ES2232862T3 - Sustitutos de plaquetas y procedimientos de conjugacion apropiados para su preparacion. - Google Patents
Sustitutos de plaquetas y procedimientos de conjugacion apropiados para su preparacion.Info
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Abstract
Producto farmacéuticamente aceptable que comprende, como portador, micropartículas insolubles a las que está unido un componente activo que es esencialmente fibrinógeno activo no degradado o un fragmento del mismo que presenta actividad de agregación plaquetaria.
Description
Sustitutos de plaquetas y procedimientos de
conjugación apropiados para su preparación.
La presente invención se refiere a sustitutos de
plaquetas, es decir, composiciones que comprenden fibrinógeno, así
como a procedimientos de conjugación que pueden utilizarse, entre
otros fines, para unir fibrinógeno a un portador particular.
Los conjugados unidos covalentemente, que
comprenden un fármaco activo y un portador, son útiles como medio
para liberar el fármaco, por ejemplo en un sitio de acción
específico. Se ha propuesto la albúmina como un portador para este
propósito. Las micropartículas de albúmina, su producción y
utilización como portador, se describen en el documento WO nº
A-9618388.
La unión covalente de péptidos y proteínas
grandes a microcápsulas de albúmina sérica humana (HSA) puede
provocar una serie de problemas. Podría no haber disponibilidad de
un número suficiente de sitios de unión para la reticulación debido
al deficiente contacto entre la proteína y la superficie de la
microcápsula. Además, es difícil de controlar la reticulación
intramolecular, no intermolecular, durante la utilización de
reticulantes cortos o de longitud cero, tales como glicolaldehído o
EDC, respectivamente. Esto puede conducir a que las microcápsulas
estén poco cargadas y a la inactivación de la proteína.
Agam y Livne, en una serie de artículos, Blood
55: 186-191 (1983), Thromb. Haemostasis 51:
145-9 (1984) y 59: 504-6 (1988) y
Eur. J. Clin. Invest. (1991), demostraron que el recubrimiento de
plaquetas fijadas con fibrinógeno incrementaba la agregación
plaquetaria y que los eritrocitos recubiertos de fibrinógeno
reducían los tiempos de sangrado en ratas trombocitopénicas. La
fijación implicaba la utilización de formaldehído.
Coller et al., J. Clin. Invest. 89:
546-555 (1992) dan a conocer
"Tromboerythrocytes", una alternativa autóloga y semiartificial
a las transfusiones de plaquetas. Con el fin de evitar las
limitaciones e inconvenientes de la utilización de plaquetas
frescas, se acoplaron eritrocitos a péptidos que contenían la
secuencia RGD de reconocimiento celular utilizando un reticulante
bifuncional.
En un resumen presentado en el XVth Congress of
the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Jerusalén,
Israel, el 11-16 de junio de 1995, Yen et
al. dieron a conocer el potencial hemostático de
"Trombospheres", es decir, microesferas de HSA reticuladas,
diámetro medio de 1,1 a 1,3 \mum, con fibrinógeno humano unido
covalentemente a su superficie. En un modelo de conejo
trombocitopénico, se redujeron los tiempos de sangrado de los oídos.
Las microesferas de ASH se da a conocer que se preparan mediante el
procedimiento descrito en el documento U.S. nº
A-5069936, es decir, un procedimiento de
disolución/desolvatación utilizando glutaraldehído como agente
reticulante, etanol para provocar la precipitación y un
tensioactivo para modificar la superficie de las moléculas de
proteína reticuladas. Estas etapas no proporcionan un control de
tamaños de las microesferas, pueden provocar la degradación de las
proteínas unidas y son inadecuadas para la preparación a gran
escala de los sustitutos de plaquetas.
El documento U.S. nº A-5069936
describe la unión covalente de diversas moléculas biológicas pero no
del fibrinógeno. Se propone un polialdehído como agente de unión
covalente. Los Ejemplos 12 y 14 utilizan glutaraldehído para unir
anticuerpo y enzima (fosfatasa alcalina), respectivamente.
El documento WO nº A-9639128
(publicado el 12 de diciembre de 1996) también describe
"Trombospheres". Nuevamente, no se da a conocer ninguna
preparación específica.
El fibrinógeno es una glicoproteína adhesiva que
contiene la secuencia RGD(S). El fibrinógeno y otras
glicoproteínas similares (incluyendo la fibronectina y el colágeno,
entre otros) pueden mediar en la adhesión de las células tumorales a
las capas sub-endoteliales. Estas glicoproteínas
interaccionan con integrinas que se encuentran en las células
tumorales, por ejemplo el receptor de fibronectina y el receptor
GPIIb/IIIa en las plaquetas; ver Dardik et al., Int. J.
Cancer 70: 201-7 (1997).
Uno de los problemas principales del tratamiento
quirúrgico del cáncer es el riesgo incrementado de que las células
del tumor sean liberadas al sistema circulatorio. Éste es uno de
los motivos de la mayor morbilidad de los pacientes con cáncer de
próstata después de la cirugía. Sería deseable eliminar las células
tumorales metastásicas circulantes o inhibir su deposición sobre las
superficies vasculares.
El documento EP nº A-0333517 da a
conocer un péptido activo conjugado a un portador, tal como ASH o
dextrano de alto peso molecular, en el que la secuencia del péptido
incluye B2-Gly-Asp, en el que B2 es
preferiblemente Lys, Arg o His. El péptido contiene una secuencia
derivada de la cadena gamma de la molécula de fibrinógeno.
