ES2231835T3

ES2231835T3 - Genes biosinteticos ii de biotina.

Info

Publication number: ES2231835T3
Application number: ES97116237T
Authority: ES
Inventors: Yasuhiro Furuichi; Tatsuo Hoshino; Hitoshi Kimura; Tatsuya Kiyasu; Yoshie Nagahashi
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2005-05-16
Anticipated expiration: 2017-09-18
Also published as: US20020123109A1; DE69731451T2; US6723544B2; DK0853127T3; EP0853127A2; CN1178834A; BR9704908A; DE69731451D1; EP0853127A3; ATE281527T1; JPH10179172A; US6117669A; CN1154722C; US20040137584A1; US6365388B1; US6955906B2; JP4267715B2; EP0853127B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DEL PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE BIOTINA MEDIANTE FERMENTACION, UTILIZANDO UN ORGANISMO OBTENIDO MEDIANTE INGENIERIA GENETICA, Y DE SECUENCIAS DE ADN Y VECTORES PARA SER UTILIZADOS EN DICHO PROCEDIMIENTO.

Description

Genes biosintéticos II de biotina.

La presente invención, se refiere a un procedimiento de producción de biotina, mediante fermentación, utilizando un organismo creado por ingeniería genética.

La biotina, es una de las vitaminas esenciales para la nutrición de animales, plantas y microorganismos, y es muy importante como aditivo de medicinas o de alimentos.

La biosíntesis de la biotina de la Escherichia coli, se ha estudiado bien, y se ha clarificado el hecho de que, la biotina, se sintetiza a partir pimelil CoA, vía el ácido 7-ceto-8-amino-pelargónico (KAPA), el ácido 7,8-diamino-pelargónico (DAPA) y destiobiotina (DTB)[Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, 544 (1987). El análisis de la información genética involucrada en la biosíntesis de la biotina, ha sido objeto de avance, en Escherichia coli (J. Biol. Chem., 263 19577, (1988), y Bacillus sphaericus (Patente estadounidense US nº 5.096.823). Se conoce que, por lo menos cuatro enzimas, se encuentran involucradas en esta trayectoria biosintética. Estas cuatro enzimas, se encuentran codificadas por los genes bioA, bioB, bioD, y bioF. El gen bioF, codifica para la KAPA sintetasa, la cual cataliza la conversión de pimelil CoA en KAPA. El gen BioA, codifica para la DAPA sintetasa, la cual convierte KAPA en DAPA. El gen BioD, codifica para la DTB sintetasa, la cual convierte la DAPA en DTB. El gen biB, codifica para la biotina sintetasa, la cual convierte la DTB, en biotina. Se ha reportado, también, el hecho de que, los genes bioC y bioH, se encuentran involucrados en la síntesis de pimelil coA, en la Escherichia coli.

Existen muchos estudios centralizados en la producción fermentativa de la biotina. Se han utilizado las Escherichia coli (patente Kokai japonesa nº 149091 / 1986 y patente Kokai japonesa nº 155081 / 1987), Bacillus sphaericus (patente Kokai japonesa nº 180174 / 1991), Serratia marcescens (patente Kokai japonesa nº 27980 / 1990), y Brevibacterium flavum (patente Kokai japonesa nº 240489 / 1991). Pero, estos procedimientos, no han sido todavía apropiados para su utilización en un procedimiento inherente a un proceso de producción industrial, debido al hecho de su reducida productividad. Además, grandes cantidades de DTB, un precursor de la biotina, se acumulan en la fermentación de esta bacteria. Así, por lo tanto, se ha asumido el hecho de que, la última etapa de la trayectoria biosintética de la biotina, desde la DTB hasta la biotina, es una etapa limitativa de la tasa limitativa.

Por otro lado, se encontró el hecho de que, una cepa bacteriana que pertenecía al género Kurthia, producía DTB, y reducidas cantidades de biotina. También, los mutantes los cuales producen unas cantidades mucho más grandes de biotina, se derivaban de cepas del tipo salvaje, del género Kurthia, mediante la selección de, antimetabolitos acidomicina ((ACM), ácido 5-2(tienil)-valérico (TVA), y alfa-metil-destiobiotina (MeDTB), de resistencia a la biotina. No obstante, en vistas a los todavía reducidos títulos, es deseable el aplicar la ingeniería genética, con objeto de mejorar la productividad de la biotina, en dichos mutantes.

La presente invención, se refiere, por lo tanto, a los fragmentos cromosómicos de DNA, los cuales portan los genes involucrados en la biosíntesis de la biotina de Kurthia sp. Los fragmentos cromosómicos de DNA, aislados, portan 8 genes, los genes bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, bioFII, bioH y bioHIII, y secuencias regulatorias transcripcionales. El gen bioFII, codifica a una isozima del producto del gen bioF. El gen bioIII, codifica para una isozima del producto del gen bioH.

La presente invención, se refiere adicionalmente a cepas de Kurthia sp., en las cuales, se amplifica por lo menos un gen involucrado en la biosíntesis de la biotina y, también, al procedimiento de producción de la biotina, mediante esta cepa de Kurthia sp., obtenida mediante ingeniería genética.

A pesar de que, el fragmento de DNA anteriormente mencionado, arriba, puede ser de varios orígenes, es preferible el utilizar las cepas pertenecientes al género Kurthia. Los ejemplos específicos de tales tipos de cepas, incluyen, por ejemplo, a la Kurthia sp. 538-6 (DSM Nº 9454) y a sus cepas mutantes, mediante la selección antimetabolitos de resistencia a la biotina, tales como la Kurthia sp. 538-KA26 (DSM Nº 10609).

Hablando de una forma general, la presente invención, se dirige a secuencias de DNA que codifican a polipéptidos representados por las SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16, y derivados funcionales de estos polipéptidos, los cuales contienen la adición / inserción / deleción y / o sustitución de uno o más residuos de aminoácido(s), y un vector que comprende una o más secuencias de DNA, de una forma específica, un vector, en donde, las citadas secuencias de DNA, se encuentran funcionalmente ligadas a una frecuencia o a frecuencias de promotores y, adicionalmente, a un célula transformadas mediante una o más secuencias de DNA o vector(es), tal y como se han definido anteriormente, arriba, y a un procedimiento para la producción de biotina, el cual comprende el cultivo de la célula, tal y como se ha definido anteriormente, arriba, en un medio, y el aislamiento de la biotina resultante, del medio de cultivo, mediante procedimientos conocidos en el arte especializado de la técnica y, de una forma más específica, a un procedimiento en donde, el cultivo, se efectúa en un transcurso de tiempo que va de 1 a 10 días, de una forma preferible, de 2 a 7 días, a un pH de 5 a 9, de una forma preferible, de 6 a 8, y a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van de 10 a 45ºC, de una forma preferible, de 25 a 30ºC.

Finalmente, la presente invención, se dirige también a un procedimiento para la preparación de composiciones farmacéuticas, de alimentos, o de piensos, caracterizado por el hecho de que, la biotina obtenida mediante tales procedimientos, se mezcla con uno o más aditivos de los que se utilizan de una forma generalizada, y con los cuales se encuentra familiarizado el experto especializado en este arte de la técnica.

Posteriormente, a continuación, se describe un procedimiento detallado para el aislamiento de fragmentos de DNA que portan los genes que codifican para las enzimas involucradas en la biosíntesis de la biotina de estas cepas bacterianas.

Así, por lo tanto, el DNA, puede extraerse de la cepa Kurthia sp. 538-KA-26, mediante el conocido procedimiento del fenol. Este DNA, se digiere a continuación, parcialmente, mediante Sau3AI, y se liga con pBR322, digerido mediante BamHI, para construir una biblioteca genónica de Kurthia sp. 538-KA-26.

Los mutantes auxotróficos de biotina que se encuentran exentos de la capacidad biosintética para producir biotina, se transforman, con la biblioteca genómica obtenida anteriormente, arriba, y se seleccionan los transformantes que muestran prototrofia a la biotina. Los transformantes seleccionados, tienen los fragmentos genómicos de DNA que complementan los genes deficientes en los mutantes auxotróficos de biotina. Como mutantes auxotróficos de biotina, pueden utilizarse los Escherichia coli R875(bioB^{-}), R877(bioD^{-}), BM7086(bioH^{-}) y R878(bioC^{-})(J.Bacteriol., 112, 830-839(1972), J.Bacteriol., 143, 789-800, (1980). La transformación de tales tipos de cepas de Escherichia coli, puede llevarse a cabo en concordancia con un procedimiento convencional, tal como el procedimiento competente de la célula [Molecular Cloning, Cold Springer Harbor Laboratory Press, 252, (1982)].

