ES2331251T3 - Material nucleico retrovirico y fragmentos nucleotidicos, asociados a la esclerosis en placas, con fines de diagnostico, profilacticos y terapeuticos. - Google Patents
Material nucleico retrovirico y fragmentos nucleotidicos, asociados a la esclerosis en placas, con fines de diagnostico, profilacticos y terapeuticos. Download PDFInfo
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Abstract
Material nucleico, en estado aislado o purificado, que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por (i) SEC ID nº 130; (ii) la secuencia complementaria de (i); y (iii) las secuencias que presentan para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos, por lo menos 50% de identidad con las secuencias (i) o (ii) respectivamente, siendo dicho material nucleico diferente de la secuencia HSAC64 del clon humano RG083M05 accesible en la base de datos EMBL, con el número AC000064.1.
Description
Material nucleico retrovírico y fragmentos
nucleotídicos, asociados a la esclerosis en placas, con fines de
diagnóstico, profilácticos y terapéuticos.
La esclerosis en placas (SEP) es una enfermedad
desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) cuya causa
completa sigue siendo desconocida.
Numerosos estudios han apoyado la hipótesis de
una etiología vírica de la enfermedad, pero ninguno de los virus
conocidos ensayados ha resultado ser el agente causante buscado: un
repaso de los virus buscados desde hace varios años en la SEP ha
sido realizado por E. Norrby y R.T. Johnson.
Recientemente, un retrovirus, diferente de los
retrovirus humanos conocidos, se ha aislado en unos pacientes que
padecen SEP. Los autores han podido demostrar asimismo que este
retrovirus podía transmitirse in vitro, que unos pacientes
que padecen SEP producían unos anticuerpos susceptibles de reconocer
unas proteínas asociadas a la infección de las células
leptomeníngeas por este retrovirus, y que la expresión de este
último podría ser estimulada en gran medida por los genes
inmediatos-precoces de ciertos virus del herpes.
Todos estos resultados justifican el papel en la
SEP de por lo menos un retrovirus desconocido o de un virus que
tiene una actividad transcriptasa inversa (RT) detectable según el
método publicado por H. Perron y calificado de actividad "RT de
tipo LM7".
Los estudios del solicitante han permitido
obtener dos líneas continuas de células infectadas por unos aislados
naturales que proceden de dos pacientes diferentes que padecen SEP,
mediante un procedimiento de cultivo tal como se describe en el
documento WO-A-93 20188. Estas dos
líneas derivadas de células de Plexus-coroides
humanas, denominadas LM7PC y PLI-2 se han
depositado en la E.C.A.C.C. respectivamente el 22 de julio de 1992 y
el 8 de enero de 1993, con los números 92 072201 y 93 010817, de
acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest. Por otro
lado, los aislados víricos que poseen una actividad RT de tipo LM7
también se han depositado en la E.C.A.C.C. con la denominación
global de "cepas". La "cepa" o aislado hospedado por la
línea PLI-2, denominada POL-2, se
ha depositado en la E.C.A.C.C. el 22 de julio de 1992 con el nº
V92072202. La "cepa" o aislado hospedado por la línea LM7PC,
denominada MS7PG, se ha depositado en la E.C.A.C.C. el 8 de enero de
1993 con el nº V93010816.
A partir de los cultivos y de las muestras
citados anteriormente, caracterizados por unos criterios biológicos
y morfológicos, se ha procedido después a caracterizar el material
nucleico asociado a las partículas víricas producidas en estos
cultivos.
Las porciones de genoma ya caracterizadas se han
usado para realizar unos ensayos de detección molecular del genoma
vírico y unos ensayos inmunoserológicos, utilizando las secuencias
de aminoácidos codificadas por las secuencias nucleotídicas del
genoma vírico, para detectar la respuesta inmunitaria dirigida
contra unos epítopos asociados a la infección y/o a la expresión
vírica.
Estas herramientas han permitido ya confirmar
una asociación entre la SEP y la expresión de las secuencias
identificadas en las patentes citadas más adelante. Sin embargo, el
sistema vírico descubierto por el solicitante, se asemeja a un
sistema retrovírico complejo. En efecto, las secuencias encontradas
encapsidadas en las partículas víricas extracelulares producidas
por los diferentes cultivos de células de pacientes que padecen SEP,
muestran claramente que existe una co-encapsidación
de genomas retrovíricos parecidos, pero diferentes del genoma
retrovírico "salvaje" que produce las partículas víricas
infectantes. Este fenómeno se ha observado entre unos retrovirus
replicativos y unos retrovirus endógenos, la noción de retrovirus
endógeno es muy importante en el contexto del presente
descubrimiento porque, en el caso de MSRV-1, se ha
observado que unas secuencias retrovíricas endógenas que comprenden
unas secuencias homólogas al genoma MSRV-1 existen
en el ADN humano normal. La existencia de elementos retrovíricos
endógenos (ERV) parecidos a MSRV-1 mediante la
totalidad o parte de su genoma, explica el hecho de que la
expresión del retrovirus MSRV-1 en las células
humanas pueda interactuar con unas secuencias endógenas cercanas.
Estas interacciones se vuelven a encontrar en el caso de retrovirus
endógenos patógenos y/o infecciosos (por ejemplo ciertas cepas
ecótropas del Murine Leukaemia virus), en el caso de retrovirus
exógenos cuya secuencia nucleotídica se puede encontrar parcial o
totalmente, en forma de ERV, en el genoma del animal hospedante
(por ejemplo, virus exógeno del tumor mamario del ratón transmitido
por la leche). Estas interacciones consisten principalmente en (i)
una transactivación o co-activación de ERVs por el
retrovirus replicativo, (ii) una encapsidación "ilegítima" de
ARN parecidos a ERVS, o ERVs -incluso de ARN celulares- que poseen
simplemente unas secuencias de encapsidación compatibles, en las
partículas retrovíricas producidas por la expresión de la cepa
replicativa, a veces transmisibles y a veces con una patogenicidad
propia, y (iii) unas recombinaciones más o menos importantes entre
los genomas co-encapsidados, en particular en las
fases de transcripción inversa, que conducen a la formación de
genomas híbridos, a veces transmisibles y a veces con una
patogenicidad propia.
Así, (i) diferentes secuencias parecidas a
MSRV-1 se han encontrado en las partículas víricas
purificadas; (ii) el análisis molecular de las diferentes regiones
del genoma retrovírico MSRV-1 se debe realizar
analizando sistemáticamente las secuencias
co-encapsidadas, interferentes y/o recombinadas que
se generan mediante la infección y/o la expresión de
MSRV-1, además, ciertos clones pueden tener unas
partes de secuencias defectivas producidas por la replicación
retrovírica, y los errores de matriz y/o de transcripción de la
transcriptasa inversa; (iii) las familias de secuencias parecidas a
una misma región genómica retrovírica son los soportes de una
detección diagnóstica global que se puede optimizar por la
identificación de regiones invariables entre los clones expresados
y mediante la identificación de marcos de lecturas responsables de
la producción de polipéptidos antigénicos y/o patógenos que pueden
ser producidos sólo por una parte, incluso uno solo, de los clones
expresados y en estas condiciones, el análisis sistemático de los
clones expresados en una región de un gen determinado permite
evaluar la frecuencia de variación y/o de recombinación del genoma
MSRV-1 en esta región y definir las secuencias
óptimas para las aplicaciones, en particular diagnósticas; (iv) la
patología provocada por un retrovirus tal como
MSRV-1 puede ser un efecto directo de su expresión y
de las proteínas o péptidos producidos por ello, pero asimismo un
efecto de la activación, de la encapsidación, de la recombinación
de genomas parecidos o heterólogos y de las proteínas o péptidos
producidos por ello; Así, estos genomas asociados a la expresión de
y/o a la infección por MSRV-1 forman parte
integrante de la patogenicidad potencial de este virus y por lo
tanto, constituyen unos soportes de detección diagnóstica y unas
dianas terapéuticas particulares. Asimismo, cualquier agente
asociado, o, co-factor de estas interacciones
responsables de la patología en cuestión, tal como
MSRV-2 o el factor gliotóxico descrito en la
solicitud de patente publicada con el nº FR-2 716
198, puede participar en la elaboración de una estrategia global y
muy eficaz de diagnóstico, de pronóstico, de seguimiento
terapéutico y/o de terapéutica integrada de la SEP en particular,
pero también de cualquier otra enfermedad asociada a los mismos
agentes.
