ES2235156T3 - Expresion y purificacion de alfa-fetoproteina humana clonada. - Google Patents
Expresion y purificacion de alfa-fetoproteina humana clonada.Info
- Publication number
- ES2235156T3 ES2235156T3 ES93915109T ES93915109T ES2235156T3 ES 2235156 T3 ES2235156 T3 ES 2235156T3 ES 93915109 T ES93915109 T ES 93915109T ES 93915109 T ES93915109 T ES 93915109T ES 2235156 T3 ES2235156 T3 ES 2235156T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fetoprotein
- afp
- baselineskip
- expression
- human alpha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 6
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 108010033448 rat alpha-fetoprotein receptor Proteins 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 101100012848 Rattus norvegicus Afp gene Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101100012844 Homo sapiens AFP gene Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 229910004861 K2 HPO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012721 SDS lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150106875 malE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
EN GENERAL, LA INVENCION CARACTERIZA UN METODO PARA PRODUCIR UNA ALFA-FETOPROTEINA HUMANA EN CELULAS PROCARIOTICAS. EL METODO INCLUYE: SUMINISTRAR UNA CELULA PROCARIOTICA TRANSFORMADA QUE INCLUYA UNA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE QUE CODIFIQUE LA ALFAFETOPROTEINA HUMANA OPERABLEMENTE UNIDA A ELEMENTOS DE SECUENCIA CAPACES DE DIRIGIR LA EXPRESION DE LA ALFA-FETOPROTEINA, Y PERMITIR QUE LA CELULA TRANSFORMADA EXPRESE LA ALFA-FETOPROTEINA HUMANA.
Description
Expresión y purificación de
alfa-fetoproteína humana clonada.
El campo de la invención es la expresión y la
purificación de alfa-fetoproteína humana
clonada.
La alfa-fetoproteína (AFP) es una
proteína sérica que normalmente se encuentra en niveles importantes
en sangre fetal. En sangre adulta, unos elevados niveles de
alfa-fetoproteína están asociados a la regeneración
del hígado y ciertos carcinomas.
No se conoce la función específica de la
alfa-fetoproteína. Papeles sugeridos para la
proteína incluyen: albúmina fetal; protección de ataque inmune
materno; y protección del estrógeno materno.
Morinaga y otros (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80:4604, 1983) presentan la clonación de AFP humana.
Innis y otros (Arch. Biochem. Biophys.
195:128, 1979) presentan la clonación de un fragmento de
aproximadamente 950 pares de bases de AFP humana en E. coli
plásmido pBR322.
Nishi y otros (J. Biochem. 104:968, 1988)
presentan la expresión de AFP de ratas en E. coli y
Saccharomyces Cerevisiae. Nishi y otros también informan de
que, en un ensayo de unión de estradiol, rAFP de rata producido por
levadura es tan como activo una AFP auténtica, mientras que la rAFP
de rata producida por bacterias es esencialmente inactiva. Además,
cuando se caracteriza por ensayo radio inmunológico o una prueba de
Ouchterlony de doble inmunodifusión, la rAFP de rata producida por
levadura tiene un parecido más cercano a la AFP de rata auténtica
que la rAFP de rata producida por bacterias. Nishi y otros indican
que:
"En la prueba de Ouchterlony de doble
inmunodifusión, la rAFP auténtica y de levadura formó una línea de
precipitina completamente fundida con anticuerpo para AFP de rata
mientras que la rAFP de E. coli mostró una reacción de
identidad parcial en una prueba similar. Es probable que la rAFP de
levadura funcionalmente activa en este estudio tuviera los pares
correctos de puentes disulfuro. Por otra parte, la rAFP de E.
coli probablemente no consiguió formarlos."
Yamamoto y otros (Life Sciences 46:1679,
1990) presentan la expresión de AFP humana en la levadura e
informan que la rAFP producida así era "inmunológicamente
indistinguible de AFP auténtica".
Giuliani y otros (Protein Engineering
2:605, 1989) presentan la expresión de una parte de AFP humana
(aminoácidos 38 a 119) en E. coli.
La solicitud de Patente Japonesa nº 88158596
presenta un procedimiento para preparar dominio humano recombinante
I AFP en E. coli.
En general, la invención dispone un procedimiento
para producir alfa-fetoproteína humana en una
célula procariota. El procedimiento incluye disponer una célula
procariota transformada que incluye una molécula de ADN
recombinante que codifica alfa-fetoproteína humana
unida operativamente a un elemento de control de expresión capaz
de dirigir la expresión de la alfa-fetoproteína
humana, y permitir que la célula transformada exprese
alfa-fetoproteína humana. En una realización
preferida, la célula procariota es E. coli. En realizaciones
más preferidas, el elemento de control de expresión incluye un
estimulador Trp de E. coli y el elemento de control de
expresión incluye un estimulador Tac de E. coli.
En un aspecto relacionado, la invención dispone
también alfa-fetoproteína humana substancialmente
pura producida disponiendo una célula procariota transformada que
incluye una molécula de ADN recombinante que codifica
alfa-fetoproteína humana unida operativamente a un
elemento de control de expresión capaz de dirigir la expresión de la
alfa-fetoproteína humana, y permitiendo que la
célula transformada exprese alfa-fetoproteína
huma-
na.
na.
