ES2233936T3 - Virus msrv1 asociado a la esclerosis en placas, sus constituyentes nucleicos y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Fragmento nucleótido aislado, cuya secuencia nucleótida, comprende una secuencia elegida entre las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, y sus secuencias complementarias. Recientemente, los trabajos de los solicitantes, han permitido obtener dos líneas continuas de células infectadas por aislamientos naturales procedentes de dos pacientes diferentes, afectados de SEP, mediante un procedimiento de cultivo. Estas dos líneas derivadas de células de plexuscoroides humanos, denominadas LM7PC y PLI-2, se han depositado en la E.C.A.C.C., respectivamente, en conformidad con las disposiciones del tratado de Budapest. Además, los aislamientos víricos, que poseen una actividad RT del tipo LM7, se han depositado igualmente en la E.C.A.C.C, bajo la denominación global de ¿cepas¿. La ¿cepa¿ o aislamiento hospedada por la línea PLI-2, denominada POL-2. La ¿cepa¿ o aislamiento hospedado por la línea LM7PC, denominada MS7PG. A partir de los cultivos y de los aislamientos anteriormente citados, caracterizados por criterios biológicos y morfológicos, se ha procedido, a continuación, a caracterizar el material nucleico asociado a las partículas víricas producidas en estos cultivos.

Description

Virus MSRV1 asociado a la esclerosis en placas, sus constituyentes nucleicos y sus aplicaciones.

La esclerosis en Placas (SEP - del francés Sclerose en Plaques), es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), cuya causa, permanece todavía desconocida.

Varios trabajos realizados, han sostenido la hipótesis de una etiología vírica de la enfermedad, pero ninguno de los virus conocidos sometidos a test de ensayo, se ha revelado como siendo el agente causante buscado: una revisión de los virus investigados desde hace años, es la que se ha llevado a cabo por parte de E. Norrby (1) y R. T. Johnson (2).

Paralelamente, se sugiere la posibilidad de un factor exógeno y/o infeccioso, por la existencia de epidemias localizadas o "clusters" de SEP, como el que ha observado en las Islas Feroes, entre los años 1943 y 1960 (3), en Cerdeña 4), en Noruega (5), así como mediante los estudios sobre las poblaciones migratorias (6). Entre los factores exógenos sugeridos, se han estudiado los virus, de la forma más frecuente, y se ha evocado, clásicamente, una etiología vírica.

La observación, en la SEP (Esclerosis en Placas), de fenómenos asimilables a una reacción de auto-inmunidad, ha conducido a una hipótesis etiológica auto-inmune "esencial" (7 y 8). Mientras tanto, esta auto-inmunidad dirigida contra ciertos componentes del SNC (sistema nervioso central), se ha revelado como poco específica de la SEP, y frecuente en las inflamaciones del SNC, asociadas o no a una infección (9, 10, 11 y 12). Además, ninguna de las terapéuticas inmuno-supresoras, ha permitido obtener unos resultados decisivos contra la SEP (13). Parece por lo tanto probable el hecho de que, las manifestaciones auto-inmunes, se inducen mediante un mecanismo de origen vírico: co-sensibilización a determinados virus asociados a moléculas de origen celular, fenómenos de mimetismo molecular, (14), o mediante expresión de superantígenos retrovíricos (15).

Trabajos realizados, han sostenido una hipótesis, según la cual, un retrovirus, sería el origen de la enfermedad: el descubrimiento reciente (16) de síndromes neurológicos asociados al virus HTLV-I, conocido en el origen, como agente de leucemias T del adulto, ha conducido, a numerosos autores (17, 18, 19, 20, 21, 22, 23), a investigar una implicación de este retrovirus humano, en la SEP, mientras tanto sin éxito, o con resultados que evocan reacciones cruzadas.

Recientemente, se ha aislado un retrovirus, diferente de los retrovirus humanos conocidos, en los pacientes afectados de SEP (24, 25 y 26). Los autores, han podido también mostrar el hecho de que, estos retrovirus, pueden transmitirse in vitro, que pacientes afectados de SEP, producían anticuerpos susceptibles de reconocer proteínas asociadas a la infección por células leptomeníngeas mediante este retrovirus y que, la expresión de éste último, podía estimularse fuertemente mediante los genes inmediatos - precoces, de ciertos herpesvirus (27).

Todos estos resultados, abogan a favor del rol interpretativo en la SEP, de por lo menos un retrovirus desconocido o de un virus que tiene una actividad transcriptasa inversa, detectable según el procedimiento publicado por parte de H. Perron (24) y calificada de actividad "RT del tipo LM7". El contenido de la publicación, identificado por (24), se incorpora en la presente descripción, a título de referencia.

Recientemente, los trabajos de los solicitantes, han permitido obtener dos líneas continuas de células infectadas por aislamientos naturales procedentes de dos pacientes diferentes, afectados de SEP, mediante un procedimiento de cultivo, tal como el que se describe en el documento de solicitud de patente internacional WO - A - 93 201 188, cuyo contenido, se incorpora a la presente descripción, a título de referencia. Estas dos líneas derivadas de células de plexus-coroides humanos, denominadas LM7PC y PLI-2, se han depositado en la E.C.A.C.C., respectivamente, el 22 de julio de 1992 y el 8 de enero de 1993, bajo los números 92072201 y 93010817, en conformidad con las disposiciones del tratado de Budapest. Además, los aislamientos víricos, que poseen una actividad RT del tipo LM7, se han depositado igualmente en la E.C.A.C.C, bajo la denominación global de "cepas". La "cepa" o aislamiento hospedada por la línea PLI-2, denominada POL-2, se depositó el 22 de julio de 1992, con el nº V92072202. La "cepa" o aislamiento hospedado por la línea LM7PC, denominada MS7PG, se depositó el 8 de enero de 1993, con el nº V93010816.

A partir de los cultivos y de los aislamientos anteriormente citados, caracterizados por criterios biológicos y morfológicos, se ha procedido, a continuación, a caracterizar el material nucleico asociado a las partículas víricas producidas en estos cultivos.

Los diferentes objetos de la presente invención, se definen en las reivindicaciones 1 a 11, en el anexo.

Antes de detallar la invención, se procederá a definir, a continuación, diferentes términos utilizados en la descripción y las reivindicaciones:

- por cepa o aislamiento, se entiende toda fracción biológica infectante y/o patógena, la cual contiene, por ejemplo, virus y/o bacterias y/o parásitos, y que genera un poder patógeno y/o antígeno, hospedado por un cultivo o un huésped vivo; a título de ejemplo, una cepa vírica en concordancia con la anterior definición, puede contener un agente infectante, por ejemplo, un protista patógeno,

- el término ``MSRV utilizado en la presente descripción, designa todo agente patógeno y/o infectante, asociado a la esclerosis en placas, especialmente, una especie vírica, las cepas atenuadas de la citada especie vírica, o las partículas defectuosas interferentes derivadas de esta especie. Se conoce el hecho de que, los virus y, de una forma particular, los virus que contienen ARN, tienen una variabilidad consecutiva, especialmente, a tasas relativamente elevadas, de mutación espontánea (28), la cual deberá tenerse en cuenta, posteriormente, a continuación, para definir la noción de equivalencia,

- por virus humano, se entiende un virus susceptible de infectar al ser humano.

- teniendo en cuenta todas las variaciones naturales o inducidas, las cuales pueden encontrarse en la práctica de presente invención, los objetivos de ésta última, definidos en las reivindicaciones, se han expresado comprendiendo los equivalentes o derivados de los diferentes materiales biológicos definidos posteriormente, a continuación, especialmente, secuencias homólogas nucleótidas o péptidas.