En este contexto, se ha hecho un descubrimiento
paralelo en otra enfermedad autoinmune, la poliartritis reumatoide
(PR), que se ha descrito anteriormente en la solicitud de patente
francesa registrada con el nº 95 02960. Este descubrimiento muestra
que, aplicando unos enfoques metodológicos similares a los usados en
los estudios del solicitante sobre la SEP, se ha podido identificar
un retrovirus expresado en la PR que comparte las secuencias
descritas para MSRV-1 en SEP y también, la
co-existencia de una secuencia asociada
MSRV-2 descrita asimismo en la SEP. En lo referente
a MSRV-1, las secuencias detectadas comúnmente en
SEP y PR, se refieren a los genes pol y gag. En el
estado actual de los conocimientos, se pueden asociar las secuencias
gag y pol descritas a las cepas
MSRV-1 expresadas en estas dos enfermedades.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente solicitud de patente tiene por
objeto diferentes resultados, suplementarios con relación a los ya
protegidos por las solicitudes de patente francesa: nº 92 04322 del
03.04.1992, publicada con el nº 2 689 519;
- -
- nº 92 13447 del 03.11.1992, publicada con el nº 2 689 521;
- -
- nº 92 13443 del 03.11.1992, publicada con el nº 2 689 520:
- -
- nº 94 01529 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 936;
- -
- nº 94 01531 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 939:
- -
- nº 94 01530 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 936;
- -
- nº 94 01532 del 04.02.1994, publicada con el nº 2 715 937;
- -
- nº 94 14322 del 24.11.1994, publicada con el nº 2 727 428;
- -
- nº 94 15810 del 23.12.1994, publicada con el nº 2 728 585; y
- -
- la solicitud de patente WO-97/06260.
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La presente invención se refiere en primer lugar
a un material nucleico, que puede consistir en un material
retrovírico, en el estado aislado o purificado, que puede ser
conocido o caracterizado de diferentes maneras:
- -
- comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por (i) SEC ID nº: 130; (ii) la secuencia complementaria a la secuencia (i); y (iii) las secuencias equivalentes a las secuencias (i) o (ii), en particular las secuencias que presentan para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos, por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 70% de homología con las secuencias (i) o (ii) respectivamente;
- -
- codifica un polipéptido que presenta, para cualquier sucesión contigua de por lo menos 30 aminoácidos, por lo menos 50%, y preferentemente por lo menos 70% de homología, con una secuencia peptídica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº: 135 y SEC ID nº: 137;
- -
- el extremo 5' de su gen pol empieza en el nucleótido 1419 de SEC ID nº: 130;
- -
- el extremo 3' de su gen gag termina en el nucleótido 1418 de SEC ID nº: 130;
- -
- el material nucleico retrovírico tal como se ha definido anteriormente está en particular asociado a por lo menos una enfermedad autoinmune tal como la esclerosis en placas o la poliartritis reumatoide.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere asimismo a un fragmento
nucleotídico que responde a por lo menos una de las siguientes
definiciones:
- -
- comprende o consiste en una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por (i) la secuencia SEC ID nº: 130; (ii) la secuencia complementaria de la secuencia (i); y (iii) las secuencias equivalentes a las secuencias (i) o (ii), en particular las secuencias que presentan para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos, por lo menos 50%, y preferentemente por lo menos 70% de homología con las secuencias (i) o (ii) respectivamente;
- -
- comprende o consiste en una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que presenta, para cualquier sucesión contigua de por lo menos 30 aminoácidos, por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 70% de homología, con una secuencia peptídica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº: 135 y SEC ID nº: 137.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros objetos de la presente invención son los
siguientes:
- -
- una sonda nucleica para la detección de un retrovirus asociado a la esclerosis en placas y/o a la poliartritis reumatoide, susceptible de hibridarse específicamente sobre cualquier fragmento definido anteriormente y que pertenece al genoma de dicho retrovirus; comprende ventajosamente de 10 a 100 nucleótidos, preferentemente de 10 a 30 nucleótidos;
- -
- un cebador para la amplificación mediante polimerización de un ARN o de un ADN de un retrovirus asociado a la esclerosis en placas y/o a la poliartritis reumatoide, que comprende una secuencia nucleotídica idéntica o equivalente a por lo menos una parte de la secuencia nucleotídica de un fragmento definido anteriormente, en particular una secuencia nucleotídica que presenta para cualquier sucesión de 10 monómeros contiguos, por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 70% de homología con por lo menos dicha parte de dicho fragmento; preferentemente la secuencia nucleotídica de un cebador de la invención se selecciona de entre las SEC ID nº 126, SEC ID nº 127, SEC ID nº 128, SEC ID nº 129, SEC ID nº 132 y SEC ID nº 133;
- -
- un ARN o ADN, y en particular un vector de replicación y/o de expresión que comprende un fragmento genómico del material nucleico o un fragmento definido anteriormente;
- -
- un péptido codificado por cualquier marco de lectura abierto que pertenece a un fragmento nucleotídico definido anteriormente, en particular un polipéptido, por ejemplo oligopéptido que forma o que comprende un determinante antigénico reconocido por unos sueros de pacientes infectados por el virus MSRV-1, y/o en los que el virus MSRV-1 ha sido reactivado; un péptido preferido comprende una secuencia idéntica, parcial o totalmente, o equivalente a una secuencia seleccionada de entre las SEC ID nº 135 y SEC ID nº 137;
- -
- una composición diagnóstica, profiláctica, o terapéutica, en particular para inhibir la expresión de por lo menos un retrovirus asociado a la esclerosis en placas y/o a la poliartritis reumatoide, que comprende un fragmento nucleotídico definido anteriormente;
- -
- un procedimiento para detectar un retrovirus asociado a la esclerosis en placas y/o a la poliartritis reumatoide, en una muestra biológica, que comprende las etapas que consisten en poner en contacto un ARN y/o un ADN que pertenece presuntamente o que procede de dicho retrovirus, o sus ARN y/o ADN complementarios, con una composición que comprende un fragmento nucleotídico definido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de detallar la invención, se definirán
ahora diferentes términos usados en la descripción y en las
reivindicaciones:
- -
- por cepa o aislado, se entiende cualquier fracción biológica infectante y/o patógena, que contiene, por ejemplo, unos virus y/o unas bacterias y/o unos parásitos, que generan un poder patógeno y/o antigénico, hospedada por un cultivo o un hospedante vivo; a título de ejemplo, una cepa vírica según la definición anterior puede contener un agente co-infectante, por ejemplo una protista patógena,
- -
- el término "MSRV" usado en la presente descripción designa cualquier agente patógeno y/o infectante, asociado a la SEP, en particular una especie vírica, las cepas atenuadas de dicha especie vírica, o las partículas defectivas interferentes o que contienen unos genomas co-encapsidados o también unos genomas recombinados con una parte del genoma MSRV-1, derivados de esta especie. Se sabe que los virus y particularmente los virus que contienen ARN, tienen una variabilidad consecutiva en particular de unos índices relativamente elevados de mutación espontánea, la cual se tendrá en cuenta a continuación para definir la noción de equivalencia,
- -
- por virus humano, se entiende un virus susceptible de infectar o de ser hospedado por el ser humano,
- -
- teniendo en cuenta todas las variaciones y/o recombinaciones naturales o inducidas que se pueden encontrar en la práctica de la presente invención, los objetos de esta última, definidos anteriormente y en las reivindicaciones, se han expresado comprendiendo los equivalentes o derivados de los diferentes materiales biológicos definidos a continuación, en particular de las secuencias homólogas nucleotídicas o peptídicas,
- -
- la variante de un virus o de un agente patógeno y/o infectante según la invención, comprende por lo menos un antígeno reconocido por lo menos por un anticuerpo dirigido contra por lo menos un antígeno correspondiente de dicho virus y/o de dicho agente patógeno y/o infectante, y/o un genoma del que cualquier parte se detecta por lo menos por una sonda de hibridación, y/o por lo menos un cebador de amplificación nucleotídica específica de dicho virus y/o agente patógeno y/o infectante, en unas condiciones de hibridación determinadas bien conocidas por el experto en la materia,
- -
- según la invención, un fragmento nucleotídico o un oligonucleótido o un polinucleótido es una cadena de monómeros, o un biopolímero, caracterizado por la secuencia informacional de los ácidos nucleicos naturales, susceptible de hibridarse a cualquier otro fragmento nucleotídico en unas condiciones predeterminadas, pudiendo contener la cadena unos monómeros de estructuras químicas diferentes y ser obtenida a partir de una molécula de ácido nucleico natural y/o por recombinación genética y/o por síntesis química; un fragmento nucleotídico puede ser idéntico a un fragmento genómico del virus MSRV-1 considerado por la presente invención, en particular un gen de este último, por ejemplo pol o env en el caso de dicho virus;
- -