En un aspecto relacionado, la invención presenta
una composición terapéutica que comprende
alfa-fetoproteína substancialmente pura producida
tal como se describe anteriormente.
Por "alfa-fetoproteína
humana" se entiende un polipéptido que tiene substancialmente la
misma secuencia de aminoácidos que la proteína codificada por el
gen de alfa-fetoproteína humana. Moringa y otros
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4604, 1983) presenta la
secuencia de ADNc complementaria a la
alfa-fetoproteína humana.
Por "elemento de control de expresión" se
entiende una sucesión de nucleótidos que incluye secuencias de
reconocimiento para factores que controlan la expresión de una
secuencia de codificación de proteínas a la cual está unida
operativamente. En consecuencia, un elemento de control de
expresión incluye generalmente secuencias para controlar tanto la
transcripción como la traducción, por ejemplo, estimuladores,
sitios de enlace de ribosomas, sitios de enlace de represores, y
sitios de enlace de activadores.
Por "substancialmente la misma secuencia de
aminoácidos" se entiende un polipéptido que presenta por lo
menos una homología de un 80% con la secuencia de aminoácidos de
origen natural de la alfa-fetoproteína humana,
típicamente de una homología de por lo menos un 85% aproximadamente
con la secuencia de alfa-fetoproteína humana
natural, más típicamente de una homología de por lo menos un 90%
aproximadamente, normalmente de una homología de por lo menos un
95% aproximadamente, y más normalmente de una homología de por lo
menos un 97% aproximadamente con la secuencia de
alfa-fetoproteína humana natural. La longitud de
las secuencias de comparación será generalmente de por lo menos 16
aminoácidos, normalmente de por lo menos 20 aminoácidos, más
normalmente de por lo menos 25 aminoácidos, típicamente de por lo
menos 30 aminoácidos, y preferiblemente de más de 35
aminoácidos.
La homología, para los polipéptidos, se mide
típicamente utilizando un software de análisis de secuencias (por
ejemplo, el Paquete de Software de Análisis de Secuencias del
Genetics Computer Group, de la Universidad del Centro de
Biotecnología de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI
53705). El software de análisis de proteínas empareja secuencias
similares asignando grados de homología a varias substituciones,
deleciones, substituciones, y otras modificaciones. Las
substituciones conservadoras incluyen típicamente substituciones
dentro de los grupos siguientes: glicina alanina; valina,
isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico,
esparraguina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y
fenilalanina, tirosina.
Tal como aquí se utiliza, el término
"substancialmente puro" describe una proteína o polipéptido
que ha sido separado de los componentes que lo acompañan de manera
natural. Típicamente, una proteína de interés es substancialmente
pura cuando por lo menos de un 60% a un 75% de la proteína total en
una muestra es la proteína de interés. Variantes o modificaciones
químicas menores comparten típicamente la misma secuencia de
polipéptidos. Una proteína substancialmente pura comprenderá
típicamente más de 85 a 90% aproximadamente de proteína en la
muestra, normalmente comprenderá más de por lo menos
aproximadamente un 95%, y preferiblemente tendrá una pureza de por
encima de aproximadamente un 99%. Normalmente, la pureza se mide
en una columna de cromatografía, gel de poliacrilamida, o por
mediante un análisis de HPLC.
Una proteína está substancialmente libre de
componentes asociados de manera natural cuando está separada de
contaminantes nativos que la acompañan en su estado natural. De
este modo, una proteína que se sintetiza químicamente o se produce
en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina
de manera natural estará substancialmente libre de sus componentes
asociados de manera natural. De este modo, el término puede
emplearse para describir polipéptidos y ácidos nucleicos derivados
de organismos eucariotas que han sido sintetizados en E.
coli y otros procariotas.
La presente invención propone
alfa-fetoproteína humana substancialmente pura.
Pueden concebirse diversos métodos para el aislamiento del AFP
humano a partir de material biológico, en parte en base a las
propiedades estructurales y funcionales de la
alfa-fetoproteína humana. Alternativamente, los
anticuerpos anti-AFP pueden inmovilizarse sobre un
substrato sólido para generar una columna de afinidad altamente
específica para la purificación de AFP
humano.
humano.
Además de polipéptidos substancialmente de
longitud total, la presente invención propone fragmentos
recombinantes biológicamente activos de
alfa-fetoproteína. Por ejemplo, fragmentos activos
de unión del ligando o inmunosupresión.