- la variante de un virus según la presente invención, comprende por lo menos un antígeno correspondiente del citado virus, y/o un genoma, en donde, cualquier parte, se detecta mediante por lo menos una sonda de hibridación, y/o por lo menos un cebador de amplificación nucleótida, específica, del citado virus, como por ejemplo, aquéllas que tienen una secuencia nucleótida elegida entre las SEQ ID NO 16 a SQ ID NO 26, SEQ ID Nº 31 a SEQ IND NO 33, y sus secuencias complementarias, en las condiciones de hibridación determinadas, bien conocidas por parte del experto en el arte de la técnica.

- según la invención, un fragmento nucleótido o un oligonucleótido o un polinucleótido, es una concatenación de monómeros, o un biopolímero, caracterizado por la secuencia informativa de los ácidos nucleicos naturales, susceptibles de hibridar a cualquier otro fragmento nucleótido, en condiciones predeterminadas, pudiendo contener, la concatenación, monómeros de estructuras químicas diferentes, y obtenerse a partir de una molécula de ácido nucleico natural y/o recombinación genética y/o por síntesis química.

- así, de este modo, un monómero, puede ser un nucleótido natural de ácido nucleico, en donde, los elementos constitutivos, son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada; en el ARN, el azúcar, es la ribosa, en el ADN, el azúcar, es la desoxi-2-ribosa; según se trate del ADN ó del ARN, la base nitrogenada, se elige entre la adenina, la guanina, el uracilo, la citosina, la timina, o el nucleótido, puede modificarse en uno, de por lo menos tres elementos constitutivos; a título de ejemplo, la modificación, puede intervenir al nivel de las bases, generando bases modificadas tales como la inosina, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5-desoxioridina, la diamino-2,6-purina, la bromo-5-desoxiiridina, o cualquier otra base modificada que favorezca la hibridación,; al nivel del azúcar, la modificación, puede consistir en el reemplazo de por lo menos una desoxirribosa por una poliamida (29), y al nivel del grupo fosfato, la modificación, puede consistir en su reemplazo por ésteres, especialmente, elegidos entre los ésteres de difosfato, de alquil- y arenilfosfonato, y de fosforotioato.

- por "secuencia de información", se entiende cualquier continuación ordenada de monómeros, en donde, la naturaleza química, y el orden, en un sentido de referencia, constituyen o no una información funcional, de la misma calidad que la de los ácidos nucleicos naturales.

- por "hibridación", se entiende el proceso durante cuyo transcurso, en condiciones operativas apropiadas, se aparean dos fragmentos nucleótidos, los cuales tienen secuencias suficientemente complementarias, para formar una estructura compleja, especialmente, doble o triple, de una forma preferente, en forma de hélice.

- una sonda, comprende un fragmento nucleótido sintetizado por vía química, obtenido por digestión o corte enzimático de un fragmento nucleótido más largo, el cual comprende por lo menos seis monómeros, de una forma ventajosa, de 10 a 100 monómeros, de una forma preferente, de 10 a 30 monómeros, y que posee una especificidad de hibridación, en condiciones determinadas; de una forma preferente, una sonda que posea menos de 10 monómeros, no se utiliza sola, sino que, ésta, se utiliza en presencia de otras sondas de tamaño tan corto, o no; en ciertas condiciones particulares, puede ser útil el proceder a utilizar sondas de un tamaño superior a 100 monómeros; una sonda, puede utilizarse, especialmente, con finalidades de diagnóstico, y se tratará, por ejemplo, de sondas de captura y/o de detección,

- la sonda de captura, puede inmovilizarse sobre un soporte sólido, mediante cualquier tipo de medio apropiado, es decir, directamente o indirectamente, por ejemplo, por covalencia o adsorción pasiva.

- la sonda de detección, puede marcarse por mediación de un marcador elegido principalmente entre los isótopos radioactivos, enzimas principalmente elegidas entre la peroxidasa y la fosfatasa alcalina, y aquéllos que son susceptibles de hidrolizar un substrato cromógeno, fluorígeno o luminiscente, compuestos químicos cromóforos, compuestos cromóforos, fluorígenos o luminicentes, análogos de bases nucleótidas, y la biotina,

- las sondas utilizadas con finalidades de diagnóstico de la invención, pueden aplicarse en todas las técnicas de hibridación conocidas y, especialmente, las técnicas denominadas "DOT-BLOT" (30), "SOUTHERN BLOT" (31), "NORTHERN BLOT", la cual es una técnica idéntica a la "SOUTHERN BLOT", pero que utiliza el ARN como diana, la técnica SÁNDWICH (32); de una forma ventajosa, se utiliza la técnica SANDWICH, en la presente invención, que comprende una sonda de captura específica y/o una sonda de detección específica, en el bien entendido que, la sonda de captura y la sonda de detección, deben presentar una secuencia nucleótida por lo menos parcialmente diferente,

- la invención, cubre igualmente a una sonda susceptible de poder hibridarse in vivo o in vitro, sobre el ARN y/o sobre el ADN, para bloquear los fenómenos de replicación, especialmente, traducción y/o transcripción, y/o para degradar el citado ADN y/o ARN,

- un cebador, es una sonda que comprende por lo menos seis monómeros y, de una forma ventajosa, de 10 a 30 monómeros, que posee una especificidad de hibridación en condiciones determinadas, para la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo, en una técnica de amplificación tal como la PCR (Polymerasa Chain Reaction -[Reacción en cadena de la polimerasa]-), en un procedimiento de elongación, tal como la secuenciacion, en un procedimiento de transcripción inversa, o análogo,

- las secuencias nucleótidas o péptidas, se denominan equivalentes o derivadas, la una con respecto a la otra, o con respecto a una secuencia de referencia si, funcionalmente, los biopolímeros correspondientes, pueden jugar sensiblemente el mismo rol interpretativo, sin ser idénticas, con respecto a la aplicación o utilización considerada, o en la técnica, en la cual éstas intervienen; son especialmente equivalentes, dos secuencias obtenidas debido al hecho de la variabilidad natural, especialmente, mutación espontánea de la especie a partir de la cual, éstas se han identificado, o inducida, así como secuencias homólogas, definiéndose la homología posteriormente, a continuación,

- por variabilidad, se entiende cualquier tipo de modificación, espontánea o inducida, de una secuencia, principalmente, por sustitución, y/o inserción, y/o deleción, de nucleótidos y/o de fragmentos nucleótidos, y/o de extensión y/o de acortamiento de la secuencia, en por lo menos uno de sus extremos; de las técnicas de ingeniería genética utilizadas, puede resultar una variabilidad no natural, por ejemplo, a raíz de la elección de los cebadores de síntesis, degenerados o no, retenidos para amplificar un ácido nucleico; esta variabilidad, puede traducirse por modificaciones de cualquier secuencia de partida, considerada como de referencia, y pueden expresarse mediante un grado de homología, con relación a la citada secuencia de referencia,

- la homología, caracteriza el grado de identidad de dos fragmentos nucleótidos o péptidos comparados; ésta se mide mediante el porcentaje de identidad el cual se determina principalmente por comparación directa de las secuencias nucleótidas o péptidas, con relación a secuencias nucleótidas o péptidas de referencia,

- este porcentaje de identidad, se ha determinado específicamente, para los fragmentos nucleótidos relevantes de la presente invención, homólogos a los fragmentos identificados por las SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 9 (MSRV-1), así como para las sondas y cebadores homólogos a las sondas y cebadores identificados por las SEQ ID NO 16 a NO 26 y SEQ ID NO 31 a NO 33; a título de ejemplo, el porcentaje de identidad más débil observado, entre los diferentes "consensus" (consensos) generales en ácidos nucleicos obtenidos a partir de los fragmentos de ARN vírico de MSRV-1, nacido de las líneas LM7PC y PLI-2, según un protocolo detallado más lejos, es de un 67%, en la región descrita en la figura 2,