El documento U.S. nº A-4673573 da
a conocer conjugados de proteína fibrinolíticamente activos,
preparados a través de la utilización de un grupo de unión
heterobifuncional en el que parte del mismo es capaz de reaccionar
con un grupo tiol. El agente de unión se hace reaccionar con el
enzima fibrinolítico y el producto resultante se hace reaccionar
con una proteína humana de portador. Los posibles portadores
incluyen la ASH.
De acuerdo con la presente invención, un producto
farmacéuticamente aceptable comprende, como portador,
micropartículas insolubles que las que se une un componente activo
que esencialmente es fibrinógeno activo no degradado o un fragmento
del mismo con actividad de agregación plaquetaria. Tal producto es
útil como sustituto de plaquetas.
La presente invención proporciona, por vez
primera, sustitutos de plaquetas puros, robustos y terapéuticamente
aceptables. La pureza puede advertirse en la ausencia de
reticulante químico y/o tensioactivo. Son adecuados para la
utilización en el tratamiento de la trombocitopenia.
Es una característica adicional de la invención
que, debido a que el fibrinógeno actúa como un agente de
reconocimiento, los productos de la invención pueden presentar
útilmente otros agentes activos unidos. Tales agentes se
seleccionarán con respecto al sitio de acción, habitualmente un
sitio de lesión u otro sitio con sangrado y a la naturaleza del
problema tratado. Por ejemplo, puede ser útil un producto de la
invención que presente una combinación de fibrinógeno y Factor VIII
en el tratamiento de la hemofilia.
La unión del compuesto activo (fibrinógeno) al
portador puede ser no química, por ejemplo por adsorción, o
química, por ejemplo mediante la utilización de una molécula de
unión de por lo menos 10 nm de longitud. La invención puede hacer
uso del hecho de que un portador tal como ASH presenta grupos tiol
libres, con lo que puede reaccionar un compuesto bifuncional,
presentando éste un grupo selectivamente reactivo con el componente
activo. Por ejemplo, el producto puede comprender albúmina
conjugada mediante sus grupos tiol al componente activo, por medio
de un espaciador de por lo menos 50 nm de longitud.
Cuando hay un espaciador, puede prepararse un
producto de la invención mediante las etapas de:
reacción del componente activo (Z) con un
reactivo bifuncional de fórmula
Y^{1}-Y-Y^{2}, en la que Y es un
espaciador de por lo menos 10 nm de longitud, Y^{1} es un grupo
selectivamente reactivo con grupos tiol libres e Y^{2} es un
grupo reactivo con el componente activo pero no con los grupos tiol;
y
reacción del
Y^{1}-Y-Y^{2} resultante con
micropartículas insolubles de una proteína que presente grupos tiol
libres.
En virtud de la invención, puede conseguirse el
control de la reticulación debido a la especificidad de los grupos
de unión hacia el grupo tiol libre disponible sobre los portadores,
tales como ASH. La reticulación controlable es un aspecto
importante de la presente invención, debido a que podría presentar
una influencia directa sobre la actividad de la molécula unida.
El espaciador puede incluir péptidos hendibles
por enzimas, enlaces lábiles frente a ácido o álcali y ser de
longitud variable, dependiendo de las necesidades de la aplicación.
La longitud del espaciador puede ser otro aspecto importante de la
presente invención, debido a que puede determinar la capacidad del
conjugado de tener como diana a receptores, tal como fibrinógeno con
GPIIb/IIIa.
El portador que se utiliza en la invención
preferiblemente se produce mediante secado por pulverización, bajo
condiciones que permitan un buen control del tamaño de partícula y
la distribución de tamaños. Por ejemplo, el tamaño preferido es de
hasta 6 \mum, por ejemplo 1 a 4 \mum, con el fin de que las
partículas pueden pasar a través de los capilares.
Los materiales y procedimientos adecuados, así
como los procedimientos de estabilización de las micropartículas,
mediante calor o reticulación química, se describen exhaustivamente
en los documentos WO-A-9218164,
WO-A-9615814 y
WO-A-9618388. Tal como se explica en
la última publicación, las condiciones que se describen no afectan
a los grupos funcionales, tales como los grupos tiol en la
albúmina, que por lo tanto permanecen disponibles para la reacción
con moléculas biológicas.
Las micropartículas utilizadas en la presente
invención pueden presentar las características físicas descritas en
las dos publicaciones indicadas anteriormente, por ejemplo, pueden
ser suaves y esféricas y contener aire. Con el fin de obtener
microcápsulas reticuladas insolubles, el producto secado por
pulverización puede hacerse reaccionar con un agente reticulante
químico. Sin embargo, son preferibles el calor y la irradiación
\gamma y también pueden esterilizar los productos de polvos
secos.
En una realización de la invención, el
fibrinógeno puede estar unido a dicho portador sin una molécula de
unión, por ejemplo mediante adsorción. Esto puede conseguirse
mediante precipitación del péptido sobre la superficie de las
microesferas, por ejemplo mediante el control del pH y otras
condiciones, como resultará evidente a un experto ordinario en la
técnica. Seguidamente se lava el fibrinógeno sobrante/no unido.
En otra realización, el fibrinógeno se une
utilizando un reactivo bifuncional convencional, tal como un
polialdehído. Es preferente el glicolaldehído. Otro ejemplo de un
espaciador es el sulfosuccinimidil
4-(yodoacetil)aminobenzoato (que es soluble en agua). Su
longitud aproximada es de 1 nm.
