ES2238774T3 - Conjugados que comprenden dos agentes activos. - Google Patents

Abstract

Conjugado farmacéutico que comprende una proteína portadora que presenta los grupos funcionales seleccionados de entre SH, NH2 y COOH, en el que la proteína portadora se encuentra en forma de micropartículas estabilizadas por calentamiento o entrecruzamiento químico, y al que están unidos un primer y segundo agentes activos, respectivamente mediante una primera molécula de enlace a un primer grupo funcional en el portador y mediante una segunda molécula de enlace a un segundo grupo funcional en el portador.

Description

Conjugados que comprenden dos agentes activos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a conjugados farmacéuticos, en particular los que comprenden dos agentes activos, y a su producción y utilización.

Antecedentes de la invención

En la patente WO nº 98/17319 se dan a conocer unos conjugados farmacéuticos y su producción. En particular, se describen conjugados de micropartículas de albúmina unidos por medio de un espaciador a un péptido RGD, tal como fibrinógeno. Su producción depende de la presencia de grupos SH funcionales en la albúmina. También se propone que el Factor VIII podría estar unido, por ejemplo como segundo agente activo, para su utilización en el tratamiento de la hemofilia. La unión puede ser química o mediante adsorción.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la utilidad de los portadores que presentan grupos funcionales adicionales, tales como grupos NH_{2} y COOH, presentes en las proteínas, al proporcionar un sitio de unión para un segundo agente activo diferente o adicional, y se define en la reivindicación 1. La función de cada agente activo puede conservarse tras la unión al portador. La invención es de valor particular con componentes activos que no pueden adsorberse fácilmente sobre el portador.

En una forma de realización particularmente preferida de la invención, los agentes activos unidos respectivamente a una microcápsula de albúmina son fibrinógeno y otra glicoproteína, tal como Factor VIII. Dichos productos pueden resultar útiles debido a que un agente activo resulta efectivo en el sitio de acción mientras que el otro actúa como agente diana.

Breve descripción del dibujo

Se ilustra esquemáticamente una forma de realización de la invención en el dibujo adjunto. El dibujo muestra cuatro etapas que son, respectivamente: (i) activación con EDC de los grupos COOH en una microcápsula que también presenta grupos SH en su superficie; (ii) utilización de un reactivo dihidrazida (en el que los grupos hidrazida se encuentran separados por un "espaciador") con el fin de proporcionar grupos hidracina libres unidos a la microcápsula mediante el espaciador; (iii) reacción del Factor VIII (FVIII) con los grupos hidrazida libres, proporcionando Factor VIII unido; y (iv) mediante la utilización de los grupos SH no reaccionados, la unión del fibrinógeno (Fb). La etapa (iv) puede llevarse a cabo tal como se describe en la patente WO nº 98/17319 o por medio de otras moléculas de enlace, tal como se describe posteriormente.

El producto de la etapa (iv), que comprende Factor VIII y fibrinógeno, resulta útil en el tratamiento de la hemofilia.

Descripción de la invención

Cualquiera o cada uno de los agentes activos puede ser una glicoproteína. El primer agente es, por ejemplo, Factor VIII. Otros compuestos adecuados incluyen Factor IX, otros factores sanguíneos, incluyendo los factores de coagulación sanguínea, proteínas de la cascada de coagulación, agentes trombolíticos, anticuerpos y \alpha-1 antitripsina.

El segundo agente activo es, por ejemplo, fibrinógeno. Otros compuestos adecuados son los péptidos que contienen RGD y las cadenas \gamma del fibrinógeno.

El agente activo puede ser un péptido (es decir, cualquier péptido, polipéptido, proteína o conjugado de los mismos) o incluir una parte peptídica, por ejemplo una glicoproteína. Dichas moléculas pueden estar unidas a microcápsulas, mediante una molécula de unión que incluya un espaciador. Más específicamente, la invención utiliza el hecho de que un portador de una proteína, tal como una albúmina de suero humana (HSA), posea grupos carboxilo, amino y tiol libres, con los que puede reaccionar un compuesto bifuncional. El compuesto bifuncional preferentemente posee un grupo selectivamente reactivo con el componente activo a conjugar.

