribencilfenílicos, una sustancia que presenta una afinidad de unión más fuerte para VLDL que para LDL, y un reactivo de enzima de ensayo de colesterol, para inducir así reacciones preferenciales de colesteroles entre lipoproteínas de alta densidad y lipoproteínas de densidad muy baja, y a continuación, determinar la cantidad de colesterol que reacciona después.

Por otra parte, la presente invención proporciona un equipo para determinar cuantitativamente el colesterol LDL, que comprende un reactivo de enzima de ensayo de colesterol y un agente tensioactivo se-
leccionado entre éteres polioxietilenalquilen fenílicos y éteres polioxietilenalquilen tribencilfenílicos.

Asimismo, la presente invención proporciona un equipo para determinar cuantitativamente el colesterol LDL tal como se ha descrito antes, que incluye además una sustancia que presenta una afinidad de unión más fuerte para VLDL que para LDL.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1 muestra la correlación de las medidas de colesterol LDL obtenidas en el ejemplo 1 a través de un método según la presente invención y las medidas del colesterol LDL obtenidas por ultracentrifugado.

La figura 2 muestra la correlación de las medidas de colesterol LDL obtenidas en el ejemplo 2 a través de un método según la presente invención y las medidas de colesterol LDL obtenidas por ultracentrifugado.

La figura 3 muestra la correlación de las medidas de colesterol LDL obtenidas en el ejemplo 3 a través de un método según la presente invención y las medidas del colesterol LDL obtenidas por ultracentrifugado.

Modos de realización de la invención preferibles

Los agentes tensioactivos que se emplean en la presente invención se seleccionan entre éteres polioxietilenalquilen fenílicos y éteres polioxietilenalquilen tribencilfenílicos y disuelven lipoproteínas. Entre los ejemplos de los primeros éteres mencionados se incluyen Emulgen A-60 (producto de Kao Corporation) y entre los ejemplos de los segundos éteres se incluyen Emulgen B66 (producto de Kao Corporation). Los agentes tensioactivos se pueden utilizar en solitario o combinando dos o más especies. La cantidad utilizada depende del compuesto y no está limitada en particular. En condiciones normales, los agentes tensioactivos se utilizan preferiblemente en una concentración de 0,01 a 2% en peso para obtener una sensibilidad que permita la detección del colesterol LDL dentro del tiempo de ensayo deseado, que difiere según el aparato de análisis en el que se aplica el reactivo.

El método de ensayo del colesterol según la presente invención se pone en práctica preferiblemente en presencia de una sustancia que tiene una afinidad de unión más fuerte para VLDL que para LDL. En particular, cuando el espécimen es suero con contenido en quilomicrón, la adición de la sustancia mencionada proporciona resultados de ensayo excelentes. Entre los ejemplos de dichas sustancias se incluyen polianiones y sustancias que forman una sal metálica divalente. Entre los ejemplos específicos de polianiones se incluyen ácido fosfotungstíco y sales del mismo, sulfato de dextrano y heparina; y entre los ejemplos más específicos de dichas sustancias se incluyen cloruros de metal divalentes como MgCl_{2}, CaCl_{2}, MnCl_{2}, o NiCl_{2} o hidratos de los mismos. Estas sustancias se pueden utilizar en solitario o combinando dos o más especies. La cantidad utilizada depende del compuesto y no está limitada de manera particular. Preferiblemente, los polianonies se utilizan en una cantidad de 0,002 a 10% en peso y las sustancias que forman iones de metal divalentes se utilizan en una cantidad de 0,01 a 1% en peso, ambos en lo que se refiere a la concentración final en la reacción.

Se añaden un agente tensioactivo y una sustancia que presenta una afinidad de unión más fuerte para VLDL que para LDL al suero que sirve como espécimen, pudiéndose añadir por separado o como una mezcla. Brevemente, se pueden añadir la primera sustancia, la segunda y una enzima de ensayo de colesterol por separado; se pueden añadir una mezcla de la primera sustancia y la segunda, o lo contrario y un reactivo de enzima de ensayo de colesterol, por separado; o una mezcla de los tres componentes, como reactivo.

Se puede emplear cualquiera de los métodos de ensayo enzimáticos conocidos para el ensayo de los colesteroles. Entre los ejemplos de métodos se incluyen un método en el que se emplea una combinación de colesterol esterasa y colesterol oxidasa como reactivo de enzima, así como un método en el que se emplea una combinación de colesterol esterasa y colesterol dehidrogenasa como reactivo de enzima. Entre ellos, es preferible un método en el que se emplea una combinación de colesterol esterasa y colesterol oxidasa. No se impone ninguna limitación en particular sobre el método para detectar finalmente los colesteroles después de la adición de estos reactivos de enzima de ensayo de colesterol, incluyéndose entre sus ejemplos análisis de medida de la absorción empleando una combinación de peroxidasa y cromogeno y detección directa de una coenzima o peróxido de hidrógeno.