El compuesto bifuncional (es decir,
Y^{1}-Y-Y^{2}) que se utiliza en
la invención puede ser generado él mismo por reacción de compuestos
más simples Y^{1}-Y^{3}-Y^{4}
y Y^{5}-Y^{6}-Y^{2}, en los
que Y^{1} es el grupo de reacción específica con tiol, Y^{4} y
Y^{5} reaccionan entre sí de manera que Y^{3} e Y^{6}
conjuntamente constituyen el espaciador Y, e Y^{2} es el grupo
reactivo con el fármaco. De esta manera, por ejemplo Y^{1} es I
reactivo con tiol y/o Y^{4}es COOH, tal como en ICH_{2}COOH.
Más específicamente, el ácido yodoacético es activado por la
adición de EDC (puede añadirse N-hidroxisuccinimida
para ayudar en la reacción de amidación catalizada por EDC,
resultando en la formación de un succinimidil éster activo). La
especie activada se incuba a continuación con un péptido o molécula
que presente grupos terminales amino (Y^{5}) y carboxilo
(Y^{2}) libres. Un péptido adecuado comprende, por ejemplo, 3 a 6
aminoácidos, tales como Gly o Ala.
El grupo carboxilo de dicho conjugado intermedio
se activa después con EDC. El espaciador activado se incuba con la
proteína y se forma un enlace peptídico con las cadenas laterales
de aminoácido lisina de la proteína. Sólo puede unirse un extremo
del espaciador a la proteína y, por lo tanto, no puede darse
reticulación en este momento. La mayoría de proteínas plasmáticas no
contienen grupos tiol libres, siendo la ASH una excepción y, por lo
tanto, se evita la formación de reticulación intramolecular de la
proteína.
A modo de ejemplo, el espaciador presenta una
funcionalidad yodoacetilo N-terminal que
reaccionará selectivamente con el tiol libre situado en el residuo
Cys-34 de las microcápsulas de ASH. Asimismo, el
espaciador puede poseer un ácido carboxílico libre que puede ser
activado, por ejemplo utilizando
1-etil-3,3-dimetilamino
propilcarbodiimida (EDC) y unirse a los grupos amina en un
péptido.
La activación del espaciado con EDC puede
llevarse a cabo a pH 6 en tampón de ácido
4-morfolinoetanosulfónico 0,05 M (tampón MES). Con
el fin de evitar la adsorción del fibrinógeno, tras hacerlo
reaccionar con el péptido activado N-yodoacetilo,
por ejemplo Gly-Leu-Phe, se cambia
el tampón por tampón borato sódico 0,1 M a pH 8. La adsorción del
fibrinógeno no ocurre al pH más elevado. Cualquier unión de
fibrinógeno a las microcápsulas de ASH se dará sólo como resultado
de la reacción del tiol libre de las microcápsulas de ASH con el
átomo de carbono adyacente a la molécula con yodo en el extremo
N-terminal del espaciador. El pH óptimo para la
interacción tiol-yodo es
pH 8.
pH 8.
Con el fin de potenciar la unión del fibrinógeno
a través del espaciador a las microcápsulas, puede incrementarse el
contenido de tiol libre de éstas utilizando reactivo de Traut
(2-iminotiolano). Este reactivo convierte los
grupos \varepsilon-amino de la lisina en grupos
tiol, resultando en un incremento en el número de tioles libres
disponibles para la unión con el espaciador y, de esta manera, con
el fibrinógeno.
También puede conseguirse una mayor carga
mediante la reticulación de los aminoácidos o péptidos que contienen
tiol (por ejemplo, cisteína, glutatión reducido) a las
microcápsulas previamente a la unión de la proteína de interés.
Pueden utilizarse moléculas de unión química, tales como el
iminotiolano, para introducir grupos tiol (así como para
incrementar el número). Podrían utilizarse otras proteínas para
producir microcápsulas si se añadiesen grupos tiol a su superficie,
como medio alternativo a la utilización de las propiedades
inherentes a la ASH (es decir, posesión de grupos tiol libres).
A continuación se incuba la proteína y espaciador
con microcápsulas de ASH que contienen grupos tiol libres. La
preparación de tales microcápsulas mediante secado por
pulverización sin pérdida de grupos funcionales se describe en los
documento WO-A-9615184 y
WO-A-9618388.
La proporción molar de espaciador a proteína debe
ser suficientemente elevada para permitir que suficientes grupos se
unan a la proteína para la reticulación con las microcápsulas, pero
suficientemente bajo para no desactivar la proteína. Dicho
procedimiento específico genera el conjugado intermedio
ICH_{2}CO(A)_{n}COOH, en el que (A)_{n}
representa n residuos del mismo o de diferentes aminoácidos. La
elección de n controla la longitud del espaciador, por ejemplo 10 a
600 nm (1 a 60 Angstroms), dependiendo de la aplicación prevista,
frecuentemente un mínimo de 50
nm.
nm.
Las etapas de procedimiento descritas
anteriormente pueden llevarse a cabo en sistemas principalmente
basados en disolventes acuosos. Los productos secundarios de
reacción pueden eliminarse fácilmente.
La tecnología de reticulación debería permitir el
control de la unión de péptidos y proteínas a microcápsulas, una
mejor conservación de la actividad de las proteínas y la capacidad
de modificar el espaciador en términos de longitud y
hendibilidad.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
productos de la reacción (que contienen fibrinógeno) pueden actuar
en el sitio de los tumores. Por lo tanto, pueden utilizarse en
terapia tumoral, por ejemplo uniendo un agente citotóxico mediante
el procedimiento particular de la presente invención o mediante los
procedimientos descritos en el documento
WO-A-9618388. Los agentes
citotóxicos adecuados incluyen metotrexato, doxorubicina,
cisplatino ó
5-fluoro-2-desoxiuridina.