Con el fin de conservar actividad, los espaciadores respectivos puede ser de longitudes definidas y/o diferentes. Son longitudes adecuadas de espaciador, 10 a 600 nm, por ejemplo 20 a 400 nm.

El espaciador puede incluir péptidos fusionables con enzimas y enlaces lábiles en ácido o en álcali, y ser de longitud variable, dependiendo de los requisitos de la aplicación. La longitud del espaciador puede ser otro aspecto importante de la presente invención, debido a que puede determinar la capacidad del conjugado de reconocer receptores, tales como fibrinógeno a GPIIb/IIIa.

En virtud de la invención, puede conseguirse el entrecruzamiento controlable debido a la especificidad de uno de los grupos de unión por el grupo funcional disponible en portadores tales como la HSA. El entrecruzamiento controlable es un aspecto importante de la presente invención, debido a que puede presentar un efecto directo sobre la actividad de la molécula unida.

La presente invención proporciona, entre otros, sustitutos plaquetarios puros, robustos y terapéuticamente aceptables. La pureza puede materializarse en ausencia de entrecruzante químico y/o de tensioactivo. Son adecuados para su utilización en el tratamiento de la trombocitopenia.

Una característica adicional de la invención que, debido a que el fibrinógeno actúa como un agente diana, los productos de la invención pueden presentar útilmente otros agentes activos unidos. Dichos agentes se seleccionan con respecto al sitio de acción, habitualmente una herida u otro sitio de hemorragia, y con respecto a la naturaleza del problema tratado.

Al proporcionar una combinación de, por ejemplo, fibrinógeno y Factor VIII, los productos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de la hemofilia. Además, o como alternativa a la utilización de un fármaco trombolítico, tal como la uroquinasa, los coágulos sanguíneos pueden ser tratados mediante la utilización de ultrasonidos. Con este propósito, las microcápsulas que contienen aire son especialmente adecuadas como portador.

El portador que se utiliza en la invención preferentemente se produce mediante secado por pulverización, bajo condiciones que permitan un buen control del tamaño de partícula y de la distribución de tamaños. Por ejemplo, el tamaño preferido es de hasta 6 \mum, por ejemplo de 1 a 4 \mum, con el fin de que las partículas puedan pasar por los capilares.

Los materiales y procedimientos adecuados, y también los procedimientos para estabilizar las micropartículas, mediante calor o mediante entrecruzamiento químico, se describen completamente en los documentos WO-A-9218164, WO-A-9615814 y WO-A-9618388. Tal como se explica en esta última publicación, las condiciones que se describen no afectan a los grupos funcionales, tales como los grupos tiol en la albúmina, que por lo tanto siguen estando disponibles para la reacción con moléculas biológicas.

Las micropartículas utilizadas en la presente invención pueden presentar las características físicas descritas en las dos publicaciones indicadas anteriormente, por ejemplo ser lisas y esféricas y contener aire. Con el fin de obtener microcápsulas entrecruzadas insolubles, el producto secado por pulverización puede hacerse reaccionar con un agente entrecruzante químico. Sin embargo, son preferidos el tratamiento por calor y por irradiación \gamma, y también pueden esterilizar los productos en forma de polvos secos.