En la presente invención, se obtuvo un plásmido híbrido, el cual complementa al mutante deficiente en biotina de Escherichia coli, de la forma descrita anteriormente, arriba. El plásmido hidrído obtenido, se denomina pKB100. El pKB100, corresponde al plásmido pBR322, el cual porta 5,58 Kb de un fragmento genómico de DNA, de la Kurthia sp. 538-KA26 y, su mapa de restricción de segmentación, se muestra en las figuras 1 y 2.

El plásmido híbrido denominado pKB200, el cual complementa al mutante deficiente en bioD de Escherichia coli, se obtuvo, también, de la forma que se describe anteriormente, arriba. El pKB200, corresponde al plásmido pBR322, que porta un fragmento de DNA de 7,87 Kb, de la Kurthia sp. 538-KA26, y su mapa de restricción de segmentación, se muestra en las figuras 1 y 3. El fragmento genómico de DNA, en el pKB200, se solapa de una forma completa, con el fragmento insertado del pKB100, y porta los genes 4bioF, bioB, bioD, ORF1 y ORF2, y una parte del gen bioA de Kurthia sp. 538-KA26, tal y como se muestra en la figura 9-A.

El gen bioA completo de Kurthia sp.538-KA26, puede aislarse mediante procedimientos convencionales, tales como el de hibridación de colonias, utilizando parte de los fragmentos genómicos de DNA en el pKB200, como una sonda. La totalidad de DNA de Kurthia sp.538-KA26, se digiere mediante una enzima de restricción, tal como la HindIII, y se liga con un vector plásmido, segmentado mediante la misma enzima de restricción. A continuación, la Escherichia coli, se transforma con los plásmidos de híbridos que portan fragmentos genómicos de DNA, de Kurthia sp. 538-KA26, para construir una biblioteca genómica. Como vector y cepa de Escherichia coli, pueden utilizarse, respectivamente, los pUC19 [Takara Shuzo Co. (Higashiira, Higashinotohin, Shimogyo-Mu, Kyoto-shi, Japón)] y Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo Co).

El plásmido híbrido denominado pKB300, el cual porta un fragmento genómico de DNA de 8,44 Kb de Kurthia sp 538-KA26, se obtuvo mediante hibridación de colonias y, su mapa de restricción de segmentación, se muestra en la figura 1. El fragmento genómico de DNA, en el PK300, porta dos cúmulos de genes involucrados en la biosíntesis de la biotina en la Kurthia sp. 538-KA26, tal y como se muestra en la figura 9-A. Un cúmulo, consiste en los genes ORF1, bioD y bioA. Otro cúmulo, consiste en los genes ORF2, bioF y biB. Las secuencias de nucleótidos de los genes bioD y bioA, se muestran en la SEQ ID No. 1 y la SEQ ID No. 3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos pronosticadas de los productos de genes bioD y bioA, se muestran en las SEQ ID N0. 2 y SEQ ID No. 4, respectivamente. El gen bioD, codifica para un polipéptido de 236 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 26.642. El gen bioA, codifica para un polipéptido de 460 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 51,731. El gen ORF1, codifica para un polipéptido de 194 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 21.516, pero, la función biológica de este producto de genes, es desconocida.

Las secuencias nucleótidas de los genes bioF y bioB, se muestran en la SEQ ID No. 5 y la SWQ ID No. 7, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos pronosticadas de los productos de los genes bioF y bioB, son la SEQ ID No. 6 y la SEQ ID No. 8, respectivamente. El gen bioF, codifica para la un polipéptido de 387 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 42.619. El gen bioB, codifica para la un polipéptido de 338 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 37,438. El gen ORF2, codifica para la un polipéptido de 63 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 7.447, pero, la función biológica de este producto de genes, es desconocida. Secuencias inversas repetidas, las cuales son señales transcripcionales de un terminador, se encuentran corriente debajo de los genes bioA y bioB. Tal y como se muestra en la figura 10, entre los genes ORF1 y ORF2, se encuentran dos secuencias promotoras de transcripción, las cuales inician transcripciones en ambas direcciones. Además, hay dos secuencias repetidas inversas denominadas Box1 y Box 2, involucradas en el control negativo de las transcripciones entre cada secuencia de promotor y cada codón de inicio translacional.

Adicionalmente, se obtuvieron dos plásmidos híbridos, los cuales complementan a los mutantes euxotróficos de Escherichia coli, de la forma descrita anteriormente, arriba. El plásmido híbrido denominado pK100, complementa al mutante deficiente en bioH y, el plásmido híbrido denominado pKC100, al mutante bioC. El pKH100 (figura 4 y 5) tiene un fragmento genómico de DNA de 1,91 Kb, de Kurthia sp. 538-KA26, el cual porta un cúmulo de genes consistente en los genes bioH y ORF3, tal y como se muestra en la figura 9-B. La secuencia de nucleótidos del gen bioH y la secuencia pronosticada de aminoácidos de este producto de genes, se muestran en las SEQ ID No. 8 y SEQ ID No. 10, respectivamente. El gen bioH, codifica para un polipéptido de 267 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 29.423. El gen ORF3, codifica para la un polipéptido de 86 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 9.955, pero, la función biológica de este producto de genes, es desconocida. Una secuencia de promotor, se encuentra corriente arriba del gen bioH, tal y como se muestra en la figura 11, y hay una secuencia repetitiva inversa, la cual es el terminador transcripcional, corriente debajo de los genes ORF3. Puesto que, la región promotora, no tiene secuencias inversas, tales como la Box1 y la Box2, se espera que, las expresiones de estos genes, no se regulen.

Por otro lado, el pKC100, porta un fragmento genómico de DNA de 6,76 Kb de Kurthia sp. 538-KA26, tal y como se muestra en las figura 6 y 7. El fragmento genómico de DNA, en el pK100, porta un cúmulo de genes, consiste en los genes bioFII, bioHII y bioC, tal y como se muestra en la figura 9-C. Los genes bioHII y bioFII, son genes para isozimas de los genes bioH y bioF, respectivamente, debido al hecho de que, los genes bioHIII y bioFII, complementan a los mutantes deficientes en bioH y deficientes en bioF, de Escherichia coli, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de los genes bioFII, bioHII y bioC, se muestran en las SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 15, respectivamente. Las secuencias pronosticadas de aminoácidos de los productos de los genes bioFII, bioHII y bioC, se muestran en las SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14 y SEQ ID No. 16, respectivamente. El gen bioFII, codifica para un polipéptido de 398 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 44.776. El gen bioHII, codifica para un polipéptido de 248 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 28.629. El gen bioC, codifica para un polipéptido de 276 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 31.599. Una secuencia de promotor, se encuentra corriente arriba del gen bioFII, y hay una secuencia repetitiva inversa, la cual se denomina Box 3, en la región del promotor, tal y como se muestra en la figura 12. La transcripción de estos genes, termina en una secuencia repetitiva inversa, la cual existe corriente abajo del gen bioC. Puesto que, la secuencia de nucleótidos de Box 3, es significativamente similar a las de los Box1 y Box2, la expresión de estos genes, se estima que se regula de una forma similar a los cúmulos de genes de bioA y bioB.

No es necesario mencionar el hecho de que, las secuencias nucleótidas y las secuencias de aminoácidos de los genes aislados anteriormente, arriba, se cambian artificialmente, en algunos casos, por ejemplo, el codón de iniciación GTG o TTG, puede convertirse en un codón ATG.

Así, por lo tanto, la presente invención, de dirige también a derivados funcionales de los polipéptidos del presente caso. Tales tipos de derivados funcionales, se definen en base a la secuencia de aminoácidos de la presente invención, mediante la adición, inserción, deleción y / o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos de tales secuencias, en donde, tales derivados, tienen todavía el mismo tipo de actividad enzimática, que los polipéptidos correspondientes de la presente invención. Tales tipos de actividades, pueden medirse mediante cualesquiera ensayos conocidos en el arte especializado de la técnica o específicamente descritas aquí. Tales derivados funcionales, pueden realizarse bien ya sea mediante síntesis química de polipétidos, conocida en el arte especializado de la técnica, o bien ya sea por medios recombinantes, en base a las secuencias de DNA, tal y como se discuten aquí, mediante procedimientos conocidos en el estado actual del arte de esta técnica especializada, y que se dan a conocer, por ejemplo, por parte de Sambrook et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, segunda edición, 1989). Los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, los cuales, de una forma general, no alteran la actividad de tales moléculas, son conocidos en el estado actual del arte correspondiente a la técnica especializada y se describen, por ejemplo, por parte de H. Neurath y R.L. Hill en "The Proteins", - Las proteínas -, (Academix Press, New York, 1979, véase, especialmente, la figura 6, página 14). Los intercambios que acontecen de una forma más común, son: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Glu, Asp/Gly, así como a la inversa.