El targeting de fármacos en células tumorales
puede conseguirse utilizando productos de la invención como
vehículos que reaccionan directamente con las células o que
participan en la agregación y deposición de la fibrina en el sitio
de la adhesión celular.
Los productos de la presente invención pueden
cargarse con agentes citotóxicos o con una combinación de agentes
citotóxicos y de targeting. En este caso pueden utilizarse para
atacar específicamente a las células tumorales diseminadas en la
circulación, mediante interacciones específicas con los receptores
glicoproteicos de la célula (búsqueda y destrucción) o mediante
participación en el proceso de agregación plaquetaria en el sitio
de la adhesión. En ambos casos, el fármaco citotóxico se concentra
en el sitio de las células tumorales invasoras.
Alternativamente, puede inhibirse la agregación
tumoral en el sistema circulatorio o incluso en el sitio de
adhesión, recubriendo la superficie de la célula tumoral con
productos de la invención y bloqueando los sitios/mecanismos que
activan las plaquetas. Esto permitiría que los mecanismos de defensa
natural del cuerpo facilitasen la eliminación de las células
tumorales.
También pueden liberarse productos que contienen,
por ejemplo, receptor GPIb (interacciona con el factor de von
Willebrands) o receptores de colágeno u otros componentes de la
matriz subendotelial, con el fin de bloquear los sitios de unión
para las células tumorales al recubrir las matrices subendoteliales.
El producto debería permitir todavía una interacción con las
plaquetas en el sitio de la lesión, pero también restringiría la
invasión de la pared vascular por parte de cualquier célula tumoral
inmovilizada.
Una ventaja importante de la presente invención
es que puede conservarse sustancialmente la actividad del
fibrinógeno. El contenido en fibrinógeno activo puede determinarse
mediante ELISA para la detección de fibrinopéptido A (FPA).
En un ensayo para detectar FPA, la incubación de
una cantidad constante de anticuerpo en exceso de fibrinopéptido A
con la muestra (o estándar) conduce a la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo. La concentración de anticuerpo
sobrante residual es inversamente proporcional a la cantidad de FPA
en la muestra (o estándar).
Con el fin de determinar la concentración de
anticuerpo, se transfieren alícuotas de la mezcla de incubación,
para la incubación posterior, en recipientes de reacción
recubiertos con FPA en exceso. Los complejos
antígeno-anticuerpo obtenidos unidos a las paredes
forman complejos sándwich con los anticuerpos
anti-IgG marcados con peroxidasa. La cantidad de
estos complejos proporciona una medida directa de la concentración
de FPA en la muestra.
Los complejos sándwich obtenidos se determinan
mediante la reacción enzimática de la peroxidasa con
H_{2}O_{2}/orto-
fenilenodiamina (cromógeno) y posterior medición espectrofotométrica a 492 nm. Debido a la relación inversa de actividad de enzima unido y concentración de antígeno, las absorbancias medidas se reducen a medida que la concentración de FPA en la muestra se incrementa. Los resultados se evalúan construyendo una curva de referencia con estándares de concentraciones conocidas.
fenilenodiamina (cromógeno) y posterior medición espectrofotométrica a 492 nm. Debido a la relación inversa de actividad de enzima unido y concentración de antígeno, las absorbancias medidas se reducen a medida que la concentración de FPA en la muestra se incrementa. Los resultados se evalúan construyendo una curva de referencia con estándares de concentraciones conocidas.
Un sustituto plaquetario de la invención
habitualmente comprende por lo menos 0,01%, preferiblemente por lo
menos 0,015%, más preferiblemente por lo menos 0,02% y con la mayor
preferencia por lo menos 0,025%, de fibrinógeno activo. La cantidad
de fibrinógeno no debe ser demasiado elevada, con el fin de evitar
la agregación, por ejemplo un máximo de 1, 1,5, 2 ó 2,5%. Del
contenido en fibrinógeno, es deseable que por lo menos el 50%,
preferiblemente por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo
menos el 90%, sea activo. Esto puede determinarse con respecto al
contenido total en fibrinógeno, que nuevamente puede medirse
mediante un procedimiento tal como ELISA. El contenido total en
fibrinógeno también puede determinarse mediante radiomarcaje, por
ejemplo con ^{125}I, y contaje, mediante procedimientos
convencionales.
El fibrinógeno puede derivarse de sangre, ser
transgénico o recombinante, de longitud completa o cualquier
fragmento activo del mismo. Entre otros, Coller et al.,
supra, dan a conocer fragmentos.
Puede administrarse para su utilización como
agente terapéutico, un producto de la invención como tal o mezclado
con cualquier portador adecuado conocido por un experto ordinario
en la materia. La cantidad de producto administrada estará
determinada en gran parte por la severidad de la lesión u otra
condición a tratar. Una dosis típica puede ser 1,5 x 10^{9}
microcápsulas por kg de peso corporal.
Los Ejemplos siguientes son ilustrativos de la
invención.
El fibrinógeno utilizado en los Ejemplos era un
producto comercialmente disponible de longitud completa y derivado
de sangre que había sido doblemente inactivado viralmente.