Habitualmente se utilizará un reactivo bifuncional diferente para unir el portador con cada agente activo. Cada compuesto bifuncional (por ejemplo Y^{1}-Y-Y^{2}) que se utiliza en la invención puede producirse mediante reacción de los compuestos más simples Y^{1}-Y^{3}-Y^{4} e Y^{5}-Y^{6}-Y^{2}, en los que Y^{1} es específicamente reactivo con un grupo funcional en el portador, Y^{4} e Y^{5} reaccionan entre sí de manera que Y^{3} e Y^{6}conjuntamente constituyen el espaciador Y, e Y^{2} es el grupo reactivo con el agente. Por ejemplo, Y^{1} puede ser reactivo con tiol, particularmente si los grupos funcionales NH_{2} o COOH han sido utilizados, o se utilizarán, para unir un agente activo. Tal como se describe completamente en la patente WO nº 98/17319, Y^{1} puede ser I y/o Y^{4} es COOH, tal como en ICH_{2}COOH. Tal molécula de enlace presenta un ácido carboxílico libre que puede ser activado, por ejemplo utilizando 1-etil-3,3-dimetilaminopropilcarbodiimida (EDC) y unirse a los grupos amina en un péptido. La proteína más la molécula de enlace se incuban a continuación con microcápsulas de HSA que contienen grupos tiol libres.

El fibrinógeno puede unirse utilizando un reactivo bifuncional convencional, tal como un polialdehído. El glicolaldehído es preferido. Otro ejemplo de un espaciador es el sulfosuccinimidil 4-(yodoacetil)aminobenzoato (que es soluble en agua).

Otra molécula de enlace que puede utilizarse es un éster de NHS. Puede formarse un éster de NHS mediante reacción entre un ácido carboxílico y N-hidroxisuccinimida en presencia de una carbodiimida. La formación del éster activo debe llevarse a cabo en un ambiente no acuoso con el fin de evitar la hidrólisis del producto. La carbodiimida de elección es por lo tanto la diciclohexilcarbodiimida (DCC) soluble en agua.

La reacción del éster activo con una amina primaria o secundaria resulta en la formación de un enlace amida estable. El principal dominio funcional objetivo para la unión del éster a proteínas es el extremo \alpha-amino terminal y los grupos \varepsilon-amino de la lisina.

La solubilidad de los ésteres de NHS refleja las condiciones en las que los compuestos son sintetizados, debido a que son bastante insolubles en medios acuosos. Con frecuencia resulta necesario disolver el éster activo en un disolvente antes de la adición al compuesto que contiene amina. Esto presenta dificultades al añadir ésteres de NHS a proteínas que no toleran concentraciones elevadas de disolventes. En estos casos, la N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), una alternativa relativamente soluble en agua a la NHS, puede utilizarse para crear el éster activo. Los ésteres sulfo-NHS son bastante estables en un ambiente acuoso y se hidrolizan mucho más lentamente que los ésteres de NHS.

Además, los reactivos que contienen hidrazida pueden utilizarse como entrecruzantes y reconocerán grupos carbonilo en las moléculas. Los compuestos que contienen aldehído reaccionarán espontáneamente con una hidrazida, dando lugar a un enlace hidrazona. Si el compuesto o proteína a unir con la molécula de enlace hidrazona no posee grupos aldehídos, éstos pueden ser creados. Las moléculas de carbohidrato ofrecen la solución ideal y pueden convertirse en aldehídos mediante una oxidación de periodato suave de cualquier grupo cis-hidroxilo. También pueden hacerse reaccionar grupos ácido carboxílico con el compuesto hidrazida, aunque la reacción requiere previamente la activación del ácido carboxílico por la EDC. Las proteínas contienen abundantes grupos ácido carboxílico, y los componentes aminoácido particulares que participarían en este tipo de reacción son las cadenas laterales de los residuos de ácido aspártico y glutámico.

Otro tipo de molécula de enlace, típicamente un compuesto heterobifuncional, es una maleimida. Las maleimidas son el producto de una reacción entre anhídrido maleico y amonio o un compuesto de amina primaria. El doble enlace de las maleimidas es capaz de reaccionar con grupos sulfhidrilo libres para formar enlaces tioéter estables. El pH óptimo para esta reacción de alquilación se encuentra comprendido entre pH 6,5 y 7,5.