- todo fragmento nucleótido, se denomina equivalente o derivado de un fragmento de referencia, si éste presenta una secuencia nucleótida equivalente a la secuencia de referencia; según la definición precedente, son principalmente equivalentes a un fragmento nucleótido de referencia:

a) todo fragmento susceptible de hibridar por lo menos parcialmente con el complemento del fragmento de referencia

b) todo fragmento cuyo alineamiento con el fragmento de referencia, conduce a evidenciar las bases contiguas idénticas, en número más importante, con cualquier otro fragmento procedente de otro grupo taxonómico

c) todo fragmento resultante o que puede resultar de la variabilidad natural de la especie, a partir de la cual éste se obtiene

d) todo fragmento que pueda resultar de las técnicas de ingeniería genética, aplicadas al fragmento de referencia

e) todo fragmento, el cual comporte, por lo menos, ocho nucleótidos contiguos, codificando un péptido homólogo o idéntico al péptido codificado por el fragmento de referencia,

f) todo fragmento diferente del fragmento de referencia, por inserción, deleción, sustitución, de por lo menos un monómero, extensión, o acortamiento de por lo menos uno de sus extremos; por ejemplo, todo fragmento correspondiente al fragmento de referencia flanqueado en por lo menos uno de sus extremos, mediante una secuencia nucleótida, que no codifica para un polipéptido,

- por polipéptido, se entiende, principalmente, todo péptido de por lo menos dos aminoácidos, principalmente, oligopéptido, proteína, extracto, separado, o substancialmente, aislado, o sintetizado, mediante la intervención de la mano del hombre, especialmente, aquéllos obtenidos por síntesis química, o mediante expresión en un organismo recombinante,

- por polipéptido codificado de una forma parcial, mediante un fragmento nucleótido, se entiende un polipéptido que presenta por lo menos 10 aminoácidos codificados mediante por lo menos 30 monómeros contiguos comprendidos en el citado fragmento nucleótido,

- un aminoácido, se denomina análogo a otro aminoácido, cuando sus características físico-quimicas respectivas, tales como la polaridad, hidrofobicidad, y/o basicidad, y/o acidez, y/o neutralidad, son sensiblemente las mismas; así, de este modo, una leucina, es análoga a una isoleucina,

- todo polipéptido, se denomina equivalente o derivado de un polipéptido de referencia, si los polipéptidos comparados, tienen sensiblemente las mismas propiedades antígenas, inmunológicas, enzimológicas y/o de reconocimiento molecular; es principalmente equivalente a un polipéptido de referencia,

a) todo polipéptido que posea una secuencia, en donde, por lo menos un aminoácido, se haya sustituido por un aminoácido análogo,

b) todo polipéptido que tenga una secuencia péptida equivalente, obtenida por variación natural o inducida del citado polipéptido de referencia, y/o del fragmento nucleótido que codifica para el citado polipéptido,

c) un mimótopo del citado polipéptido de referencia,

d) todo polipéptido, en cuya secuencia, uno o varios aminoácidos de la serie L, se reemplazan por un aminoácido de la serie D, y viceversa,

e) todo polipéptido, en cuya secuencia, se ha introducido una modificación de las cadenas laterales de los aminoácidos, tal como, por ejemplo, una acetilación de las funciones aminas, una carboxilación de las funciones tiol, una esterificación de las funciones carboxílicas,

f) todo polipéptido, en cuya secuencia, se ha modificado un enlace o enlaces polipéptidos, como por ejemplo, los enlaces carba, retro, inverso, retro-inverso, reducidos, y metilen-oxi,

g) todo polipéptido, en donde, por lo menos un antígeno, se reconoce por un antígeno del polipéptido de referencia,

- el porcentaje de identidad que caracteriza a la homología de los fragmentos péptidos comparados es, según la presente invención, de por lo menos un 50% y, de una forma preferente, de por lo menos un 70%.

Dado que un virus que posea una actividad enzimática transcriptasa inversa puede estar genéticamente caracterizado, tanto en la forma ARN, como en la forma ADN, se hará mención tanto del ADN, como del ARN vírico, para caracterizar las secuencias relativas a un virus que posea una actividad transcriptasa inversa (MSRV-1) de este tipo.

Las expresiones de orden utilizadas en la presente descripción, y las reivindicaciones, tales como "primera secuencia nucleótida", no se retienen para expresar un orden en particular, sino para definir de una forma más clara la invención.

La invención, se comprenderá mejor, a raíz de la lectura de la descripción detallada que seguirá, en referencia a las figuras anexadas, en las cuales:

- la figura 1, representa los "consensus" (consensos) generales en ácidos nucleicos de las secuencias MSRV-1B, amplificadas mediante la técnica de PCR, en la región "pol", a partir del ADN vírico nacido de las líneas LM7PC y PLI-2, identificadas por las referencias SEQ IND NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, y SEQ ID NO 6, y los consensos comunes con cebadores de amplificación que portan la referencia SEQ ID NO 7,

- la figura 2, representa el árbol filogenético de las secuencias de tipo MSRV-1B, obtenidas por PCR, en la región "pol", definida por Shih (33),

- la figura 3, proporciona la definición para un tramo de lectura funcional para cada familia de tipo MSRV-1B/"PCRpol", definiéndose, las citadas familias A a D, respectivamente, por las secuencias nucleótidas SEQ IND NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, y SEQ ID NO 6, descritas en la figura 2,

- la figura 4, es una representación de la actividad transcriptasa inversa (RT) en dpm (desintegración por minuto), en las fracciones de sacarosa extraídas sobre un gradiente de purificación de los viriones producidos por los linfocitos B, en cultivo, de un paciente afectado de SEP,

- la figura 5, proporciona, en las mismas condiciones que la figura 4, la dosificación de actividad de transcriptasa inversa, en el cultivo de una línea de linfocitos B, obtenida a partir de un testigo exento de esclerosis en placas,

- la figura 6, representa la secuencia nucleótida del clon PSJ17 (SEQ IND NO 9),

- la figura 7, representa la secuencia nucleótida SEQ ID NO 8, del clon denominado M003 - P004.

- la figura 8, representa la secuencia nucleótida SEQ ID NO 2, del clon F11-1; la parte repetida entre dos flechas, en la región del cebador, corresponde a una variabilidad impuesta por la elección del cebador que haya servido para la clonación de F11-1; sobre esta misma figura, se encuentra representada la traducción en aminoácidos,

- la figura 9, representa la secuencia nucleótida SEQ ID NO 1, y un tramo funcional de lectura posible en aminoácidos de SEQ ID NO 1; sobre esta secuencia, la secuencias consenso de las transcriptasas inversas, se encuentran subrayadas,

- las figuras 10 y 11, proporcionan los resultados de una PCR en forma de fotografía, bajo luz ultravioleta, de un gel de agarosa, impregnado de bromuro de etidio, definiéndose los productos de amplificación obtenidos a partir de los cebadores identificados por las SEQ IND NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, y SEQ ID NO 19,

- la figura 12, proporciona una representación matricial de homología entre SEQ ID NO 1 de MSRV-1, y la de un retrovirus endógeno denominado HSERV9; esta homología, de por lo menos un 65%, se evidencia mediante un trazo pleno (continuo), significando, la ausencia de trazo, una homología inferior al 65%.