Las microcápsulas de ASH utilizadas en los
Ejemplos se prepararon mediante secado por pulverización y después
se estabilizaron mediante calentamiento, tal como se describe en el
documento WO nº A-9615814. Las microcápsulas se
sumergieron en Tween 80 al 1% y se lavaron extensivamente con PFPW
para eliminar el Tween 80 y el excipiente previamente a su
utilización.
PFPW = agua purificada exenta de pirógenos
DTNB = ácido
5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico)
El contenido en tioles libres se midió utilizando
el ensayo Ellman con DTNB. Este reactivo participa en un mecanismo
de intercambio de tioles con cualquier tiol libre presente en la
proteína a examen y libera (TNB) que puede medirse a 412 nm
mediante espectrofotometría UV/VIS.
Se hicieron reaccionar éster
N-hidroxisuccinimida de ácido yodoacético (IAAE)
con tetra-alanina (AAAA) en una mezcla de metanol y
agua destilada durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió EDC
en una proporción molar de 1,2 en relación a AAAA en agua destilada
durante 5 minutos, después de lo cual se añadió fibrinógeno
resuspendido en agua destilada. Tras agitar durante 1 hora a
temperatura ambiente, se añadieron microcápsulas y la mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 16 horas más.
Las microcápsulas se lavaron 6 veces con agua
destilada posteriormente a la reacción con el fin de eliminar
fibrinógeno y espaciador no reaccionado y después se resuspendieron
en agua destilada, dando una concentración final de microcápsulas
de 100 mg/ml.
Se calculó que la cantidad utilizada de
fibrinógeno (54 mg) era igual a 0,5 equivalentes molares en
relación a las microcápsulas (20 mg). Se consideró que ésta era la
carga máxima posible, dado el contenido en tioles libres de las
microcápsulas.
Los resultados del ELISA revelaron que se había
alcanzado una carga de fibrinógeno de 0,5 mg por 100 mg de ASH. Una
prueba en porta realizada con 5 mg de microcápsulas marcadas y 0,15
unidades de trombina dio un resultado positivo. La agregación
ocurrió inmediatamente al añadir trombina.
Se llevó a cabo el procedimiento del Ejemplo 1
utilizando las mismas cantidades de microcápsulas y de fibrinógeno
sin IAAE, AAAA ó EDC. Los resultados del ELISA en esta muestra
mostraron que se había alcanzado una carga de fibrinógeno de 0,06
mg por 100 mg de ASH. Esto se había conseguido sin utilizar un
reticulante. La muestra también dio un resultado positivo en la
prueba en porta, pero la agregación no ocurrió hasta
aproximadamente 12 segundos después de la adición de la
trombina.
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1 pero,
con el fin de optimizar la reacción entre IAAE y AAAA, se realizó
el seguimiento mediante HPLC en fase reversa. Con este fin fue
necesario investigar la cantidad de AAAA requerida para convertir
todo el IAAE en producto. Cualquier IAAE no reaccionado
posiblemente podría participar en reacciones secundarias no deseadas
más adelante durante la síntesis. En consecuencia, se incrementó la
cantidad reaccionada de AAAA de 1 equivalente molar a 4, mientras
que la cantidad utilizada de IAAE se mantuvo constan-
te.
te.
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, pero
se investigó la cantidad requerida de espaciador para una cantidad
dada de fibrinógeno, utilizando una proporción de IAAE a AAAA de
1:4 y un exceso de EDC de 1,2 equivalentes molares con respecto a
AAAA. Se calculó la cantidad utilizada de espaciador utilizando el
número de moles de IAAE presentes, debido a que éste es el
constituyente activo y el factor limitante en la preparación del
espaciador. De esta manera, se incrementó la proporción
IAAE-AAAA-EDC a fibrinógeno desde
1:1 hasta 1:5.
Los resultados del ELISA revelaron que una
proporción de fibrinógeno a
IAAE-AAAA-EDC de 1:2 rendía
reproduciblemente la máxima carga de fibrinógeno. Se calculó la
carga en 0,06 mg por 100 mg de ASH y la muestra se agregó dentro de
los 5 segundos según la prueba en porta.
En un experimento adicional de optimización, se
repitió el Ejemplo 1 pero con una cantidad reducida de fibrinógeno.
Se variaron las proporciones de
IAAE-AAAA-(EDC)-Fibrinógeno a
microcápsulas, como 0,5, 0,3, 0,1, 0,05 y equivalentes.
Los resultados del ELISA revelaron que todas las
muestras excepto la de proporción 1:0,01 presentaban una carga
aceptable de fibrinógeno. Las muestras variaban entre 0,1 y 0,2 mg
de fibrinógeno por 100 mg de ASH y el experimentó demostró que la
reducción de la cantidad de fibrinógeno hasta sólo 0,05
equivalentes molares rendía una carga tan elevada como la
utilización de 0,5 equivalentes molares.