- así, un monómero puede ser un nucleótido natural de ácido nucleico, cuyos elementos constitutivos son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada; en el ARN el azúcar es la ribosa, en el ADN el azúcar es la desoxi-2-ribosa; según que se trate del ADN o del ARN, la base nitrogenada se selecciona de entre la adenina, la guanina, el uracilo, la citosina, y la timina; o el nucleótido puede ser modificado en uno por lo menos de los tres elementos constitutivos; a título de ejemplo, la modificación puede intervenir a nivel de las bases, generando unas bases modificadas tales como la inosina, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5-desoxiuridina, la diamino-2,6-purina, la bromo-5-desoxiuridina y cualquier otra base modificada que favorece la hibridación; a nivel del azúcar, la modificación puede consistir en la sustitución de por lo menos una desoxiribosa por una poliamida, y a nivel del grupo fosfato, la modificación puede consistir en su sustitución por unos ésteres, en particular seleccionados de entre los ésteres de difosfato, de alquilo y arilfosfonato y de fosforotioato,
- -
- mediante la expresión "secuencia informacional" se entiende cualquier sucesión ordenada de monómeros, cuya naturaleza química y el orden en un sentido de referencia, constituyen o no una información funcional de la misma calidad que la de los ácidos nucleicos naturales,
- -
- por hibridación se entiende el proceso durante el cual, en unas condiciones de funcionamiento apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, que tienen unas secuencias suficientemente complementarias, se aparean para formar una estructura compleja, en particular doble o triple, preferentemente en forma de hélice,
- -
- una sonda comprende un fragmento nucleotídico sintetizado por vía química u obtenido por digestión o corte enzimático de un fragmento nucleotídico más largo, que comprende por lo menos seis monómeros, ventajosamente de 10 a 100 monómeros, preferentemente de 10 a 30 monómeros, y que posee una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas; preferentemente, una sonda que comprende menos de 10 monómeros no se usa sola, sino en presencia de otras sondas de tamaño tan corto o no; en ciertas condiciones particulares, puede resultar útil usar unas sondas de tamaño superior a 100 monómeros; una sonda puede ser usada en particular con fines de diagnóstico y se tratará, por ejemplo, de sondas de captura y/o de detección,
- -
- la sonda de captura se puede inmovilizar sobre un soporte sólido mediante cualquier medio apropiado, es decir, directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o adsorción pasiva,
- -
- la sonda de detección se puede marcar mediante un marcador seleccionado en particular de entre los isótopos radioactivos, unas enzimas seleccionadas en particular de entre la peroxidasa y la fosfatasa alcalina y aquéllos susceptibles de hidrolizar un sustrato cromógeno, fluorígeno o luminiscente, unos compuestos químicos cromóforos, unos compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes, unos análogos de bases nucleotídicas, y la biotina,
- -
- las sondas usadas con fines de diagnóstico de la invención se pueden usar en cualquier técnica de hibridación conocida, y en particular las técnicas denominadas "DOT-BLOT", "SOUTHERN BLOT", "NORTHERN BLOT" que es una técnica idéntica a la técnica "SOUTHERN BLOT" pero que usa ARN como diana, la técnica SANDWICH; ventajosamente, se usa la técnica SANDWICH en la presente invención, que comprende una sonda de captura específica y/o una sonda de detección específica, entendiéndose que la sonda de captura y la sonda de detección deben presentar una secuencia nucleotídica por lo menos parcialmente diferente,
- -
- cualquier sonda según la presente invención puede hibridarse in vivo o in vitro sobre el ARN y/o sobre el ADN, para bloquear los fenómenos de replicación, en particular traducción y/o transcripción, y/o para degradar dicho ADN y/o ARN,
- -
- un cebador es una sonda que comprende por lo menos seis monómeros, y ventajosamente de 10 a 30 monómeros, que poseen una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas, para la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo en una técnica de amplificación tal como la PCR (Polymerase Chain Reaction), en un procedimiento de elongación, tal como la secuenciación, en un método de transcripción inversa o análogo,
- -
- dos secuencias nucleotídicas o peptídicas son denominadas equivalentes o derivadas una con relación a la otra, o con relación a una secuencia de referencia, si funcionalmente los biopolímeros correspondientes pueden desempeñar sustancialmente la misma función, sin ser idénticas, frente a la aplicación o al uso considerado, o en la técnica en la que intervienen; en particular, son equivalentes dos secuencias obtenidas del hecho de la variabilidad natural, en particular mutación espontánea de la especie a partir de la cual se han identificado, o se han inducido, así como dos secuencias homólogas, siendo la homología definida a continuación,
- -
- por "variabilidad" se entiende cualquier modificación, espontánea o inducida de una secuencia, en particular por sustitución, y/o inserción, y/o deleción de nucleótidos y/o de fragmentos nucleotídicos, y/o extensión y/o acortamiento de la secuencia en uno por lo menos de los extremos; una variabilidad no natural puede resultar de las técnicas de ingeniería genética usadas, por ejemplo de la elección de los cebadores de síntesis degenerados o no, seleccionados para amplificar un ácido nucleico; esta variabilidad puede traducirse por unas modificaciones de cualquier secuencia de partida, considerada como referencia, y que pueden ser expresadas por un grado de homología con relación a dicha secuencia de referencia,
- -
- la homología caracteriza el grado de identidad de dos fragmentos nucleotídicos o peptídicos comparados; se mide por el porcentaje de identidad que está determinado en particular por la comparación directa de secuencias nucleotídicas o peptídicas, con relación a unas secuencias nucleotídicas o peptídicas de referencia,
- -
- cualquier fragmento nucleotídico se denomina equivalente o derivado de un fragmento de referencia si presenta una secuencia nucleotídica equivalente a la secuencia del fragmento de referencia; según la definición anterior, en particular son equivalentes a un fragmento nucleotídico de referencia:
- (a)
- cualquier fragmento susceptible de hibridarse por lo menos parcialmente con el complemento del fragmento de referencia,
- (b)
- cualquier fragmento cuya alineación con el fragmento de referencia conduce a demostrar unas bases contiguas idénticas, en número más importante que con cualquier otro fragmento que procede de otro grupo taxonómico,
- (c)
- cualquier fragmento que resulta o que puede resultar de la variabilidad natural de la especie, a partir de la cual se obtiene,
- (d)
- cualquier fragmento que puede resultar de las técnicas de ingeniería genética aplicadas al fragmento de referencia,
- (e)
- cualquier fragmento, que comprende por lo menos ocho nucleótidos contiguos, que codifica para un péptido homólogo o idéntico al péptido codificado por el fragmento de referencia,
- (f)
- cualquier fragmento diferente del fragmento de referencia, mediante inserción, deleción, sustitución de por lo menos un monómero, extensión, o acortamiento en uno por lo menos de sus extremos; por ejemplo, cualquier fragmento que corresponde al fragmento de referencia, flanqueado en uno por lo menos de sus extremos por una secuencia nucleotídica que no codifica para un polipéptido,
- -
- por polipéptido se entiende en particular cualquier péptido de por lo menos dos aminoácidos, en particular oligopéptido, proteína, extracto, separado, o sustancialmente aislado o sintetizado, por la intervención del hombre, específicamente los que se obtienen por síntesis química, o por expresión en un organismo recombinante,
- -
- por polipéptido codificado de manera parcial por un fragmento nucleotídico, se entiende un polipéptido que presenta por lo menos tres aminoácidos codificados por lo menos por nueve monómeros contiguos incluidos en dicho fragmento nucleotídico,
- -
- un aminoácido se denomina análogo a otro aminoácido, cuando sus características fisicoquímicas respectivas, tales como la polaridad, la hidrofobicidad, y/o la alcalinidad, y/o acidez, y/o neutralidad, son sustancialmente las mismas; de esta manera, una leucina es análoga a una isoleucina,
- -
- cualquier polipéptido se denomina equivalente o derivado de un polipéptido de referencia, si los polipéptidos comparados tienen sustancialmente las mismas propiedades, y en particular las mismas propiedades antigénicas, inmunológicas, enzimológicas y/o de reconocimiento molecular; en particular es equivalente a un polipéptido de referencia:
- (a)
- cualquier polipéptido que comprende una secuencia de la que por lo menos un aminoácido ha sido sustituido por un aminoácido análogo,
- (b)
- cualquier polipéptido que tiene una secuencia peptídica equivalente, obtenida por variación natural o inducida de dicho polipéptido de referencia, y/o del fragmento nucleotídico que codifica para dicho polipéptido,
- (c)
- un mimotopo de dicho polipéptido de referencia,
- (d)
- cualquier polipéptido en cuya secuencia se sustituyen uno o varios aminoácidos de la serie L por un aminoácido de la serie D, y viceversa,
- (e)
- cualquier polipéptido en cuya secuencia se ha introducido una modificación de las cadenas laterales de los aminoácidos, tal como por ejemplo una acetilación de las funciones aminadas, una carboxilación de las funciones tiol, una esterificación de las funciones carboxílicas,
- (f)
- cualquier polipéptido en cuya secuencia han sido modificados uno o varios enlaces peptídicos, como por ejemplo los enlaces carba, retro, inverso, retro-inverso, reducidos, y metilenoxi,
- (g)
- cualquier polipéptido del que por lo menos un antígeno es reconocido por un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de referencia,
- -
- el porcentaje de identidad que caracteriza la homología de dos fragmentos peptídicos comparados es según la presente invención de por lo menos 50% y preferentemente, de por lo menos 70%.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que un virus que posee una actividad
enzimática transcriptasa inversa puede ser genéticamente
caracterizado tanto en forma de ARN como de ADN, se mencionará
tanto el ADN como el ARN viral para caracterizar las secuencias
relativas a un virus que posee dicha actividad transcriptasa
inversa, denominado MSRV-1 según la presente
descripción.