Los fragmentos de ADN natural o sintético que
codifican para la alfa-fetoproteína humana o un
fragmento deseado de la misma se incorporarán en estructuras de ADN
capaces de la introducción a un cultivo de células y de la
expresión en el mismo. Estructuras de ADN preparadas para la
introducción en dichos hospedadores incluirán típicamente un origen
de repetición que puede utilizar la célula hospedadora, un
fragmento de ADN que codifica la parte deseada de la
alfa-fetoproteína humana, secuencias de
transcripción reguladoras de iniciación traslacional unidas
operativamente al segmento que codifica la
alfa-fetoproteína, y secuencias de transcripción y
terminación traslacional reguladoras unidas operativamente al
segmento que codifica la alfa-fetoproteína. Las
secuencias reguladoras de transcripción incluirán típicamente un
estimulador heterólogo que es reconocido por el hospedador. La
selección de un estimulador apropiado dependerá del hospedador, si
bien pueden utilizase estimuladores tales como trp, tac y fago
estimuladores, estimuladores de tRNA y estimuladores de enzimas
glicolíticos bajo circunstancias apropiadas (Sambrook y otros eds.,
Molecular Closing; Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). En algunos casos puede ser
deseable incluir secuencias de reconocimiento situadas
adecuadamente para factores capaces de regular la transcripción en
la célula hospedadora (por ejemplo, el represor lac de E.
coli). Pueden utilizarse vectores de expresión disponibles en
el mercado que incluyen el sistema de replicación y secuencias de
transcripción y de translación reguladoras junto con sitios
apropiados para la inserción de un fragmento de ADN que codifica el
gen que se ha de expresar.
Los distintos estimuladores, de transcripción, y
de traducción descritos anteriormente se denominan generalmente
como "elemento de control de expresión".
\newpage
También es posible integrar un fragmento de ADN
que codifica todo o parte de la AFP humana en el cromosoma de la
célula hospedadora.
Los vectores que contienen los segmentos de ADN
de interés pueden transferirse a la célula hospedadora por métodos
muy conocidos, que varían en función del tipo de hospedador celular
(Sambrook y otros, supra). El término "célula transformada"
significa que también incluye la descendencia de una célula
transformada.
Hospedadores procariotas útiles para la expresión
de alto nivel de proteínas recombinantes incluyen: distintas cepas
de E. coli, Bacilus Subtilis, y
Pseudomonas.
El procedimiento de la invención dispone un medio
a través del cual se generan grandes cantidades de
alfa-fetoproteína humana que presenta una actividad
biológica. La AFP producida de acuerdo con el procedimiento de la
invención presenta actividad biológica a pesar del hecho de que no
se modifica de la misma manera que la AFP humana de origen
natural.
Otras características y ventajas de la invención
serán claras a partir de la siguiente descripción de las
realizaciones preferidas, y de las reivindicaciones.
Se construyó una biblioteca de ADNc fraccionada
en tamaños (0,5-3 kb) preparada a partir de ARN
poli(A)^{+} aislado de células de hígado (\sim3
gramos de peso húmedo) de un aborto humano de 4,5 meses.
(Alternativamente, puede obtenerse una biblioteca de ADNc fetal de
Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). El ARN total se
preparó mediante el procedimiento de tiocianato de guanidio
(Chirgwin y otros, Biochemistry 18:5294, 1979), y se
seleccionó mARN por cromatografía de oligo
DT-celulosa (Collaborative Research, Bedford, MA).
(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros,
eds., Wiley Interscience, Nueva York, 1989). Se sintetizó ADNc
utilizando el kit de síntesis de ADNc Librarían II (Invitrogen, San
Diego, CA) y se fraccionó sobre un gel de azarosa a 1%. Se
extrajeron fragmentos de 0,5 a 3 kb y se ligó al vector
pTZ18-RB (Invitrogen), y se utilizó para
transformar E. coli. DH1\alphaF' (Invitrogen) competente.
Se llevó a cabo un procedimiento colony lifts con filtros
Colony/Plaque Screen (DuPont, Wilmington, DE), y las
colonias bacterianas transferidas fueron lisadas y desnaturalizados
mediante incubación en una solución de 0,5M NaOH, 1,5M NaCl durante
10 minutos. Los filtros se lavaron durante 5 minutos en 1,5M NaCl,
0,50M Tris-HCl (pH 7,6), y se secó al aire. Después
se lavaron los filtros 5 veces en cloroformo, se impregnaron en
0,3M NaCl para eliminar residuos celulares, y después se secó al
aire. El ADN se fijó a la nitrocelulosa calentando a 80º en vacío
durante 2 horas. Los filtros calentados fueron prehibridados
durante 3 horas a 37ºC en 6X SCC (1X SSC= 150 mM NaCl, citrato de
sodio 15 mM [pH 7,0]), 1X solución de Denhardt (0,2
polivinilpirrolidona, 0,2 gil ESA, 0,2 Ficoll 400), 0,05%
pirofosfato de sodio, 0,5% SDS, y 100 \mug/ml ADN E. coli.
La hibridación se realizó durante 18-24 horas a
37ºC en la misma solución sin SDS, que contenía 1-2
x 10^{6} cpm/ml de dos oligonucleótidos marcados con ^{32}P
mediante fosforilación del extremo 5' (Current Protocols in
Molecular Biology, supra). La secuencia de los
oligonucleótidos utilizada para explorar la biblioteca:
51-TGTCTGCAGGATGGGGAAAAA-3' (ID.