Debido a que los resultados conseguidos en el
Ejemplo 4 fueron bastante uniformes, se llevaron a cabo dos
experimentos. La Tabla 1 muestra las cantidades utilizadas para
investigar las cargas de fibrinógeno en el primer experimento,
utilizando las proporciones siguientes:
IAAE:AAAA (1:4)
IAAE-AAAA-EDC:Fibrinógeno
(2:1)
IAAE-AAAA-(EDC)-Fibrinógeno:Microcápsulas
(0,3:1)
La Tabla 2 resume las cantidades requeridas para
el segundo experimento, que utilizó las mismas cantidades que el
primer experimento excepto en:
IAAE-AAAA-(EDC)-Fibrinógeno:Microcápsulas
(0,05:1)
\vskip1.000000\baselineskip
| Reactivo | Cantidad | Número de moléculas |
| IAAE | 52 \mug | 182 |
| AAAA | 210 \mug | 695 |
| EDC | 160 \mug | 834 |
| Fibrinógeno | 31 mg | 91 |
| Microcápsulas | 20 mg | 303 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Reactivo | Cantidad | Número de moléculas |
| IAAE | 8,6 \mug | 30,4 |
| AAAA | 35 \mug | 115,8 |
| EDC | 26,6 \mug | 139 |
| Fibrinógeno | 5,2 mg | 15,2 |
| Microcápsulas | 20 mg | 303 |
En ambos experimentos las microcápsulas se
hicieron reaccionar con el espaciador en fosfato sódico 0,1 M,
tampón de cloruro sódico 0,15 M a pH 8 a temperatura ambiente
durante 16 horas. A continuación, las microcápsulas se lavaron
extensivamente con PFPW y se resuspendieron, proporcionando una
concentración final de microcápsulas de 100 mg/ml.
Los resultados del ELISA obtenidos para las
muestras de proporción 0,3 y 0,05 revelaron que 0,38 y 0,42 mg de
fibrinógeno estaban unidos por 100 mg de ASH, respectivamente. Los
resultados de las pruebas en porta para ambas muestras dieron
resultados positivos, dándose la agregación aproximadamente 2
segundos después de la adición de la trombina.
Se preparó 1 mg de tetra-alanina
(AAAA). Se pesaron e introdujeron 3 mg de
tetra-alanina (Sigma) en un frasco bijou de 7 ml, se
disolvieron en 3 ml de PFPW y se agitaron con vórtex.
Se prepararon 3 mg/ml de éster succinimida de
ácido yodoacético (IAAE). Se pesaron e introdujeron 3 mg (Sigma) en
un frasco bijou de 7 ml y se disolvieron en 1 ml de metanol. La
mezcla resultante se sometió a agitación con vórtex.
Se pipetearon 70 \mul de la
tetra-alanina en un frasco bijou de 7 ml seguido de
5,7 \mul de IAAE. La mezcla resultante se agitó con vórtex. La
proporción molar de IAAE a tetra-alanina era de
1:4.
Se formularon microcápsulas de 2,3 g con glucosa.
La mezcla consistía en aproximadamente 800 mg de proteína y 1.600 mg
de glucosa. Se preparó una concentración de proteína de 50 mg/ml en
Tween 80 al 1% (v/v) (Sigma).
El contenido se sometió a agitación con vórtex y
se dejó reposar durante aproximadamente 30 minutos a temperatura
ambiente, con el fin de hacer sedimentar las microcápsulas huecas.
Se añadió una alícuota de 400 \mul a un eppendorf después de
agitar con vórtex. La muestra se sometió a centrifugación a 3.000
rpm durante 2 minutos en un Beckmann GS-15 a
temperatura ambiente (Fuerza Centrífuga Relativa (RCF) = 1.502
radianes/segundo). A continuación, la muestra resultante se lavó 3
veces con 1 ml de PFPW. El pellet se almacenó a temperatura
ambiente para su uso posterior.
Se reconstituyó un vial de fibrinógeno humano en
20 ml de solución salina 0,1 M/tampón fosfato sódico 0,025 M (pH
7,2) que produce una concentración teórica de fibrinógeno de 60
mg/ml. Se preparó una solución de fibrinógeno 5,8% (p/v) con
respecto a PEG 1000 mediante la adición de 4 ml de solución PEG
tamponada al 35% (p/v). La solución resultante se mezcló mediante
inversión sólo y después se enfrió sobre hielo durante 15 a 20
minutos. El precipitado resultante se centrifugó (4.000 rpm/4
minutos/Beckamn GS15). Se retiró el sobrenadante y se midió el
volumen.
Después, se lavó el pellet mediante la adición de
PEG al 7% (p/v)/solución salina 0,1 M/tampón de fosfato sódico
0,025 M (pH 7,2). Se utilizó la mitad del volumen de fibrinógeno de
la solución madre original para lavar el pellet. El pellet se
resuspendió en el tampón y se mezcló con un agitador de cuvettes. La
solución se centrifugó a 4.000 rpm durante 4 minutos. Se retiró el
sobrenadante del pellet lavado y se midió el volumen. El pellet se
reconstituyó en 20 ml de fosfato sódico 0,025 M/solución salina 0,1
M tamponada a pH 7,2. Se midió el volumen de la solución purificada
de fibrinógeno. La concentración total de proteínas se determinó
mediante ensayo BCA. La concentración de fibrinógeno se calculó
leyendo la absorbancia U.V. a 280 nm. Debido a que es conocido que
una solución de fibrinógeno al 1% (p/v) posee un coeficiente de
extinción de 15,5 a 280 nm, es posible calcular la concentración de
fibrinógeno (ref. "Haemostasis and Thrombosis", vol. nº 1,
tercera edición, página 492, R. F. Doolittle).
Se preparó 1 mg/ml EDC en PFPW. Se pesaron e
introdujeron 3 mg de EDC (Sigma) en un frasco bijou de 7 ml y se
disolvieron en 3 ml de PFPW. La mezcla resultante se agitó con
vórtex. El frasco bijou que contenía el espaciador reaccionado se
retiró del agitador. Se añadieron 53 \mul del EDC a la mezcla de
reacción. La proporción molar de EDC a tetra-alanina
era de 1:1,2. La mezcla resultante se agitó con vórtex y se agitó
durante aproximadamente 5 minutos.