Adicionalmente, la presente invención, no se dirige únicamente a las secuencias de DNA, tal como las que se dan a conocer, por ejemplo, en la lista de secuencias, así como a sus hebras complementarais, sino que, además, se dirige también a aquéllas que incluyen estas secuencias de DNA, las cuales hibridan bajo condiciones standard, con tales tipos de secuencias o fragmentos de éstas y de DNA, las cuales, debido a la degeneración del código genético, no hibridan bajo condiciones standard con tales tipos de secuencias, pero que codifican para polipéptidos, los cuales tienen exactamente la misma secuencia de aminoácidos.

Las "condiciones standard" para la hibridación, significan, en este contexto, las condiciones las cuales se utilizan generalmente por parte de una persona experta en este arte especializado de la técnica, para detectar señales específicas de hibridación, y las cuales se describen, por ejemplo, por parte de Sambrook et al., (ver anteriormente, arriba) o, de una forma preferible, la denominada de condiciones de hibridación severa y de lavado no severo o, de una forma más preferible, la denominada de condiciones de hibridación severa y de lavado severo, con las cuales se encuentra familiarizada la persona experta en el arte de la técnica especializada, y las cuales se describen, por ejemplo, por parte de Sambrook et al. (ver anteriormente, arriba).

Las secuencias de DNA que se derivan de las secuencia de DNA de la presente invención, bien ya sea porque éstas hibridan con tales secuencias de DNA (véase, anteriormente, arriba), o bien ya sea porque pueden construirse mediante la reacción en cadena de la polimerasa, mediante la utilización de cebadores designados en base a tales secuencias de DNA, pueden prepararse bien ya sea tal y como se indica, a saber, por parte de la reacción PCR, o mediante mutagénesis dirigida a sitios (véase, por ejemplo, Smith, Ann, Rev. Genet. 19, 423 (1985) o de forma sintética, tal y como se describe, por ejemplo, en la patente europea EP 747 483, o mediante los procedimientos usuales de la clonación molecular, tal y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (ver anteriormente, arriba).

Como cepa huésped para la expresión y / o amplificación de las secuencias de DNA de la presente invención, pueden utilizarse cualesquiera microorganismos, por ejemplo, los que se identifican en la patente europea EP 635 572, pero es preferible el uso de las cepas pertenecientes al género Kurthia, especialmente, Kurthia sp. 538-6 (DSM Nº 9454) y Kurthia sp. 538-51F9 (DSM N0. 10610).

Con objeto de obtener un transformante con una alta productividad de biotina, las secuencias de DNA de la presente invención, se utilizan bajo el control de un promotor, el cual es efectivo en tales células huésped. Las secuencias de DNA de la presente invención, pueden introducirse en la célula huésped, mediante la transformación con un plásmido que porte tales secuencias de DNA, o mediante la integración en el cromosoma de la célula huésped.

Cuando se utiliza la Kurthia sp. 538-51F9, como célula huésped, la Kurthia sp. 538-51F9, puede transformarse con un plásmido híbrido, el cual porta por lo menos un gen involucrado en la síntesis de la biotina, aislado anteriormente, arriba, a partir de la cepa Kurthia sp. Como vector plásmido para el plásmido híbrido, pueden utilizarse el pUB110 [J. Bacteriol. 154, 1184-1194, (1983)], el pHP13 (Mol. Gen. Genet. 209, 335-342, 1987), u otros plásmidos que comprendan el origen de la replicación que funciona en la cepa Kurthia sp. Como secuencias de DNA para la amplificación y / o la expresión de Kurthia sp, puede utilizarse cualquier secuencia de DNA de la presente invención, pero se prefiere la secuencia de DNA correspondiente a al gen bioB, que codifica para la sintetasa de biotina. Un ejemplo de tal tipo de plásmido híbrido es el pYK114, mostrado en la figura 14. En este plásmido, el gen bioB, se encuentra bajo el control del promotor para el gen bioH, y porta el origen de replicación para el pUB110.

La cepa Kurthia sp. 538-51F, puede transformarse con el plásmido pYK114, obtenido de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, mediante el procedimiento de transformación de protoplastos [Molecular Biological Methods for Bacillus, 150 (1990)]. No obstante, puesto que, la cepa Kurthia sp. 538-51F9, tiene una reducida eficiencia de regeneración a partir de protoplasmas, la eficiencia de transformación de esta cepa, es muy baja. Así, por lo tanto, se prefiere utilizar una cepa, la cual tenga una alta eficiencia de regeneración a partir de protoplastos, debiéndose utilizar, por ejemplo, la cepa Kurthia sp. 538-51F9-RG21, la cual puede prepararse de la forma que se describe en el ejemplo 14 del presente caso.

La presente invención, proporciona también un procedimiento para la producción de biotina, mediante el cultivo de los transformantes de esta forma obtenidos, y la separación y purificación de la biotina producida.

El cultivo de los transformantes utilizados en la presente invención, puede realizarse mediante procedimientos conocidos en el arte especializado de la técnica. Puede utilizarse un medio el cual contenga una fuente de carbono asimilable, una fuente de nitrógeno digestible, una sal inorgánica, y otros nutrientes necesarios para el crecimiento del transformante. Como fuente de carbono, puede emplearse, por ejemplo, glucosa, fructosa, lactosa, galactosa, sucrosa, maltosa, almidón, dextrina o glicerol. Como fuente de nitrógeno, puede emplearse, por ejemplo, peptona, judía de soja en forma de polvo, licor de maíz en remojo, extracto de carne, sulfato amónico, nitrato amónico, urea, o una mezcla de estos. Adicionalmente, como sal inorgánica, pueden utilizarse sulfatos, hidrocloruros o fosfatos de calcio, magnesio, zinc, manganeso, cobalto y hierro. Y, en caso necesario, pueden también añadirse factores de nutrientes convencionales, o un agente antiespumante, tal como un aceite animal, un aceite vegetal o un aceite mineral. Si el transformante obtenido tiene un marcador resistente a los antibióticos, el respectivo antibiótico, debe suplementarse en el medio. El pH del medio de cultivo, debe ser de un valor comprendido dentro de unos márgenes que van de 5 a 9, de una forma preferible, de 6 a 8. La temperatura de cultivo, puede ser de un valor que va de 10 a 45ºC, de una forma preferible, de 25 a 30ºC. El tiempo de restricción, puede ser de 1 a 10 días, de una forma preferible, de 2 a 7 días.

La biotina producida bajo unas condiciones como las que se han descrito anteriormente, arriba, puede recuperarse de una forma fácil, mediante procedimientos conocidos en el arte de la técnica especializada. Así, por ejemplo, después de que los materiales sólidos se hayan retirado de la solución, la biotina existente en el filtrado, se absorbe sobre carbón activo y, a continuación, se eluye y se purifica adicionalmente con una resina de intercambio de iones. De una forma alternativa, el filtrado, se aplica directamente a una resina de intercambio de iones y, después de la elución, el producto deseado, se recristaliza a partir de una mezcla de alcohol y agua.

Antes de proceder a exponer en mayor detalle la presente invención, mediante la referencia a los ejemplos que siguen a continuación, se facilita una pequeña descripción de las figuras incluidas, las cuales representan:

Figura 1: Mapas de restricción de los pKB100, pKB200 y pKB300.

Figura 2: Estructura del pKB100.

Figura 3: Estructura del pKB200.

Figura 4: Mapas de restricción y resultados de comple-mentación de los pKH100, pKH200 y pKH300.

Figura 5: Estructura del pK100.

Figura 6: Mapas de restricción de los pKC100, pKC101 y pK102.

Figura 7: Estructura del pKC100.

Figura 8: Estructuras de los plásmidos derivados de los pKB100, pKB101 y pKB102.

Figura 9: Organizaciones de los cúmulos de genes involucrados en la biosíntesis de biotina de Kurthia sp. 538-KA26.

Figura 10: Secuencia de nucleótidos entre los genes ORF1 y ORF2 de Kurthia sp. 538-KA26.

Figura 11: Secuencia de nucleótidos de la región promotora del cúmulo de genes bioH.

Figura 12: Secuencia de nucleótidos de la región promotora de cúmulo de genes bioFII.

Figura 13: Construcción del vector lanzadera pYK114.