Para realizar el ensayo de colesterol LDL, se determina la cantidad de reacción relevante una vez terminadas las reacciones de colesteroles en lipoproteínas distintas a LDL. Se puede emplear un método en el que la reacción de los colesteroles en las lipoproteínas distintas a LDL se completa sustancialmente después de dejar que prosiga la reacción durante un período de tiempo especifico, y se vigila cinéticamente la reacción que tiene lugar después. Alternativamente, se puede emplear un método en el que se añade además un agente de aceleración de la reacción para acelerar la reacción de LDL, la reacción que se produce entonces se mide a través de un método de reacción de punto final; y el valor se ajusta mediante el uso de un valor en blanco (método de 2 puntos). En lo que se refiere a los agentes de aceleración de la reacción que se pueden usar en el método de dos puntos se incluyen los mismos agentes tensioactivos que los utilizados en la reacción de los colesteroles en lipoproteínas distintas a LDL en una concentración mayor y otro tipo de agente tensioactivo. En el método de dos puntos, se pueden introducir los colesteroles en otro sistema de reacción aislado del sistema para determinar el LDL para detectar exclusivamente la reacción del colesterol LDL durante la reacción de los colesteroles en lipoproteínas distintas a LDL.

Entre los ejemplos de otras lipoproteínas contenidas en el suero se incluyen quilomicrón, que aparece típicamente de forma exclusiva tras la ingestión de alimentos. Quilomicrón tiene aproximadamente la misma reactividad que VLDL. Por lo tanto, la reactividad de quilomicrón también se acelera de manera similar a VLDL por adición de polianiones, una sustancia que forma iones metálicos divalentes, etc. y la reacción de quilomicrón se completa también cuando se completa la reacción de VLDL. Por consiguiente, el colesterol LDL se puede determinar cuantitativamente y fraccionadamente a través de la medida de la cantidad de reacción de colesterol después.

Ejemplos

La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, quedará descrita a continuación con los ejemplos, que no deberán considerarse como limitativos de la invención.

Ejemplo 1

Se ensayaron espécimenes de suero con lípidos normal para determinar el colesterol LDL a través del método de la presente invención mediante el uso de un analizador automático modelo 7070 de Hitachi, y se compararon las medidas con las obtenidas por ultracentrifugado. En la figura 1 se muestran los resultados.

Brevemente, se añadió al espécimen (4 \mul), un reactivo (300 \mul) que contenía fosfotungstato sódico (0,02% en peso) y MgCl_{2}.6H_{2}O (0,2% en peso). Aproximadamente cinco minutos depués, se añadió un reactivo de ensayo de colesterol (100 \mul) que contenía Emulgen A-60 (producto de Kao Corporation) (0,5% en peso), colesterol esterasa (1 U/ml), colesterol oxidasa (1 U/ml), peroxidasa (1U/ml), 4-aminoantipirina (0,005% en peso) y N,N-dimetil-m-toluidina (0,04% en peso) y se midieron los cambios de la absorbancia a 545 nm durante un período de un minuto a cinco minutos tras la adición de un segundo aditivo.

Para el ultracentrifugado, se sometió el suero a centrifugado a 100.000 g durante dos horas mediante el uso de una ultracentrífuga, para eliminar así la capa superior. Se añadió a una parte alícuota (1 ml) recogida de la capa inferior resultante una solución de heparina (40 \mul; heparina = 5000 unidades usp/ml) y una solución MgCl_{2} 1M (50 \mul) y se centrifugó la mezcla a 5000 rpm durante 30 minutos para obtener así un sobrenadante. Se sometieron a un ensayo de colesterol la solución (que contenía LDL y HDL) de la capa inferior obtenida por ultracentrifugado y el sobrenadante fraccionado (que contenía HDL) obtenido tras la adición de una solución de heparina y una solución de MgCl_{2}, representando el valor obtenido al sustraer éste último del primero el nivel de colesterol LDL (Referencia; Paul S. Bachorik y cols. Clin. Chem. 41/10, 1414-1420, 1955).

Tal como se observa en la figura 1, la presente invención proporciona medidas que tienen una excelente correlación con las obtenidas a través del centrifugado convencional, a pesar de que el método de la presente invención requiere una pequeña cantidad de muestra y puede llevarse a cabo de un modo sencillo.