Puede preferirse no utilizar EDC. Por ejemplo, una molécula de enlace preferida comprende la combinación de un éster de NHS (ver anteriormente) y un grupo maleimida. El éster de NHS, que sustituiría la EDC, se diseña para reaccionar con grupos amina libres, produciendo enlaces amida estables sin necesidad de ninguna activación. Éste se une covalentemente, por ejemplo fibrinógeno con el espaciador. El grupo maleimida, que es altamente reactivo con los tioles libres, reacciona específicamente con el residuo Cys-34 en las microcápsulas, creando un enlace tioéter.

El éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) es un entrecruzante heterobifuncional comercialmente disponible que satisface los requisitos para la unión covalente del fibrinógeno con las microcápsulas de HSA de una manera altamente controlada. El entrecruzante presenta un éster de NHS separado del grupo maleimida por ácido benzoico. Un procedimiento típico para su utilización implica la reacción de fibrinógeno con MBS, rindiendo la proteína como intermediario maleimida activado.

La purificación, por ejemplo mediante precipitación con PEG, puede eliminar cualquier MBS no reaccionado antes de hacer reaccionar el intermediario proteína con los grupos tiol libres en las microcápsulas de HSA. Las técnicas analíticas actuales pueden utilizarse a continuación para determinar la actividad del producto final.

La carga de fibrinógeno o de otros agentes activos puede variarse utilizando este procedimiento de entrecruzamiento. El número de tioles libres disponibles en las microcápsulas para la unión puede incrementarse y controlarse utilizando 2-iminotiolano (reactivo de Traut). Cualquier incremento en el número de tioles libres resultaría en un número incrementado de enlaces tioéter y, por lo tanto, en una cantidad incrementada de fibrinógeno unido.

El procedimiento hidrazida de entrecruzamiento puede aplicarse para la unión con las microcápsulas de HSA de cualquier dominio que posea una función carbohidrato. Los ejemplos específicos incluyen la cadena \gamma de fibrinógeno, GBIb y Factor VIII.

Otra molécula de unión bifuncional que puede utilizarse es un reactivo dihidrazida, por ejemplo de la fórmula H_{2}N-NH-(CH_{2})_{n}-NH-NH_{2}, en la que n es de 4 a 20. En un ejemplo específico, n es 6 (dihidrazida de ácido adípico o AADH). Las condiciones apropiadas para utilizarlo, para proporcionar una glicoproteína unida, resultarán evidentes a los expertos ordinarios en la técnica. Dicho compuesto reaccionará fácilmente con los grupos aldehído y puede unirse a ácidos carboxílicos mediante la utilización de activador carbodiimida.

Con el fin de unir la cadena \gamma de fibrinógeno a las microcápsulas de HSA, los grupos de carbohidratos situados en la cadena \gamma puede tener que someterse a una oxidación suave con periodato sódico. Esto divide el componente cis-diol del anillo de azúcar, rindiendo aldehídos reactivos. Si la cadena se hace reaccionar con AADH, la conjugación final del intermediario con las microcápsulas de HSA puede implicar la unión del extremo libre de la molécula de enlace hidrazida con los grupos ácido carboxílico de las microcápsulas. Esto puede requerir EDC.

Un procedimiento alternativo de unión que aplica el concepto hidrazida implica la utilización de un entrecruzante heterobifuncional. Dicha molécula de enlace presenta la función hidrazida en un extremo y se encuentra separada, por ejemplo de un grupo piridiltio (S-SC_{5}H_{4}N) por un segmento de cadena simple de carbonos o por una estructura aromática más compleja. El grupo hidrazida reacciona con los grupos aldehído situados en, por ejemplo, la cadena \gamma tratada con periodato, dando lugar a un enlace covalente de hidrazona. El grupo piridilditiol participa en una reacción de intercambio de disulfuros con el tiol libre, Cys-34, en las microcápsulas de HSA.