Figura 14: Construcción del plásmido pYK114 de expresión de bioB.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de los genes bioB y bioF de la Kurthia sp. 538.-KA26 1. Preparación de la biblioteca genómica

Se procedió a cultivar la cepa resistente a la acidomicina, de Kurthia sp., 538-KA26 (DSM Nº 10609), en 100 ml de caldo de nutriente (Kyokuto Seiyaku Co; Honcho 3-1-Japón) a una temperatura de 30ºC, durante el transcurso de toda la noche y, las células bacterianas, se recuperaron mediante centrifugación. El DNA en su totalidad, se extrajo de las células bacterianas mediante el procedimiento de extracción de fenol [Experimentos con fusiones de genes], Cold Spring Harbor Laboratory, 137 - 138, (1984), y se obtuvieron 1,9 mg del DNA íntegro.

El DNA íntegro (10 \mug), se digirió parcialmente con 1,2 unidades de Sau3AI, a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, para proporcionar fragmentos con alrededor 10 kb de longitud. Se obtuvieron fragmentos de DNA de 5 - 15 Kb, mediante electroforesis en gel de agarosa.

El vector pBR322 (Takara Shuzo CO.). se digirió completamente con Bam HI y, a continuación, se trató con fosfatasa alcalina, para evitar la autoligadura. Los fragmentos de DNA, se ligaron con el pBR322, utilizando un equipo, a modo de kit, de ligadura de DNA (Takara Shuzo Co.), en concordancia con las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligadura, se transfirió a la Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo Co.), mediante el apropiado y competente procedimiento de la célula [Molecular Cloning, - Clonación molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, 252 - 253, (1982)] y, las cepas, se seleccionaron para la resistencia a la ampicilina (100 \mug/ml), en medio LB sobre placa de agar (1% de Bacto-triptona, 0,5% de extracto de Bacto-levadura, 0,5% de NaCl, pH 7,5). Se obtuvieron aproximadamente 5.000 genes individuales, los cuales tenían los fragmentos genómicos de DNA, como una biblioteca genómica.

Las cepas ampicilino-resistentes de la biblioteca genómica de Kurthia sp. 538-KA26, se cultivaron a una temperatura de 37ºC, durante el transcurso de toda la noche, en 50 ml de medio LB, el cual contenía 100 \mug/ml de ampicilina y, las células bacterianas, se recogieron mediante centrifugación. El plásmido de DNA, se extrajo de las células bacterianas, mediante el procedimiento de desnaturalización alcalina [Molecular Cloning, - Clonación molecular -, Cold Springer Harbor Laboratory, 90 - 91, (1982)].

2. Selección del clon que porta el gen bioB procedente de la biblioteca genómica

3. El plásmido de DNA, se transfirió mediante el procedimiento competente de la célula, al mutante R875, deficiente en bio-B de Escherichia coli (J. Bacteriol. 112, 830 - 839, 1972), sin una actividad de biotina-sintetasa. Las células transformadas de Escherichia coli R875, se lavaron dos veces con 0,85% NaCl y se agotaron con placas de agar al 1,5% de medio M9CT (0,6% de Na_{2}HPO_{4}, 0,3% HK_{3}PO_{4}), 0,05% NaClo, 0,1% NH_{4}Cl, 2 mM MgSO_{4}, 0,1 mM CaCl_{2}, 0,2% glucosa, 0,6% casaminoácido exento de vitaminas, 1 \mug/ml tiamina), que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y, las placas, se incubaron a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 40 horas. El transformante, se cultivó en medio LB, que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y, el plásmido híbrido, se extrajo de las células. El plásmido híbrido, porta un inserto de 5,58 kb y se designó pKB100. El mapa de restricción, se muestra en las figuras 1 y 2.

3. - Complementación de mutantes deficientes en biotina, de Escherichia coli, con pKB100

El pKB100, se transfirió a los mutantes deficientes en biotina, de Escherichia coli R875(bioB^{-}), W602(bioA^{-}), R878(bioC^{-}), R877(bioD^{-}), R874(bioF^{-}), o BM7086(bioH^{-})[J. Bacteriol. 112, 830 - 839, (1972), y J. Bacteriol., 143, 789-800, (1980)], mediante el método competente de la célula. Los mutantes transformados, se lavaron tres veces con 0,85% NaCl, y se sometieron a la acción de placas, sobre placas de agar M9CT, las cuales contenían 100 \mug/ml de ampicilina, 1 ng/ml de biotina y, las placas, se incubaron a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, para realizar el análisis de complementación. Tal y como se muestra en la tabla 1, el pKB100, pudo complementar no únicamente el mutante de bioB, sino también el mutante de bioF. Como contraste de ello, los mutantes de bioA, bioD y bioH, no se complementaron con el pKB100. A raíz de estos resultados, se confirmó que, el pKB100, portaba los genes bioB y bioF, de Kurthia sp. 538-KA26.

TABLA 1

1

Ejemplo 2 Aislamiento de plásmido híbrido que porta el gen bioD de Kurthia sp. 538-KA26 1. Aislamiento del plásmido híbrido que porta el gen bioD

Se procedió a transferir la biblioteca genómica de Kurthia sp. 538-KA26 del ejemplo 1-1, al mutante de Escherichia coli, deficiente en bioD, R877 y, los transformantes que tenían un fenotipo de resistencia a la ampicilina y prototrofia a la biotina, se seleccionaron de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 1-2. Los transformantes, se cultivaron a una temperatura de 37ºC, durante el transcurso de toda la noche, en medio LB, con 100 \mug/ml de ampicilina y, las células bacterianas, se recolectaron mediante centrifugación. El plásmido híbrido, se extrajo de las células, mediante el procedimiento de desnaturalización alcalina. El plásmido híbrido, tenía un fragmento de inserto de DNA de 7,87 Kb, y se designó como pKB200. Los modelos patrones de segmentación del pKB200, se analizaron utilizando varias endonucleasas de restricción (HindIII, NeoI, EcoRI, BglII, SalI, y PstI) y se compararon con los del pKB100. El análisis de restricción de endonucleasa, reveló el hecho de que, los dos plásmidos híbridos, tenían exactamente los mismos sitios de segmentación y que, el fragmento de DNA de 1,5 Kb, se extendía hacia el lado izquierdo del pKB100 y, el fragmento de 0,8 KB, se extendía hacia el lado derecho, en el pKB200 (figuras 1 y 3).

2. Complementación del mutante deficiente en biotina, de Escherichia coli, con pKB200

El pKB200, se transfirió a los mutantes deficientes en biotina, de Escherichia coli, R875(BioB^{-}), W602(BioA^{-}), R878(BioC^{-}), R877(bioD^{-}), R874(bioF^{-}), o BM7086(bioH^{-}). Se realizó un análisis de complementación, mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1 - 3. El pKB200, complementaba los mutantes bioD y bioB, pero no los mutantes bioA, bioC, bioF y bioH, tal y como se muestra en la Tabla 1. Si bien el pKB200 se solapaba sobre la totalidad de la longitud del pKB100, el pKB200, no complementaba el mutante bioF.

Ejemplo 3 Aislamiento del plásmido híbrido que porta el gen bioH de Kurthia sp. 538-KA26 1. Aislamiento del plásmido híbrido que porta el gen bioH

Se procedió a transferir la biblioteca genómica de Kurthia sp 538-KA26 del ejemplo 1-1, al mutante de Escherichia coli, deficiente en bioH, BM7086. Los transformantes que tenían el clon bioH, se seleccionaron para la prototrofia a la biotina, de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 1-2. Los plásmidos híbridos, se extrajeron de las células transformadas mediante el procedimiento de desnaturalización alcalina y se analizaron mediante enzimas de restricción. El plásmido híbrido, tenía un fragmento insertado de DNA, de 1,91 Kb, y se designó pKH100, Puesto que, la biblioteca genómica utilizada anteriormente, arriba, tiene 5 - 15 Kb de fragmentos genómicos de DNA, se pensó en someter a una modificación el fragmento pKH100, tal como deleción, en la cepa de Escherichia coli. El mapa de restricción del pKH100, se muestra en las figuras 4 y 5. Los modelos patrón del pKH100, eran completamente diferentes de los del pKB100 y pKB200. Así, por lo tanto, el pKH100, porta un fragmento de DNA del cromosoma de Kurthia, el cual difiere de los que se encuentran en el pKB100 y pKB200.