Se añadieron 10,3 mg de fibrinógeno en 258 \mul
a 40 mg/ml. La proporción molar de fibrinógeno a microcápsulas de
ASH era de 0,1:1. La proporción molar de IAAE a fibrinógeno era de
2:1. El frasco bijou se invirtió y se agitó durante aproximadamente
60 minutos.
Se resuspendieron 20 mg de microcápsulas lavadas
en tampón, es decir en hidrogenofosfato disódico 0,1 M/NaCl 0,15 M a
pH 8,0. El pH se ajustó con HCl 12 N. Se añadieron 613 \mul de
tampón al interior de las microcápsulas. Después, éstas se
añadieron a la mezcla de reacción de 387 \mul. Esto resultó en un
volumen final de 1 ml. La mezcla resultante se agitó durante la
noche a temperatura ambiente. Dicha reacción duró aproximadamente
16 horas.
Se retiró el frasco bijou de la placa de
agitación. Se centrifugó a 4.500 rpm durante 1 minuto (RCF = 3.379
radianes/segundo). Se retiró el sobrenadante para ser analizado
mediante ELISA.
El pellet se lavó 6 veces en 1 ml de PFPW. El
líquido de los lavados también se conservó para determinar un
balance de masas mediante ELISA. A continuación, se resuspendió el
pellet en 200 \mul de PFPW. Una muestra se analizó mediante ELISA
(100 \mul) y una mediante prueba en porta (100 \mul).
Se almacenaron muestras del producto a 4ºC.
Se preparó un vial de las microcápsulas
formuladas que contenía 1 gramo de proteína y 2 gramos de manitol.
Los viales irradiados se almacenaron a 4ºC. Se preparó una
concentración de proteínas de 50 mg/ml en Tween 80 al 1% (v/v). El
contenido se agitó con vórtex y se dejó reposar durante
aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la
sedimentación de las microcápsulas huecas.
Para una preparación de 1 gramo, se añadió una
alícuota de 20 ml a un tubo de centrifugación Beckman de 50 ml
después de la agitación con vórtex. El tubo se centrifugó en
Beckman Avanti J-25 a 5.000 rpm durante 3 minutos a
temperatura ambiente (Fuerza Centrífuga Relativa (RCF) = 4.648
radianes/segundo). Después, se lavó 2 veces con 20 ml de PFPW a
3.300 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente (RCF = 2.025
radianes/segundo).
Las microcápsulas finalmente se lavaron con 20 ml
de tampón fosfato 10 mM (pH 6,0) con centrifugación a 3.000 rpm
durante 2 minutos a temperatura ambiente (RCF = 2.025
radianes/segundo). El pellet se resuspendió en 20 ml de tampón
fosfato 10 mM (pH 6,0) y se transfirió a un recipiente Sterilin de
70 ml con un agitador magnético.
Se reconstituyó el fibrinógeno en WFI para
producir una concentración teórica de fibrinógeno de aproximadamente
40 mg/ml. La suspensión se mezcló suavemente en un mezclador de
rodillos durante 20 minutos. El fibrinógeno en exceso se congeló
rápidamente en nitrógeno líquido en viales criogénicos Nalgene y se
almacenó
(-20ºC).
(-20ºC).
Para 1 gramo de preparación, se añadió
fibrinógeno (0,25 ml a 40 mg/ml) a las microcápsulas, bajo
agitación. La proporción molar de fibrinógeno a microcápsulas de
ASH era de 0,002:1. La mezcla se agitó durante aproximadamente 4
horas.
Se retiró el recipiente de la placa de agitación
y el contenido se transfirió a un tubo Beckman de 50 ml. Se
centrifugó a 3.300 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente
(RCF = 2.025 radianes/segundo). Se descartó el sobrenadante. El
pellet se lavó 3 veces en 20 ml de API. Los líquidos de lavado se
descartaron. Después, se resuspendió el pellet en 10 ml utilizando
API. Una muestra de 500 \mul se analizó mediante ELISA, una
mediante determinación por prueba en porta y una mediante contaje
Coulter.
Al completar el contaje Coulter, la muestra se
formuló mediante la adición de solución madre de manitol (153
mg/ml) y solución madre de tampón fosfato (250 mM) con el fin de
conseguir manitol isotónico (51 mg/ml), tampón fosfato 25 mM (pH
7,0 \pm 0,2) y un contaje de 1.500 millones de
microcápsulas/ml.
Se resuspendieron microcápsulas de ASH (50 mg,
0,757 \mumoles) en tampón de borato sódico 0,1 M, pH 8,05 (832
\mul) y se añadió 2-iminotiolano (520 \mug,
3,78 \mumoles) en tampón de borato sódico 0,1 M, pH 8,05 (168
\mul). La reacción se agitó durante una hora a temperatura
ambiente, después de lo cual las microcápsulas se lavaron en agua
destilada (5 x 5 ml). Se les dio a las microcápsulas un lavado final
en tampón de borato sódico 0,1 M, pH 8,05 y se resuspendieron en el
mismo tampón (2 ml).
Control
Se resuspendió fibrinógeno (20 mg, 0,058
\mumoles) en tampón MES 0,05 M, pH 6,03 (1,2 ml) y se agitó a
temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron microcápsulas de
ASH (50 mg, 0,757 \mumoles) en tampón de borato sódico 0,1 M, pH
8,05 (2 ml) y la reacción se agitó durante 2 horas adicionales a
temperatura ambiente.