Ejemplo 1 Obtención de clones denominados MSRV-1B, que definen a un retrovirus MSRV-1, por amplificación PCR "anidada" de las regiones POL conservadas de los retrovirus, sobre preparaciones de viriones nacidos de líneas LM7PC y PLI-2

Se procedió a utilizar una técnica de PCR, derivada de la técnica publicada por parte de Shih (33). Esta técnica, permite, mediante tratamiento de todos los componentes del medio reactivo, mediante la DNAsa, el eliminar cualquier traza de ADN contaminante. Ésta permite, paralelamente, mediante la utilización de cebadores diferentes, pero trasladantes en series sucesivas, de ciclos de amplificaciones por PCR, el aumentar las posibilidades de amplificar una ADNc sintetizada a partir de una cantidad de ARN, reducida al principio, y todavía reducida en la muestra, mediante la acción parásita de la DNAsa sobre el ARN. Efectivamente, la DNAsa, se utiliza en las condiciones de actividad, en exceso, que permiten el eliminar toda traza de ADN contaminante, antes de la inactivación de esta enzima remanente en la muestra, mediante calentamiento a una temperatura de 85ºC, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos. Esta variante de la técnica de PCR, descrita por parte de Shih (33), se utilizó sobre un ADNc, sintetizado a partir de los ácidos nucleicos de fracciones de partículas infectantes purificadas, sobre gradiente de sacarosa, según la técnica descrita por parte de H. Perron (34), a partir del aislamiento "POL-2" (ECACC nº V92072202), producido por la línea PLI-2 (ECACC nº V92072201) por una parte, y a partir del aislamiento MS7PG (ECACC nº V93010816) producido por la línea LM7PC (ECACC nº 93010817) por otra parte. Estos cultivos, se obtuvieron según los procedimientos que fueron objeto de las publicaciones de solicitudes de patentes internacionales nº WO 93/210 188 y WO/201 189.

Después de la clonación con el TA Cloning Kit®, de los productos amplificados mediante esta técnica de y análisis de la secuencia, con la ayuda de un secuenciador automático, según se describe en el ejemplo 1, las secuencias, se analizaron con la ayuda del logiciel Genworks®, sobre la última versión disponible del banco de datos Genebank®.

Las secuencias clonadas y secuenciadas a partir de estas muestras, corresponden principalmente a un tipo de secuencia, encontrada en la mayoría de los clones (55% de los clones nacidos de los aislamientos POL-2 de los cultivo PLI-2, y 67% de los clones nacidos de los aislamientos MS7PC) que corresponde a una familia de secuencias "pol", próximas pero diferentes del retrovirus endógeno humano denominado ERV-9 o HSERV-9.

Este primer tipo de secuencias, las cuales representan la mayoría de los clones, se encuentra constituida por secuencias, cuya variabilidad, permite el definir cuatro sub-familias de secuencias. Esas sub-familias de secuencias, son suficientemente próximas entre ellas, para que se puedan considerar de "quasi-especies" procedentes del mismo retrovirus, tal y como se conoce bien, para el retrovirus HIV-1 (37), o como el resultado de la interferencia con varios retrovirus endógenos corregulados en las células productoras. Estos elementos endógenos, más o menos defectuosos, son sensibles a las mismas señales de regulación generadas eventualmente por un retrovirus replicante, debido la hecho de que, éstos, pertenecen a la misma familia de retrovirus endógenos (38). Esta nueva familia de retrovirus endógenos o, de una forma alternativa, esta nueva especie retrovírica, de la cual se ha obtenido un cultivo de la generación de "quasi-especies", y que contiene un consenso de secuencias descritas posteriormente, a continuación, se denomina MSRV-1B.

En la figura 1, se presentan los consensos generales de las secuencias de diferentes clones MSRV-1B secuenciados, durante el transcurso de esta experiencia, identificándose estas secuencias, respectivamente, por SEQ IND NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, y SEQ ID NO 6. Estas secuencias, presentan una homología en ácidos nucleicos, comprendida dentro de unos márgenes que van de un 70% a un 88%, con la secuencia HSERV9 referenciada X57147 y M37638, en la base de los datos Genebank®. En esta figura, las sub-familias A, B, C, D, representan las secuencias que se han encontrado, de una forma preponderante, en experiencias similares, repetidas ulteriormente, en las muestras de ARN puro de los viriones purificados a partir de los aislamientos MS7PG y POL-2. A partir de estas familias de secuencias, se han definido cuatro secuencias nucleicas "consenso" representativas de diferentes "quasi-especies" de un retrovirus MSRV-1B, eventualmente exógeno, o de diferentes sub-familias de un retrovirus endógeno MSRV-1B. Estos consensos representativos, se representan en la figura 3, con la traducción en aminoácidos. Existe un tramo de lectura funcional, para cada sub-familia de estas secuencias MSRV-1B, y puede verse que, el tramo de lectura abierta, funcional, corresponde, cada vez, a la secuencia en aminoácidos que viene en segunda línea, bajo la secuencia en ácidos nucleicos. El consenso general de la secuencia MSRV-1B, identificada por SEQ ID NO 7, se obtiene mediante esta técnica de PCR, en la región "pol", y se presenta en la figura 1.

Ejemplo 2 Obtención de clones denominados MSRV-1B, que definen a una familia MSRV-1, por amplificación PCR "anidada" de las Regiones POL conservadas de los retrovirus, sobre preparaciones de linfocitos b de un nuevo caso de SEP

Se utilizó la misma técnica de PCR, modificada según la técnica de Shih (33), para amplificar y secuenciar el material nucleico ARN presente en una fracción de viriones, purificada en el pico de actividad transcriptasa inversa "del tipo LM7", sobre gradiente de sacarosa, según la técnica descrita por parte de Perron (34) y según los protocolos mencionados en el ejemplo 1, a partir de una línea linfoblastoide espontánea, obtenida por autoinmortalización en un cultivo, de linfocitos B de un paciente SEP seropositivo, para el virus de Epstein-Barr (EBV), después de la puesta en cultivo de las células linfoides sanguíneas en el medio de cultivo apropiado, el cual contenía una concentración apropiada de ciclosporina A. Una representación de la actividad transcriptasa inversa en las fracciones de sacarosa extraídas sobre un gradiente de purificación de los viriones producidos por esta línea, se encuentra representada en la figura 4. Además, se procedió a tratar los sobrenadantes de cultivo de una línea B, obtenida en las mismas condiciones, a partir de un testigo exento de esclerosis en placas, en las mismas condiciones y, la dosificación de la actividad transcriptasa inversa en las fracciones del gradiente de sacarosa, se verificó como negativa por todas partes (ruido de fondo), y se presenta en la figura 5. Se procedió a analizar la fracción 3 del gradiente correspondiente a la línea B de SEP, y la misma fracción, sin actividad transcriptasa inversa, del gradiente testigo no-SEP, mediante la misma técnica RT-PCR que la utilizada precedentemente, derivada de Shih (33), seguida de las mismas etapas de clonación y de secuenciación, tales como las descritas en el ejemplo 1.

Es del todo notable, el hecho de que, la secuencias del tipo MSRV-1, se encuentren en el único material asociado a un pico de actividad transcriptasa inversa "del tipo LM7", procedente de la línea linfoblastoide B de SEP. Estas secuencias, no se encontraron con el material de la línea linfoblastoide B testigo (no-SEP), en 26 clones recombinantes, tomados al azar. Únicamente se encontraron las secuencias contaminantes del tipo Mo-MuLV, procedentes de la transcriptasa inversa comercial, utilizada para la etapa de síntesis del ADNc, y secuencias sin analogía retrovírica particular, en este testigo, debido al hecho de que, la amplificación "consenso" de las secuencias de polimerasa homólogas que realiza esta técnica PCR. Además, la ausencia de diana concentrada que compite para la reacción de amplificación en las muestras testigos, permite la amplificación de los contaminantes diluidos. La diferencia de los resultados es, según se evidencia, altamente significativa (chi-2, p < 0,001).

Ejemplo 3 Obtención de un clon PSJ17, el cual define a un retrovirus MSRV-1, por reacción de trancriptasa inversa endógena, sobre una preparación de virión nacido de la línea PLI-2

Este enfoque, pretende obtener secuencias de ADN retrotranscritas a parir del ARN, supuesto retrovírico, en el aislamiento, utilizando la actividad transcriptasa inversa, presente en el mismo aislamiento. Esta actividad transcriptaza inversa, no puede funcionar, teóricamente, más que en presencia de un ARN retrovírico, ligado a un ARNt cebador o híbrido a hebras cortas de ADN, ya retro-transcritas en las partículas retrovíricas (39). Así, de esta forma, la obtención de secuencias retrovíricas específicas, en un material contaminado por ácidos nucleicos celulares, se ha optimizado, según estos autores, gracias a la amplificación enzimática específica de las porciones de ARN de virus, mediante una actividad transcriptasa inversa vírica. Los autores, han determinado, para ello, las condiciones físico-químicas particulares, en la cuales, esta actividad enzimática de transcripción inversa, sobre los ARN contenidos en viriones, podía ser efectiva in vitro. Estas condiciones, corresponden a la descripción técnica de los protocolos presentados posteriormente, a continuación (reacción de RT endógena, purificación, clonado y secuenciación).