Ejemplo 2

Se ensayó un espécimen que contenía suero con contenido en quilomicrón que tenía un alto nivel en triglicéridos para determinar el colesterol LDL a través del método de la presente invención mediante el uso de un analizador automático 7070 modelo Hitachi, y se compararon las medidas con las obtenidas por ultracentrifugado. En la figura 2 se muestran los resultados.

Brevemente, se añadió al espécimen (4 \mul) un reactivo (300 \mul) que contenía Emulgen B66 (producto de Kao Corporation) (0,5% en peso), colesterol esterasa (0,3 U/ml), colesterol oxidasa (0,3 U/ml), peroxidasa (0,3 U/ml) y 4-aminoantipirina (0,002% en peso). Aproximadamente cinco minutos después, se añadió un reactivo (100 \mul) que contenía Triton X-100 (1% en peso) y N,N-dimetil-m-toluidina (0,04 % en peso) y se midieron los cambios de absorbancia sustrayendo la absorbancia medida a 545 nm antes de la adición del segundo reactivo de la medida cinco minutos después de su adición (corrección teniendo en cuenta el cambio de cantidad de los reactivos).

En la etapa de ultracentrifugado, se repitió el procedimiento del ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 2, de manera similar al ejemplo 1, en el ejemplo 2, se obtuvieron medidas del colesterol LDL que tenían una excelente correlación con las obtenidas a través del centrifugado convencional.

Ejemplo 3

Se repitió el procedimiento del ejemplo 2, mediante el uso del mismo espécimen y los mismos reactivos con la excepción de que se incorporó además ácido fosfotungstíco (0,3% en peso) en el primer reactivo, y se compararon las medidas con las obtenidas por ultracentrifugado. En la figura 3 se muestran los resultados.

Tal como se observa en la figura 3, de manera similar al ejemplo 1, en el ejemplo 3 se obtuvieron medidas del colesterol de LDL que tenían una excelente correlación con las obtenidas por centrifugado convencional, a pesar de que se utilizó un suero que contenía quilomicrón.

Aplicación industrial

La presente invención elimina la necesidad de tratamientos previos como son el centrifugado y la electroforesis y permite realizar una determinación cuantitativa de colesterol LDL, fraccionada para los colesteroles contenidos en otras lipoproteínas, que se puede llevar a cabo de una manera eficaz, sencilla y por lo tanto se puede aplicar a diversos aparatos de análisis automáticos utilizados en los exámenes clínicos. Así pues, la invención es enormemente útil en el campo clínico.

Claims (4)

1. Un método para determinar cuantitativamente colesterol de lipoproteína de baja densidad que comprende las etapas de:

(a) adición al suero de

(i) un agente tensioactivo seleccionado entre éteres polioxietilenalquilen fenílicos y éteres polioxietilenalquilen tribencilfenílicos y

(ii) un reactivo de ensayo de ensayo de colesterol,

para inducir así las reacciones preferenciales de colesteroles entre lipoproteínas de alta densidad y lipoproteínas de densidad muy baja y posteriormente

(b) determinación de la cantidad del colesterol que reacciona después.

2. El método para determinar cuantitativamente el colesterol de lipoproteína de baja densidad según la reivindicación 1, en el que además del agente tensioactivo y la enzima de ensayo de colesterol, se añade una sustancia que presenta una afinidad de unión más fuerte para la lipoproteína de densidad muy baja que para la lipoproteína de baja densidad, siendo la sustancia que presenta una afinidad de unión más fuerte para la lipoproteína de densidad muy baja que para la lipoproteína de baja densidad un polianión seleccionado del grupo que consiste en ácido fosfotúngstico y sales del mismo, sulfato de dextrano y heparina, o una sustancia que forma un cloruro de metal divalente seleccionado del grupo que consiste en MgCl_{2}, CaCl_{2}, MnCl_{2}, NiCl_{2} o hidratos de los mismos.

3. Un equipo para determinar cuantitativamente un colesterol de lipoproteína de baja densidad que comprende un reactivo de ensayo de ensayo de colesterol y un agente tensioactivo seleccionado entre éteres polioxietilenalquilen fenílicos y éteres polioxietilenalquilen tribencilfenílicos.

4. El equipo para la determinación cuantitativa según la reivindicación 3, que comprende además una sustancia que presenta una afinidad de unión más fuerte para la lipoproteína de densidad muy baja que para la lipoproteína de baja densidad, siendo la sustancia que presenta una afinidad de unión más fuerte para la lipoproteína de densidad muy baja que para la lipoproteína de baja densidad un polianión seleccionado del grupo que consiste en ácido fosfotungstico y sales de los mismos, sulfato de dextrano y heparina o una sustancia que forma un cloruro de metal divalente seleccionado del grupo que consiste en MgCl_{2}, CaCl_{2}, MnCl_{2}, NiCl_{2} o hidratos de los mismos.