Las expresiones de orden usadas en la presente
descripción y en las reivindicaciones, tales como "primera
secuencia nucleotídica" no se consideran para expresar un orden
particular, sino para definir más claramente la invención.
Mediante la expresión "detección de una
sustancia o agente", se entiende a continuación tanto una
identificación como una cuantificación, o una separación o
aislamiento de dicha sustancia o de dicho agente.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de la lectura de la descripción detallada
siguiente, realizada haciendo referencia a las figuras adjuntas, en
las que:
La figura 1 representa la estructura general del
ADN proviral y el ARN genómico de MSRV-1.
La figura 2 representa la secuencia nucleotídica
del clon denominado CL6-5' (SEC ID nº 112) y tres
marcos de lectura potenciales en aminoácidos que figuran bajo la
secuencia nucleotídica.
La figura 3 representa la secuencia nucleotídica
del clon denominado CL6-3' (SEC ID nº 114) y tres
marcos de lectura potenciales en aminoácidos que figuran bajo la
secuencia nucleotídica.
La figura 4 representa la secuencia nucleotídica
del clon denominado C15 (SEC ID nº 117) y tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La figura 5 representa la secuencia nucleotídica
del clon denominado 5M6 (SEC ID nº 120) y tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La figura 6 representa la secuencia nucleotídica
del clon denominado CL2 (SEC ID nº 130) y tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La Figura 7 representa tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos expresados por
pET28C-clon 2 y que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La Figura 8 representa tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos expresados por
pET21C-clon 2 y que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La figura 9 representa la secuencia nucleotídica
del clon denominado LB13 (SEC ID nº 141) y tres marcos de lectura
potenciales en aminoácidos que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La figura 10 representa la secuencia
nucleotídica del clon denominado LA15 (SEC ID nº 142) y tres marcos
de lectura potenciales en aminoácidos que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La figura 11 representa la secuencia
nucleotídica del clon denominado LB16 (SEC ID nº 124) y tres marcos
de lectura potenciales en aminoácidos que figuran bajo la secuencia
nucleotídica.
La figura 12 representa la actividad promotora
expresada en cpm/4 min de las secuencias U3R subclonadas a partir
de LTR de orígenes diferentes en el plásmido PCAT3. PCAT3 significa
plásmido solo, PCAT-PH74 significa plásmido más
clon U3R endógeno expresado en la placenta, PCAT-c16
significa plásmido más clon U3R amplificado en el ARN de un plasma
SEP, PCAT-5M6 significa plásmido más región U3R
amplificada en el ADN celular, "sin plásmido" significa la
ausencia de plásmido en el ensayo.
La Figura 13 representa las secuencias MSRV1 env
y LTR3'. Las flechas horizontales indican el inicio de las regiones
env, U3 y R. En la región env: el péptido señal y la región
inmunosupresiva potencial están subrayados, los sitios de
glicosilación potenciales están enmarcados y los sitios de escisión
potenciales se indican mediante unas flechas verticales. En la
región U3R: el elemento de regulación CAAT y la TATA Box están
subrayados, el sitio "cap" y la señal de poliadenilación
también están indicados.
La Figura 14 representa una región LTR5' (RU5)
seguida de un sitio PBS (primer binding site) complementario del
ARNt Trp y de un gen gag que codifica para una proteína de
aproximadamente 487 aminoácidos. Los aminoácidos conservados en la
nucleocápsida están subrayados dos veces. Los aminoácidos que
definen la región de mayor homología en la cápsida aparecen en
negrita y están subrayados una vez. Las / en la secuencia de
aminoácidos indican unas variaciones observadas según los clones y
en la secuencia nucleotídica indican unos saltos de marco en
ciertos clones. Las regiones enmarcadas corresponden a unos epítopos
identificados por análisis peptídico de la región
C-terminal.
C-terminal.
La Figura 15 representa la región integrasa de
MSRV1, la secuencia nucleotídica y la secuencia en aminoácidos
deducida de la región integrasa que corresponde al clon
87-23. En la Figura 15 // significa un salto de
marco que ha sido suprimido para restituir el ORF potencial. Las
letras en negrita subrayadas representan los aminoácidos
conservados de las integrasas retrovíricas.
La Figura 16 describe las secuencias
nucleotídica y peptídica del clon B13 (idéntico al clon FBd13
descrito en unas solicitudes anteriores) con indicación de los ORF
y de codones stop representados por un punto. La región subrayada y
en negrita representa el dominio inmunosupresor potencial. El
dominio solo subrayado representa el inicio del
LTR3'.
LTR3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Una 3'RACE ha sido efectuada sobre el ARN total
extraído de plasma de un paciente que padece SEP. Un plasma de
control sano, tratado en las mismas condiciones, ha sido usado como
control negativo. La síntesis de ADNc ha sido realizada con un
cebador oligo dT identificado por la SEC ID nº 68 (5' GAC TCG CTG
CAG ATC GAT TTT TTT TTT TTT TTT T 3') y la transcriptasa inversa
"Expand^{TM} RT" de Boehringer según las condiciones
recomendadas por la compañía: Una PCR ha sido efectuada con la
enzima Klentaq (Clontech) bajo las siguientes condiciones: 94ºC
durante 5 min., después 93ºC durante 1 min., 58ºC durante 1 min.,
68ºC durante 3 min. durante 40 ciclos y 68ºC durante 8 min., con un
volumen de reacción final de 50 \mul.
Cebadores usados para la PCR:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº69
- 5' GCC ATC AAG CCA CCC AAG AAC TCT TAA CTT 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº68
Una segunda PCR denominada "semi anidada"
ha sido realizada con un cebador 5' situado en el interior de la
región ya amplificada. Esta segunda PCR ha sido efectuada bajo las
mismas condiciones experimentales que las usadas durante la primera
PCR, utilizando 10 \mul del producto de amplificación resultante
de la primera PCR.
\newpage
Cebadores usados para la PCR
semi-anidada:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº 70
- 5' CCA ATA GCC AGA CCA TTA TAT ACA CTA ATT 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 68
Los cebadores SEC ID nº 69 y SEC ID nº 70 son
específicos de la región pol de MSRV-1.
Un producto de amplificación de 1,9 Kb ha sido
obtenido para el plasma de paciente SEP. El fragmento
correspondiente no ha sido observado en el plasma de control sano.
Este producto de amplificación ha sido clonado de la manera
siguiente:
- el ADN amplificado ha sido insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®: Los 2 \mul de disolución de ADN han sido mezclados con 5 \mul de agua destilada estéril, 1 \mul de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 \mul de "pCR^{TM} VECTOR" (25 ng/ml) y 1 \mul de "T4 DNA LIGASA". Esta mezcla se incubó una noche a 12ºC. Las etapas siguientes han sido realizadas de acuerdo con las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Al final del proceso, las colonias blancas de bacterias recombinantes (white) han sido inoculadas nuevamente para ser cultivadas y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el proceso denominado "miniprep". La preparación de plásmido de cada colonia recombinante ha sido cortada por una enzima de restricción apropiada y analizada sobre gel del agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor Sp6 presente sobre el plásmido del TA Cloning kit®. La reacción previa a la secuenciación ha sido efectuada a continuación según el método recomendado para el uso del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido realizada en los aparatos 373 A y 377 Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El clon obtenido contiene una región
CL6-5' que codifica para el extremo N terminal de la
integrasa y una región CL6-3', que corresponde a la
región 3' terminal de MSRV-1 y que permite definir
el final de la envolvente (234 pb) y las regiones U3, R (401 pb)
del retrovirus MSRV1.
La región que corresponde al extremo N terminal
de la integrasa está representada por su secuencia nucleotídica
(SEC ID nº 112) en la figura 27. Los tres marcos de lectura
potenciales están presentados por su secuencia aminoácida bajo la
secuencia nucleotídica, y la secuencia de aminoácidos del extremo
N-terminal de la integrasa se identifica por la SEC
ID nº 113.