Los enlaces carbohidrato que contribuyen a las cadenas tanto beta como gamma dentro de la estructura de fibrinógeno constituyen sitios ideales para el entrecruzamiento. Cada cadena oligosacárida contiene once unidades monosacárido en total, comprendiendo una combinación de residuos N-acetilglucosa, manosa, galactosa y ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico). Los carbohidratos están unidos mediante un residuo asparagina en ambas cadenas de fibrinógeno.

Un espaciador entrecruzante basado en el grupo funcional hidrazida es particularmente adecuado para la unión covalente de agentes, tales como glicoproteínas, por ejemplo fibrinógeno o Factor VIII, con las microcápsulas de HSA. Esto puede ocurrir a través del dominio carbohidrato, es decir, potencialmente sin afectar la parte proteica. Como primera etapa, resulta necesaria la modificación del residuo terminal de ácido siálico. La oxidación selectiva del periodato del diol presente en la cadena lateral de azúcar resulta en la formación de un aldehído activo. La concentración de periodato sódico y la temperatura de reacción pueden controlarse para determinar si sólo son hendidos los dioles de ácido siálico o si la oxidación es no selectiva. La incubación adicional con un grupo funcional hidrazida resulta en la formación de hidrazona. La adición de cianoborohidruro sódico provoca la reducción y estabilización del enlace de hidrazona, sin necesidad de EDC.

La 3-(2-piridiltio)propionilhidrazida (PDPH) es un entrecruzante preferido de dicho tipo. Puede participar tanto en la formación de hidrazona con fibrinógeno, como en la reacción de tioles libres con las microcápsulas de HSA. El enlace disulfuro del fibrinógeno derivatizado con hidrazona se rompe y experimenta una intercambio de tioles libres con el residuo Cys-34 en las microcápsulas de HSA, formando un segundo enlace disulfuro. Esto provoca la liberación de piridil-2-ditiona, la presencia de la cual puede detectarse mediante la lectura de absorbancias a 343 nm.

Tal como se ha indicado anteriormente, los productos de la invención que contienen fibrinógeno pueden actuar en los sitios tumorales. Por lo tanto, pueden utilizarse en la terapia antitumoral, por ejemplo mediante la unión a un agente citotóxico mediante el procedimiento particular de la presente invención o mediante los procedimientos descritos en el documento WO nº A-9618388. Los agentes citotóxicos adecuados incluyen metotrexato, doxorubicina, cisplatín y 5-fluoro-2'-desoxiuridina.

Puede conseguirse dirigir los fármacos hacia las células tumorales utilizando productos de la invención como vehículos que reaccionan directamente con las células o mediante la participación en la agregación y deposición de fibrina en el sitio de la adhesión celular.

Los productos de la presente invención pueden cargarse con agentes citotóxicos o una combinación de agentes citotóxicos y diana. A continuación pueden utilizarse para reconocer las células tumorales diseminadas en la circulación, mediante interacciones específicas con los receptores celulares de glicoproteína (búsqueda y destrucción) o mediante la participación en el proceso de agregación plaquetaria en el sitio de adhesión. En ambos casos, el fármaco citotóxico se concentra en el sitio de las células tumorales invasoras.

Alternativamente, la agregación tumoral puede inhibirse en el sistema circulatorio, o incluso en el sitio de adhesión, mediante el recubrimiento de la superficie de las células tumorales con productos de la invención y bloqueando los sitios/mecanismos que activan las plaquetas. Esto permitiría entonces que los mecanismos naturales de defensa del cuerpo facilitasen la eliminación de las células tumorales.

También pueden administrarse productos que contienen, por ejemplo, receptor GPIb (interacciona con el factor de von Willebrand) o receptores del colágeno o de otros componentes matriciales subendoteliales, con el fin de bloquear potencialmente los sitios de unión de las células tumorales al recubrir las matrices subendoteliales. El producto todavía debería permitir una interacción con las plaquetas en el sitio de una herida, aunque también debería restringir la invasión de la pared vascular por cualquier célula tumoral inmovilizada.