2. Complementación del mutante deficiente en biotina, de Escherichia coli, con pKB100

Se realizó un análisis de complementación mediante el procedimiento descrito en los ejemplos 1 - 3. El pKH100, se transfirió a los mutantes deficientes en biotina, de Escherichia coli, R875(BioB^{-}), W602(BioA^{-}), R878(BioC^{-}), R877(bioD^{-}), R874(bioF^{-}), o BM7086(bioH^{-}). El pKH100, complemantaba únicamente al mutante bioH, pero no a los mutantes bioB, bioA, bioC y bioF, tal y como se muestra en la Tabla 1. Así, de esta forma, el pKH, porta el gen bioH.

Ejemplo 4 Aislamiento del plásmido híbrido que porta el gen bioC de Kurthia sp. 538-KA26 1. Aislamiento del plásmido híbrido que porta el gen bioC

Se procedió a transferir la biblioteca genómica de Kurthia sp 538-KA26 del ejemplo 1-1, al mutante de Escherichia coli, deficiente en bioC, R878. Los transformantes con el clon bioC, se seleccionaron para la prototrofia a la biotina, de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 1-2. El plásmido híbrido, se extrajo de las células transformadas mediante el procedimiento de desnaturalización alcalina y se analizó mediante enzimas de restricción. El plásmido híbrido, tenía un fragmento insertado de DNA, de 6,76 Kb, y se designó pKC100. El mapa de restricción del pKC00, se muestra en las figuras 6 y 7.

Los modelos patrón del pKC100, eran completamente diferentes de los del pKB100, pKB200 y pKH100. Así, por lo tanto, el pKC100, porta una diferente región del cromosoma de Kurthia, con respecto a las de los pKB100, pKB200 y pKH100.

2. Complementación del mutante deficiente en biotina, de Escherichia coli, con pKC100

Se realizó un análisis de complementación mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1 - 3. El pKC100, se transfirió a los mutantes deficientes en biotina, de Escherichia coli, R875(BioB^{-}), W602(BioA^{-}), R878(BioC^{-}), R877(bioD^{-}), R874(bioF^{-}), o BM7086(bioH^{-}). El pKC100, complemantaba a los mutantes bioC, bioF y bioH, tal y como se muestra en la tabla 1. Puesto que el fragmento insertado de DNA, en el pKH100, era diferente de los del pKB100 y pKH100, el pKC100, porta no únicamente el gen bioC, sino también genes para isozimas del producto del gen de bioF (KAPA sintetasa) y el producto del gen bioH.

Ejemplo 5 Aislamiento del plásmido híbrido que porta el gen bioA de Kurthia sp. 538-KA26 1. Aislamiento de la región izquierda del DNA cromosómico en el pKB200

Se procedió a aislar la región izquierda del DNA cromosómico en el pKB200 procedente de DNA cromosómico de la Kurthia sp. 538-KA26, mediante el procedimiento de hibridación. El DNA íntegro de Kurthia sp. 538-KA26, se digirió completamente con HindIII, y se sometió a electroforesis de gel de agarosa. Los fragmentos de DNA sobre el gel, se desnaturalizaron y, a continuación, se transfirieron a una membrana de nylon (Hybond-N, Amersham), en concordancia con las recomendaciones del fabricante.

El plásmido pKB200, se digirió completamente con NcoI y se aisló un fragmento de NcoI de 2,1 Kb, mediante electroforesis en gel de agarosa (figura 1). El fragmento de NcoI, se marcó con ^{32}P, mediante el sistema de marcación de DNA Multiprime (Amersham) y se utilizó como una sonda de hibridación. La hibridación, se realizó sobre la membrana preparada anteriormente, arriba, utilizando el "Rapid Hibridation buffer", - tampón de hibridación rápida -, (Amersham), en concordancia con las instrucciones del fabricante. La sonda, hibridó fuertemente a un fragmento de HindIII, de aproximadamente 8,5Kb.

Con objeto de aislar el fragmento de 8,5 kb, El DNA íntegro de Kurthia sp. 538-KA26, se digirió completamente con HindIII, y se obtuvieron fragmentos de DNA, mediante electroforesis de gel de agarosa. El plásmido vector pUC19 (Takara Shuzo Co.), se digirió completamente con HindIII, se trató con fosfatasa alcalina, con objeto de evitar la autoligadura. Los fragmentos de DNA de 7,5 - 9,5 Kb, se ligaron con los del pUC19 segmentado, utilizando un equipo de ligadura, a modo de kit (Takara Shuzo Co.) y, la mezcla de reacción, se transfirió a Escherichia coli JM109, mediante el procedimiento competente de la célula. Se obtuvieron aproximadamente 1.000 clones individuales que portaban tales tipos de fragmentos genómicos de DNA, como una biblioteca genómica.

La selección, se llevó a cabo mediante el procedimiento de hibridación de colonias, en concordancia con el protocolo descrito por parte de Maniatiset al. [Molecular Cloning, - Clonación molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, 312 - 328, (1982)]. La colonias que crecieron en placas de agar, se transfirieron a membranas de nylon (Hybond-N. Amsersham) y se lisaron mediante álcali. El DNA desnaturalizado, se inmovilizó sobre las membranas. Los fragmentos de NcoI, marcados con ^{32}P, preparados según se describe anteriormente, arriba, se utilizaron como una sonda de hibridación y, la hibridación, se realizó utilizando el sistema "Rapid Hibridation buffer", - tampón de hibridación rápida -, (Amersham), en concordancia con las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron tres colonias, la cuales hibridaron con el DNA de la sonda, y se extrajeron plásmidos híbridos de estas colonias, mediante el procedimiento de desnaturalización alcalina.

El análisis de la estructura, se realizó con enzimas de restricción (BAMHI, HindIII, NcoI, EcoRI, BglII, SalI y PstI). La totalidad de los tres plásmidos híbridos, tenían un fragmento insertado de DNA, de 8,44 Kb y, los tres plásmidos híbridos, tenían exactamente los mismos modelos patrón de segmentación. Estos resultados, indican que, éstos, eran idénticos. El plásmido híbrido, se designó pKB300. El mapa de restricción de pKB300, se muestra en la figura 1. Aproximadamente la mitad de la longitud del fragmento genómico de DNA, en el pKB300, se solapa con la del pKB200.

2. Complementación del mutante deficiente en bioA, de Escherichia coli, con pKB300

El análisis de complementación de Escherichia coli W602 (bioA^{-}) con pKB300, se realizó mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1 - 3. Puesto que el pKB300 complementaba la mutación de la bioA (Tabla 1), el pKB300, porta el gen bioA de Kurthia sp.

Ejemplo 6 Subclonación de los genes bioA, B, D y F de Kurthia sp. 538-KA26 1. Construcción del plásmido híbrido pKB103 y pKB104

Se procedió a digerir completamente el pKB100 con Hind III, y se aisló un fragmento de HindIII de 3,3 Kb. El fragmento de 3,3 Kb, se ligó con el vector pUC18 (Takara Shuzo Co.), se segmentó con HindIII utilizando un equipo a modo de kit, de ligadura de DNA, para construir los plásmidos híbridos pKB103 y pKB104. En los pKB103 y pKB104, los fragmentos de 3,3 Kb, se insertaron en ambas direcciones, relativas al operador del promotor del gen faltante en pUC18. El mapa de restricción, se muestra en la figura 8.

La complementación de los mutantes de Escherichia coli deficientes en bioB o bioF, (R875 o R874), respectivamente, se realizaron de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 1 - 3. El pKB103 y pKB104, complementaban los mutantes de bioB y bioF (tabla 2).

2. Construcción de derivados de pKB200

Puesto que, el pKB200 complementaba la mutación de biotina y cubría la totalidad de la longitud del pkB100 que porta los genes bioB y bioF, se construyó una serie de mutaciones de deleción de pKB200, para localizar de una forma más precisa bioB, bioD y bioF. Se insertó un fragmento de SalI-HindIII de 4,0 Kb, de pKB200, en los sitios SalI y HindIII de pUC19, para proporcionar pKB221 y pKB222, en los cuales, el fragmento SalI-HindIII, se emplazó en ambas orientaciones.

El pKB200, se digirió completamente con NruI, y se aisló un fragmento de Nrul de 7,5 Kb, mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de Nrul, se recirculó mediante un equipo, a modo de kit de ligadura de DNA, y se obtuvo el pKB223.

El pKB200, se digirió completamente con HindIII. Se aisló un fragmento de HindIII de 4,8 Kb, mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el sitio de HindIII del pUC18, en ambas direcciones, con objeto de generar pKB224 y pKB225.