SEQ. nº: 1) y 5'-CATGAAATGACTCCAGTA- 3' (ID. SEQ.
nº: 2), corresponden a las posiciones 772 a 792 y a las posiciones
1405 a 1422 de la secuencia de codificación de AFP humana,
respectivamente. Los filtros se lavaron dos veces durante 30
minutos a 37ºC con 6X SSC, 0,05% pirofosfato de sodio y una vez
durante 30 minutos 48ºC en la misma solución. Los filtros secos
fueron expuestos a películas Kodak XAR en presencia de pantallas
intensificadoras de Du Pont Cronex Lightning Plus durante
24-48 horas para identificar clones positivos. Los
clones positivos fueron aislados, amplificados, y sometidos a
análisis de Southern blot (Current Protocols in Molecular
Biology, supra). Brevemente, se hidrolizó ADN purificado
con los enzimas de restricción apropiados, y los fragmentos
resultantes se resolvieron en gel de agarosa al 1%. El ADN fue
transferido después a una membrana de nitrocelulosa. Las
condiciones de hibridación fueron tal como se ha descrito
anteriormente excepto en que se utilizó un tercer oligonucleótido
marcado con ^{32}P
(5'-CATAGAAATGAATATGGA-3' (ID. SEQ.
nº: 3), representando las posiciones 7 a 24 de la zona que codifica
la AFP humana) además de las otras dos sondas descritas
anteriormente. Se identificaron cinco clones positivos entre las
3.000 colonias cribadas. Se utilizó un clon, el pLHuAFP, en la
configuración que se describe a continuación.
Se creó una estructura que contiene un codon de
iniciación de traducción seguido de la secuencia de codificación de
la AFP humana y un codon de terminación de traducción utilizando los
siguientes cinco fragmentos de ADN.
Fragmento 1: Se calentaron dos oligonucleótidos
no fosforilados para formar una molécula de ADN de doble cadena que
consiste en un sitio de reconocimiento de EcoRI cohesivo del
extremo 5', seguido de un codon de iniciación ATG y los primeros 60
bp del ADNc de AFP humana hasta el sitio de restricción PstI (e
inclusive) localizado en la posición 60 en la secuencia de
codificación. (En este esquema, el nucleótido 1 es el primer
nucleótido del primer codon (Thr) en la proteína madura y
corresponde al nucleótido 102 de Morinaga y otros, supra).
Este fragmento fue ligado a pUC119 (pUC19 con la zona intergénica
de M13 desde HgiA I en 5465 hasta AhaII en 5941 insertados en el
sitio Nde I del pUC19) linearizado con Eco RI y Pst I. El ADN
resultante fue amplificado en E. coli NM522 (Pharmacia,
Piscataway, NJ). La inserción de EcoRI-PstI se
recuperó por digestión enzimática del plásmido recombinante seguida
de separación electroforética en gel de poliacrilamida al 5% y el
aislamiento del gel.
Fragmento 2: Se obtuvo un fragmento de 97 bp de
ADNc de AFP humana (posiciones 57 a 153) por digestión de pLHuAFP
con PstI y NsiI y gel purificando tal como se ha descrito
anteriormente. Este clon contiene toda la zona de codificación de
AFP humana así como las secuencias no traducidas 5' y 3'.
Fragmento 3: Se obtuvo un fragmento de 224 bp de
ADNc de AFP humana (posiciones 150 a 373) por digestión de pLHuAFP
con NsiI y AlwNI y purificando como descrito anteriormente.
Fragmento 5: Se calentaron dos oligonucleótidos
no fosforilados para formar 86 bp de ADN de doble cadena que
contiene la secuencia de AFP humana desde la posición 1693 en el
sitio de Styl al codon de terminación TAA que termina la zona de
codificación de la AFP en la posición 1773, seguido de sitio de
BamHI cohesivo. Este ADN sintético se utilizó sin más
manipulaciones.
Se hidrolizó pBlueScript (StrataGene, La Jolla,
CA) completamente con EcoRI y BamHI, y se añadió a la mezcla de
ligación que contenía los cinco fragmentos purificados descritos
anteriormente. Una ligación de control contenía solamente
pBluescript linearizado. Se utilizaron partes de estas dos mezclas
de ligación para transformar el E. coli DH5\alpha
competente (GIBCO/BRL, Grand Island, NY). Los plásmidos
recombinantes fueron aislados de varios transformantes y fueron
cribados mediante análisis de enzima de restricción extensivo y
secuenciación de ADN. Se seleccionó un plásmida recombinante y se
designó como pHuAFP. Se utilizó para la posterior inserción del gen
de AFP humana en varios vectores de expresión. El pHuAFP incluye
un único fragmento de EcoRI-BamHI que contiene la
secuencia de codificación completa para la AFP humana además de un
codon de partida ATG en el extremo 5' y un codon final TAA en el
extremo 3'.
Se consiguió con éxito una síntesis de alto nivel
de AFP humana en E. coli en tres sistemas de expresión
diferentes. El sistema TRP proporcionó una expresión directa. El
sistema RX1 produjo una proteína de fusión que contenía 20
aminoácidos codificados por trpE y secuencias de vectores. El
sistema MAL expresó AFP fundido al producto gen malE, una proteína
de unión a maltosa de 42 kd.
Sistema de Expresión TRP: El fragmento de
codificación de AFP EcoRI-BamHI de 1186 bp del
pHuAFP se clonó en el vector de expresión pTrp4 (Olsen y otros,
J. Biotechnol. 9:179, 1989) curso abajo del estimulador trp y
un sitio de unión d ribosomas modificado.