Una ventaja importante de la presente invención es que la actividad de los agentes activos (u otro péptido RGD) puede conservarse sustancialmente. El contenido de fibrinógeno activo puede determinarse mediante ELISA; ver patente WO nº 98/17319.

Un conjugado de la invención puede comprender por lo menos 0,01%, preferentemente por lo menos 0,015%, más preferentemente por lo menos 0,02% y con la mayor preferencia por lo menos 0,025% de glicoproteína activa. La cantidad de fibrinógeno no debe ser demasiado elevada, con el fin de evitar la agregación, por ejemplo hasta 1, 1,5, 2 ó 2,5%. Del contenido de fibrinógeno, es deseable que por lo menos el 50%, preferentemente por lo menos el 70%, más preferentemente por lo menos el 90%, sea activo. Esto puede determinarse con respecto al contenido total de fibrinógeno, que nuevamente puede medirse mediante un procedimiento tal como ELISA. El fibrinógeno total también puede determinarse mediante radiomarcaje, por ejemplo con ^{125}I y contaje mediante procedimientos convencionales.

El fibrinógeno puede derivarse a partir de sangre, ser transgénico o recombinante, ser de longitud completa o ser cualquier fragmento activo del mismo. Los fragmentos se dan a conocer, entre otros, en Coller et al., J. Clin. Invest. 89: 546-555 (1992).

Para la utilización como agente terapéutico, puede administrarse un producto de la invención solo, o en mezcla con cualquier portador adecuado conocido por los expertos ordinarios de la técnica. La cantidad de producto administrado se determinará principalmente a partir de la gravedad de la herida u otra condición a tratar. Una dosis típica puede ser de 1,5 x 10^{9} microcápsulas por kg de peso corporal.

Los Ejemplos siguientes ilustran la invención.

Las microcápsulas de HSA utilizadas en los Ejemplos se prepararon mediante secado por pulverización y después se estabilizaron mediante calentamiento, tal como se describe en el documento WO nº A-9615814. Para el enlace covalente se reconocieron dos grupos funcionales en las microcápsulas de HSA, los dominios de amina y tiol libre. Se seleccionaron entrecruzadores específicos para ambas proteínas con el fin de utilizar estos grupos diferentes.

El fibrinógeno utilizado en los Ejemplos era un producto de longitud completa, derivado de sangre, disponible comercialmente (SNBTS), que había sido doblemente inactivado víricamente.

Se obtuvo Alphanate® Factor VIII en Grifols UK y se utilizó en toda la invención. Se almacenaron alícuotas de 1 unidad internacional de Factor VIII/ml en agua destilada a -20ºC hasta su utilización.

El Factor VIII se unió utilizando 1-etil-1,3-dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) y el espaciador homobifuncional, dihidrazida de ácido adípico (AADH). La activación de los grupos carboxilo en la proteína Factor VIII se ve facilitada por la reacción con la EDC previamente a la adición de AADH. El dominio hidrazida libre en el extremo restante del entrecruzador reacciona a continuación con las funciones amina de las microcápsulas de HSA, liberando un derivado de urea. El fibrinógeno se unió utilizando MBS.

La prueba utilizada para el análisis de la carga y actividad de Factor VIII fue el kit de prueba Quadratech Coatest VIII: C/4. La prueba utiliza las capacidades de cofactor del Factor VIII.

La prueba en porta registra el tiempo necesario para que el producto final reaccione con la trombina y forme agregados. El producto final (50 \mul) se colocó en un porta de microscopio y se añadió trombina (50 \mul). Los dos se agitaron durante 2 segundos y se registró el tiempo transcurrido desde el inicio de la formación de agregados hasta el final de la agregación.