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El pKB200, se digirió parcialmente con NcoI, y se aisló un fragmento de NcoI de 3,1 Kb, mediante electroforesis en gel de agarosa. Los finales del fragmento de NcoI, se convirtieron en despuntados, mediante un fragmento de Klenow de la DNA polimerasa I (Takara Shuzo Co.) y se ligaron con engarces de HindIII (Talara Shuzo Co.). El fragmento de HindIII, de 3,1 Kb, se obtuvo mediante tratamiento con HindIII y se clonó en el sitio de Hind del pUC19, en ambas direcciones, para proporcionar pKB228 y pKB229.

De la misma forma, ambos finales del fragmento de NcoI de 2,1 Kb, de pKB200, se convirtieron en sitios HindIII, mediante tratamiento con fragmento de Klenow y adición de engarces de HindIII. A continuación, el fragmento de HindIII obtenido, se insertó en el sitio de HindIII de pUC19, en ambas direcciones, para proporcionar pKB230 y pKB231.

El pKB2345 y el PkB235, se generaron mediante la inserción de un fragmento HindIII-NruI de pKB230, de 1,6 Kb, en los sitios HindIII y SmalI de pUC19 y pUC18, respectivamente.

Los mapas de restricción del los derivados de pKB200, se muestran en la figura 8.

3. Análisis de complementación de los mutantes deficientes en biotina, de Escherichia coli, con derivados de pKB200

Se realizaron análisis de complementación con los derivados de pKB200, de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 1 - 3. Los resultados de complementación, se recopilan en la tabla 2. El mutante deficiente en bioB, se complementó mediante pkB221, pKB222, pKB224, pKB225, pero no con pKB223, pKB228, pKB229, pKB230, pKB231, pKB234 y pKB235. El mutante deficiente en bioF, se complementó mediante pKB223, pKB224, pKB225, pKB228 y pKB229, pero no mediante pKB221, pKB222, pKB230, pKB231, pKB234 y pKB235. Por otro lado, el muntante deficiente en bioD, se complementó mediante pKB223, pKB224 y pKB225, pero no con pKB221 y pKB222.

Conjuntamente con el análisis de complementación con pKB103 y pKB104, estos resultados apoyan el hecho de que, el gen bioF, se encuentra presente en el lado izquierdo del primer sitio de NruI, sobre el pKB103, mientras que, el gen bioB, se encuentra localizado en el lado derecho del mismo sitio de NruI, con un soporte solapado hacia la izquierda, y que, el gen bioD, se encuentra presente sobre, como mucho, la región del lado izquierdo de 1,5 Kb, del pKB200. Así, de este modo, los resultados de complementación con varios derivados de pKB100 y pKB200, mostraban el hecho de que, los genes bioD, bioF y bioB, yacen, a su vez, sobre la región de 4,4 Kb, de lado izquierdo del sitio HindIII de pKB200.

4. Construcción del plásmido híbrido pKB361

Con objeto de determinar la localización del gen bioA, se construyó el derivado del pKB300. El pKB361, se generó mediante la inserción de un fragmento de BamHI-SalI de 2,8 Kb, de pKB300, en los sitios de BamHI y SalI de uUC19 (figura 8).

El pKB361, se transfirió al mutante deficiente en bioA de Escherichia coli (W602), y se realizó un análisis de complementación, de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 1 - 3. El mutante de bioA, se complementó mediante pKB361 (tabla 2), sugiriendo la presencia del gen bioA, en la región de 2,8 Kb, entre los sitios BamHI y SalI de pKB300.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

2

Ejemplo 7 Subclonación del gen bioH de Kurthia sp. 538-KA26 1. Construcción del plásmido híbrido pKB103 y pKB104

Se procedió a digerir completamente el pKB100 con BamIII, y se recirculó con un equipo, a modo de kit, de ligadura de DNA, para generar pKH101, el cual, era un producto de deleción a partir del pKH100 (figura 4). EL pKH102, se construyó a partir del pKH100, mediante tratamiento con HindIII, seguido mediante recirculación con un equipo a modo de kit de ligadura de DNA. El pKH102, carecía de un fragmento de HindIII de 1,07 kb, en el pKH100 (figura 4).

El análisis de complementación del mutante de bioH (R878), de Escherichia coli, se realizó con pKH101 y pKH102, de la misma forma que en el ejemplo 1 - 3. El pKH101, complementó el mutante de bioH, pero no el pKH102 (figura 4). Los resultados, indicaban que, el gen bioH, se encuentra localizado en la región izquierda (1,16 Kb) del sitio de BamHI, sobre el pKH100.

Ejemplo 8 Subclonación del gen bioC de Kurthia sp. 538-KA26

El pKB100, se digirió completamente con BamHI, y se aisló un fragmento de BamHI de 1,81 Kb, mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de BamHI, se ligó con pBR322, tratado con BamHI y el fragmento de Klenow, mediante un equipo, a modo de kit de ligadura de DNA. Finalmente, se obtuvieron el pKC101 y pKC102, en los cuales, el fragmento de BamHI, se insertó en ambas direcciones (figura 6).

El pKC101 y pKC102, se transfirieron al mutante bioC R878 de Escherichia coli, y se llevó a cabo un análisis de complementación, de la misma forma que en el ejemplo 1 - 3. El mutante bioC, se complementó con pKC01 y pKC102 y, el gen bioC, se confirmó que yacía en el fragmento de BamHI de 1,81 kb.

Ejemplo 9 Secuencia de nucleótidos de los fragmentos de DNA insertados en los pKB100, pKB200 y pKB300

Para el análisis de secuenciación de los fragmentos de DNA insertados de los pKB100, pKB200 y pKB300, se construyeron varios subclones que se solapaban mutuamente, utilizando pUC18, pUC19, M13mp18 y M13mp19 (Takara Shuzo Co.) y se obtuvo una serie de derivados de deleción de los subclones, mediante el equipo a modo de kit de deleción de secuenciación, del tipo Kilo-Secuencing Deletion kit (Takara Shuzo Co.). A continuación, se procedió a llevar a cabo un análisis de secuenciación de nucleótidos de los derivados de deleción, mediante la técnica de terminación de la cadena didedoxi (Versión del kit de secuenciación de DNA, correspondiente el modelo Sequenase version 2,0, utilizando 4-deaza-dGTP, United States Biochemical Co.). Los resultados, se analizaron mediante el programa de computadora (GENETYX), de la firma Software Development Co.

El análisis computerizado de esta secuencia, reveló el hecho de que, el fragmento clonado de DNA, tenía la capacidad de codificar para seis estructuras de lectura abierta (ORF - del inglés, open reading frames -). Este gen operón, tiene dos cúmulos de genes procedentes de ambas direcciones (Fig. 9-A).

La primera ORF en el cúmulo de genes izquierdo, se inicia con el codón TTG, precedido mediante un sitio de enlace ribosómico (RBS, del inglés - ribosomal binding site -), con homología al final 3' del Bacillus subtitilis 16S rRNA, y codifica para una proteína de 194 residuos de aminoácidos, la cual tiene un peso molecular de 21.561. No fue posible el determinar la función del producto de genes, mediante el análisis de complementación y, en concordancia con ello, esta ORF, se denominó ORF1.

La secuencia de nucleótidos de la segunda ORF, en el cúmulo de genes izquierdo, se muestra en la SEQ ID No. 1. Este gen, codifica para una proteína de 236 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 26,642. La secuencia de aminoácidos pronosticada de este producto de genes, se muestra en la SEQ ID No. 2. Se encuentra un RBS putativo, corriente arriba del codón de iniciación de ATG. El análisis de complementación (Ejemplo 6 - 3), mostró que, esta ORF, es el gen bioD.

La tercera ORF, en el cúmulo de genes izquierdo, tiene un RBS putativo corriente arriba del codón de iniciación ATG y, la secuencia de nucleótidos de este gen, se muestra en la SEQ ID No. 3. Este gen, codifica para una proteína de 460 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 51.731. La secuencia de aminoácidos pronosticada de este producto de genes, se muestra en la SEQ ID No. 4. Se confirmó el hecho de que, esta OEF, correspondía al gen bioA (Ejemplo 6 - 3). Se encontró que, una secuencia inversa, se encontraba localizada aproximadamente 3 pb corriente debajo del codón de terminación. Esta estructura, puede actuar como un terminador transcripcional.

La primera ORF, en el cúmulo de genes derecho, denominada ORF2, se inicia en el codón ATG, precedido por un RBS putativo. Este producto de genes, es una proteína consistente en residuos de 63 aminoácidos y, el peso molecular calculado, es de 7.477. No pudimos identificar la función de este producto de genes, mediante el análisis de complementación, y la búsqueda de homología de la secuencia de aminoácidos. En concordancia con ello, esta ORF, se denominó ORF2.