Brevemente, el pHuAFP fue digerido con EcoRI y
BamHI, y los extremos se llenaron utilizando polimerasa de Klenow.
El fragmento de AFP de 1186 bp se purificó después en gel. El pTrp4
fue diferido en Clal, los extremos se llenaron utilizando
Polimerasa de Klenow, y el vector linearizado fue purificado en
gel. El fragmento de AFP de 1186 bp y la parte principal del pTrp4
fueron ligados y se utilizaron para transformar E. coli
competente de las cepas siguientes: DH5\alpha, BL21 (F. W.
Studier, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY), SG927
(American Type culture Collection, Rockville, Md.: Acc. nº 39627),
SG928 (ATCC Acc. Nº 39628), y SG935 (ATCC Acc. nº 39623).
Sistema de Expresión RX1: Se clonó ADNc de AFP
humana en el vector de expresión pRX1 (Rimm y otros, Gene 75:323,
1989) adyacente al estimulador trp y en el marco de traducción de
TrpE. El ADNc de AFP humana se suprimió del pHuAFP por digestión
con EcoRI y BamHI y se clonó en pRX1 tratado adecuadamente (BioRad
Laboratories, Hércules, CA). Las cepas E. coli descritas
anteriormente y CAG456 (D. W. Cleveland, Johns Hopkins University,
Baltimore, MD) se transformaron después con la última configuración
de plásmido identificada como pRX1/HuAFP.
Sistema de Expresión MAL: El ADNc de AFP se
insertó en el vector de expresión pMAL (New England Biolabs, Inc.,
Beverly, MA) bajo el control del estimulador tac y en el marco de
traducción de malE. Brevemente, el pHuAFP fue hidrolizado con BamHI
y los extremos fueron suavizados utilizando polimerasa de Klenow.
El ADNc de AFP humana fue liberado del resto del ADN plásmido por
digestión de EcoRI y después se purificó en gel. El fragmento
purificado fue ligado al pMAL-C digerido
apropiadamente. Se utilizó un plásmido recombinante orientado
correctamente, designado pMAL/HuAFP, para transformar E.
coli DH5\alpha, TBI (New England Biolabs) y SG935.
La zona de codificación de AFP utilizada en la
configuración de los tres vectores de expresión fue secuenciada y
se encontró que codificaba AFP de longitud total.
Se incubaron cultivos bacterianos a 30ºC o 37ºC
con aireación. Los cultivos durante la noche de E. coli
crecieron en un medio LB complementado con los antibióticos
apropiados según fue necesario (era tetraciclina-HCl
a 50 \mug/ml, y ampicilina-Na a 100
\mug/ml).
Sistemas de Expresión TRP y RX1: El estimulador
trp fue inducido bajo condiciones de inanición de triptófano. La
inducción se realizó en un medio M9CA preparado tal como sigue: se
añadió 1 g de ácidos Casamino (Difco Laboratories, Detroit, MI), 6
g de Na_{2}HPO_{4}, 3 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de NaCl, 1 g
de NH_{4}Cl a un litro de agua milli-Q (Millipore
Corp., Bedford, MA), el pH se reguló a 7,4 y la solución de dispuso
en autoclave. El medio enfriado se hace MgSO_{4} 2 mM, CaCl_{2}
0,1 mM, y 0,2% glucosa. Después de una dilución de 100 partes de un
cultivo por la noche en M9CA complementado con antibióticos, las
células crecieron a 30ºC a A550 de 0,4, se cultivaron por
centrifugado, y se guardaron en forma de pellets a -20ºC.
Sistema de Expresión MAL: El estimulador tac fue
inducido con el inductor gratuito IPTG. Se diluyeron los cultivos de
noche en 100 partes en un medio LB complementado con antibióticos,
y las células crecieron a 37ºC a A550 de 0,4. Se añadió después
IPTG a una concentración final de 0,3 mm, y las bacterias se
incubaron 2 horas adicionales. Las células se cultivaron entonces
por centrifugado y se guardaron en forma de pellets a -20ºC.
Se llevaron a cabo estudios analíticos para
determinar la expresión y el comportamiento de AFP recombinante.
Los pellets de células fueron suspendidos en una solución de lisis
SDS (0,16M Tris-HCl [pH 6,8], 4% w/v SDS, 0,2M DTT,
20% glicerol, 0,02% azul de bromofenol), calentado durante 5
minutos, y utilizada para el análisis mediante
SDS-PAGE o bien fueron suspendidos en un buffer de
lisis que consistía en Na_{2}HPO_{4} 10 mM, NaCl 30 mM, 0,25%
Tween 20, EDTA 10 mM, EGTA 10 mM y se incubó con 1 mg/ml de
lisozima a 4ºC durante 30 minutos antes de sonicación en modo
pulsado para 3 x 1 minutos al 50% de potencia (Sonics and
Materials, Danbury, CT: sonificador modelo VC300). El lisado se
centrifugó a 10.000 g durante 20 minutos, y el sobrenadante que
contiene la proteína soluble fue decantado en un tubo de prueba
separado y se congeló a -20ºC hasta su uso. El pellet que contiene
la proteína insoluble fue resuspendido en el buffer de lisis SDS,
se calentó durante 5 minutos y se mantuvo a -20ºC hasta su uso. Se
analizó la proteína total liberada en el buffer de lisis SDS, así
como fracciones solubles y de pellets mediante
SDS-PAGE y detección inmunológica tras una
transferencia western blot. En estos estudios se examinaron de
manera rutinaria geles con azul de Coomassie con un vídeo
densitómetro (BioRad, modelo 620). Esto permitió una valoración
cualitativa de la cantidad de AFP recombinante producido como un
porcentaje de la proteína celular total.