En un experimento de repetición, el producto final se formuló utilizando 51 mg/ml de manitol, tampón de fosfato sódico 25 mM, pH 7,0. Los contajes de las muestras se llevaron a cabo con un Coulter Multisizer y se calculó el volumen de agente de formulación requerido para producir una concentración en la muestra de 1.500 millones de microcápsulas por ml. La muestra se centrifugó a 3.500 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se decantó previamente a la resuspensión en el volumen calculado de tampón de formulación.

Ejemplo 1

Se extrajo una alícuota de una solución madre 3 mg/ml de MBS en DMF (8 \mul, 24 \mug, 72,5 nmoles) y se añadió a fosfato sódico 20 mM, pH 7,5 (1.867 \mul). La solución se mezcló uniformemente y se añadió fibrinógeno (125 \mul de solución 40 mg/ml en agua destilada, 14,5 nmoles) para producir un volumen total de reacción de 2 ml. La mezcla se hizo reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo agitación continua.

Se sumergieron las microcápsulas (100 mg, 1.515 nmoles) en Tween 80 al 1% y se lavaron dos veces en agua destilada, una vez en tampón de reacción, fosfato sódico 20 mM, pH 7,5, previamente a la reacción, con el fin de eliminar cualquier excipiente.

A continuación, la solución de fibrinógeno se añadió a las microcápsulas de HSA y se hizo reaccionar durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Tras lavar el producto dos veces en tampón de reacción con el fin de eliminar cualquier exceso de fibrinógeno no reaccionado, se descartó el sobrenadante y se añadió 1 U de FVIII (1 U de FVIII en agua destilada). Volumen total de reacción: 1 ml. Las microcápsulas de HSA se sumergieron en Tween 80 al 1% durante 30 minutos y se lavaron dos veces en agua destilada y una vez en tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,5, previamente a la adición a la muestra de proteínas respectiva.

Se preparó una solución madre 0,1 mg/ml de dihidrazida de ácido adípico (AADH) en fosfato sódico 20 mM, pH 7,5. Se añadió una alícuota (12 \mul, 1,2 \mug) al tampón (988 \mul) hasta un volumen total de 1 ml. A continuación se añadió una unidad de Factor VIII.

Se preparó una solución 0,02 mg/ml de EDC en el mismo tampón añadiendo una alícuota de 200 \mul de solución 1 mg/ml en 10 ml de tampón. A continuación se introdujo EDC (41 \mul, 0,82 ng, 5 equivalentes molares) en la solución de proteínas y se hizo reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente.

Las muestras que contenían FVIII derivatizada se hicieron reaccionar en presencia de microcápsulas durante 4 horas y las muestras de fibrinógeno derivatizadas, durante 30 minutos, con independencia del orden de reacción.

Tras completar el tiempo de reaccionar entre una proteína y las microcápsulas de HSA, la muestra se lavó, previamente a la adición de la segunda proteína derivatizada. Al hacer reaccionar en primer lugar el fibrinógeno, las muestras se lavaron dos veces en tampón y el sobrenadante del lavado final se decantó previamente a la introducción de FVIII derivatizado. Al hacer reaccionar en primer lugar el FVIII, se llevó a cabo una etapa de lavado.

Se incluyeron controles que contenían una proteína entrecruzada y microcápsulas. También se sometió a la prueba Quadratech Coatest una muestra de fibrinógeno (5 mg) en tampón de fosfato sódico 20 mM (2 ml, 2,5 mg/ml de concentración de proteínas).

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos en estos experimentos. Los valores de concentración no están corregidos respecto a las muestras de control.

TABLA 1

1

La actividad del Control 1 en la prueba en porta se comparó con las dos muestras de reacción. Se observó que previamente a la introducción de fibrinógeno, la adición y reacción del Factor VIII derivatizado resultaba en una reducción de actividad. Esta reducción puede ser debida a una carga reducida de fibrinógeno en presencia de FVIII entrecruzado. Sin embargo, al reaccionar en primer lugar el fibrinógeno derivatizado con las microcápsulas, no se observó ningún cambio significativo de actividad en comparación con el Control 1.