La secuencia de nucleótidos de la segunda ORF, en el cúmulo derecho de genes, se muestra en la SEQ ID No. 5. Este gen, tiene tres codones ATG potenciales de iniciación, correspondientes a los residuos de aminoácidos primero, vigésimo sexto y trigésimo segundo. El análisis de complementación (Ejemplo 6 - 3), mostró el hecho de que, esta ORF, corresponde al gen bioF. La secuencia de aminoácidos pronosticada de este productos de genes, se muestra en la SEQ ID No. 6. El peso molecular de la proteína pronosticada, con 387 residuos de aminoácidos, se calculó que era de 42.619, iniciándose desde el primer codón de iniciación.

La tercera ORF, en el cúmulo de genes derecho, tal y como se muestra en la SEQ ID No. 7, tiene tres codones potenciales de iniciación, dos codones ATG (los residuos de aminoácidos primero y décimo octavo) y un codón GTG (el décimo segundo residuo de aminoácido). La secuencia de aminoácidos pronosticada de este producto de genes, se muestra en la SEQ ID No.8. El peso molecular de la proteína pronosticada, con 338 residuos de aminoácidos, trasladada desde el primer codón de iniciación, se calculó que era el de 37.438. El análisis de complementación (Ejemplo
6 - 3), mostró el hecho de que, esta ORF, correspondía al gen bioB. La presencia de una secuencia de repetitiva inversa, de 16 pb, corriente debajo del codón de terminación, es característica de un terminador transcripcional.

Existían dos posibles secuencias promotoras que formaban promotores frente a frente, entre las ORF1 y ORF2, tal y como se muestra en la figura 10. Las transcripciones, procedieron hacia la izquierda, hacia el interior del cúmulo de genes de ORF1, bioD y bioA, y hacia la derecha, hacia el interior del cúmulo de genes, de ORF2, bioF y bioB. Adicionalmente a lo anteriormente expuesto, se encontraban localizadas dos terminadores trascripcionales, corriente abajo de los codones de terminación de los genes bioA y bioB. Así, por lo tanto, las transcripciones, en ambas direcciones, generaron dos mRNAs diferentes.

Se encontraron dos componentes, en las secuencias repetitivas inversas, Box1 y Box2, entre el sitio de iniciación de los genes ORF1 y ORF2 (figura 10). La homología en su totalidad, para el Box1 y Box2, era del 82,5%. La comparación del Box1 o Box2 con el operón de biotina de Escherichia coli [Nature, 276, 689-694, (1978)], mostraba el hecho de que, existe un alto nivel de conservación (54% de homología, para ambos). Las similitudes entre dos secuencias repetitivas inversas del operador de biotina de Escherichia coli, sugieren el hecho de que, el Box1 y Box2, deben encontrarse involucrados en el control negativo de la síntesis de biotina mediante biotina.

Ejemplo 10 Secuencia de nucleótidos en los fragmentos insertados de DNA, de pKH100

El análisis de la secuencia de nucleótidos en el fragmento insertado de DNA, de pKH100, se realizó de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 9. Se encontró un cúmulo de genes que contenía dos ORFs, sobre el fragmento insertado de DNA (Figura 9 - B). Adicionalmente a ello, se confirmó el hecho de que, una parte del plásmido vector pBR322, y el fragmento de DNA habían sido objeto de deleción.

La primera ORF, tal y como se muestra en la SEQ ID No.9, codifica para una proteína de 267 residuos de aminoácidos y, el peso molecular calculado, era de 29.423. La secuencia de aminoácidos seleccionada, de este producto de genes, se muestra en la SEQ ID No. 10. Un RBS putativo, se encuentra localizado a 6 pb corriente arriba del codón de iniciación ATG. El análisis de complementación, tal y como se muestra en la figura 7, indicaba que, esta ORF, correspondía al gen bioH.

La segunda ORF, con un RBS potencial, se encontró corriente abajo del gen bioH. La ORF, codifica para una proteína de 86 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 9.955. La proteína, codificada por la ORF, no mostraba homología con los productos de genes de biotina de Escherichia coli y Bacillus sphaericus. La ORF, se denominó ORF3.

Se encontró una posible secuencia promotora, corriente arriba del codón de iniciación del gen bioH, tal y como se muestra en la Figura 11. Puesto que no se encontró una secuencia repetitiva inversa, tal como Box1 y Box2, en la región no codificante 5' del gen bioH, la transcripción de este cúmulo de genes, no debe ser regulada. Además, existe una secuencia repetitiva inversa, solapando con el codón de terminación de ORF3. Puesto que esta estructura es capaz de actuar como un terminador transcripcional, el promotor bioH putativo, permitiría, por lo tanto, la transcripción de los genes bioH y ORF3.

Ejemplo 11 Secuencia de nucleótidos en los fragmentos insertados de DNA, de pKC100

El análisis de la secuencia de nucleótidos del fragmento insertado de DNA, se realizó de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo 9. Se encontró un cúmulo de genes consistente en tres ORFs, en el fragmento insertado de DNA (figura 9-C).

La tercera ORF, tiene un RBS putativo, corriente arriba del codón de iniciación y, la secuencia de nucleótidos de este gen, se muestra en la SEQ ID No. 15. Este gen, codifica para una proteína de 276 residuos de aminoácidos y, el peso molecular calculado, es de 31,599. La secuencia de aminoácidos pronosticada de este producto de genes, se muestra en la SEQ ID No. 16. El análisis de complementación, se muestra en el ejemplo 8, indicando que, esta ORF, corresponde al gen bioC.

La primera ORF, tal y como se muestra en la SEQ ID No. 11, codifica para una proteína de 398 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 44.776. Se encuentra localizado un RBS putativo, corriente arriba del codón de iniciación. La secuencia de nucleótidos pronosticada, de este gen, tal y como se muestra en la SEQ ID No. 12, tiene un 43% de homología con la del producto de genes de Kurthia sp. 538-KA26 en el ejemplo 9. Además, el pKC100, complementaba al mutante bioF de Escherichia coli, tal y como se muestra en la figura 4. Así, por lo tanto, se concluyó que, esta ORF, era un gen para una isozima del producto de genes bioF, KAPA sintetasa. Así, por lo tanto, esta ORF, se denominó gen bioFII.

La segunda ORF, tal y como se muestra en la SEQ ID No. 13, tiene un RBS putativo, corriente arriba del codón de iniciación. Este gen, codifica para una proteína de 248 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 28.629. La secuencia de aminoácidos pronosticada de este producto de genes, tal y como se muestra en la SEQ ID No. 14, tiene un 24,2% de homología con la del producto de genes de Kurthia sp. 538-KA26 en el ejemplo 10. Tal y como se muestra en la figura 4, el pKC100, complementaba también al mutante bioH de Escherichia coli. Estos resultados, mostraban que, esta ORF, es un gen para una isozima del producto de genes bioH y, por lo tanto, esta ORF, se denominó gen bioHII.

Una posible secuencia de promotor, se encontró corriente arriba del codón de iniciación del gen bioFII, tal y como se muestra en la figura 12. Se encuentra localizada una secuencia inversa entre la secuencia de promotor y el RBS del gen bioFII. Esa secuencia de repetición inversa, designada como Box3, se comparó con la Box1 y Box2, localizadas entre los genes ORF1 Y la ORF2 (ejemplo 9). Los Box1, Box2 y Box3, eran extremadamente similares el uno con el otro (la homología de Box1 y Box3, era de un 80,0% y, la del Box2 y Box3, era del 77,5%. Así, por lo tanto, el cúmulo del gen bioC, debe regularizarse mediante un control negativo, de una forma similar al cúmulo de bioA y el cúmulo de bioB. Adicionalmente a ello, existe una secuencia repetitiva inversa de 254 pb, corriente abajo del codón de terminación del gen bioC. La estructura, se cree que actúa como un terminador transcripcional.