Todos los procedimientos se llevaron a cabo a
4ºC, salvo que se indique lo contrario. Cada pellet de células
congelado a partir de cultivo de un litro fue resuspendido en 25 ml
de buffer A de lisis, Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], 20%
sacarosa, 100 \mug/ml lisozima, 10 \mug/ml PMSF), y se incubó
durante 10 minutos. Se añadió EDTA a una concentración final de 35
mM; y el extracto se dejó reposar otros 10 minutos. Tras la adición
de 25 ml de buffer B de lisis (Tris-HCl 50 mM [pH
7,5], EDTA 25 mM, 0,2% Tritón X-100), el lisado se
incubó 30 minutos adicionales. El lisado celular fue centrifugado a
12.000 g durante 20 minutos, y el precipitado que contiene la AFP
recombinante se lavó dos veces con 50 ml de buffer de lavado
(Tris-HCl 50 mM [pH 8,0], EDTA 10 mM, 0,2% Tritón
X-100), seguido cada vez por centrifugado tal como
se ha especificado anteriormente. El precipitado se disolvió en 50
ml de Buffer de desnaturalización (0,1M K_{2}HPO_{4} [pH 8,5],
6M guanidina-HCl, 0,1M
2-mercaptoetanol), sonicado, y después se mezcló en
un Nutator (Clay Adams) durante 4 horas. El extracto solubilizado
fue diluido en 50 partes en Tris-HCl 50 mM, NaCl
100 mM, EDTA 1 mM, y la proteína de AFP recombinante se dejó
renaturalizar 24 horas. Esta etapa de dilución de 50 partes es
importante ya que antes de la dilución la AFP parece estar
microagregada. Después de la dilución y la reconcentration, la AFP
no está agregada. La solución se concentró en 100 partes en
membranas YM10 utilizando una unidad de filtración Amicon, y se
aclaró mediante un filtro de membranas Millex 0,22 \mum
(Millipore). La AFP recombinante se purificó también a temperatura
ambiente en una columna Mono Q (Pharmacia) y se equilibró en
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) con proteínas enlazadas
eluídas utilizando un gradiente lineal de 0-100%
NaCl 1M, Tris-HCl 2 mM (pH 8,0). Los fragmentos
fueron analizados mediante SDS-PAGE, APAGE, y
Western blotting.
Se llevó a acabo una SDS-PAGE en
un sistema de buffer discontinuo y una PAGE alcalina según Hames y
otros (Gel Electrophoresis of Proteins: A Practicak
Approach, IRL Press, London, 1981) empleando el aparato de
electroforesis mini-Protean (BioRad). La detección
inmunológica de AFP humano recombinante tras una
SDS-PAGE o APAGE se llevó a cabo impregnando los
geles en buffer de transferencia (Tris-HCl 12,5 mM,
glicina 96 mM, 20% metanol [pH 8,2]) durante 15 min. Después se
estratificaron los geles individuales con una membrana Immobilon
PVDF (Millipore) y se intercalaron entre las redes de electrodos
del dispositivo de transferencia mini-Protean
(BioRad), con los geles adyacentes al cátodo. El sistema se
sumergió en buffer de transferencia, y se aplicó una corriente de
150 MA durante 2 horas. Los sitios sin reaccionar en las láminas
de Immobilon PVDF fueron bloqueados en Tris-HCl 20
mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, 3% gelatina durante 1 hora. Se empleó
antisuero de AFP antihumano de conejo y anticuerpos IgG de
anticonejo de cabra conjugados a fosfatasa alcalina (BioRad) como
anticuerpo principal y secundario, respectivamente. La actividad de
la fosfatasa alcalina se detectó utilizando
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato y p-nitroazul de tetrazolio
(Bio-Rad).
El AFP humano recombinante fue cuantificado
utilizando un kit de ELISA de AFP humana (Abbott Laboratories,
Chicago, IL).
El rendimiento de la AFP se estimó examinando
geles con tinción de plata. Cuando las células SG935 se transforman
con el plásmido que codifica la AFP que utiliza el sistema de
expresión Trp, la AFP representa de un 2 a un 5% de proteína E.
coli celular total (aproximadamente 3-7 mg de
AFP por litro de cultivo). Tal como se ha descrito anteriormente,
la mayoría de la AFP en el extracto inicial es insoluble. El
procedimiento de resolubilization descrito anteriormente permite una
recuperación de 50-60% de AFP en forma de AFP
monomérica estable y semipurificada (rendimiento aproximado 50
mg/20 l de E. coli). Esto puede purificarse además para dar
25 mg de AFP monomérica puro.