Este enfoque molecular, consiste en utilizar una preparación de virión concentrada, pero no purificada, obtenida a partir de sobrenadantes de cultivo de la línea PLI-2, preparados según el procedimiento siguiente: los sobrenadantes de cultivo, se recolectan dos veces por semana, se pre-centrifugan a 10.000 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, para eliminar los residuos o pedazos celulares y, a continuación, se congelan, a una temperatura de -80ºC, o se utilizan tal cuales, para las etapas siguientes. Los sobrenadantes frescos o descongelados, se centrifugan sobre un cojín de PBS-glicerol 30%, a 100.000 g (o a 30.000 revoluciones por minuto, en un rotor LKB-HITACHI del tipo 45 T), durante un transcurso de tiempo de 2 h horas, a una temperatura de 4ºC. Después de la eliminación de sobrenadante, la torta residual sedimentada, se recoge en un pequeño volumen de PBS, y constituye la fracción de virión concentrado, pero no purificado. Esta muestra vírica concentrada, pero no purificada, se utilizó para efectuar una reacción denominada de transcriptasa inversa endógena, tal como la que se describe a continuación: un volumen de 200 \mul de virión modificado, según el protocolo descrito posteriormente, a continuación, y que contiene una actividad transcriptasa inversa de aproximadamente 1 - 5 millones de ddm, se descongela a una temperatura de 37ºC, hasta la aparición de una fase líquida y, a continuación, se emplaza sobre hielo. Se preparó un tampón 5 veces concentrado, con los componentes siguientes: Tris-HCl pH 8,2, 500 mM; NaCl 75 mMM; MgCl_{2} 25 mM; DDT 75 mM y NP 40 0,10%. Se procedió a mezclar 100 \mul de tampón 5X + 25 \mul de una solución de dATP 100 mM + 25 \mul de una solución de dTTP 100 mM + 25 \mul de una solución de dGTP 100 mM + 25 \mul de una solución de dCTRP 100 mM + 100 \mul de agua destilada estéril + 200 \mul de la suspensión de viriones (actividad T.I. de 5 millones de DPM) en el PBS, y se incubaron a una temperatura de 42ºC, durante un transcurso de tiempo de 3 horas. Después de esta incubación, la mezcla reactiva, se ajustó directamente a una mezcla tamponada fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (Sigma ref. P 3803); las fase acusa, se recolectó en un volumen de agua estéril, y se añadió a la fase orgánica, para volver a extraer el material nucleico residual. Las fases acuosas recolectadas, se reagruparon y, los ácidos nucleicos contenidos, se precipitaron mediante la adición de acetato de sodio 3M, pH 5,2, a 1/10 de volumen + 2 volúmenes de etanol + 1 \mul de glicógeno (Boehringer-Mannheim ref. 901 393) y el sometimiento de la muestra, a una temperatura de -20ºC, durante un transcurso de tiempo de 4 horas, o durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura de +4ºC. El precipitado obtenido, después de la centrifugación, se lavó, a continuación, con etanol a un 70%, y se resuspendió en 60 ml de agua destilada. Los productos de esta reacción, se purificaron, se clonaron y se secuenciaron, a continuación, según el protocolo que se describe a continuación: Se generaron ADNs finales, libres, con adeninas no-apareadas en las extremidades: en primer lugar, se procedió a efectuar una reacción de "llenado": se mezclaron 25 \mul de una solución de ADN 2,5 mM, la cual contenía, en cantidad equimolar, dATP + dGTP + dTTP + dCTP/1 \mul de ADN polimerasa T4 (Boehringer-Mannheim ref. 1417 975)/1 \mul de una solución al 1% suero-albúmina bovina/16 \mul de agua destilada estéril. Esta mezcla, se incubó durante un transcurso de tiempo de 20 minutos, a una temperatura de 11ºC. Se añadieron 50 \mul de tampón TE y 1 \mul de glicógeno (Boehringer-Mannheim ref. 901 393), antes de la extracción de los ácidos nucleicos, con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (Sigma ref. P 3803), y precipitación con acetato de sodio, tal y como se ha descrito precedentemente. El ADN precipitado después de la centrifugación, se resuspendió en 10 \mul de tampón 10 mM Tris pH 7,5. A continuación, se procedió a mezclar 5 \mul de eta suspensión con 20 \mul de tampón Taq 5X, 20 \mul de 5 mM dATP; 1 \mul (5U) de Taq ADN polimerasa (Amplitaq®) y 54 \mul de agua destilada estéril. El ADN en suspensión en la solución acuosa extraída, debajo de la película de aceite, después de incubación, se precipitó de la forma descrita precedentemente, y se resuspendió en 2 \mul de agua destilada estéril. El ADN obtenido, se insertó en un plásmido, con la ayuda del equipo, a modo de kit, TA Clonign®. Los 2 \mu de solución de ADN, se mezclaron con 5 \mul de agua destilada estéril, 1 \mul de tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 \mul de "pCR® VECTOR" (25 ng/ml) y 1 \mul de "TA DNA LIGASA". Se procedió a incubar esta mezcla, durante el transcurso de toda una noche, a una temperatura de 12ºC. Las etapas siguientes, se realizaron en conformidad con las instrucciones del equipo a modo de kit TA Cloning® (British Biotechnology). Al final de este procedimiento, se replantaron las colonias blancas de bacterias recombinantes (white), para cultivarse, y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (36). La preparación del plásmido, de cada colonia recombinante, se cortó, mediante una enzima de restricción apropiada y análisis sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseían un inserto detectado bajo la luz UV, después del marcado del gel con bromuro de etidio, se seleccionaron para la secuenciación del inserto, después de hibridación, con un cebador complementario del promotor Sp6, presente sobre el plásmido de clonación del TA cloning Kit®. La reacción previa a la secuenciación, se efectuó, a continuación, según el procedimiento preconizado para la utilización del equipo, a modo de kit, de secuenciación, del tipo "Prism ready reaction kit dye deoxiterminator cycle sequencing ki" (Applied Biosystems, ref. 401384) y la secuenciación automática, se realizó con el aparato de secuenciación del tipo "Automatic Secuencer modelo, 373 A" Applied Biosystems, según las instrucciones del
fabricante.

El análisis discriminante sobre los bancos de datos informáticos de las secuencias clonadas a partir de los fragmentos de ADN presentes en la mezcla reactiva, permitió el evidenciar una secuencia del tipo retrovírico. El clon correspondiente PSJ17, se secuenció enteramente y, la secuencia obtenida, presentada en la figura 6, e identificada por SEQ ID NO 9, se analizó con la ayuda del logiciel "Geneworks®", sobre los bancos de datos actualizados "Genebank". El análisis de los bancos de datos, no permitió el encontrar una secuencia idéntica ya descrita. Solamente una homología parcial, pudo encontrarse, con ciertos elementos retrovíricos conocidos. La homología relativa más interesante, concierne a un retrovirus endógeno denominado ERV-9, o SERV.-9, según las referencias (40).