La región C16-3' está
representada por su secuencia nucleotídica (SEC ID nº 114) en la
figura 3. Los tres marcos de lectura potenciales están presentados
por su secuencia aminoácida bajo la secuencia nucleotídica. Una
secuencia aminoácida que corresponde al extremo
C-terminal de la proteína env de
MSRV-1 se identifica por la SEC ID nº 115.
Con el fin de evaluar la actividad promotora del
LTR obtenido a partir del clon 6 (c16), se ha realizado un ensayo
de actividad promotora que usa la enzima CAT (cloramfenicol acetil
transferasa) con la región U3R correspondiente. Paralelamente, se
ha ensayado un clon que contiene la misma región U3R de ARN
retroviral endógeno expresado en la placenta normal (PH74) y un
clon (5M6) que procede de ADN. El resultado presentado en la figura
12 muestra una acentuada actividad promotora del LTR que procede de
plasma SEP (c16) y una actividad significativamente más débil con
las secuencias de origen endógeno no SEP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Una RT-PCR ha sido efectuada
sobre el ARN total extraído de viriones concentrados por
ultracentrifugación a partir de un sobrenadante de cultivo de
sinoviocitos que proceden de un paciente PR. La síntesis de ADNc ha
sido realizada con un cebador oligo dT y la transcriptasa inversa
"Expand^{TM} RT" de Boehringer según las condiciones
recomendadas por la compañía. Una PCR ha sido efectuada con el
Expand^{TM} Long Template PCR System (Boehringer) bajo las
condiciones siguientes: 94ºC durante 5 min. y después 93ºC durante 1
min., 60ºC durante 1 min., 68ºC durante 3 min. durante 40 ciclos y
68ºC durante 8 min. y con un volumen de reacción final de 50
\mul.
Cebadores usados para la PCR:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº: 69
- 5' GCC ATC AAG CCA CCC AAG AAC TCT TAA CTT 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 116
- 5' TGG GGT TCC ATT TGT AAG ACC ATC TGT AGC TT 3'
Una segunda PCR denominada
"semi-anidada" ha sido realizada con un cebador
5' situado en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda
PCR ha sido efectuada bajo las mismas condiciones experimentales que
las usadas durante la primera PCR (salvo que se realizaron 30
ciclos en vez de 40), usando 10 \mul del producto de
amplificación resultante de la primera PCR.
Cebadores usados para la PCR
semi-anidada:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº70
- 5' CCA ATA GCC AGA CCA TTA TAT ACA CTA ATT 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 116
Los cebadores SEC ID nº 69 y SEC ID nº 70 son
específicos de la región pol de MSRV-1. El cebador
SEC ID nº 116 es específico de la secuencia FBd13 (también
denominada B13) y esta localizado en la región env conservada entre
los oncoretrovirus.
Un producto de amplificación de 1932 pb ha sido
obtenido y clonado de la manera siguiente:
- el ADN amplificado ha sido insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®. Las diferentes etapas han sido realizadas de acuerdo con las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Al fin del proceso, las colonias blancas de bacterias recombinantes (white) han sido inoculadas nuevamente para ser cultivadas y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep". La preparación de plásmido de cada colonia recombinante ha sido cortada por una enzima de restricción apropiada y analizada sobre gel del agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor SP6 presente sobre el plásmido de clonación del TA cloning kit®. La reacción previa a la secuenciación ha sido efectuada a continuación según el método recomendado para el uso del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido realizada en los aparatos 373 A y 377 de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El clon C15 obtenido contiene una región que
corresponde a la región de envolvente de MSRV-1, de
1.481 pb.
La región env del clon C15 está representada por
su secuencia nucleotídica (SEC ID nº 117) en la figura 5. Los tres
marcos de lectura potenciales de este clon están presentados por su
secuencia aminoácida bajo la secuencia nucleotídica. El marco de
lectura que corresponde a una proteína env estructural
MSRV-1 se identifica por la SEC ID nº 118.
A partir de las secuencias definidas que
proceden de los clones c16 y C15, se ha podido efectuar una
construcción plasmídica que codifica para una envolvente completa
seguida del LTR3', tal como se presenta en la figura 13 con el
marco de lectura correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una PCR monodireccional ha sido efectuada sobre
el ADN extraído de linfocitos B inmortalizados en cultivo de un
paciente PR. La PCR ha sido efectuada con Expand^{TM} Long
Template PCR System (Boehringer) bajo las condiciones siguientes:
94ºC durante 3 min. y después 93ºC durante 1 min., 60ºC durante 1
min., 68ºC durante 3 min. durante 10 ciclos, después 93ºC durante 1
min., 60ºC durante 1 min. con 15 s de extensión por cada ciclo,
68ºC durante 3 min. durante 35 ciclos y 68ºC durante 7 min. y con un
volumen de reacción final de 50 \mul.
El cebador usado para la PCR identificado por la
SEC ID nº 119 es 5' TCA AAA TCG AAG AGC TTT AGA CTT GCT AAC CG
3';
El cebador SEC ID nº 119 es específico de la
región env del Clon C15.
\newpage
Un producto de amplificación de 1.673 pb ha sido
obtenido y clonado de la manera siguiente:
- el ADN amplificado ha sido insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®. Las diferentes etapas han sido realizadas de acuerdo con las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Al final del proceso, las colonias blancas de bacterias recombinantes (white) han sido inoculadas nuevamente para ser cultivadas y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep". La preparación de plásmido de cada colonia recombinante ha sido cortada por una enzima de restricción apropiada y analizada sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido de clonación del TA cloning kit®. La reacción previa a la secuenciación ha sido efectuada según el método recomendado para el uso del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido realizada en los aparatos 373 A y 377 Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El clon 5M6 obtenido contiene una región que
corresponde a la región 3' de la envolvente de
MSRV-1, de 492 pb seguida de las regiones U3, R y
U5 (837 pb) de MSRV-1.
El clon 5M6 está representado por su secuencia
nucleotídica (SEC ID nº 120) en la figura 5. Los tres marcos de
lectura potenciales de este clon se representan por su secuencia
aminoácida bajo la secuencia nucleotídica. El marco de lectura que
corresponde al extremo C-terminal de la proteína env
MSRV-1 se identifica por la SEC ID nº 121.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Una RT-PCR ha sido efectuada
sobre el ADN total tratado con la DNAsaI y extraído a partir de un
plexo coroideo que procede de un paciente que padece SEP. La
síntesis de ADNc ha sido realizada con un cebador oligo dT y la
transcriptasa inversa "Expand^{TM} RT" de Boehringer según
las condiciones recomendadas por la compañía. Un control "no
RT" se ha efectuado paralelamente sobre el mismo material. Una
PCR ha sido efectuada con la Taq polimerasa (Perkin Elmer) bajo las
condiciones siguientes: 95ºC durante 5 min., y 95ºC durante 1 min.,
55ºC durante 1 min., 72ºC durante 2 min. durante 35 ciclos y 72ºC
durante 8 min. y con un volumen de reacción final de 50 \mul.
Cebadores usados para la PCR:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº 122
- 5' GGC ATT GAT AGC ACC CAT CAG 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 123
- 5' CAT GTC ACC AGG GTG GAA TAG 3'
El cebador SEC ID nº 122 es específico de la
región pol de MSRV-1 y más precisamente similar a la
región integrasa descrita anteriormente. El cebador SEC ID nº 123
ha sido definido sobre unas secuencias de los clones obtenidos
durante ensayos anteriores.
Un producto de amplificación de aproximadamente
760 pb ha sido obtenido únicamente en el ensayo con RT y ha sido
clonado de la manera siguiente:
- el ADN amplificado ha sido insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning®. Las diferentes etapas han sido realizadas según las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Al final del proceso, las colonias blancas de bacterias recombinantes (white) han sido inoculadas nuevamente para ser cultivadas y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "miniprep". La preparación de plásmido de cada colonia recombinante ha sido cortada por una enzima de restricción apropiada y analizada sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido de clonación del TA cloning kit®. La reacción previa a la secuenciación ha sido efectuada a continuación según el método recomendado para el uso del kit de secuenciación "PRISM^{Tm} Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido realizada en los aparatos 373 A y 377 de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El clon LB16 obtenido contiene las secuencias
que corresponden a la integrasa. La secuencia nucleotídica de este
clon es identificada por la SEC ID nº 124 en la figura 11, estando
determinados tres marcos de lectura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Una amplificación por PCR ha sido efectuada
sobre el ADN total extraído a partir de 100 \mul de plasma de un
paciente que padece SEP. Un control con agua, tratado bajo las
mismas condiciones, ha sido utilizado como control negativo. La
síntesis de ADNc ha sido realizada con 300 pmoles de un cebador
aleatorio (GIBCO-BRL, Francia) y la transcriptasa
inversa "Expand RT" (BOEHRINGER MANNHEIM, Francia) según las
condiciones recomendadas por la compañía. Una amplificación por PCR
("polymerase chain reaction") ha sido efectuada con la enzima
Taq polimerasa (Perkin Elmer, Francia) usando 10 \mul de ADNc
bajo las condiciones siguientes: 94ºC durante 2 min., 55ºC durante
1 min., 72ºC durante 2 min. y 94ºC durante 1 min., 55ºC durante 1
min., 72ºC durante 2 min. durante 30 ciclos y 72ºC durante 7 min. y
con un volumen de reacción final de 50 \mul.