Ejemplo 12 Construcción de un vector lanzadera para Escherichia coli y cepa Kurthia sp

Se procedió a construir un vector lanzadera para Escherichia coli y Kurthia sp., mediante la estrategia que se muestra en la figura 13. El plásmido Staphiloccus aureus pUB110 (Bacillus Genetic Stock Center; The Ohio State University, Department of Biochemistry, 484 West Twelfh Avenue, Columbus, Ohio 43210, USA), se digirió completamente con EcoRI y PvuII. Se aisló un fragmento de EcoRI-PvuII, que contiene el origen de replicación de Kurthia sp. y, el gen resistente a la kanamicina, se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa. El pUC19, se digirió completamente con EcoRI y DraI y, el fragmento de EcoRI-DraI de 1,2 Kb, que tenía el origen de replicación de Escherichia coli, se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa. Así, de esta forma, estos fragmentos, se ligaron con un equipo, a modo de kit, de ligadura de DNA, para generar el vector lanzadera pYK1. El pK1, puede replicar en Escherichia coli y Kurthia sp. y Escherichia coli o Kurthia sp., transformada mediante pYK1, muestra resistencia a la Kanamicina.

Ejemplo 13 Construcción del plásmido de expresión del gen bioB de Kurthia sp

El YK114, en el cual, el gen bioB de Kurthia, se insertó corriente abajo del promotor del gen bioH de Kurthia, se construyó mediante la estrategia tal como se muestra en la figura 14. El pKH101 del ejemplo 7, se digirió completamente con BanII y, los finales de los fragmentos de BamII, se embotaron con el fragmento de Klenow de la DNA polimerasa. A continuación, los fragmentos de BamII, se trataron con EcoRI, y se aisló un fragmento embotado de EcoRI de 0,6 Kb, que contenía el promotor bioH, mediante electroforesis en gel de agarosa. El pKB104 del ejemplo 6, se digirió completamente con KpnI y, los finales del KpnI, se cambiaron a finales embotados, mediante tratamiento con el fragmento de Klenow. Después de la digestión con HindIII, se aisló un fragmento despuntado de HindIII, de 1,3 Kb, que portaba el gen bioB, mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos embotados de EcoRI, y de HindIII despuntado, se ligaron con pYK1, digerido con EcoRI y HindIII, para construir pYK11. El gen bioB, se expresa, de una forma constructiva, bajo el promotor bioH procedente de pYK114.

Ejemplo 14 Aislamiento de la cepa derivada de Kurthia sp. 538-51F9, con una alta eficiencia de transformación

Se procedió a cultivar la Kurthia sp. 538-51F9 (DSM No. 10610), a una temperatura de 28ºC, en 50 ml de caldo de soja Tripticasa (Becton Dickinson), hasta una densidad óptica, a 600 nm (OD_{600}) de 1,0. Se recolectaron las células crecidas, mediante centrifugación, y se suspendieron en SMM (0,5 M sucrosa, 0,02 M maleato sódico, 0,02 M MgCl_{2} 6H_{2}O; Ph 6,5) a OD_{600} 16. A continuación, se añadió lisozima (Sigma), a la suspensión de células, a 200 \mug/ml y, la suspensión, se incubó a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 90 minutos, para formar protoplastos. Después de que los protoplastos se hubieran lavado con SMM, dos veces, éstos se suspendieron en 0,5 ml de SMM. Se añadió una solución de 1,5 ml de PEG (30%, peso / volumen, polietilenglicol 400 en SMM), a la suspensión de protoplasto y, la suspensión, se incubó durante un transcurso de tiempo de 2 minutos, en hielo. A continuación, se añadieron 6 ml de SMM y, los protoplastos, se recolectaron mediante centrifugación. Los protoplastos recolectados, se suspendieron en SMM, y se incubaron a una temperatura de30ºC, durante un transcurso de tiempo de 90 minutos. Se añadió medio DM3 (0,5 M succinato sódico pH 7,3, 0,5% peso / volumen casaminoácido, 0,5% peso / volumen extracto de levadura, 0,3% peso / volumen de KH_{2}PO_{4}, 0,7% peso / volumen de K_{2}HPO_{4}, 0,5%

\hbox{peso /}

volumen glucosa, 0,02 M MgCl_{2} 6H_{2}O, 0,01% peso / volumen de albúmina de célula bobina), con un contenido de un 0,6% de agarosa (Sigma; tipo VII), a la suspensión de protoplasto y, la suspensión, se sobrepuso sobre placas de agar de medio DM3. Las placas, se incubaron a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 3 días. En total, se obtuvieron 65 colonias, regeneradas sobre las placas de DM3.

La eficiencia de transformación de las cepas regeneradas, se investigó con pYK1 del ejemplo 12. Como resultado de ello, se seleccionaron 40 cepas, y se cultivaron a una temperatura de 28ºC, en 50 ml de caldo se soja tripticasa, hasta que el OD_{600}, era 1,0. Se recolectaron células crecidas, mediante suspensión en SMM, a OD_{600}16. A continuación, las células, se trataron con lisozima, mediante el procedimiento descrito anteriormente, arriba, y se obtuvieron los protoplastos. Los protoplastos, se suspendieron en 0,5 ml de SMM, y se añadió pYK1 (1 \mug), a las suspensiones de protoplasto. Después de la adición de 1,5 ml de una solución de PEG, las suspensiones, se incubaron durante un transcurso de tiempo de 2 minutos, en hielo, se añadieron 6 ml de SMM y, a continuación, los protoplatos, se recolectaron mediante centrifugación. A continuación, los protoplastos, se suspendieron en SMM, y se incubaron a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. El medio DM3, con un contenido del 0,6% de agarosa, se añadió a las suspensiones de protoplastos y, las suspensiones, se sobrepusieron en placas de agar, del medio DM3. Las placas, se incubaron a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 3 días. La DM3-agarosa, incluyendo las colonias regeneradas sobre las placas, se recolectaron y se diseminaron sobre las placas de agar del caldo nutriente, con 5 \mug/ml de kanamicina, para seleccionar los transformantes. Las placas, se incubaron durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura de 30ºC. Finalmente, se obtuvo la cepa derivada, Kurthia sp. 538-51F9-RG21, caracterizada por una alta eficiencia de transformación (2.000 transformantes por \mug de DNA).

Ejemplo 15 Amplificación del gen bioB en Kurthia sp. 538-51F9-RG21 1. Transformación de Kurthia sp. 538-51F9-RG21

El plásmido de expresión del gen bioB de la cepa Kurthia, pYK114, se construyó de la forma que se describe en el ejemplo 13. La Kurthia sp. 538-51F9-RG21, se transformó con pYK114 y, el plásmido vector pYK1, tal y como se describe en el ejemplo 14. La Kurthia sp 538-51F9-RG21, que portaba el PYK1 o el pYK114, se denominó Kurthia sp.538-51F9-RG21 (pYK1) o Kurthia sp. 538-51F9-RG21 (pYK114), respectivamente.

2. Producción de biotina mediante fermentación

Se procedió a inocular Kurthia sp.538-51F9-RG21 (pYK1) y Kurthia sp. 538-51F9-RG21 (pYK114), en 50 ml del medio de producción (6% de glicerol, 4,5% de proteasa peptona, 0,1% KH_{2}PO_{4}, 0,05% MgSO_{4} 7H_{2}O, 0,05% FeSO_{4} 7H_{2}O, 0,001% MnSO_{4}5H_{2}O; pH 7,0), con un contenido de 5 \mug/ml de kanamicina. Como control, se aisló Kurthia sp. 538-51F9-RG21, en 50 ml del medio de producción. El cultivo, se llevó a cabo a una temperatura de 28ºC, durante 120 horas.

Después del cultivo, se centrifugaron 2 ml del caldo de cultivo, para retirar las células bacterianas, y se obtuvo el sobrenadante. Se procedió a someter a tets de ensayo la producción de biotina en el sobrenadante, mediante el test de ensayo microbiológico, utilizando Lactobacillus Plantarum (ATCC 8014). Las cantidades de biotina producida, se proporcionan en la tabla 3.

TABLA 3

Cepa de Kurthia sp.	Producción de biotina (mg/l)
51F9-RG21	15,4
51F9-RG21 (pYK1)	14,3
51F9-RG21 (pYK114)	39,1

Claims

1. Una secuencia de DNA que codifica a un polipéptido representado mediante las SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16.

2. Una secuencia de DNA, que comprende una secuencia de DNA seleccionada entre el grupo consistente en la SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15.

3. Un vector que comprende una o más secuencias de DNA, tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Un vector tal y como se define en la reivindicación 3, en donde, las citadas secuencias de DNA, se encuentran funcionalmente enlazadas a secuencia(s) de promotores.

5. Una célula transformada mediante una o más secuencias de DNA, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o vector(es), tal y como se define en las reivindicaciones 3 ó 4.

6. Un procedimiento para la producción de biotina, el cual comprende el cultivar la célula, tal y como se define en la reivindicación 5, en un medio, y aislar la biotina resultante, a partir del medio de cultivo, mediante procedimientos conocidos en el arte de la técnica especializada.