Ejemplo 4 Amplificación PCR de la secuencia nucleica contenida entre la región 5' definida por el clon "pol MSRV-1B" y la región 3' definida por el clon PSJ17

Se definieron cinco oligonucleótidos, M001, M002, M003-BCD, P004 Y P005, para amplificar ARN procedente de viriones purificados POL-2. Se efectuaron reacciones de control, de tal forma que se controlara la presencia de contaminantes (reacción sobre el agua). La amplificación, consiste en una etapa de RT-PCR, según el protocolo descrito en el Ejemplo 1, seguida de una PCR "anidada", según el protocolo PCR descrito en el documento de solicitud de patente europea EP-A 0 569 272. En el primer ciclo RT-PCR, se utilizaron los cebadores M001 y P004 o P005. En el segundo ciclo PCR, se utilizaron los cebadores M002-A o M003-BCD, y el cebador P004. Los cebadores, se posicionan del la forma que sigue:

1

El producto de amplificación "anidado" obtenido y denominado M003-P004, se presenta en la figura 7, y corresponde a la secuencia SEQ ID NO 8.

Ejemplo 5 Amplificación y clonación de una porción del genoma retrovírico MSRV-1, con la ayuda de una secuencia ya identificada, en una muestra de virus purificada al pico de actividad trancriptasa inversa

Se procedió a utilizar una técnica PCR derivada de la técnica publicada por parte de Frohman (41). La técnica derivada, permite, con la ayuda de un cebador específico en 3' del genoma a amplificar, el proceder a la elongación de la secuencia, hacia la región 5' del genoma a analizar. Esta variante técnica, se describe en la documentación de la firma ``Clontech Laboratories INc., (Palo Alto, California, USA), proporcionada con su producto "5'-AmpliFINDER® RACE KIT", el cual se utilizó sobre una fracción de virión purificado tal y como se describe precedentemente.

Los cebadores 3' específicos utilizados en el protocolo del equipo, a modo de kit, para la síntesis del cDNA y amplificación PCR, son respectivamente complementarios a las secuencias MSRV-1 siguientes:

cDNA: TCATCCATGTACCGAAGG (SEQ ID NO 25)

amplificación: ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT (SEQ ID NO 26)

Los productos nacidos de la PCR, se purificaron después de la purificación sobre gel de agarosa, según los procedimientos convencionales (36) y, a continuación, se resuspendieron en 10 ml de agua destilada. Siendo una de las propiedades de la polimerasa Taq, la de añadir una adenina en el extremo 3' de cada una de las dos hebras de ADN, el ADN obtenido, se insertó directamente en un plásmido, con la ayuda del equipo, a modo de kit, TA Cloning® (British Biotechnology). Los 2 \mul de solución de ADN, se mezclaron con 5 \mul de agua destilada estéril, 1 \mul de tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 Ml de "pCR® VECTOR" (25 ng/ml) y 1 \mul de "TA DNA LIGASA". Se procedió a incubar esta mezcla, durante el transcurso de toda una noche, a una temperatura de 12ºC. La etapas siguientes, se realizaron en conformidad con las instrucciones del equipo, a modo de kit, TA Cloning® (British Biotechnology). Al final de este procedimiento, las colonias blancas de bacterias recombinantes (white), se replantaron para cultivarse y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep" (36). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante, se cortó mediante una enzima de restricción apropiada, y se analizó sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseían un inserto detectado bajo luz UV, después del marcado del gel con bromuro de etidio, se seleccionaron, para la secuenciación del inserto, después de hibridación, con un cebador complementario del promotor Sp6, presente sobre el plásmido de clonación del TA Clonig kit®. La reacción previa a la secuenciación, se efectuó, a continuación, según el procedimiento preconizado para la utilización del equipo de secuenciación, a modo de kit, "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cicle secuencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384), y la secuencia automática, se realizó con el aparato "Automatic sequencer, modelo 373A", Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.

Esta técnica, se aplica, en primer lugar, a dos fracciones de virión purificado, tal y como se describe posteriormente, a continuación, sobre sacarosa, a partir del aislamiento "POL-2" producido por la línea PLI-2, por una parte, a partir del aislamiento MS7PG, producido por la línea LM7PC, por otra parte: los sobrenadantes de cultivos, se recolectan dos veces por semana, se pre-centrifugan a 10.000 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, para eliminar los pedazos o restos celulares y, a continuación, se congelan, a una temperatura de -80ºC, o se utilizan tal cual, para las etapas siguientes. Los sobrenadantes frescos, o descongelados, se centrifugan sobre cojín de PBS-glicerol 30%, a 100.000 g (o 30.000 revoluciones por minuto, en un rotor LKB-HITACHI, del tipo 45T), durante un transcurso de tiempo de 2 horas, a una temperatura de 4ºC. Después de la eliminación del sobrenadante, la torta residual sedimentada, se recoge en un pequeño volumen de PBS, y constituye la fracción de viriones concentrados, pero no purificados. El virus concentrado, se deposita, a continuación, sobre un gradiente de sucrosa, en un tampón PBS, estéril (15 a 50% peso/peso), y se somete a ultracentrifugado, a 35.000 revoluciones por minuto (100.000 g), durante un transcurso de tiempo de 12 horas, a una temperatura de +4ºC, en un rotor de cubiletes. Se recogen 10 fracciones de 20 \mul, en cada fracción, después de la homogeneización para dosificar la actividad transcriptasa inversa, según la técnica descrita por parte de H. Perron (24). Las fracciones que contienen el pico de actividad RT "del tipo LM7", se diluyen, a continuación, en tampón PBSA estéril, y se ultracentrifugan durante un transcurso de tiempo de una hora, a 35.000 revoluciones/minuto (100.000 g), para sedimentar las partículas víricas. La torta residual del virión purificado, de esta forma obtenido, se recoge, a continuación, en un pequeño volumen de un tampón adecuado para la extracción de ARN. La reacción de sintetasa de cDNA mencionada anteriormente, más arriba, se realiza sobre este ARN extraído de virión extracelular purificado. La amplificación PCR, según la técnica citada anteriormente, más arriba, permitió obtener el clon F1-11, cuya secuencia, identificada por SEQ ID NO 2, se presenta en la figura 8.

Este clon, permite el definir, con los diferentes clones previamente secuenciados, una región representativa del género "pol" del retrovirus MSRV-1, tal como la representada en la figura 9. Esta secuencia, denominada SEQ ID NO 1, se reconstituye a partir de los diferentes clones que se recubren en sus extremidades, corrigiendo los artefactos ligados a los cebadores y a las técnicas de amplificación o de clonación, las cuales interrumpirían artificialmente la trama de lectura del conjunto.

En la figura 9, la trama de lectura potencial, antes de su traducción en aminoácidos, se presenta debajo de la secuencia de ácidos nucleicos.

Ejemplo 8 Detección de secuencias específicas MSRV-1 en diferentes muestras de plasma procedentes de pacientes afectados de SEP o de testigos

Se procedió a utilizar una técnica de PCR, semejante a la descrita en el ejemplo 7, para detectar los genomas MSRV-1, en los plasmas obtenidos después de extracción de la sangre sobre EDTA, de pacientes afectados de SEP y de testigos no-SEP.

La extracción de los ARN del plasma, se efectuó según la técnica descrita por parte de P. Chomzynski (35), después de la adición de un volumen de tampón que contenía guanidina tiocianato, a 1 ml de plasma, guardada congelada, a una temperatura de -80ºC, después de la recogida.

Para la MSRV-1, la amplificación, de efectuó en dos etapas. Además, la muestra de ácidos nucleicos, se trató previamente mediante la DNAsa y se realizó un control PCR, sin RT (transcriptasa inversa AMV), sobre las dos etapas de amplificación, de tal forma que se verificara el hecho de que, la amplificación RT-PCR, procediera exclusivamente del ARN MSRV-1. En caso de control sin RT positivo, la muestra alicuotada, de ARN de partida, se trata de nuevo con la DNAsa, y se amplifica de nuevo.

