ES2235155T3

ES2235155T3 - Preparacion farmaceutica a base de ramnolipidos contra enfermedades dermatologicas.

Info

Publication number: ES2235155T3
Application number: ES93914523T
Authority: ES
Inventors: Goran Piljac; Visnja Piljac
Original assignee: Paradigm Biomedical Inc
Current assignee: Paradigm Biomedical Inc
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2013-02-04
Also published as: PT630252E; BE1005704A4; JP2004149547A; JP3860206B2; CA2129542C; DK0630252T3; WO1993014767A2; AU3453493A; EP0630252B1; CA2129542A1; JPH09503196A; EP0630252A1; DE69333723T2; DE69333723D1; ATE284697T1; WO1993014767A3

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA PREPARACION FARMACEUTICA QUE CONSTA COMO INGREDIENTE ACTIVO DE AL MENOS UN RAMNOLIPIDO O UNA SAL DEL MISMO ACEPTABLE FARMACEUTICAMENTE, Y DE UN TRANSPORTADOR Y/O DILUYENTE, PREFERIBLEMENTE QUE CONSTA DE UN RAMNOLIPIDO DE FORMULA (I), EN DONDE R1= H, ALFA-L-RAMNOPIRANOSILO; R2= H, (A); R3= (C5C20)-SATURADO, -MONO-DE ALQUILO POLIINSATURADO; R4= (C5-C20)SATURADO, -MONO-DE ALQUILO POLIINSATURADO. LA PREPARACION SE USA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DERMATOLOGICAS, POR EJ. INFECCIONES DEL VIRUS DEL PAPILOMA.

Description

Preparación farmacéutica a base de ramnolípidos contra enfermedades dermatológicas.

La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica que comprende como principio activo al menos un ramnolípido. En particular, la presente invención se refiere a tal preparación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades dermatológicas.

Entre los biotensioactivos están los glucolípidos. Debido a las diferentes combinaciones de hidratos de carbono y lípidos, junto con los diferentes enlaces estructurales y los diferentes estados iónicos, hay variedad de glucolípidos que tienen entre ellos un equilibrio hidrófilo / lipófilo totalmente diferente. Se sabe que varias cepas de Pseudomonas, tal como Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, pueden realizar una secreción extracelular de ramnolípidos, cuando crecen sobre fuentes de carbono solubles e insolubles.

Los resúmenes de patente de JAPÓN, vol. 13, nº 61, de 10 de febrero de 1989 y el documento JP-A-63253025 describen el uso de ramnolípidos en el tratamiento de enfermedades inflamatorias cuando se administran por vía oral o parenteral.

FAT. SCI. TECHNOL. vol. 91, nº 9, 1989, páginas 363-366, S. Lang et al.: "Antimicrobial Effects of Biosurfactants" enseña que los ramnolípidos poseen propiedades antimicrobianas, específicamente que pueden evitar el crecimiento de las bacterias Gram-positivas.

J. of antibiotics 1971, vol. 24, nº 12, 1971, páginas 855-859, S Itoh et al., enseña que los ramnolípidos pueden mostrar diversas actividades biológicas in vitro.

Current Microbiol. vol. 10, nº 6, 1984, páginas 323-328, T.R. Shryock et al., describe que el ramnolípido de Pseudomonas estimula tanto la quimiotaxis como la quimiocinesis.

Febs Letters, vol 139, nº 1, 1982, páginas 81-85, T. Hirayama et al., describe metil-ramnolípidos novedosos a partir de Pseudomonas aeruginosa.

El documento DE-A-2 150 375 describe la actividad antivírica del ácido 2-0-9-L-ramnopiranosil-(1-ranmopiranosil)-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico.

Enfermedad de Duhring, lupus eritematoso sistémico, infecciones por Herpes simplex, infecciones por virus del papiloma, ictiosis vulgar, eritrodermia ictiosiforme, queratodermia palmoplantar, epidermólisis ampollosa hereditaria simple y similares.