Cebadores usados para la amplificación por
PCR:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID Nº 126
- 5' CGG ACA TCC AAA GTG ATG GGA AAC G 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 127
- 5' GGA CAG GAA AGT AAG ACT GAG AAG GC 3'
Una segunda amplificación por PCR denominada
"semi-anidada" ha sido realizada con un cebador
5' situado en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda
PCR ha sido efectuada bajo las mismas condiciones experimentales
que las usadas durante la primera PCR, usando 10 \mul del producto
de amplificación resultante de la primera PCR.
Cebadores usados para la amplificación por PCR
semi-anidada:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº 128
- 5' CCT AGA ACG TAT TCT GUA GAA TTG GG 3';
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 129
- 5' TGG CTC TCA ATG GTC AAA CAT ACC CG 3'
Los cebadores SEC ID nº 128 y SEC ID nº 129 son
específicos de la región pol, clon G+E+A, más específicamente la
región E: posición de nucleótidos nº 423 a nº 448. Los cebadores
usados en la región 5' han sido definidos sobre unas secuencias de
clones obtenidos durante ensayos previos.
Un producto de amplificación de 1.511 pb ha sido
obtenido a partir del ARN extraído del plasma de paciente SEP. El
fragmento correspondiente no se observó para el control con agua.
Este producto de amplificación ha sido clonado de la manera
siguiente.
El ADN amplificado ha sido insertado en un
plásmido con la ayuda del kit TA Cloning^{TM}. Los 2 \mul de
disolución de ADN han sido mezclados con 5 \mul de agua destilada
estéril, 1 \mul de un tampón de ligación 10 veces concentrado
"10X LIGATION BUFFER", 2 \mul de "pCR^{TM} VECTOR" (25
ng/ml) y 1 \mul de "T4 DNA LIGASA". Esta mezcla se incubó
durante una noche a 14ºC. Las etapas siguientes han sido realizadas
según las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). La mezcla
se extendió después de la transformación de la ligación en unas
bacterias E. coli INV\alphaF'. Al final del proceso, las
colonias blancas de bacterias recombinantes han sido inoculadas
nuevamente para ser cultivadas y permitir la extracción de los
plásmidos incorporados según el procedimiento denominado
"minipreparación de ADN" (17). La preparación de plásmido de
cada colonia recombinante ha sido cortada por la enzima de
restricción Eco RI y analizada sobre gel de agarosa. Los
plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del
marcado del gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para
la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un
cebador complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido
de clonación del TA cloning kit®. La reacción previa a la
secuenciación ha sido efectuada a continuación según el método
recomendado para el uso del kit de secuenciación "PRISM^{TM}
Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied
Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido
realizada en los aparatos 373 A y 377 de Applied Biosystems, según
las instrucciones del fabricante.
El clon obtenido, denominado CL2, contiene una
región C-terminal similar a la región 5' terminal de
los clones G+E+A de MSRV-1, que permite definir la
región C-terminal del gen gag y una nueva región que
corresponde a la región N-terminal del gen gag
MSRV-1.
CL2 permite definir una región de 1.511 pb que
presenta una fase abierta de lectura dentro de la región
N-terminal de 1.077 pb que codifica para 359
aminoácidos y una fase no abierta de lectura, de 454 pb, que
corresponde a la región C-terminal del gen gag
MSRV-1.
La secuencia nucleotídica de CL2 se identifica
por la SEC ID nº 130. Está representada en la figura 6, con los
marcos de lectura potenciales en aminoácido.
El fragmento de 1.077 pb de CL2 que codifica
para 359 aminoácidos ha sido amplificado por PCR con la enzima
Pwo (5 U/\mul) (Boehringer Mannheim, Francia) usando 1
\mul de la minipreparación del ADN del clon 2 bajo las
condiciones siguientes: 95ºC durante 1 min., 60ºC durante 1 min.,
72ºC durante 2 min. durante 25 ciclos y con un volumen de reacción
final de 50 \mul con la ayuda de los cebadores:
- -
- cebador 5' (Bam HI), identificado por la SEC ID nº 132
- 5' TGC TGG AAT TCG GGA TCC TAG AAC GTA TTC 3' (30 mer), y
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3' (Hind III), identificado por la SEC ID nº 133
- 5' AGT TCT GCT CCG AAG CTT AGG CAG ACT TTT 3' (30 mer)
que corresponden, respectivamente, a la
secuencia nucleotídica del clon 2 en posición -9 a 21 y 1066 a
1095.
El fragmento obtenido después de la PCR ha sido
linearizado por Bam Hl y Hind III y subclonado en los
vectores de expresión pET28C y pET21C (NOVAGEN) linearizado por
Bam Hl y Hind III. La secuenciación del ADN del
fragmento de 1.077 pb del clon 2 en los dos vectores de expresión ha
sido realizado según el método recomendado para el uso del kit de
secuenciación "PRISM^{TM} Ready Reaction Amplitaq® FS,
DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y
la secuenciación automática ha sido realizada en los aparatos 373 A
y 377 de Applied Biosystems, según las instrucciones del
fabricante.
La expresión de la secuencia nucleotídica del
fragmento de 1.077 pb del clon 2 por los vectores de expresión
pET28C y pET21C se identifican respectivamente por las SEC ID nº 135
y SEC ID nº 137.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Las construcciones pET28C-clon 2
(1.077 pb) y pET21C-clon 2 (1.077 pb) sintetizan, en
la cepa bacteriana BL21 (DE3), una proteína en fusión N- y
C-terminal para el vector pET28C y
C-terminal para el vector pET21C con 6 Histidinas,
de masa molecular aparente de aproximadamente 45 kDa, demostrada por
electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS-PAGE
(SDS = Dodecil Sulfato de Sodio) (Laemmli, 1970 (1)). La reactividad
de la proteína ha sido demostrada frente a un anticuerpo monoclonal
anti-histidina (DIANOVA) mediante la técnica de
transferencia Western (Towbin et al., 1979 (2)).
Las proteínas recombinantes
pET28C-clon 2 (1.077 pb) y
pET21C-clon 2 (1.077 pb) han sido visualizadas en
SDS-PAGE en la fracción insoluble después de la
digestión enzimática de los extractos bacterianos con 50 \mul de
lisozima (10 mg/ml) y lisis por ultrasonidos.
Las propiedades antigénicas de los antígenos
recombinantes pET28C-clon 2 (1.077 pb) y
pET21C-clon 2 (1.077 pb) han sido ensayados
mediante transferencia Western después de la solubilización del
residuo bacteriano con SDS al 2% y
\beta-mercaptoetanol 50 mM. Después de la
incubación con los sueros de pacientes que padecen esclerosis en
placas, los sueros de los controles neurológicos y los sueros de los
controles de centro de transfusión sanguínea (CTS), los
inmunocomplejos han sido detectados con la ayuda de un suero de
cabra anti-IgG y anti-IgM humanos,
acoplado a la fosfatasa alcalina.
Los resultados se presentan en la tabla
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que, en las
condiciones técnicas usadas, aproximadamente 40% de los sueros
humanos afectados de esclerosis en placas ensayados reaccionan con
las proteínas recombinantes pET28C-clon 2 (1.077
pb) y pET21C-clon 2 (1.077 pb). Se observó una
reactividad en un control neurológico y es interesante apuntar que
los ARN extraídos a partir de este suero, después de la etapa de
transcriptasa inversa, se amplifican asimismo por PCR en la región
pol. Esto sugiere que unas personas que no han desarrollado una SEP
pueden asimismo hospedar y expresar este virus. Por el contrario,
un control (donante CTS) aparentemente sano, posee unos anticuerpos
anti-gag (clon 2, 1.077 pb). Lo cual es compatible
con una inmunidad adquirida contra MRSV-1 fuera de
una enfermedad autoinmune asociada declarada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Una RT-PCR
("reverse-transcriptase-polymerase
chain reaction") ha sido efectuada a partir del ARN total
extraído de viriones, que proceden de sobrenadantes de células
linfocitarias B de los pacientes que padecen esclerosis en placas,
concentrados mediante ultracentrifugaciones. La síntesis de ADNc ha
sido realizada con un cebador específico SEC nº XXX y la
transcriptasa inversa "Expand^{TM} RT" de BOEHRINGER MANNHEIM
según las condiciones recomendadas por la compañía.