El protocolo de tratamiento mediante la DNAsa desprovista de actividad RNAsa, es la siguiente: el ARN extraído, se alicuota en presencia de "inhibidor de RNAsa" (Boehriger - Mannheim), en agua tratada con DEPC, a una concentración final de 1 \mug en 10 \mul; a estos 10 \mul, se añadieron 1 \mul de "RNAse free DNAse" (DNAsa exenta de RNAsa) (Boehriger - Mannheim), y 1,2 \mul de tampón, a un pH 5, que contenía 0,1 M/l de acetato sódico y 5 mM/l de MgSO_{4}: la mezcla, se incubó durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a una temperatura de 20ºC, y se condujo a una temperatura de 95ºC, durante un transcurso de tiempo de 1,5 minutos, en un "termocycler" (termocliclador).

La primera etapa de RT-PCR MSRV-1, se efectuó según una variante del procedimiento de amplificación de ARN, tal y como se describe en la solicitud de patente europea EP - A - 569 272 A1. Principalmente, la etapa de síntesis de ADNc, se efectúa a una temperatura de 42ºC, durante un transcurso de tiempo de 1 hora; la amplificación de PCR, se desarrolla sobre 40 ciclos, con una temperatura de hibridación de los cebadores ("annealing") de 53ºC. El volumen de la reacción, es de 100 \mul.

Los cebadores utilizados para esta primera etapa, son los siguientes:

- cebador 5', identificado por SEQ ID NO 16

5'AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3'

- cebador 5', identificado por SEQ ID NO 17

5'TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3'

después de esta etapa, se extrajeron 10 \mul del producto de amplificación y se utilizaron para realizar una segunda amplificación PCR, denominada "anidada", con cebadores situados en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda etapa, se desarrolla durante 35 ciclos, con una temperatura de hibridación de los cebadores ("annealing") de 53ºC. El volumen de la reacción, es de 100 \mul.

Los cebadores utilizados para esta segunda etapa, son los siguientes:

- cebador 5', identificado por SEQ ID NO 18

5'TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3'

- cebador 5', identificado por SEQ ID NO 19

5'AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3'

En la figura 10, se presentan los resultados de PCR, en forma de fotografías bajo luz ultravioleta de geles de agarosa impregnados de bromuro de etidio, en los cuales, se ha detectado una electroforesis de los productos de amplificación de PCR, depositados separadamente en los diferentes hoyos.

El hoyo número 8, contiene una mezcla de marcadores de hoyos moleculares de ADN y, los hoyos 1 a 7, representan, en el orden correspondiente, los hoyos amplificados de los ARN totales de plasmas procedentes de 4 testigos sanos, exentos de SEP (hoyos 1 a 4) y de 3 pacientes afectados de SEP, en diferentes fases de la enfermedad (pozos 5 a 7).

La figura 11, representa el resultado de la amplificación específica por RT-PCR "anidada" MSRV-1:

el hoyo nº 1, contiene el producto PCR efectuada con agua solamente, sin la adición de transcriptasa inversa AMV; el hoyo nº 2, contiene el producto PCR efectuada con agua, solamente, con la adición de transcriptasa inversa AMV, el hoyo nº 3, contiene una mezcla de marcadores de peso molecular ADN; los hoyos 4 a 13, contienen, en el orden correspondiente, los productos amplificados a partir de los ARN totales extraídos de fracciones de gradiente de sacarosa (recolectados desde arriba, hacia abajo), sobre el cual, se ha centrifugado una torta residual de virión procedente de un sobrenadante de cultivo, infectado mediante MSRV-1, al equilibrio, según el protocolo descrito por parte de Perron (34); en el hoyo 14, no se ha depositado nada; en los hoyos 15 a 17, se han depositado los productos amplificados de ARN extraídos de plasmas procedentes de 3 pacientes afectados de SEP, en diferentes fases de la enfermedad.

El genoma retrovírico MSRV-1, se encuentra, de hecho, en la fracción del gradiente de sacarosa que contiene el pico de actividad transcriptasa inversa, medida según la técnica descrita por parte de H. Perron (24), con una intensidad muy fuerte (fracción del gradiente, depositada en el hoyo nº 8). Tuvo lugar una ligera amplificación, en la primera fracción (hoyo nº 4), correspondiente, de una forma verosímil, al ARN liberado por partículas lisadas que flotarían en la superficie del gradiente; al mismo tiempo, sedimentaron, en la última fracción (fondo del tubo), residuos agregados, generando algunas copias del genoma MSRV-1, las cuales dieron lugar a una amplificación de intensidad reducida.

De los 3 plasmas de SEP sometidos a test de ensayo, en esta serie, se encontró el ARN MSRV-1, en un caso, que producía una amplificación muy intensa (hoyo nº 17).

En esta serie, se detectó el genoma ARN retrovírico MSRV-1, correspondiente, de una forma verosímil, a partículas de virus extracelulares presentes en el plasma, en un número extremadamente reducido, mediante RT-PCR "anidada", en un caso de SEP, de entre los 3 sometidos a test de ensayo. Otros resultados obtenidos en series más extendidas, confirman estos resultados.

Además, la especificidad de las secuencias amplificadas mediante estas técnicas PCR, puede verificarse y evaluarse mediante la técnica "ELOSA", tal como la que se describe por parte de F. Mallet (42), y en el documento FR - 2 663 040.

Para la MSRV-1, los hoyos de la PCR anidada anteriormente descrita, pueden someterse a test de ensayo, en dos sistemas ELOSA, que permitan el detectar, separadamente, un consenso A, y un consenso B+C+D de MSRV-1, correspondiente a las sub-familias descritas en el ejemplo 1, y las figuras 1, 2 y 3. En efecto, las secuencias próximas del consenso B+C+D, se encuentran, esencialmente, en las muestras de ARN procedentes de los viriones MSRV-1, purificadas a partir de cultivos o amplificaciones en líquidos biológicos extra-celulares de pacientes SEP, en el momento en que, las secuencias próximas del consenso A, se encuentran, esencialmente, en el ADN celular humano normal.

El sistema ELOSA/MSRV-1, para la captura y la hibridación específica de los hoyos PCR de la sub-familia A, utiliza un oligonucleótido de captura cpV1A, con un enlace amina en 5', y un oligonucleótido de detección biotinilado dpV1A, que tiene respectivamente, por secuencia:

- cpV1A identificada por SEQ ID NO 31

5' GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3', correspondiente al oligonucleótido de captura ELOSA de los productos PCR anidada MSRV-1, efectuada con los cebadores identificados por SEQ ID NO 16 y SEQ ID NO 17, seguido, eventualmente, de la amplificación con los cebadores identificados por SEQ ID NO 18 y SEQ ID NO 19, sobre extracción de pacientes.

- cpV1A identificada por SEQ ID NO 32

5' CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3', correspondiente al oligonucleótido de captura ELOSA de la subfamilia de los productos PCR anidada MSRV-1, efectuada con los cebadores identificados por SEQ ID NO 16 y SEQ ID NO 17, seguido, eventualmente, de la amplificación con los cebadores identificados por SEQ ID NO 18 y SEQ ID NO 19, sobre extracción de pacientes.

El sistema ELOSA/MSRV-1, para la captura e hibridación específica de los hoyos PCR de la sub-familia B+C+D, utiliza el mismo oligonucleótido de detección, biotinilado, dpV1A, y un oligonucleótido de captura cpV1B, con un enlace amina, en 5', que tiene, por secuencia:

- cpV1B identificada por SEQ ID NO 33

5' GTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3', correspondiente al oligonucleótido de captura ELOSA de la subfamilia B + C + D, de los productos PCR anidada MSRV-1, efectuada con los cebadores identificados por SEQ ID NO 16 y SEQ ID NO 17, seguido, eventualmente, de la amplificación con los cebadores identifcados por SEQ ID NO 18 y SEQ ID NO 19, sobre extracción de pacientes.

Este sistema de detección ELOSA, permitió verificar el hecho de que, ninguno de los productos PCR de esta forma amplificados, a partir de los plasmas de pacientes SEP, tratados por la DNAsa, contenía la secuencia de la sub-familia A, y que todos eran positivos con el consenso de sub-familias B, C y D.