Se realizaron degradaciones Edman
automáticas utilizando un microsecuenciador de fase gas
proteína/péptido Porton con un HPLC microbore integrado
personalizado para optimizar la secuencia. El análisis de
secuencias de proteínas fue asistido mediante el uso de programas
seleccionados dentro del paquete de software PC/Gen
(Intelligenetics).
Puede utilizarse AFP humano recombinante y
fragmentos de la misma producidos por células procariotas para
estándares de diagnósticos y para usos terapéutico.
Puede administrarse AFP recombinante y fragmentos
de la misma en una cantidad eficaz, solo o en combinación con un
excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los
polipéptidos y composiciones pueden administrarse solos o en
combinación con otros agentes terapéuticos a través de cualquier
medio apropiado, por ejemplo por vía intravenosa, oral,
intramuscular o intranasal.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Murgita, Robert A.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Expresión y Purificación de Alfa-Fetoproteína Humana Clonada
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fish & Richardson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 225, Franklin Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PÁIS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02110-2804
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO ELECTRÓNICO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco 3,5'', 1,44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2 Modelo 50Z o 55SX
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: IMB P.C. DOS (Versión 3.30)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect (Versión 5.0)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/767.435
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 27 de Septiembre de 1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Paul T. Clark
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Nº de REGISTRO: 30.162
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº de REFERENCIA/SUMARIO: 04844/002001
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617)-542-5070
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617)-542-8906
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: 200154
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA INDENTIFICACIÓN DE
SECUENCIA NÚMERO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SECUENCIA nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCTGCAGG ATGGGGAAAAA
\hfill
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA INDENTIFICACIÓN DE
SECUENCIA NÚMERO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SECUENCIA nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGAAATGA CTCCAGTA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA INDENTIFICACIÓN DE
SECUENCIA NÚMERO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TRENZADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SECUENCIA nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATAGAAATG AATATGGA
\hfill
Claims (6)
1. Procedimiento para producir
alfa-fetoproteína humana biológicamente activa en
una célula procariota, que comprende
disponer una célula procariota transformada que
incluye una molécula de ADN recombinante que codifica la citada
alfa-fetoproteína humana unida operativamente a un
elemento de control de expresión capaz de dirigir la expresión de
dicha alfa-fetoproteína humana,
cultivar dicha célula transformada, y purificar
la citada alfa-fetoproteína humana.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado en que dicha célula procariota es E.
coli.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado en que dicho elemento de
control de expresión comprende un estimulador Trp de E.
coli.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado en que dicho elemento de
control de expresión comprende un estimulador Tac de E.
coli.
5. Alfa-fetoproteína humana
substancialmente pura producida mediante el procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Composición terapéutica que comprende la
alfa-fetoproteína substancialmente pura producida de
la reivindicación 5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76743591A | 1991-09-27 | 1991-09-27 | |
| PCT/US1992/008317 WO1994010199A1 (en) | 1991-09-27 | 1992-10-30 | Expression and purification of cloned human alpha-fetoprotein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2235156T3 true ES2235156T3 (es) | 2005-07-01 |
Family
ID=26785055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES93915109T Expired - Lifetime ES2235156T3 (es) | 1991-09-27 | 1992-10-30 | Expresion y purificacion de alfa-fetoproteina humana clonada. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5384250A (es) |
| EP (1) | EP0749441B1 (es) |
| JP (1) | JPH08511677A (es) |
| AT (1) | ATE285416T1 (es) |
| CA (1) | CA2120131A1 (es) |
| DE (1) | DE69233463T2 (es) |
| ES (1) | ES2235156T3 (es) |
| WO (1) | WO1994010199A1 (es) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6288034B1 (en) | 1995-01-24 | 2001-09-11 | Martinex R & D Inc. | Recombinant human alpha-fetoprotein as an immunosuppressive agent |
| US6331611B1 (en) | 1991-09-27 | 2001-12-18 | Mcgill University | Expression and purification of cloned human alpha-fetoprotein |
| US5965528A (en) * | 1991-09-27 | 1999-10-12 | Mcgill University | Recombinant human alph-fetoprotein as an immunosuppressive agent |