Preferiblemente, el ramnolípido es un ramnolípido de fórmula general

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1

Los ramnolípidos muy activos se obtienen cuando el ramnolípido es un dirramnolípido.

Cuando el sustituyente R_{2} es hidrógeno, el ramnolípido comprende sólo un grupo lipídico. Cuando el sustituyente R_{2} está formado por el grupo

\delm{C}{\delm{\para}{R _{4} }}

H --- CH_{2} --- COOH,

la molécula de ramnolípido comprende dos unidades lipídicas conectadas entre sí por un enlace éster.

Los sustituyentes R_{3} y R_{4} pueden seleccionarse de grupos alquilo (C_{5}-C_{20}) saturados, mono o poliinsaturados, lineales o ramificados. Se prefieren los grupos alquilo saturados no ramificados que tienen la fórmula general (CH_{2})_{x}-CH_{3}, en la que x = 4 - 19. Más preferiblemente, x = 4 ó 6 para los grupos alquilo.

Se obtiene una preparación farmacéutica muy activa cuando comprende el ramnolípido que es (ácido alfa-L-ramnopiranosil-(1,2)-alfa-L-ramnopiranosil)-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico.

Basándose en un ejemplo no limitativo, se describirá el aislamiento del ramnolípido y el uso en una preparación farmacéutica según la presente invención. En el presente documento se utilizarán los siguientes métodos.

1. Aislamiento y caracterización

A partir de lodos de perforación se han aislado cepas bacterianas, cuyas cepas pueden sintetizar ramnolípidos tanto sobre una fuente de carbono soluble (glucosa) como sobre una fuente de carbono insoluble (glicerol, gasóleo). Estas cepas bacterianas aisladas se han caracterizado como cepas de Pseudomonas (BBL Minitek, Numerical Determination and Identification System, Becton, Dichinson and Company).

2. Concentración y purificación

Los ramnolípidos presentes en el medio debido a una secreción extracelular se han concentrado y purificado utilizando diferentes procedimientos.

a) Precipitación ácida

El pH del sobrenadante se ajustó a pH 1,5-2,0 usando ácido clorhídrico, entonces se evaporó hasta 1/10 del volumen inicial y se dejó durante la noche a 4ºC. El sedimento (0,5-2,0 g/l) se centrifugó a 17.300 x g durante 30 minutos a 4ºC y posteriormente se extrajo usando CH_{2}Cl_{2},se filtró, se evaporó, se resuspendió en agua y se precipitó de nue-
vo.

b) Fraccionamiento de la espuma

Se introdujo aire comprimido en el sobrenadante y la espuma formada se llevó a un recipiente separado o se introdujo en agua acidificada (pH 1,5-2,0).

c) Cromatografía

El sobrenadante se aplicó sobre una columna preparativa (resina Amberlit XAD-8 o XAD-2, Rohm & Haas). La columna se equilibró usando agua y tras la absorción se aclaró con agua. Los compuestos activos se eluyeron usando un alcohol alquílico inferior, tal como etanol y metanol. El disolvente usado se evaporó a vacío y el concentrado se acidificó y precipitó como se describió anteriormente.

3. Detección química y caracterización

Se llevó a cabo de manera analítica una cromatografía en capa fina usando placas de gel de sílice 60F 254 (Merck) y se realizó de manera preparativa usando placas Kemika. Para una separación óptima, pueden utilizarse las siguientes mezclas de disolventes:

CHCl_{3}- MeOH - ácido acético - agua (25:15:4:2; 12:15:4:2; 25:25:4:2)

CHCl_{3}- MeOH - ácido acético (80:15:5)

Hexano - isopropil éter - ácido acético (15:10:1)

CHCl_{3}- MeOH - NH_{4}OH (25%)- agua (65:25:4:2)

Propanol - NH_{4}OH (25%) (4:1)

Ejemplo

Se cultivó Pseudomonas aeruginosa a una temperatura de 32ºC. Los siguientes medios de cultivo fueron muy adecuados para la producción de ramnolípidos.

a): 5 g de glucosa, 5 g de peptona, 2 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de MgSO_{4}. H_{2}O, 3 g de KNO_{3}, 1 ml de disolución de Gottlib y 1 litro de agua.

b): 20 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura, 20 g de CaCO_{3} y 1 litro de agua.