Al final de cuentas, de nuestros primeros resultados de detección PCR del genoma de agentes patógenos y/o infectantes, es verosímil el hecho de que, el "virus libre", puede circular en el flujo sanguíneo de los pacientes en fase de brote agudo, fuera del sistema nervioso. Esto es compatible con la existencia quasi-sistemática de "brechas" en la barrera hemato-encefálica de los pacientes en fase activa de SEP.

Así, de este modo, puede ya pretenderse, gracias a los descubrimientos efectuados y los procedimientos aplicados y puestos a punto, por parte de los inventores, el realizar un diagnóstico de infección y/o de la reactivación MSRV-1 y evaluar una terapia en la SEP, sobre la base de su eficacia para "negativizar" la detección de estos agentes, en los fluidos biológicos de los pacientes. Además, la detección precoz en las personas que no presentan todavía los signos neurológicos de SEP, podría permitir el instaurar un tratamiento tanto más eficaz, sobre la evolución clínica ulterior que precedería a la fase de lesión que corresponde a la aparición de los trastornos neurológicos. Ahora bien, hoy en día, un diagnóstico de SEP, no puede establecerse antes de la instalación de una sintomatología neurológica que causa lesiones y, por lo tanto, no se instaura ningún tratamiento, antes de la emergencia de una clínica evocatoria de las lesiones del sistema nervioso central, ya consecuentes. El diagnóstico de una infección y/o reactivación de MSRV-1, en el hombre, es por lo tanto determinante y, la presente invención, proporciona los medios.

Es por lo tanto posible, además de realizar un diagnóstico de la infección y/o de la reactivación MSRV-1, evaluar una terapia en la SEP sobre la base de su eficacia de "negativizar" la detección de estos agentes en los fluidos biológicos de los pacientes.

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(36) Sambrook J., Fritsch E.F., et Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

(37) Meyerhans et coll., Cell 1989, 58, 901-910.

(38) Linial M.L. and Miller A.D., "Current topics in microbiology and immunobiology. Retroviruses, strategies of replication" vol. 157, 125-152; Swanstrom R. et Vogt P.K., éditeurs, Springer-Verlag, Heidelberg 1990.

(39) Lori F. et coll., J. Virol. 1992, 66, 5067-5074.

(40) La Mantia et coll., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1513-1520.

(41) Frohman et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 8998-9002.

(42) F. Mallet et coll., Journal of Clinical Microbiology 1993; 31, 1444-1449.

(1) INFORMACIONES GENERALES:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BIOMERIEUX

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: NINGUNA

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: MARCY L'ETOILE

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 69280

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: EXTENSIÓN DE SEP

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 38

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disco del tipo "floppy"

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

LOGICIEL: PatentIn Release #1,0, versión #1,30 (OEB)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1158 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 297 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTAGGGAT ANCCCTCATC TCTTTGGTCA GGTACTGGCC GAAGATCTAG GCCACTTCTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCCAGSN ACTCTGTYCC TTCAG

\hfill

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCAGGGAT AGCCCCCATC TATTTGGCCA GGCACTAGCT CAATACTTGA GCCAGTTCTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACCTGGAC AYTCTYGTCC TTCGGT

\hfill

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCARRGA TAGCCCCCATC TATTTGGCCW RGYATTAGCC CAAGACTTGA CYCAATTCTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACCTGGA CACTCTTGTCC TTYRG

\hfill

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCAGGGAT AGCTCCCATC TATTTGGCCT GGCATTAACC CGAGACTTAA GCCAGTTCTY

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACGTGGAC ACTCTTGTCC TTTGG

\hfill

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTTGCCAC AGGGGTITAR RGATANCYCY CATCTMTTTG GYCWRGYAYT RRCYCRAKAY

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YTRRGYCAVT TCTYAKRYSY RGSNAYTCTB KYCCTTYRGT ACATGGATGA C

\hfill

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 645 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 741 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAGTAAG GAAACCCAACG GAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGAGTTGC ACAAGTGCG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGGGATAG CCCCCATCTA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 5, 7, 10, 13,

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES: G representa la inosina(i)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCGTGCCG CAGGG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGGGATA GCCCTCATCTC T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGGGATAG CCCCCATCTA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD : 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGTAAGGAC TCCTAGAGCT ATT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATCCATGT ACCCAAGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGGGTTC CAAGTTCCCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCTAGGCC ACTTCTCAGG TCCAGS

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 6, 12, 19,

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES: G representa la inosina (i)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATCTGTTTG GGCAGGCAGT AGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGAGCCAG TTCTCATACC TGGA

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Claims (11)

1. Fragmento nucleótido aislado, cuya secuencia nucleótida, comprende una secuencia elegida entre las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, y sus secuencias complementarias.

2. Utilización de un fragmento de un polinucleótido de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, y sus secuencias complementarias, para la preparación de una sonda o de un cebador par la detección de un material vírico, asociado a la esclerosis en placas.

3. Sonda susceptible de poder hibridarse específicamente con un ARN o un ADN de un material vírico, asociado a la esclerosis en placas, caracterizado por el hecho de que, ésta, comprende una secuencia nucleótida elegida entre SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, y sus secuencias complementarias.

4. Cebador para la amplificación de un ARN o de un ADN de un material vírico, asociado a la esclerosis en placas, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende una secuencia nucleótida elegida entre SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, y sus secuencias complementarias.

5. Composición diagnóstica, profiláctica, o terapéutica, para la detección, la prevención o el tratamiento de un agente vírico asociado a la esclerosis en placas, caracterizado por el hecho de que, ésta, comprende por lo menos un fragmento nucleótido cuya secuencia nucleótida consiste en una secuencia elegida entre las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, y sus secuencias complementarias o consiste en una secuencia nucleótida la cual, para toda continuación de 100 monómeros contiguos, presenta por lo menos un 50%, de una forma preferente, por lo menos un 70% de identidad, con una secuencia elegida entre SEQ ID NO: 1, a SEQ ID NO: 9, y sus secuencias complementarias.

6. Procedimiento par detectar y/o identificar un agente vírico asociado a la esclerosis en placas, en una muestra biológica, caracterizado por el hecho de que se pone en contacto por lo menos un ácido nucleico de la citada muestra, o su complementario, con una composición tal como la que se define en la reivindicación 5.

7. Procedimiento para detectar y/o identificar y/o separar y/o cuantificar, en una muestra biológica, un agente vírico, asociado a la esclerosis en placas, caracterizado por el hecho de que se pone en contacto, por lo menos un ácido nucleico de la citada muestra, o su complementario, con por lo menos una sonda tal como la que se define en la reivindicación 3.

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que, antes de poner en contacto el ácido nucleico, con por lo menos una sonda, se amplifica el citado ácido nucleico o su complementario, con por lo menos un cebador tal como el que se define en la reivindicación 4.

9. Composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica, para la detección, la prevención o el tratamiento de un agente vírico, asociado a la esclerosis en placas, caracterizado por el hecho de que, ésta, comprende por lo menos un polipéptido de por lo menos 10 aminoácidos, codificado por un fragmento nucleótido, cuya secuencia nucleótida, consiste en una secuencia nucleótida elegida entre una de las secuencias nucleótidas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9.

10. Composición, según la reivindicación 9, caracterizada por el hecho de que, ésta, comprende por lo menos un polipéptido codificado por un fragmento nucleótido, cuya secuencia nucleótida, consiste en una secuencia nucleótida elegida entré una de las secuencias nucleótidas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9.

11. Procedimiento para detectar y/o identificar un agente vírico asociado a la esclerosis en placas, en una muestra biológica, caracterizado por el hecho de que se pone en contacto la citada muestra biológica, con una composición tal como la que se define en la reivindicación 9, o en la reivindicación 10.