El bajo rendimiento en porcentaje de FVIII obtenido en la Reacción 1 sugiere que la reacción anterior de MBS-fibrinógeno con las microcápsulas aparentemente obstruye la carga del Factor VIII. Esto puede ser el resultado de la adsorción de un exceso de fibrinógeno sobre la superficie de las microcápsulas de HSA que bloquean los sitios de entrecruzamiento.

Sin embargo, al comparar la Reacción 2 con el Control 2, la concentración de FVIII está incrementada, y esto puede deberse a las impurezas, tales como Factor VIII, Factor IXa o Factor Xa, en el material de partida de fibrinógeno. Estas impurezas también podrían explicar la actividad positiva registrada en el control de fibrinógeno-MBS en el que no había FVIII. Las muestras de solo fibrinógeno también produjeron un resultado positivo bajo condiciones experimentales, confirmando la presencia de impurezas que interferían con los valores de concentración obtenidos en el ensayo.

Los resultados indican que es preferible hacer reaccionar FVIII derivatizado utilizando AADH y EDC con las microcápsulas de HSA previamente a la adición de fibrinógeno derivatizado, con el fin de producir un producto final que conserve una actividad elevada de ambas proteínas.

Ejemplo 2

Se siguió la metodología descrita en el Ejemplo 1, en el que se había hecho reaccionar Factor VIII derivatizado previamente a la adición de fibrinógeno derivatizado. Se incluyó un control que contenía únicamente fibrinógeno recombinante reaccionado con MBS y microcápsulas. También se analizó una muestra de fibrinógeno recombinante. En la Tabla 2 se muestran los resultados; no están corregidos respecto a los valores de control.

TABLA 2

2

El fibrinógeno recombinante sólo resultó en el registro de un valor de concentración mucho menor en la prueba Coatest en comparación con la muestra de fibrinógeno SNBTS en el Ejemplo 1. Esta diferencia puede explicarse por la ausencia de impurezas en el fibrinógeno recombinante. Este incremento en la concentración de la muestra de control era inesperada y puede ser debida a que las microcápsulas de HSA también presentaban un efecto sobre la prueba en ausencia de Factor VIII.

La actividad en la prueba en porta era inferior para los productos del Ejemplo 1. Esta pérdida de actividad podría estar provocada por la carga reducida del fibrinógeno recombinante bajo las condiciones utilizadas. Resultará evidente que pueden llevarse a cabo modificaciones a fin de optimizar la actividad del producto final.

Claims (11)

1. Conjugado farmacéutico que comprende una proteína portadora que presenta los grupos funcionales seleccionados de entre SH, NH_{2} y COOH, en el que la proteína portadora se encuentra en forma de micropartículas estabilizadas por calentamiento o entrecruzamiento químico, y al que están unidos un primer y segundo agentes activos, respectivamente mediante una primera molécula de enlace a un primer grupo funcional en el portador y mediante una segunda molécula de enlace a un segundo grupo funcional en el portador.

2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el portador es albúmina de suero humana.

3. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el portador se encuentra en forma de microcápsulas.

4. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer agente es una glicoproteína.

5. Conjugado según la reivindicación 4, en el que el primer agente es Factor VIII.

6. Conjugado según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el segundo agente es fibrinógeno.

7. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer grupo funcional es NH_{2} o COOH.

8. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera molécula de enlace se deriva de una dihidrazida.

9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera molécula de enlace presenta una longitud de por lo menos 10 nm.

10. Utilización de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una condición en un sitio en el cuerpo de un paciente, en el que uno de los agentes resulta efectivo para tratar la condición y el otro agente actúa como un agente diana del sitio.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que la condición es hemorragia, por ejemplo hemofilia, el sitio es una herida, un agente es Factor VIII y el otro agente es fibrinógeno.