La glucosa puede reemplazarse por glicerol, con lo que se forma un sistema de dos fases. El glicerol proporciona, como una fuente de carbono, un mejor rendimiento en comparación con la glucosa, pero se requiere un procedimiento más complicado. El cambio en la tensión superficial de los medios de cultivo a 28-31 mN/m se midió mediante un tensiómetro de anillo de White. Una disminución en la tensión superficial es un buen indicio del rendimiento al final de la fermentación. La concentración de ramnolípidos se midió de manera espectrofotométrica usando reactivos de antrona. Tras la separación de la biomasa mediante centrifugación, el sobrenadante se sometió a cromatografía en placas de gel de sílice 60 F 254 y en placas Kemika.

La presencia de glucolípidos se demostró usando los siguientes reactivos, alfa-naftol para lípidos, difenilamina para glucolípidos y beta-naftol timol y antrona para hidratos de carbono y oligosacáridos. Usando estos reactivos, se demuestra que los compuestos son del tipo glucolípido. Usando alfa-ciclodextrina, reactivo y colorante para ácidos grasos, se demuestra que la parte lipófila / hidrófila de la molécula consiste en cadenas de ácidos grasos que tienen un número par de átomos de carbono. Se obtuvieron resultados negativos usando reactivos para lípidos insaturados. Usando KMnO_{4} alcalino y AgNO_{3} amoniacal se ha demostrado la presencia de enlaces glucosídicos. Usando hidrólisis alcalina se rompen los enlaces éster entre los ácidos grasos y usando hidrólisis ácida se rompe el enlace O-glucosídico entre un grupo azúcar y el grupo OH de la parte lipídica de la molécula.

Se pasaron 10 volúmenes del sobrenadante que comprendía ramnolípidos a una columna de Amberlit XAD-8 o XAD-2 (Rohm & Haas). La columna se lavó con agua. Los ramnolípidos se eluyeron usando MeOH al 100%. Las fracciones que comprenden los ramnolípidos se evaporaron y se añadieron posteriormente a agua pura. Se añadió HCl 1N para precipitar los ramnolípidos. Los ramnolípidos precipitados se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos. Los ramnolípidos ahora precipitados se lavaron usando agua pura y se centrifugaron posteriormente a 3000 rpm durante 10 minutos. El pH de los lípidos precipitados se ajustó a 7,2 usando NaOH 1/10 N. Tras la liofilización, se disolvieron 10 g de la preparación liofilizada en 50 ml de propanol y se aplicaron en una columna de gel de sílice (HPLC de Waters, 500 ml de volumen) equilibrada con hexano. Las impurezas se eluyeron usando propanol 5 1. Los ramnolípidos se eluyeron usando una mezcla de disolventes que comprendía propanol - NH_{4}OH al 25% (4:1). Las fracciones activas se evaporaron y se disolvieron en agua, se precipitaron de nuevo en HCl 1N, se centrifugaron a 3000 rpm y los precipitados se ajustaron a un pH de 7,2 utilizando NaOH 0,1 N y se liofilizaron.

Los ramnolípidos puros obtenidos se utilizaron para preparar las preparaciones farmacéuticas según la invención. Estas preparaciones pueden contener disoluciones, pomadas, cremas, geles, fluidos, polvos, píldoras y similares.

Dependiendo de la enfermedad que se vaya a tratar, tales como enfermedades dermatológicas, de la gravedad de la enfermedad, de la edad del paciente y similares, las preparaciones farmacéuticas pueden comprender del 0,05 al 10% en peso del ramnolípido activo. Preferiblemente, la concentración de ramnolípido es del 0,1 a 2,0% en peso, más preferiblemente del 0,1 al 1,0% en peso. El límite inferior se determina por la actividad del ramnolípido presente y el límite superior se determina predominantemente desde el punto de vista económico.