Cebador usado para la síntesis del ADNc,
identificado por la SEC ID nº 138:
- 5' CTT GGA GGG TGC ATA ACC AGG GAA T 3'
Una amplificación por PCR ha sido realizada con
la Taq polimerasa (perkin Elmer, Francia) en las condiciones
siguientes: 94ºC durante 1 min., 55ºC durante 1 min., 72ºC durante 2
min. durante 35 ciclos y 72ºC durante 7 min. y con un volumen de
reacción final de 100 \mul.
Cebadores usados para la amplificación por
PCR:
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº 139
- 5' TGT CCG CTG TGC TCC TGA TC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 138
- 5' CTT GGA GGG TGC ATA ACC AGG GAA T 3'
Una segunda amplificación por PCR denominada
"semi-anidada" ha sido realizada con un cebador
3' situado en el interior de la región ya amplificada. Esta segunda
amplificación ha sido realizada bajo las mismas condiciones
experimentales que las que se usaron durante la primera
amplificación, usando 10 \mul del producto de amplificación
procedente de la primera PCR.
\newpage
Cebadores usados para la amplificación por PCR
"semi-anidada":
- -
- cebador 5', identificado por la SEC ID nº 139
- 5' TGT CCG CTG TGC TCC TGA TC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- cebador 3', identificado por la SEC ID nº 140
- 5' CTA TGT CCT TTT GGA CTG TTT GGG T 3'
Los cebadores SEC ID nº 138 y SEC ID nº 140 son
específicos de la región gag, clon 2 posición nucleotídica nº
373-397 y nº 433-456. Los cebadores
usados en la región 5' han sido definidos sobre unas secuencias de
los clones obtenidos durante unos ensayos previos.
Un producto de amplificación de 764 pb ha sido
obtenido y clonado de la manera siguiente:
- el ADN amplificado ha sido insertado en un plásmido con la ayuda del kit TA Cloning^{TM}. Los 2 \mul de disolución de ADN han sido mezclados con 5 \mul de agua destilada estéril, 1 \mul de un tampón de ligación 10 veces concentrado "10X LIGATION BUFFER", 2 \mul de "pCR^{TM} VECTOR" (25 ng/ml) y 1 \mul de "T4 DNA LIGASE". Esta mezcla se incubó durante una noche a 14ºC. Las etapas siguientes han sido realizadas según las instrucciones del kit TA Cloning® (Invitrogen). Esta mezcla se extendió después de la transformación de la ligación en unas bacterias E. coli INV\alphaF'. Al final del proceso, las colonias blancas de bacterias recombinantes han sido inoculadas nuevamente para ser cultivadas y permitir la extracción de los plásmidos incorporados según el procedimiento denominado "minipreparación de ADN" (17). La preparación de plásmido de cada colonia recombinante ha sido cortada por la enzima de restricción Eco RI y analizada sobre gel de agarosa. Los plásmidos que poseen un inserto detectado bajo luz UV después del marcado del gel con bromuro de etidio, han sido seleccionados para la secuenciación del inserto, después de la hibridación con un cebador complementario del promotor T7 presente sobre el plásmido de clonación del TA cloning kit®. La reacción previa a la secuenciación ha sido efectuada a continuación según el método recomendado para el uso del kit de secuenciación "PRISM^{TM} Ready Reaction AmpliTaq® FS, DyeDeoxy^{TM} Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) y la secuenciación automática ha sido realizada en los aparatos 373 A y 377 de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante.
El clon LB13 obtenido contiene una región
N-terminal del gen gag MSRV-1
homóloga al clon 2 y un LTR que corresponde a una parte de la
región U5. Entre la región U5 y gag se ha identificado un sitio de
fijación para los ARN de transferencia, el PBS "primer binding
site".
La secuencia nucleotídica del fragmento de 764
pb del clon LB13 en el plásmido "pCR^{TM} VECTOR" está
representado en el identificador SEC ID nº 141.
El sitio de fijación para los ARN de
transferencia, que presentan una secuencia de tipo PBS triptófano,
ha sido identificado en posición nucleotídica nº
342-359 del clon LB13.
Puesto que este mismo PBS se ha encontrado
nuevamente en las copias endógenas homólogas a
MSRV-1, la familia endógena así definida se
denominará de ahora en adelante HERV W, según la nomenclatura
propuesta para las familias de retrovirus endógenos
(W=Triptófano).
Un ORF corto de aproximadamente 65 aminoácidos
se ha encontrado en la región U5 del LTR 5' del clon LB13.
Secuencia del ORF:
- PMASNRAITLTAWSKIPFLGIRETKNPRSENTRLATMLEAAHHHEGSSPPLSWELWEQGPQVTIW.
La secuencia nucleotídica correspondiente que
empieza con un codón ATG es susceptible de ser expresada en un ADN
subgenómico a partir de un LTR proviral (U3RU5).
Otro clon, denominado LA15, ha sido obtenido
sobre el ARN total extraído de viriones concentrados mediante
ultracentrifugación a partir de un sobrenadante de cultivo de
sinoviocitos que proceden de un paciente que padece poliartritis
reumatoide. La estrategia de amplificación y clonación del clon LA15
es exactamente la misma que la que se ha usado para el clon
LB13.
La secuencia nucleotídica del clon LA15 que está
representada en el identificador SEC ID nº 142 es muy similar al
clon LB13. Esto sugiere que el retrovirus MSRV-1
detectado en la esclerosis en placas presenta unas secuencias
similares a las encontradas en la poliartritis reumatoide.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Los clones CL2 y LB13 ya se han descrito en los
ejemplos anteriores. El clon LB15 se ha obtenido usando la
secuencia R del LTR del clon c16 para definir un cebador en 5' y los
cebadores anti-sentido usados son los mismos que
para el clon LB13. El clon CL17 se ha obtenido por
RT-PCR anidada usando los cebadores siguientes:
- 5'-TCATGCAACTGCACTCTTCTGGTCCG-3' (sentido)
- 5'-TCTTGCACTAACCTCCACTGTCCGTTCC-3' (anti-sentido)
- 5'-ATCCCCCAGTAACAATTTGGTGACCACG-3' (sentido)
- 5'-TCGGGTCTAAGAGGGTACTTCCTTTGGTACC-3' (anti-sentido)
El clon LB15 se ha obtenido a partir de viriones
obtenidos mediante cultivo de células de SEP. El clon LB17 se ha
obtenido a partir del cultivo de plasma de paciente SEP.
Estos clones que se solapan han permitido
reconstruir una secuencia RU5-gag con un ORF
potencial dentro del gen GAG, tal como las representadas en la
figura 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
La región que corresponde a la integrasa se ha
amplificado y clonado a partir de plasma de SEP usando una
RT-PCR semi-anidada con los
cebadores siguientes situados en las regiones pol y env de
MSRV1.
En la región pol:
- 5'-TTACGCAGGTCTCAGGGATGAGCTT-3' (sentido-PCR primaria)
- 5'-CGGCAGTAGCAGTCTTAGTATCTGAAGCAGTTA-3' (sentido-PCR secundaria)
\vskip1.000000\baselineskip
En la región env:
- 5'-GGTACGGAGGGTTTCATGTAGTTTTGAG-3' (PCR anti sentido primaria y secundaria)
El clon amplificado comprende 774 pb en la
región pol/RT, toda la región integrasa (1.197 pb) y el inicio de
la región env (480 pb). En la figura 15 se muestra la secuencia
nucleotídica que corresponde a la región integrasa y la traducción
en aminoácidos del ORF potencial.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Unas secuencias parecidas a ERV9 se han
encontrado en proporción minoritaria en las preparaciones del virión
procedente de SEP en relación con las secuencias MSRV1. Se ha
descrito la existencia de fenómenos de
co-encapsidación de secuencias endógenas
filogenéticamente cercanas en las partículas retrovirales producidas
por una cepa replicativa. De manera sorprendente, una región de ARN
que comprende un inicio ORF en la parte 3' de env y que continúa
potencialmente en el LTR3' ha sido encontrada de nuevo en diferentes
muestras de SEP. Con el fin de precisar la existencia de un ORF se
han realizado unos ensayos de
transcripción-traducción y han permitido mostrar la
realidad de un ORF env que contiene la totalidad de la parte
transmembranaria (TM) y que se termina en el inicio del LTR
putativo. Sin embargo, una trama adicional (ORFX) sigue y continúa
dentro del LTR3'. Los dos productos de expresión se han visualizado
y sus ORF respectivos han sido subclonados. La figura 16 representa
las secuencias nucleotídica y peptídica del clon B13 descrito
anteriormente precisando los ORF en la región env truncada y en el
LTR putativo. La presencia de dichos ARN puede ser el origen de
recombinaciones con la cepa replicativa, y por consiguiente,
generar unas cepas de patogenicidad modificada.