| US5674842A (en) * | 1994-10-26 | 1997-10-07 | Health Research, Incorporated | Growth inhibitory peptide |
| US7101837B1 (en) | 1995-01-24 | 2006-09-05 | Martinex R & D Inc. | Recombinant human alpha-fetoprotein as a cell proliferative agent |
| WO1996022787A1 (en) * | 1995-01-24 | 1996-08-01 | Murgita Robert A | Recombinant human alpha-fetoprotein and uses thereof |
| US6534479B1 (en) | 1995-01-24 | 2003-03-18 | Martinex R & D Inc. | Recombinant alpha-fetoprotein hybrid cytotoxins for treating and diagnosing cancers |
| US5866329A (en) * | 1995-09-27 | 1999-02-02 | Demetriou; Achilles A. | Method and probe for detection of gene associated with liver neoplastic disease |
| US6087334A (en) * | 1998-08-21 | 2000-07-11 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Anti-diabetic peptides |
| US7208576B2 (en) * | 1999-01-06 | 2007-04-24 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Non-glycosylated human alpha-fetoprotein, methods of production, and uses thereof |
| EP1148779B1 (en) * | 1999-01-06 | 2007-12-12 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals |
| DE60215823T2 (de) * | 2001-08-07 | 2007-09-06 | Novozymes A/S | Kohlhydrate und polyole zum lösen der proteinkristalle |
| EA011606B1 (ru) * | 2004-07-14 | 2009-04-28 | Эдуард Борисович Татулов | Способы получения и применения рекомбинантного альфа-фетопротеина |
| KR20090104041A (ko) * | 2006-12-19 | 2009-10-05 | 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. | 다발성 경화증을 치료하기 위한 α페토프로테인 및 면역조절제의 병용투여 |
| EP2510941A3 (en) | 2007-02-20 | 2013-01-23 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating multiple sclerosis by administration of alpha-fetoprotein in combination with an integrin antagonist |
| US20100304873A1 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Lipa Markowitz | Bowling Ball and Football Game Controller |
| CN105732795A (zh) * | 2016-03-21 | 2016-07-06 | 海南医学院 | 一种获得人类甲胎蛋白的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH025866A (ja) * | 1988-06-27 | 1990-01-10 | Kansai Shin Gijutsu Kenkyusho:Kk | ヒトアルファフェトプロテインドメインｉ遺伝子、対応プラスミド組換体、対応形質転換体、該ドメインｉの製造法及び製造された該ドメインｉ |
| US5206153A (en) * | 1990-06-27 | 1993-04-27 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Method of producing human α-fetoprotein and product produced thereby |
-
1992
- 1992-09-28 CA CA002120131A patent/CA2120131A1/en not_active Abandoned
- 1992-10-30 JP JP6507567A patent/JPH08511677A/ja active Pending
- 1992-10-30 ES ES93915109T patent/ES2235156T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 WO PCT/US1992/008317 patent/WO1994010199A1/en not_active Ceased
- 1992-10-30 EP EP93915109A patent/EP0749441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 DE DE69233463T patent/DE69233463T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-30 AT AT93915109T patent/ATE285416T1/de not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-10-08 US US08/133,773 patent/US5384250A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE285416T1 (de) | 2005-01-15 |
| WO1994010199A1 (en) | 1994-05-11 |
| CA2120131A1 (en) | 1994-05-11 |
| EP0749441A4 (en) | 1998-12-30 |
| EP0749441A1 (en) | 1996-12-27 |
| EP0749441B1 (en) | 2004-12-22 |
| US5384250A (en) | 1995-01-24 |
| JPH08511677A (ja) | 1996-12-10 |
| DE69233463T2 (de) | 2005-12-22 |
| DE69233463D1 (de) | 2005-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dingwall et al. | Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. | |
| Rollet et al. | Expression of Drosophila's 27 kDa heat shock protein into rodent cells confers thermal resistance | |
| US5443825A (en) | Human leukemia inhibitory factor | |
| EP0749441B1 (en) | Expression and purification of cloned human alpha-fetoprotein | |
| PT99118B (pt) | Processo de preparacao de protease de interleucina 1b,de inibidores da protease de interleucina 1b e de composicoes farmaceuticas | |
| PT816506E (pt) | Sistema para a expressao de antigenios heterologos como proteinas de fusao | |
| FI91074C (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi | |
| Chang et al. | Expression in Escherichia coli of open reading frame gene segments of HTLV-III | |
| JP2686257B2 (ja) | 新規なｄａｆの製造のための核酸 | |
| JP2004505640A5 (es) | ||
| US5824788A (en) | Cloning of gene encoding the GP28.5 protein of toxoplasma gondii; peptide fragments of said protein and their applications | |
| Aitken et al. | Amino and carboxy terminal sequences of the DNA-binding protein HU from the Cyanobacterium Synechocystis PCC 6701 (ATCC 27170) | |
| JP2862870B2 (ja) | 新規ペプチド | |
| DE69935599D1 (de) | Modifizierte hcv peptid-impfstoffe | |
| JP2001517091A (ja) | Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉについての抗原性組成物および検出方法 | |
| Jia et al. | Carbohydrate-binding protein 35: molecular cloning and expression of a recombinant polypeptide with lectin activity in Escherichia coli | |
| JP2000503850A (ja) | Ｓ―層―タンパク質の組み換え発現 | |
| JP2974348B2 (ja) | ヘモフイルス インフルエンザｂ型の膜タンパク及びペプチド | |
| JP2829397B2 (ja) | フィブリン結合活性ポリペプチド | |
| ES2224616T3 (es) | Alergeno principal recombinado del polen de artemisa vulgaris (artemisa). | |
| PT1704234E (pt) | Produção do péptido tipo glucagon 2 e de análogos do mesmo | |
| Braciak et al. | Vector-derived expression of recombinant rat interleukin-6 | |
| US4578219A (en) | Antigenic peptide compound | |
| HK1076285A (en) | Expression and purification of cloned human alpha-fetoprotein | |
| AU646888B2 (en) | Gene encoding a 30-kilodalton outer membrane protein of bordetella pertussis |