Ejemplo de formulación

Se enriqueció una base de pomada usando un 1,0% en peso de ramnolípido. El ramnolípido era ácido (alfa-L-ramnopiranosil-(1,2)-alfa-L-ramnopiranosil)-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico y se identificó usando:

i): datos de ^{1}H y ^{13}C-RMN; y

ii): datos de espectrofotometría de masas.

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2

20

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3

Espectro de masas

m/z : 673 [M + H + Na]^{-}

m/z : 695 [M + H + 2Na]^{+}

m/z : 525 [M - C_{10}H_{18}O_{2} + 2Na]^{+} menos el lípido terminal

m/z : 379 [M - C_{10}H_{18}O_{2} - ramnosa + 2Na]^{+} menos el lípido terminal y ramnosa

Para pacientes humanos, las siguientes enfermedades dermatológicas se trataron usando la preparación según el ejemplo de formulación: psoriasis pustulosa, neurodermatitis crónica multilocular, liquen rojo plano y acné papulopustulosa. El tratamiento en las superficies cutáneas afectadas durante un periodo de aproximadamente dos semanas dio como resultado una desaparición sustancialmente total de las características de las enfermedades dermatológicas.

Claims

1. Uso de un ramnolípido de fórmula general:

4

en la que

R_{1} = H, alfa-L-ramnopiranosilo;

R_{2} = H,

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---

\delm{C}{\delm{\para}{R _{4} }}

H --- CH_{2} --- COOH;

R_{3} = alquilo (C_{5}-C_{20}) saturado, mono o poliinsaturado;

R_{4} = alquilo (C_{5}-C_{20}) saturado, mono o poliinsaturado; para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de acné vulgar, dermatitis alérgica de contacto, neurodermatitis circunscrita multilocular, neurodermatitis difusa, neurodermatitis eritrodérmica, neurodermatitis crónica circunscrita unilocular, neurodermatitis verrugosa, neurodermatitis infantil, prúrigo crónico, acné rosacea, psoariasis vulgar, liquen rojo plano, dermatitis numular eccematosa, epidermólisis ampollosa hereditaria distrófica recesiva, dermatitis seborréica, eritema nodoso, pénfigo vulgar, dermatitis herpetiforme o enfermedad de Duhring, Lupus eritematoso sistémico, ictiosis vulgar, eritrodermia ictiosiforme, queratodermia palmoplantar, epidermólisis ampollosa hereditaria simple.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que

R_{3} = -(CH_{2})_{x}-CH_{3},

\hskip0.3cm

y

\hskip0.3cm

x = 4 - 19.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que

x = 4 ó 6.

4. Uso según la reivindicación 2 ó 3, en el que

R_{4}= -(CH_{2})_{x},

\hskip0.3cm

y

\hskip0.3cm

x = 4 - 19.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que

X = 4 ó 6.

6. Uso según la reivindicación 1 - 5, en el que

R_{1}= alfa-L-ramnopiranosilo.

7. Uso según la reivindicación 2 - 6, en el que x = 6.

8. Uso según la reivindicación 1 - 7, en el que

R_{2} = ---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{\hskip-0.25cm(CH _{2} ) _{y} }{\delm{\para}{\hskip-0.125cmCH _{3} }}}}

H --- CH_{2} --- COOH;

e y = 4 – 19.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que

Y = 4 ó 6.

10. Uso según la reivindicación 1 - 9, en el que el ramnolípido es ácido (alfa-L-ramnopiranosil-(1,2)-alfa-L-ramnopiranosil)-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico.

11. Uso según la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de psoriasis.

12. Uso según la reivindicación 10 para la para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de liquen rojo plano, dermatitis alérgica de contacto, dermatitis numular eccematosa, neurodermatitis circunscrita multilocular e ictiosis vulgar.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento tiene una concentración de ramnolípido del 0,05 al 10% en peso de ramnolípido activo.