Ejemplo
Se resuspendió N-yodoacetil
Gly-Leu-Phe (3 mg, 595 \mumoles)
en MES 0,05 M, pH 6,03 (1,2 ml), se añadió EDC (2 mg, 10,4
\mumoles) y la reacción se agitó durante 5 a 7 minutos a
temperatura ambiente. Se añadió fibrinógeno (20 mg, 0,058
\mumoles) y la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura
ambiente. Se añadieron microcápsulas de ASH (50 mg, 0,757
\mumoles) en tampón de borato sódico 0,1 M, pH 8,05 (2 ml) y la
reacción se agitó durante 2 horas adicionales a temperatura
ambiente.
Se recogió una muestra de cada una de las
reacciones, de control y experimentales, para la determinación del
tiol libre. La muestra restante de material de control y
experimental se lavó con agua destilada (2 x 5 ml) y se
resuspendió, dando una concentración de microcápsulas de ASH de 100
mg/ml.
En el presente Ejemplo, se incrementó el
contenido en tioles libres de las microcápsulas de ASH desde 0,211
hasta 1,73 nmoles SH por nmol de ASH. No se observó efecto alguno
sobre la actividad de la muestra de control (sin espaciador). Sin
embargo, al hacer reaccionar las microcápsulas modificadas con el
fibrinógeno que había sido incubado con el espaciador, se obtuvo una
muestra que era activa según la prueba en porta. La actividad en la
prueba en porta se incrementó hasta 5-15 segundos
en las microcápsulas de ASH con un contenido más elevado de tioles
libres. Esto sugiere que el incremento del contenido en tioles
libres de las microcápsulas de ASH conduce a una mayor actividad del
producto final, debido a que puede alcanzarse un nivel más elevado
de unión del espaciador y, de esta manera, de fibrinógeno.
Se añadió EDC (69,8:1 de una solución 0,5 mg/ml
en agua) a N-yodoacetil tetraglicina (125,5:1 de
una solución 0,5 mg/ml en agua) y la mezcla se agitó durante 5
minutos a temperatura ambiente. Se añadió fibrinógeno (186:1 de una
solución 55,5 mg/ml) y la reacción se agitó durante 1 hora a
temperatura ambiente.
Se añadieron microcápsulas cargadas con
doxorubicina, que contenían 0,56 moles de fármaco por mol de ASH
(100 mg), se resuspendieron en 1,619 ml de agua y se añadieron a la
solución de fibrinógeno activado. La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 16 horas.
Las microcápsulas se recogieron mediante
centrifugación a 3.500 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se
retiró y descartó. Las microcápsulas se lavaron en agua (4 x 5 ml)
y se resuspendieron en 1 ml de agua, dando una concentración final
de ASH de aproximadamente 100 mg/ml.
Se analizó la actividad de la muestra y se
encontró que la adición de fibrinógeno no resultaba en pérdida
alguna de doxorubicina de las microcápsulas. Además, las
microcápsulas doblemente cargadas mostraban actividad con la
trombina, indicando que el fibrinógeno unido seguía siendo activo a
pesar de la presencia de la doxorubicina. Los niveles de
fibrinógeno presente se determinaron mediante ELISA. Los resultados
de este análisis mostraron una carga moderada de fibrinógeno.
Claims (18)
1. Producto farmacéuticamente aceptable que
comprende, como portador, micropartículas insolubles a las que está
unido un componente activo que es esencialmente fibrinógeno activo
no degradado o un fragmento del mismo que presenta actividad de
agregación plaquetaria.
2. Producto según la reivindicación 1, en el que
el portador comprende micropartículas de proteína reticulada.
3. Producto según la reivindicación 2, en el que
la proteína es albúmina.
4. Producto según la reivindicación 3, en el que
la albúmina es albúmina sérica humana.
5. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el fibrinógeno es de longitud
completa.
6. Producto según la reivindicación 5, que
comprende 0,01 a 2,5% en peso de fibrinógeno activo y no más del 50%
de fibrinógeno inactivo.
7. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la unión no es química, por
ejemplo mediante adsorción.
8. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la unión es covalente, a través de
una molécula de unión química, en ausencia de tensioactivo.
9. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la unión es covalente, a través de
una molécula de unión química de por lo menos 10 nm de longitud.
10. Producto según la reivindicación 9, que
comprende albúmina conjugada a través de sus grupos tiol con el
componente activo, por medio de un espaciador de por lo menos 50 nm
de longitud.
11. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para su utilización como sustituto de
plaquetas.
12. Producto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además un agente
citotóxico unido.
13. Producto según la reivindicación 12, en el
que el agente citotóxico es metotrexato, doxorubicina, cisplatino ó
5-fluoro-2'-desoxiuridina.
14. Procedimiento para la preparación de un
producto según la reivindicación 9 ó 10, que comprende las etapas
siguientes:
hacer reaccionar el componente activo (Z) con un
reactivo bifuncional de fórmula
Y^{1}-Y-Y^{2}, en la que Y es un
espaciador de por lo menos 10 nm de longitud, Y^{1} es un grupo
selectivamente reactivo con los grupos tiol libres e Y^{2} es un
grupo reactivo con el componente activo pero no con los grupos tiol;
y
hacer reaccionar el
Y^{1}-Y-Z resultante con
micropartículas insolubles de una proteína que presenta grupos tiol
libres.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que Y^{1} es I.
16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, en el que Y^{2} es COOH.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que el reactivo bifuncional es obtenible mediante reacción de un
componente espaciador con ácido yodoacético opcionalmente
activado.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, en el que el espaciador comprende un ácido
graso o cadena peptídica.
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