(1) Laemmli U. K. Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature. (1970). 227: 680-685.
(2) Towbin H., Staehelin T. y
Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some
applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1979). 76:
4350-4354.
<110> bioMérieux
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Material nucleico retrovírico y
fragmentos nucleotídicos, asociados a la esclerosis en placas, con
fines de diagnóstico, profilácticos y terapéuticos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BR51193
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR-9708816
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
07-07-1997
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 68
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
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\hskip-.1em\dddseqskipgactcgctgc agatcgattt tttttttttt tttt
\hfill34
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<210> 69
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 69
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\hskip-.1em\dddseqskipgccatcaagc cacccaagaa ctcttaactt
\hfill30
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<210> 70
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 70
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\hskip-.1em\dddseqskipccaatagcca qadeattata tacactaatt
\hfill30
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<210> 112
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<211> 310
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<212> ADN
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<213> humano
\newpage
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<400> 112
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<210> 113
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<211> 103
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 113
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<210> 114
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<211> 635
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 114
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<210> 115
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<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
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<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 116
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\hskip-.1em\dddseqskiptggggttcca tttgtaagac catctgtagc tt
\hfill32
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<210> 117
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<211> 1481
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<212> ADN
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<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
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<210> 118
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<211> 493
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 118
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211>32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaaatcga agagctttag acttgctaac cg
\hfill32
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcattgata gcacccatca g
\hfill21
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<210 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgtcacca gggtggaata g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 758
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggacatcca aagtgatggg aaacg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacaggaaa gtaagactga gaaggc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctagaacgt attctggaga attggg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggctctcaa tggtcaaaca tacccg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctggaatt cgggatccta gaacgtattc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttctgctc cgaagcttag gcagactttt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttqgagggt geataaccag ggaat
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtccgctgt gctcctgatc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgtcctt ttggactgtt tgggt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 764
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 800
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
Claims (24)
1. Material nucleico, en estado aislado o
purificado, que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada
de entre el grupo constituido por (i) SEC ID nº 130; (ii) la
secuencia complementaria de (i); y (iii) las secuencias que
presentan para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos, por lo
menos 50% de identidad con las secuencias (i) o (ii)
respectivamente, siendo dicho material nucleico diferente de la
secuencia HSAC64 del clon humano RG083M05 accesible en la base de
datos EMBL, con el número AC000064.1.
2. Material nucleico según la reivindicación 1,
caracterizado porque las secuencias (iii) son las secuencias
que presentan para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos por
lo menos 70% de identidad con las secuencias (i) o (ii)
respectivamente.
3. Material nucleico, en estado aislado o
purificado, que codifica para un polipéptido que presenta, para
cualquier sucesión contigua de por lo menos 30 aminoácidos, por lo
menos 50% de identidad con una secuencia peptídica seleccionada de
entre el grupo constituido por la SEC ID nº 135 y SEC ID nº 137,
siendo dicho material nucleico diferente de la secuencia HSAC64 del
clon humano RG083M05 accesible en la base de datos EMBL, con el
número AC000064.1.
4. Material nucleico según la reivindicación 3,
caracterizado porque codifica para un polipéptido que
presenta, para cualquier sucesión de por lo menos 30 aminoácidos,
por lo menos 70% de identidad con SEC ID nº 135 o SEC ID nº
137.
5. Material nucleico retroviral, cuyo extremo 3'
del gen gag termina en el nucleótido 1418 de SEC ID nº 130.
6. Material nucleico retroviral según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque
está asociado a por lo menos una enfermedad autoinmune tal como la
esclerosis en placas o la poliartritis reumatoide.
7. Fragmento nucleotídico que comprende una
secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido
por (i) SEC ID nº 130; (ii) la secuencia complementaria de (i); y
(iii) las secuencias que presentan para cualquier sucesión de 100
monómeros contiguos, por lo menos 50%, y preferentemente por lo
menos 70% de homología con las secuencias (i) o (ii)
respectivamente, siendo dicho fragmento nucleotídico diferente de la
secuencia HSAC64 del clon humano RG083M05 accesible en la base de
datos EMBL, con el número AC000064.1.
8. Fragmento nucleotídico según la
reivindicación 7, que consiste en una secuencia nucleotídica
seleccionada de entre el grupo constituido por (i) SEC ID nº 130;
(ii) la secuencia complementaria de (i); y (iii) las secuencias que
presentan para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos, por lo
menos 50% de identidad con las secuencias (i) o (ii)
respectivamente.
9. Fragmento según la reivindicación 7 u 8,
caracterizado porque las secuencias (iii) son las secuencias
que presentan para cualquier sucesión de 100 monómeros contiguos
por lo menos 70% de identidad con las secuencias (i) o (ii)
respectivamente.
10. Fragmento nucleotídico que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que
presenta, para cualquier sucesión contigua de por lo menos 30
aminoácidos, por lo menos 50% de identidad con una secuencia
peptídica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID
nº 135 y SEC ID nº 137, siendo dicho fragmento nucleotídico
diferente de la secuencia HSAC64 del clon humano RG083M05 accesible
en la base de datos EMBL, con el número AC000064.
11. Fragmento nucleotídico según la
reivindicación 10, que consiste en una secuencia nucleotídica que
codifica para un polipéptido que presenta, para cualquier sucesión
contigua de por lo menos 30 aminoácidos, por lo menos 50% de
identidad con una secuencia peptídica seleccionada de entre el grupo
constituido por las SEC ID nº 135 y SEC ID nº 137.
12. Fragmento según la reivindicación 11,
caracterizado porque codifica para un polipéptido que
presenta, para cualquier sucesión de por lo menos 30 aminoácidos,
por lo menos 70% de identidad con las SEC ID nº 135 y SEC ID nº
137.
13. Sonda nucleica para la detección de un
retrovirus asociado a la esclerosis en placas y/o a la poliartritis
reumatoide, caracterizada porque es susceptible de hibridarse
específicamente sobre cualquier fragmento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12, que pertenece al genoma de dicho
retrovirus.
14. Sonda según la reivindicación 13,
caracterizada porque comprende de 10 a 100 nucleótidos.
15. Sonda según la reivindicación 14,
caracterizada porque comprende de 10 a 30 nucleótidos.
\newpage
16. Cebador para la amplificación mediante
polimerización de un ARN o de un ADN de un retrovirus asociado a la
esclerosis en placas y/o a la poliartritis reumatoide,
caracterizado porque comprende un fragmento según cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 12.
17. Cebador según la reivindicación 16,
caracterizado porque su secuencia nucleotídica se selecciona
de entre las SEC ID nº 127, SEC ID nº 128, SEC ID nº 129, SEC ID nº
132 y SEC ID nº 133.
18. ARN que comprende un fragmento según
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
19. ADN que comprende un fragmento según
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
20. Vector de replicación y/o de expresión, que
comprende un fragmento genómico del material nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un fragmento según
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
21. Péptido codificado por cualquier marco de
lectura abierto que pertenece a un fragmento nucleotídico según
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que forma o que comprende
un determinante antigénico reconocido por unos sueros de pacientes
infectados por el virus MSRV-1 y/o en los que el
virus MSRV-1 se ha reactivado.
22. Péptido según la reivindicación 21, que
comprende una secuencia idéntica a una secuencia seleccionada de
entre las SEC ID nº 135 y SEC ID nº 137.
23. Composición diagnóstica, profiláctica o
terapéutica para inhibir la expresión de por lo menos un retrovirus
asociado a la esclerosis en placas y/o a la poliartritis reumatoide,
que comprende un fragmento nucleotídico según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12.
24. Procedimiento para detectar un retrovirus
asociado a la esclerosis en placas y/o a la poliartritis reumatoide,
en una muestra biológica, caracterizado porque se pone en
contacto un ARN y/o un ADN que presuntamente pertenece o que
procede de dicho retrovirus, o su ARN y/o ADN complementario, con
una composición que comprende un fragmento nucleotídico según
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9708816A FR2765588A1 (fr) | 1997-07-07 | 1997-07-07 | Materiel nucleique retroviral et fragments nucleotidiques notamment associes a la sclerose en plaques et/ou la polyarthrite rhumatoide, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
| FR9708816 | 1997-07-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2331251T3 true ES2331251T3 (es) | 2009-12-28 |
Family
ID=9509117
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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